PRÁCTICA N°2 OBTENCIÓN DE PENICILINA Y COMPROBACIÓN DE SU ACCIÓN ANTIBIÓTICA

PRÁCTICA N°2
OBTENCIÓN DE PENICILINA Y COMPROBACIÓN DE SU ACCIÓN
ANTIBIÓTICA
I. INTRODUCCIÓN
Las sustancias medicinales seguras tienen el poder para destruir y verificar el crecimiento
de organismos infecciosos en el cuerpo. Los organismos pueden ser bacterias, virus,
hongos, o los animales minúsculos llamados protozoos. Un grupo particular de estos
agentes se constituye de drogas llamadas antibióticos, desde el griego anti ("contra") y
bios ("vida"). Algunos antibióticos se producen desde organismos vivientes tales como
bacterias, hongos y moldes. Los otros son totalmente o en parte sintéticos que es,
producido artificialmente. La penicilina es quizás el mejor antibiótico conocido. Su
descubrimiento y luego desarrollo ha permitido a la profesión médica tratar
efectivamente muchas enfermedades infecciosas, incluyendo algunas que alguna vez
amenazaron la vida.
Hace tiempo todos los antibióticos se hicieron desde organismos vivos. Este proceso
conocido como biosíntesis, se usa todavía en la fabricación de algunos antibióticos.
Realmente los organismos fabrican el antibiótico. La gente involucrada sólo provee las
condiciones favorables para que los organismos puedan hacer el trabajo y entonces ellos
extraen la droga.
La penicilina es un antibiótico que pertenece al grupo de los β-Lactámicos; los cuales son
inhibidores de la síntesis de la pared celular bacteriana. Se combinan específicamente con
las denominadas proteínas que unen penicilina de la célula bacteriana e inhiben la
actividad enzimática de estas proteínas produciendo la muerte celular.
Las penicilinas son producidas por muchos hongos, particularmente especies de
Penicillium y Aspergillus.
La fabricación de penicilina es un ejemplo del proceso típico de obtención de antibióticos.
El hongo utilizado industrialmente pertenece al grupo del Penicillium chrysogenum y es
particularmente activo sobre el estafilococo, estreptococo y neumococo, así como sobre
la mayor parte de los microorganismos Gram Positivos, presentando escasa acción sobre
los Gram Negativos. La penicilina es lábil en medio ácido y puede ser inactivada por
hidrólisis del anillo β -Lactámico con penicilinasas.
II. Objetivos
 Obtención de penicilina por inoculación de esporas de Penicillium chrysogenum
previamente sembradas en agar sabouraud-glucosa en medio de cultivo líquido
que contiene los nutrientes apropiados para la generación y crecimiento de la
biomasa.
 Comprobar el efecto del antibiótico obtenido sobre la cepa Escherichia coli, por el
método de los discos de difusión.
III. Material y Método
2.1.
Material


2.2.
Microorganismo
Cultivo de Penicillium chrysogenum, obtenido de una naranja
enmohecida y sembrada en agar Sabouraud-glucosa: glucosa: 40.0g,
peptona: 10.0g, agar: 15.0g, agua destilada: 1L (pH 5.6).
Material de uso común en el laboratorio: 1 jeringa desechable de 5 ml,
agua estéril para inyección, algodón, gasa, asa de siembra, papel
indicador del pH (1-7), embudo de vidrio con filtro redondo, mechero
Bunsen, erlenmeyer de 500ml.
Método
2.2.1. Preparación del inóculo
Se debe repicar Penicillium Chrysogenum en un tubo de ensayo que
contenga agar sabouraud inclinado y dejarlo crecer durante 8 días,
mientras este tiempo transcurre se disuelven los componentes del
caldo de cultivo (lactosa: 30.0g, glucosa: 10.0g, extracto de levadura:
40.0g, nitrato sódico: 3.0g, dihidrogenofosfato sódico: 0.5g, fenilacetato
sódico: 0.3g, sulfato magnésico: 0.25g, sulfato de cinc: una punta de
espátula, agua corriente: 1L) en un erlenmeyer de 500ml, se ajusta a pH
entre 5.5 y 6, se tapa con algodón y se esteriliza en autoclave a 121°C
por 15 minutos. Al día siguiente se procede a la siembra, para ello, se
debe limpiar la cabina correctamente, y llevar allí, el medio
autoclavado, guantes quirúrgicos, asa de siembra, jeringa desechable
de 5 ml, agua estéril para inyección, aspersor con alcohol, gasa y
mechero; encender el motor de la cabina y la lámpara germicida y dejar
durante 20 minutos, luego apagar la lámpara germicida , encender la
lámpara fluorescente, incluir el inóculo y proceder con la inoculación de
la siguiente manera: Saque 5ml de agua para inyección con la jeringa y
descárguelos sobre el tubo donde se encuentra el inóculo, agite un poco
con cuidado de no regar nada y luego adicionar en el erlenmeyer
donde se encuentra el medio, realice el mismo procedimiento con 5 ml
más y tape con el algodón. Saque todo el material de la cabina, limpie
bien con alcohol y gasa, lleve el medio al agitador orbital (shaker)
controle el pH cada 2 ó 3 días manteniéndolo a pH 5, durante 10 a 15
días.
2.2.2. Cristalización de la penicilina:
Filtrar el caldo de cultivo; tomar el filtrado y ajustar el pH a 2.0 con
ácido fosfórico, añadir un volumen igual de éter enfriado en un baño de
hielo; luego adicionar unas puntas de espátula de sulfato sódico
anhidro, concentrar a vacío hasta reducir a 1/4 el filtrado, añadir un
poco de solución de éter disuelto en trietilamina. Filtrar y recoger los
cristales obtenidos.
Cortar con perforadora pequeños círculos de papel de filtro e
impregnarlos con el filtrado del medio, luego colocarlos en una caja de
petri, la cual previamente ha sido sembrada con un microorganismo
sensible a la penicilina, que puede ser: Bacillus subitlis, Escherichia coli y
Pseudomonas fluorescens. Incubar a 28ºC por 24 horas; al día siguiente
se comprueba la actividad de la penicilina por la aparición de halos de
inhibición alrededor de los discos de papel.
2.2.3. Preparación de las placas de ensayo
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Microorganismos
Escherichia coli

Agar de ensayo para bacterias
Agar MacConkey

Aparatos
Asas de siembra y mechero Bunsen, espátula de Drigalski, pipetas
desechables (1ml estériles), solución de NaCl (0,9%, estéril), tubos de
ensayo (estériles)

Procedimiento operativo
Suspender un asa de siembra de las bacterias de ensayo en 2ml de
solución de cloruro sódico estéril; pasar 0,1ml de la suspensión
bacteriana a la placa con agar de MacConkey; extenderla regularmente
con la espátula de Drigalski, secar las placas: dejarlas a 45ºC en una
incubadora o estufa abierta, durante 20 minutos.
Colocar la tapa, tener listas las placas de ensayo, durante 2 horas.
2.2.4. Comprobación de la penicilina con un ensayo de difusión
Material: Placas de ensayo, discos de papel impregnados de penicilina
Aparatos: Pinzas, mechero Bunsen, estufa y regla graduada


Procedimiento operativo
Colocar los discos de papel con penicilina sobre las placas de ensayo con
las pinzas esterilizadas a la llama (3-5 discos), incubar las placas de
ensayo a 28ºC, durante 24 horas
Controlar de las placas: se comprueba la actividad de la penicilina por la
aparición de halos de inhibición alrededor de los discos de papel.
IV. Resultado
 El diámetro del halo de inhibición es una medida de la acción (y
concentración) antibiótica de la penicilina obtenida. Los halos claros se
miden con la regla y los datos obtenidos se reúnen en una tabla. Si se
tiene poca práctica, aunque la manipulación haya sido cuidadosa
pueden producirse errores, por lo que es recomendable llevar a cabo
cada experiencia por triplicado. Por ello, habría que realizar la
preparación para la cristalización de la sal de penicilina sólo cuando se
haya establecido con certeza la actividad antibiótica con el ensayo con
el filtrado de cultivo.

El alumno deberá representar aquí a través de esquemas, el
procedimiento y los resultados de la práctica.
V. Discusión de los resultados
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Anexo: Penicillium chrisogenum
a) Características macroscópicas:
Colonias de crecimiento rápido, alcanzando un diamétro de 4 cm en 7 días. Superficie de
la colonia vellosa, aterciopelada, de color verde claro a verde-azul con una corona radial
ancha y blanca. Presenta exudado amarillo brillante. Reverso habitualmente amarillo
cremoso. Esporulación ambudante.
b) Características microscópicas:
Presenta conidióforos tabicados de paredes lisas, hialinos, usualmente triverticilados,
ramificado al final, con métulas (8.0 a 12.0 x 2.0 a 2.7 µm) y fiálides en forma cilíndrica (7.0
a 12.0 x 2.0 a 2.5 µm) donde nacen conidios lisos, subglobosos a elipsoidales (3.0 a 4.0 x
3.8 a 3.8 µm), hialinos o verde-azulados.