Laboratorio N7

Microbiología General
Facultad de Ciencias Exactas
UNLP
Laboratorios Nº10: Antimicrobianos
1. Prueba de difusión en ágar: ANTIBIOGRAMA, técnica de Kirby y Bauer.
Objetivo: Determinar el espectro de susceptibilidad a antimicrobianos de Escherichia coli,
Pseudomonas. sp. por la técnica de difusión en agar.
Preparación del medio de cultivo
Ágar Mueller-Hinton
Infusión de carne de buey 300 ml
Aminoácidos de caseína
15 g
Almidón
1.5 g
Agar
17 g
Agua destilada c.s.p.
1000 ml
pH final=7.4.
El medio de cultivo, agar Mueller-Hinton, se entuba a razón de 25 ml por tubo y se esteriliza
en autoclave, 120ºC por 15 min. Una vez esterilizado se vuelca en placas de Petri, sobre una
superficie horizontal y uniforme con el fin de obtener una profundidad aproximada de 4 mm.
Esto requiere unos 25 ml de medio en placas de 100 mm de diámetro. Antes de ser utilizadas
se secarán a 35ºC durante 20 a 30 min.
Preparación del inóculo
A partir de un desarrollo en agar nutritivo se realiza una suspensión directa a partir de 4 ó 5
colonias con 18-24 hs. de incubación en solución fisiológica ajustando la turbidez al 0.5 de la
escala de Mc Farland (aprox. 1.5 x 108ufc/ml). Dentro de los 15 minutos de estandarizado en
inóculo, se siembra el medio de la siguiente manera: se sumerge un hisopo de algodón estéril
en la suspensión estandarizada y el exceso de líquido se elimina presionando y rotando el
hisopo firmemente contra el interior del tubo por encima del nivel de líquido. Luego se pasa el
hisopo en franjas uniformes en tres direcciones cubriendo toda la superficie de la placa de
agar para obtener una siembra uniforme. Las placas se dejan secar de 3 a 5 minutos antes de
aplicar los discos. El inóculo debe dar un desarrollo confluente (aplicar los discos dentro de los
15 min. posteriores a la inoculación).
Aplicación de los discos
Los discos de antimicrobianos se aplican sobre la superficie de las placas inoculadas con
pinza estéril. Todos los discos deben presionarse suavemente sobre el agar para asegurar
contacto total con la superficie. Deben colocarse a una distancia igual o mayor de 15 mm del
borde de la placa y lo bastante separados para evitar la superposición de los halos de
inhibición. No usar más de 6 discos por placa de 100 mm.
Dentro de los 15 min. de colocados los discos llevar a incubar con la placa invertida a 35ºC
durante 16 a 18 hs.
Lectura e interpretación
Luego del período de incubación se leen los halos de inhibición utilizando un calibre o una
regla.
1
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El punto final es la inhibición total del crecimiento, sin tener en cuenta las colonias diminutas
que puedan detectarse solo con una observación muy minuciosa. Los diámetros de zonas
para antimicrobianos individuales se traducen a las categorías de susceptibles, intermedios o
resistentes con referencia a tablas interpretativas. Generalmente son aquellas recomendadas
por el CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)
Control de calidad del ensayo
Para monitorear la exactitud y precisión del procedimiento y la calidad de los reactivos se
realiza un control de calidad periódico con cepas control de susceptibilidad conocida y
genéticamente estable. Las cepas recomendadas para control de métodos de difusión son:
Escherichia coli (ATCC 25922 y ATCC 35218), Staphylococcus aureus (ATCC 25923),
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) y Enterococcus faecalis (ATC29212).
Cepa
Antibiótico
Halo de inhibición
(mm)
Criterio de corte
(mm)
Interpretación
2. Prueba de dilución en caldo: Determinación de la C.I.M.
Objetivo: Determinar el valor de la concentración inhibitoria mínima (C.I.M.) de ampicilina
sobre Escherichia coli por la técnica de dilución en caldo.
Preparación del medio de cultivo
Caldo de Mueller-Hinton suplementado con Cl2Ca (25 mg/l) y Cl2Mg (50 mg/l).
Preparación de la solución del antibiótico
Pesar 10 mg del antibiótico ampicilina y llevar a volumen en matraz aforado de 10 ml con
agua destilada estéril (solución stock de 1000 µg/ml). En el momento de usar se diluye 1/10
con agua destilada estéril (solución de trabajo de 100 µg/ml).
Preparación del inóculo
A partir de un cultivo puro de E. coli en agar nutritivo se prepara una suspensión en solución
fisiológica ajustando la turbidez al 0.5 de la escala de Mc. Farland. Diluir esta suspensión
1/100 colocando 0.2 ml en 19.8 ml de caldo Mueller-Hinton.
Preparación de las diluciones
Se preparan diluciones al doble a partir de la solución de trabajo, directamente en los tubos
de la siguiente manera
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a- Disponer y enumerar 14 tubos estériles.
b- Comenzar colocando el caldo de Mueller-Hinton de acuerdo a lo indicado en la tabla.
c- A los tubos 1, 2 y 12 agregarles 0.5 ml de la solución de antibiótico 100 µg/ml.
d- A partir del 2º tubo, luego de homogeneizar muy bien, extraer 0.5 ml y pasarlos al tubo
siguiente. Realizar esta operación hasta el tubo 11, descartar de aquí 0.5 ml..
e- Agregar a todos los tubos que indica la tabla 0.5 ml de inóculo.
Tubo 12: Control de esterilidad de la solución de antibiótico.
Tubo 13: Control crecimiento de la cepa.
Tubo 14: Control de esterilidad del caldo.
Incubar los tubos a 35ºC durante 18 a 20 hs.
Lectura
La menor concentración de antimicrobiano que produce una inhibición completa del desarrollo
visible representa la C.I.M.
Para la interpretación de la lectura (S, I, R) se recurre a las tablas de C.I.M. para el antibiótico
ensayado recomendadas por el CLSI.
Control de calidad
Para monitorear la exactitud y precisión del procedimiento y la calidad de los reactivos se
realiza un control de calidad en paralelo al ensayo con cepas control de susceptibilidad
conocida y genéticamente estables. Las cepas recomendadas para control de métodos de
dilución son: Escherichia coli (ATCC 25922 y ATCC35218), Staphylococcus aureus (ATCC
25923), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) y Enterococcus faecalis (ATC29212) entre
otras.
Esquema para la realización de la C.I.M.
Dil. del antibiótico
(ml)
Inóculo
Conc. final
antibiótico
100 µg/ml
0.5 ml
50 µg/ml
100 µg/ml
0.5 ml
25 µg/ml
0.5 del tubo 2
0.5 ml
12.5 µg/ml
0.5 ml
0.5 del tubo 3
0.5 ml
6.25 µg/ml
5
0.5 ml
0.5 del tubo 4
0.5 ml
3.12 µg/ml
6
0.5 ml
0.5 del tubo 5
0.5 ml
1.56 µg/ml
0.78 µg/ml
Tubo
Caldo M-H
1
----
0.5 de
2
0.5 ml
0.5 de
3
0.5 ml
4
Resultado
(turbidez)
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7
0.5 ml
0.5 del tubo 6
0.5 ml
8
0.5 ml
0.5 del tubo 7
0.5 ml
0.39
9
0.5 ml
0.5 del tubo 8
0.5 ml
0.195 µg/ml
10
0.5 ml
0.5 del tubo 9
0.5 ml
0.09
11
0.5 ml
0.5 del tubo 10
y retirar 0.5 ml
0.5 ml
0.045 µg/ml
12
0.5 ml
0.5 de
100µg/ml
--------
13
0.5 ml
--------------------------
0.5 ml
14
1
--------------------------
--------
ml
µg/ml
µg/ml
Control de
est. de dil.
Atb.
Control de
cepa
Control de
est. del caldo
CIM: ...................................... Interpretación:.......................................................
3. Valoración microbiológica de antibióticos
Objetivo: Determinar la potencia de una muestra de ampicilina inyectable por la técnica
microbiológica de difusión en ágar (3+3).
Ensayo aleatorizado en dosis (3+3), por la técnica de difusión en agar.
En el trabajo práctico se realizará la valoración de una muestra de ampicilina inyectable de 1000mg
por el método cilindro-placa.
Previo a la valoración de cualquier antibiótico debe realizarse la curva de calibración Dosis-Respuesta
para la selección de las diluciones de prueba en las condiciones del ensayo. En este caso el análisis
de la curva log concentración (µg/ml) vs halo (mm) permitió seleccionar las siguientes tres
concentraciones de trabajo: 0,15 µg/ml - 0,30 µg/ml - 0,60 µg/ml.
Realización del ensayo de valoración
-Preparación de las diluciones del estándar de referencia.
Utilizar un estándar de Ampicilina de 980 µg/mg, Proceder de acuerdo a lo indicado en la USP-XXV
(Biological Test/ Antibiotics-Microbial Assays). Pesar exactamente alrededor de 20 mg del estándar.
Calcular el volumen de agua destilada estéril para resuspender la pesada de forma de obtener una
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solución de 5000 µg/ml, teniendo en cuenta la potencia (µg/mg). Realizar el siguiente esquema de
diluciones:
1:50
1:10
0.15: 10 ==> 0.15 µg/ml
5000 µg/ml →→→→ 100 µg/ml →→→→ 10 µg/ml→→→ 0.30: 10 ==> 0.30 µg/ml
ADE
S3
S3
0.60: 10 ==> 0.60 µg/ml
Solución 3 (S3):
P04K2H -------16.73 g
P04KH2 ------ 0.523 g
AD
-------1000 ml
pH 8, 0.1M
-Preparación de las diluciones de la muestra.
Preparar las diluciones de la muestra siguiendo el esquema utilizado para el estándar. Considerar
que la muestra tiene una potencia del 100% según lo declarado por el fabricante.
-Preparación del inóculo.
El microorganismo utilizado como indicador es el Micrococcus luteus, ATCC 9341. Sembrar la cepa
en 3 tubos de ágar para antibióticos Nº11 de Merck, e incubar 24 hs a 32 ºC. Resuspender los
desarrollos en solución fisiológica (0.85% NaCl), de forma de obtener un inóculo denso y homogéneo.
Finalmente calibrar el inóculo al 25% de transmitancia leída a 580 nm. Así preparado puede
conservarse a 4ºC durante 14 días.
Calcular el volumen de inóculo a sembrar por placa sobre la base de la relación propuesta por USPXXV: 0.5 ml cada 100 ml del medio.
-Preparación de las placas.
Se utiliza el ágar para antibióticos Nº11 de Merck, envasado a razón de 16 ml por tubo. Fundir 6
tubos del medio Nº11, enfriarlos a 45-50ºC y mantenerlos en Baño María. Inocularlos, homogeneizar
y volcar en las respectivas placas de Petri estériles. Dejar secar 10 minutos en flujo laminar.
-Reservorio del antibiótico
Utilizar cilindros de vidrio o de acero inoxidable esterilizados en estufa. Sus dimensiones son:
diámetro externo: 8 mm; diámetro interno: 6 mm y longitud: 10 mm.
-Ensayo
• Dibujar 4 esquemas de distribución de las diluciones sobre papel asignándoles las letras A,B,C y
D. Cada esquema tendrá las 6 diluciones: dosis baja (1), media (2) y alta (3) del estándar y dosis
baja (4), media (5) y alta (6).de la muestra
1
5
A
6
•
•
4
2
3
Colocar las placas rotuladas con una letra sobre las plantillas según los esquemas.
Con pinza estéril disponer 6 cilindros por placa.
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•
Cargar con pipeta automática 25 µl de cada una de las diluciones en los respectivos cilindros, de
acuerdo a la distribución de cada esquema. Cambiar de la punta descartable (tip) en cada dilución.
• Dejar las placas sobre la mesada para permitir la predifusión del antibiótico durante 20 minutos.
• Llevar a incubar a 37 ºC durante 24 horas.
• Retirar los cilindros y descartarlos en formol al 5%.
• Rotular los halos de inhibición y leer con calibre por el reverso de las placas.
• Registrar los datos según la planilla: placas vs. diluciones.
Placas
0,15
µg/ml
Estándar
0,30
µg/ml
S1
S2
0,60 µg/ml
0,15 g/ml
S3
T1
Muestra
0,30
µg/ml
0,60
µg/ml
T2
T3
A
B
C
D
A*
B*
Prom.
(mm)
•
Luego de evaluar estadísticamente los datos mediante un análisis de varianza, calcular la
potencia real del producto.
• Graficar el logaritmo de las concentraciones ensayadas en función de los halos de inhibición para
el estándar y la muestra.
De acuerdo al procedimiento realizado las dosis alta, media y baja del estándar son iguales a las
dosis alta, media y baja de la muestra, por lo tanto se esperaría una respuesta coincidente entre
ambas. Esto equivale a decir que la potencia real de la muestra es igual a la potencia supuesta. La
diferencia real que pueda existir entre las dos respuestas lineales queda demostrada por la distancia
vertical que aparezca entre las dos líneas paralelas: M, de donde se estima la potencia real de la
muestra.
Deducción de las ecuaciones en el ensayo 3 + 3.
Como puede observarse en la figura, para cada una de las dosis supuestas de la muestra, existe una
respuesta que puede traducirse en una dosis real si se interpola el diámetro en la curva
correspondiente al estándar. Tomando en cuenta lo que se acaba de enunciar podemos decir que:
Considerando que la relación entre la dosis real y la dosis supuesta es idéntica a la relación entre
M  log
Dreal(3)
Dreal(2)
Dreal(1)
 log
 log
D sup(3)
D sup(2)
D sup(1)
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la potencia real (de la muestra) y la potencia supuesta (del estándar) podemos escribir:
Si se logra determinar la relación entre Preal y Psup (R) puede determinarse la potencia de la
M  log
Preal
 log R
P sup
muestra ya que la potencia supuesta es conocida. Para esto calculemos la pendiente de las rectas
teniendo en cuenta los datos de que disponemos. Hay dos maneras de hallarla que quedan claras si
se observa el Gráfico -1.
Grafico-1: Relación entre el log Dosis y el halo de inhibición en un ensayo de valoración
microbiológica de un antibiótico por el método de difusión en ágar, en tres niveles de dosis (3+3).
Log Dosis
Standard (S)
D real (3)
D sup (3)
Muestra (T)
D real (2)
D sup (2)
D real (1)
I
M
Pendiente 
M
I

F
E
D sup (1)
F
E
S1
T1
S2
T2
S3
T3
Diámetro del halo
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Con
F  T 1  S1)  (T 2  S 2)  (T 3  S 3)  
1
3
(Nótese que se hace un promedio de tres distancias).
E  S 2  S1)  ( S 3  S 2)  (T 2  T 1)  (T 3  T 2)  
1
4
(Nótese que se hace un promedio de cuatro distancias).
Simplificando
E  ( S 3  S1)  (T 3  T 1)  
1
4
El valor de I también es conocido ya que es el logaritmo de la relación entre dosis sucesivas
(usualmente log 2=0.301). Queda claro que
M F
I
E
Por lo tanto estamos en condiciones de calcular M y R a partir de los resultados de los halos de
inhibición obtenidos. La potencia real de la muestra estará dada por
Preal  R  P sup
En este caso, como R>1, la potencia de la muestra es mayor que la del standard (Preal>Psup) lo cual
concuerda con el gráfico. En el caso que la situación real sea la inversa de la planteada para deducir
las ecuaciones, esto es cuando la potencia de la muestra sea menor que la del standard, las mismas
ecuaciones seguirán siendo válidas pero el valor calculado para “F” será negativo, el log M será
negativo y el R<1 (Preal<Psup).
Cabe aclarar que todas estas ecuaciones sólo podrán aplicarse si el ensayo cumple con el análisis de
varianza que asegure, entre otros requisitos, que se cumplen las condiciones de linealidad y
paralelismo requeridas.
Potencia de la muestra:...................................................
Resultado (de acuerdo a USP XXV):
8
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CUESTIONARIO
1- ¿Qué es y cuáles son las condiciones deseables en un antibiótico?
2- ¿Cómo pueden clasificarse los antibióticos?
3- a) ¿Cómo explica el mecanismo de acción de las penicilinas?
b) ¿En qué fase del crecimiento manifiestan su acción?
4- a) ¿Cómo explica la toxicidad selectiva de los antimicrobianos que afectan la membrana
citoplasmática de los procariotes?
b) ¿En qué fase del crecimiento manifiestan su acción?
5- ¿Cómo se explica la inhibición microbiana por antimetabolitos?
6- a) ¿Cómo se originan las cepas resistentes a los antimicrobianos?
b- ¿Cómo manifiestan los microorganismos la resistencia a los antimicrobianos?
7- a) ¿Qué es un antibiograma y con qué finalidad se realiza?
b) ¿Qué es la CIM y cuando se aplica?
c) ¿Qué es la CBM?
8- ¿Cuál es el objetivo del control de calidad del las pruebas de susceptibilidad?
9- Las siguientes fórmulas explican la relación entre el tamaño de la zona de inhibición y la
concentración del antibiótico más la influencia de distintos parámetros, en el ensayo de difusión en
ágar.
ln m' = ln m0 - y2 / 4DT'
y2
D = f ( temperatura/ viscosidad x radio molecular)
= 4DT [ln m0 /H - ln m' - ln ( 4 ¶ D T)]
y: Radio del halo de inhibición.
m': Concentración del antibiótico en el borde del halo de inhibición.
m0 : Concentración del antibiótico en el reservorio.
D : Coeficiente de difusión del antibiótico.
T´ : Tiempo en que se forma el halo de inhibición.
H : Espesor de la capa de ágar.
¿Cómo afectaría el tamaño del halo de inhibición la variación de los siguientes parámetros?
a) Aumento de la concentración del antibiótico en el reservorio.
b) Aumento de la temperatura de incubación.
c) Aumento del volumen de medio por placa.
d) Aumento de la cantidad de microorganismos inoculados por placa.
e) Cambio del medio de cultivo utilizado.
f) El antibiótico A dio un halo de inhibición mayor que el producido por el antibiótico B bajo las mismas
condiciones de trabajo. ¿Qué puede decirse respecto del grado de susceptibilidad de la cepa
testeada sobre cada antibiótico?
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10- Ly11BB es un nuevo antibiótico -lactámico de administración oral, con un espectro de actividad
antimicrobiana similar a las cefalosporinas. Es resistente a -lactamasas y químicamente más
estable.
Con el fin de obtener una interpretación confiable de la prueba de susceptibilidad por difusión se
realizó un difusograma (gráfico que representa los valores de log CIM en función de los diámetros de
los halos de inhibición) con 579 aislamientos clínicos típicos de especies representativas y utilizando
discos con 30 µg de Ly11BB.
Los resultados se muestran en la siguiente figura:
CIM µg/ml >32 --
192
1
1
3 2 4 4 1 2 1 3 1 6 2 1
32 --
4
1 2 1
16 --
1
2
8
--
1
4
--
2
--
1
--
2 1 2 3 1
1
1
1 4 2
1
1 1 1 2 1 2 1
2 2 2 1 2 2
1
1 2
1
1 1
2 5 3 6 6
1
1 2 1
0.5 --
1
1
1
3 1 1 2 1 1 1
4 10 4 9 7 6 2 2 3
8 14 22 11 18 7 11 6 3 1 2 8
2 13 11 7 11 13 7 6
0.25 -10
15
20
25
2
30
1
8
1 6 2 6 1 1 1
2
35 mm
Es importante considerar que en los ensayos de difusión hay tres tipos de errores: I) falsos
susceptibles (very major), II) falsos resistentes (major) y III) intermedios por uno de los métodos y
sensibles o resistentes por el otro (minor).
Uno de los criterios utilizados para definir los "diámetros o puntos de corte" es mantener los falsos
susceptibles por debajo de 1% de la población.
a) Explique claramente cómo definiría los diámetros de corte para el ensayo de difusión en ágar.
b) ¿Cuáles serían los valores críticos recomendados para el ensayo de difusión del Ly11BB,
Agréguelos al gráfico. Considere CIM  8 µg/ml CIM  32 µg/ml, como valores de corte. Para muchas
otras cefalosporinas se considera resistencia con d < 14 mm y sensibilidad con d > 18 mm.
c) ¿Cómo se efectuaron las determinaciones de cada uno de los puntos de la figura 1?
d) Dibuje un gráfico de log CIM en función de diámetro del halo de inhibición y marque las zonas
donde se verifiquen los errores que se mencionan en el texto.
e) ¿Podría aplicar el criterio de considerar sensibles a los microorganismos que presentan un d > 18
mm? ¿Por qué?
11- En un ensayo realizado para determinar la susceptibilidad de Sthaphylococcus aureus a tres
antibióticos se obtuvieron los resultados de la tabla siguiente:
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Cepas
ensayadas
de S.
aureus
MSSA
(n =32)
MRSA
(n = 63)
Antibiótico
Valores de corte
de CIM (µg/ml)
Meticilina
8
Penicilina
 0.12
 0.25
Ciprofloxacina
1
4
Meticilina
Penicilina
8
 0.12
 16
 0.25
Ciprofloxacina
1
4
 16
Valor de
CIM
hallados
Nº de
cepas
0.5 a 4
0.08
0.4
0.5
2
> 64
> 128
8
0.5
2
>64
32
5
27
24
4
4
63
63
12
2
49
S
I
R
a) Complete la tabla según % de cepas S, I, y R.
b) Defina que es la CIM y explique en forma de esquema como realizaría el ensayo para
determinar uno de los casos de la tabla.
12- El antibiograma de la cepa Streptococcus thermophilus arrojó los siguientes resultados:
Nitrofurantoína (carga de disco: 300 µg/ml): 19 mm y Kanamicina (carga de disco: 10 µg): 25 mm. Si
las normas de interpretación de halos y correlación con la CIM son:
R
 14
Halos de inhibición (mm)
I
S
15-16
 17
CIM
R
 100 µg/ml
S
Nitrofurantoína
 25 µg/ml
300 µg/ml
Kanamicina
14-17
 13
 18
 25 µg/ml
 6 µg/ml
10 µg/ml
a) ¿Cómo interpreta los resultados?
b) ¿Cómo podría confirmar estos resultados y qué situaciones se podrían presentar?
13- Los datos que se detallan a continuación fueron extraídos de una colección de cultivos de
referencia. Estas cepas son utilizadas periódicamente para verificar la interpretación de los halos de
inhibición en los ensayos de susceptibilidad a los antibióticos. El antibiótico estudiado es vancomicina.
a) Grafique un difusograma con estas cepas de referencia e indique las normas de interpretación de
los halos. Considere los valores de corte para CIM  8 µg/ml y  16 µg/ml.
b) El aislado fue ensayado en un test de susceptibilidad a este antibiótico y el halo obtenido fue de
28 mm de diámetro. Indique de acuerdo al difusograma la sensibilidad de la cepa a este
anibiótico.
c) Describa esquemáticamente y fundamente el ensayo realizado al aislado en b).
d) ¿Qué tipos de discrepancias entre CIM y diámetro de halo conoce? Indíquelas en el gráfico.
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CIM (µg/ml)
Log2 CIM
Halo (mm)
0.250
-2
40
0.250
0.250
0.250
0.250
1
1
1
16
16
64
64
-2
-2
-2
-2
0
0
0
4
4
6
6
38
37
39
<8
22
29
32
16
15
9
8
Cepas
Shigella- 1
Shigella - 2
Shigella - 3
Shigella - 4
Pseudomonas 1- 2- 3- 4 y 5
Klebsiela- 1
Klebsiela- 2
Klebsiela- 3
Proteus- 1
Proteus- 2
Aerobacter- 1
Aerobacter- 2
14- ¿En qué casos justificaría una valoración microbiológica de un antibiótico?
15- Un laboratorio farmacéutico necesita controlar la materia prima para la elaboración de
comprimidos de Gentamicina (sulfato). Para tal fin realiza la valoración microbiológica por difusión en
ágar (3+3), obteniendo los siguientes resultados:
Placas
A
B
C
205
206
204
Standard
239
252
234
293
295
299
190
197
178
Muestra
228
230
220
283
281
290
Los halos fueron registrados como décima de mm.
Dosis 1= 0,2 µg/ml, Dosis 2 = 0,40 µg/ml.
Los datos cumplen con las condiciones del análisis de varianza.
a) ¿Cuál es la potencia de la materia prima valorada?
b) Grafique los resultados y deduzca la ecuación que permite su cálculo.
c) ¿Cuál es el fundamento del método empleado?
12