caracterización molecular, detección y resistencia de
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59 CARACTERIZACIÓN MOLECULAR, DETECCIÓN Y RESISTENCIA DE MYCOBACTERIUM AVIUM SUBESPECIE PARATUBERCULOSIS Iker Sevilla Agirregomoskorta TESIS DOCTORALES N.º 59 UNIVERSIDAD DEL PAÍS VASCO CARACTERIZACIÓN MOLECULAR, DETECCIÓN Y RESISTENCIA DE MYCOBACTERIUM AVIUM SUBESPECIE PARATUBERCULOSIS Iker Sevilla Agirregomoskorta NEKAZARITZA, ARRANTZA ETA ELIKADURA SAILA DEPARTAMENTO DE AGRICULTURA PESCA Y ALIMENTACIÓN Vitoria-Gasteiz, 2007 SEVILLA AGIRREGOMOSKORTA, Iker Caracterización molecular, detección y resistencia de “Mycobacterium avium” subespecie “Paratuberculosis”/ Iker Sevilla Agirregomoskorta. - 1ª ed. - Vitoria-Gasteiz : Eusko Jaurlaritzaren Argitalpen Zerbitzu Nagusia = Servicio Central de Publicaciones del Gobierno Vasco, 2007 p. ; cm. - (Tesis doctorales ; 59) Tesis-Universidad del País Vasco ISBN 978-84-457-2602-0 1. Paratuberculosis-Tesis doctorales. I. Euskadi. Departamento de Agricultura, Pesca y Alimentación. II. Título. III. Serie 636.2/.3:616.98:579.873.2(043) Edición: 1.ª junio 2007 © Administración de la Comunidad Autónoma del País Vasco Departamento de Agricultura, Pesca y Alimentación Internet: www.euskadi.net Edita: Eusko Jaurlaritzaren Argitalpen Zerbitzu Nagusia Servicio Central de Publicaciones del Gobierno Vasco Donostia-San Sebastián, 1 - 01010 Vitoria-Gasteiz Impresión: XXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXX ISBN: 978-84-457-2602-0 D. L.: XXXXXXXXX Caracterización Molecular, Detección y Resistencia de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis Tesis Doctoral Memoria del trabajo realizado en Neiker-Tecnalia presentado por Iker Sevilla Agirregomoskorta para optar al grado de Doctor en Biología por la Universidad del País Vasco 2007 El presente trabajo de Tesis Doctoral ha sido realizado en el Departamento de Sanidad Animal del Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario–NeikerTecnalia. Su desarrollo ha sido posible gracias a las becas de Formación de Tecnólogos del Departamento de Agricultura, Pesca y Alimentación, y de Formación de Doctores en centros de la Red Vasca de Ciencia, Tecnología e Innovación del Departamento de Industria, Comercio y Turismo y del Departamento de Educación, Universidades e Investigación del Gobierno Vasco, y a la beca de la Fundación Cándido Iturriaga. Ainarari Amatxu ta Amamari Patxi, Elixabete ta Aitari Familia ta Lagunei AUTORIZACION DEL/LA DIRECTOR/A DE TESIS PARA SU PRESENTACION Los Dres. Ramón A. Juste Jordán y Joseba M. Garrido Urkullu como Directores de la Tesis Doctoral: Caracterización Molecular, Detección y Resistencia de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis realizada en el Departamento/Instituto Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario (NEIKER-Tecnalia) por el Doctorando Don/ña. Iker Sevilla Agirregomoskorta, autorizan la presentación de la citada Tesis Doctoral, dado que reúne las condiciones necesarias para su defensa. En Derio a 11 de Diciembre de 2006 LOS DIRECTORES DE LA TESIS Fdo.: Ramón A. Juste Jordán Fdo.: Joseba M. Garrido Urkullu RATIFICACION DEL/LA PONENTE PARA LA PRESENTACION DE LA TESIS El Dr. Mikel Iriondo Orensanz como Tutor y Ponente de la Tesis Doctoral del Doctorando Don Iker Sevilla Agirregomoskorta, ratifica la autorización de los Directores para la presentación de la Tesis Doctoral que lleva por título Caracterización Molecular, Detección y Resistencia de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis, realizada en el Departamento/Instituto Departamento de Sanidad Animal del Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario (NEIKER-Tecnalia). En Leioa a 26 de Diciembre de 2006 EL TUTOR DE LA TESIS Fdo.: Mikel Iriondo Orensanz CONFORMIDAD DEL DEPARTAMENTO/INSTITUTO El Consejo del Departamento/Instituto de en reunión celebrada el día ____ de de ha acordado dar la conformidad a la admisión a trámite de presentación de la Tesis Doctoral titulada: Caracterización Molecular, Detección y Resistencia de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis dirigida por los Dres. Ramón A. Juste Jordán y Joseba M. Garrido Urkullu y presentada por Don/ña. Iker Sevilla Agirregomoskorta ante este Departamento/Instituto. En a de de Vº Bº DIRECTOR/A DEL DEPARTAMENTO/INSTITUTO Fdo.: __________________________ SECRETARIO/A DEL DEPARTAMENTO/INSTITUTO Fdo.: _______________________ ACTA DE GRADO DE DOCTOR ACTA DE DEFENSA DE TESIS DOCTORAL DOCTORANDO DON/ÑA. Iker Sevilla Agirregomoskorta TITULO DE LA TESIS: Caracterización Molecular, Detección y Resistencia de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis El Tribunal designado por la Subcomisión de Doctorado de la UPV/EHU para calificar la Tesis Doctoral arriba indicada y reunido en el día de la fecha, una vez efectuada la defensa por el doctorando y contestadas las objeciones y/o sugerencias que se le han formulado, ha otorgado por___________________la calificación de: unanimidad ó mayoría En a de de EL/LA PRESIDENTE/A, EL/LA SECRETARIO/A, Fdo.: Fdo.: Dr/a: ____________________ Dr/a: ______________________ VOCAL 1º, VOCAL 2º, VOCAL 3º, Fdo.: Fdo.: Fdo.: Dr/a: Dr/a: Dr/a: EL/LA DOCTORANDO/A, Fdo.: Iker Sevilla Agirregomoskorta AGRADECIMIENTOS Dicen que para ser feliz en la vida como mínimo es necesario plantar un árbol, escribir un libro y tener un hijo. No creo que todo ello sea necesario, pero yo por si acaso, ya he cumplido la primera premisa, y con esta tesis intento dejar cumplida también la segunda. De la tercera... hablaremos. El camino ha sido duro y difícil, lleno de subidas y bajadas, pero los logros obtenidos y el apoyo recibido han permitido mantener el rumbo trazado. Por eso, quiero agradecer a todos la ayuda que me habéis brindado para lograr el cachito de mi felicidad que tenéis entre las manos. Antes de nada, quiero dar las gracias a las personas a quien está dedicado este trabajo. A Ainara, a ama, a amama, a Patxi, a Elixabete, a aita, a mis familiares más cercanos y a mis amigos de toda la vida. Espero que después de soportarme durante este tiempo, todavía os queden ganas de seguir haciéndolo por mucho más tiempo. Les doy las gracias a Ramón y a Joseba, por darme esta oportunidad, por dirigir mi trabajo, por discutirlo, por disfrutar de él, por buscar soluciones y por confiar en mí incluso cuando ni siquiera yo era capaz de hacerlo. A Mikel, por hacer de puente entre Neiker y la Universidad y por conseguir las respuestas a todas mis preguntas. A los tres, gracias por transmitirme vuestra tranquilidad. Agradezco mucho la labor de las personas que durante este tiempo han contribuido de una u otra forma al trabajo del grupo de micobacterias de Neiker. A Mertxe, Mariví G., Mariví L., Sara, Natalia, Olaia, Ainara, Zuriñe, Galder, Amaia, y nuestro último fichaje pero no menos importante, Elena. Sin su trabajo esta tesis nunca habría salido adelante. Además, me alegra haber hecho muy buenas migas con algunos de ellos. En este sentido, también me gustaría dar las gracias por su colaboración al grupo de micobacterias de León, formado por Francisco, Valentín, Andrea, Jorge, Carlos, María, Laetitia y otros que no conozco pero que seguramente habrán aportado su trabajo. También aprovecho para dar las gracias al grupo de micobacterias del IREC, a JM Plazaola, a Shoor Vir, a Ana Claudia, a RJ Whittington, a RH Whitlock, a Tomás, a Buenaventura, a Artur, a María Jesús, a Martha, y a todos los ganaderos y veterinarios que nos han suministrado muestras e información, por su importantísima colaboración. A Gorka, que no ha dudado en prestarme toda la ayuda que haya podido necesitar, y cuyo trabajo ha permitido parte de esta tesis. A Ana G., Marta, Inés y Jesse por dejarme dar el primer paso en el mundo de la investigación y echarme un cabo cuando lo he necesitado. A Ana H. por contestar a mis preguntas e incentivar nuestra curiosidad. Muchas gracias a Itziar, Xeider, Jon, Iratxe, David, Bea, Vega, Josune, Mara, Idoia, y Leyre, mis compañeros de laboratorio de siempre, los que más se han implicado, los que más veces han soportado mi mala uva cuando las cosas se torcían, pero también con los que más he reído y disfrutado. Entre ellos cuento ya con auténticos amigos. También a las recientes incorporaciones Laura E., Félix, y Sonia, y a otros que dejaron Neiker, como Aitzol, Laura L., Laura M., Itziar K., y Dani. Muchas gracias a todos por vuestro apoyo, interés, y ayuda, por hacer el día a día más ameno y agradable. Gracias a José Carlos por “prestarme” material con una sonrisa y ayudarme con las contaminaciones. A Lucía por ayudarme con los medios y los pedidos, y por surtirnos de ositosgominola para no perder las energías. A Rakel, Gloria y Argiñe, por ayudarme en mis inicios en el laboratorio, a Nieves, Arrate, Esme y Nico por conseguir las mejores muestras y echar un cable. A Iñigo, Jon Paul, Leire, Iranzu, Yolanda, Nekane, Jon A. y Rosa por su apoyo administrativo, y a Gontzal y Aitor por su apoyo informático. A José Ángel, Unai, Sergio, Fernando y Fidel por mantener, muchas veces desde la “sombra”, el funcionamiento general de Neiker, y hacer lo posible por satisfacer nuestras necesidades. A Mari y a Claudina, que además de ocuparse de que todo esté limpio, una me echa piropos y otra me trae pan recién horneado los días de bocadillo. A Julián y a Fer por ayudarme con la encuadernación y diseño del libro de tesis. Creo que es imposible no dejarme a alguien en el tintero, pero espero que sepa perdonarme. Me alegro mucho de haber contado con vosotros en este período tan importante. ESKERRIK ASKO DANORI ! ÍNDICE LISTA DE ABREVIATURAS .......................................................................................................................25 INTRODUCCIÓN GENERAL ......................................................................................................................27 ESCENARIO Y PLANTEAMIENTO DEL TRABAJO DE LA TESIS.................................................33 OBJETIVOS ................................................................................................................................................36 ESTUDIOS LLEVADOS A CABO .........................................................................................................36 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA ...........................................................................................................39 ETIOLOGÍA .................................................................................................................................................41 Género Mycobacterium......................................................................................................................41 Morfología externa ..........................................................................................................................41 Metabolismo ......................................................................................................................................42 Composición genética ...................................................................................................................42 Clasificación taxonómica..............................................................................................................43 Identificación.....................................................................................................................................45 Tipado molecular .............................................................................................................................48 Complejo M. avium..............................................................................................................................50 Historia ................................................................................................................................................51 Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis.......................................................................52 Morfología y metabolismo ............................................................................................................52 La micobactina .................................................................................................................................53 Los medios de cultivo....................................................................................................................54 Resistencia y persistencia............................................................................................................55 Composición genética ...................................................................................................................56 EPIDEMIOLOGÍA ......................................................................................................................................57 Hospedadores .......................................................................................................................................57 Transmisión ...........................................................................................................................................59 Distribución y prevalencia ................................................................................................................61 Trascendencia Económica ...............................................................................................................65 Implicaciones en salud pública ......................................................................................................66 Enfermedad de Crohn ....................................................................................................................66 Map en la cadena alimentaria del ser humano. La leche, el agua y otros productos. Inactivación de Map en leche ......................................................................................................71 Epidemiología molecular...................................................................................................................75 PATOGÉNESIS Y PATOLOGÍA ............................................................................................................83 Entrada e invasión de Map en el hospedador............................................................................83 Factores de virulencia....................................................................................................................85 Respuesta inmune del hospedador...............................................................................................86 Cuadro clínico .......................................................................................................................................90 Lesiones macroscópicas ..................................................................................................................91 Lesiones microscópicas ...................................................................................................................92 DIAGNÓSTICO...........................................................................................................................................93 Diagnóstico basado en las técnicas histopatológicas convencionales ...........................93 Diagnóstico basado en la detección bacteriológica................................................................94 Tinción y detección al microscopio ..........................................................................................94 Análisis inmunohistoquímico de preparaciones histológicas ........................................95 Aislamiento ........................................................................................................................................95 Detección de DNA............................................................................................................................98 Diagnóstico basado en la respuesta inmunológica del hospedador ..............................102 Detección de la inmunidad celular in vivo: Intradermorreacción.................................103 Detección de la inmunidad celular in vitro ...........................................................................103 • Prueba del IFN-γ ................................................................................................................104 Detección de la inmunidad humoral .......................................................................................105 • Prueba de AGID .................................................................................................................105 • Prueba de ELISA................................................................................................................106 TRATAMIENTO Y MEDIDAS DE CONTROL...................................................................................108 Programas de detección y eliminación de positivos ............................................................110 Programas que incluyen la vacunación.....................................................................................111 ESTUDIOS.....................................................................................................................................................115 ESTUDIO I. Comparison of blood polymerase chain reaction and enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection in cattle and sheep ..............................................................................................................117 Abstract .................................................................................................................................................119 Introduction..........................................................................................................................................119 Materials and methods.....................................................................................................................120 Results ...................................................................................................................................................122 Discussion and conclusions..........................................................................................................123 Acknowledgements...........................................................................................................................125 ESTUDIO II. Molecular typing of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis strains from different hosts and regions .......................................................................................127 Summary ...............................................................................................................................................129 Introduction..........................................................................................................................................129 Materials and methods.....................................................................................................................129 Results ...................................................................................................................................................132 Discussion............................................................................................................................................133 Acknowledgements...........................................................................................................................135 ESTUDIO III. Pulsed-field gel electrophoresis profile homogeneity of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis isolates from cattle and heterogeneity of those from sheep and goats .....................................................................................................................................137 Abstract .................................................................................................................................................139 Background..........................................................................................................................................139 Methods.................................................................................................................................................141 Sources and growth of isolates ................................................................................................141 Cultures for PFGE..........................................................................................................................143 Isolate identification: IS900 PCR and Locus 251 PCR ......................................................143 IS1311 PCR-REA ............................................................................................................................143 SnaBI-SpeI PFGE analysis..........................................................................................................143 Phylogenetic analysis of PFGE profiles and estimation of genetic diversity...........144 Results ...................................................................................................................................................145 IS900 PCR and Locus 251 PCR.................................................................................................145 IS1311 PCR-REA ............................................................................................................................145 SnaBI-SpeI PFGE analysis..........................................................................................................146 Phylogenetic analysis of PFGE profiles and estimation of genetic diversity...........150 Discussion............................................................................................................................................151 Conclusions .........................................................................................................................................155 Authors' contributions .....................................................................................................................156 Acknowledgements...........................................................................................................................156 ESTUDIO IV. Detection and pathological implications of the presence of IS900 in human Mycobacterium avium isolates...........................................................................................157 Abstract .................................................................................................................................................159 Introduction..........................................................................................................................................159 Methods and results .........................................................................................................................160 Discussion and conclusions..........................................................................................................161 ESTUDIO V. Inactivation of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in cow’s milk by means of high hydrostatic pressure at mild temperatures......................................163 Abstract .................................................................................................................................................165 Introduction..........................................................................................................................................165 Materials and methods.....................................................................................................................166 Strains and preparation of inocula ..........................................................................................166 Inoculation .......................................................................................................................................166 HHP treatments ..............................................................................................................................166 Microbiological analysis .............................................................................................................167 Statistical analysis ........................................................................................................................167 Results, discussion and conclusions.........................................................................................167 Acknowledgements...........................................................................................................................170 DISCUSIÓN GENERAL .............................................................................................................................171 CONCLUSIONES GENERALES..............................................................................................................179 RESUMEN; LABURPENA; SUMMARY.................................................................................................183 RESUMEN .................................................................................................................................................185 LABURPENA............................................................................................................................................188 SUMMARY ................................................................................................................................................191 BIBLIOGRAFÍA CITADA ...........................................................................................................................195 LISTA DE ABREVIATURAS A: adenina ABC: adenosine triphosphate-binding cassette transporter ABTS: 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6sulphonic acid) AFLP: amplified fragment length polymorphism Ag: antigen/ antígeno AGID: agar gel immunodiffusion AP: alkaline phosphatase ASA: 5-amino salicylic acid ATCC: American type culture collection BHI: brain heart infusion BSA: bovine serum albumin (k)bp: (kilo) base pair/ pares de bases C: citosina CARD: caspase-activating and recruitment domain CD: cluster of differentiation CF: complement fixation CFU: colony forming unit CIP: Collection de l'Institut Pasteur CMI: cell mediated immunity CS: complementary sensitivity CTAB: cetyl-trimethylammonium bromide dATP: (2’-deoxyadenosine 5’-triphosphate) dCTP: (2’-deoxycytidine 5’-triphosphate) dGTP: (2’-deoxyguanosine 5’-triphosphate) DMSO: dimethyl sulfoxide DNA: deoxyribonucleic acid DR: direct repeats dTTP: (2’-deoxythymidine 5’-triphosphate) EDTA: ethylene-di-amine-tetra-acetic acid EEUU: Estados Unidos de América ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay EST: expressed sequence tag FAP: fibronectin-attachment protein FET: Fisher exact test FPA: fluorescence polarization assay FR: flanking region G: guanina GLC: gas-liquid chromatography GM-CSF: granulocyte macrophage colony stimulating factor HEY(M): Herrold’s egg yolk (medium) HHP: high hydrostatic pressure HIV: human immunodeficiency virus HPC: hexadecyl pyridinium chloride HPLC: high performance liquid chromatography HRP: horse radish peroxidase HTST: high temperature short time hsp: heat shock protein IFN: interferón IL: interleukin IS: insertion sequence ITS: internal transcribed spacer IVIAT: in vivo induced antigen technology JNK/SAPK: c-Jun N-terminal kinase/stress activated protein kinase LAM: lipoarabinomanano LFA: leukocyte function antigen LB: linfocito B LJ: Lowënstein-Jensen LT: linfocito T LTh: LT helper MAC: Mycobacterium avium complex MAIC: Mycobacterium avium-intracellulare complex Maa: Mycobacterium avium subespecie avium Mah: Mycobacterium avium subespecie hominissuis MALDI-tof: Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight Map: Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis MAPK: mitogen-activated protein kinase Mas: Mycobacterium avium subespecie silvaticum MGIT: mycobacterial growth indicator tube mig: macrophage-induced gene MIRU: mycobacterial interspersed repetitive unit MLSSR: multi-locus short sequence repeat MLVA: multi-locus VNTR analysis MMP: matrix metalloproteinase MOTT: mycobacteria other than tuberculosis MPIL: multiplex PCR of IS900 insertion loci MSPD: matrix-solid phase dispersion MTC: Mycobacterium tuberculosis complex NK: natural killer NOD: nucleotide oligomerization domain NRAMP: natural resistance-associated macrophage protein NTM: nontuberculous mycobacteria OADC: oleic acid-albumin-dextrose-catalase OD: optical density OPD: ortho-phenylenediamine ORF: open reading frame PBS: phosphate-buffered saline PCR: polymerase chain reaction PFGE: pulsed field gel electrophoresis PNPP: para-nitrophenyl phosphate PPA: protoplasmatic paratuberculosis antigen PPD: protein purified derivative PPE: Pro-Pro-Glu PRA: PCR-REA Q-RT-PCR: quantitative-real time-PCR RAPD: randomly amplified polymorphic DNA rDNA/rRNA: DNA/RNA ribosómico RFLP: restricted fragment length polymorphism REA: restriction endonuclease analysis RNA: ribonucleic acid ROC: receiver operation characteristic RT: room temperature SDS: sodium dodecyl sulfate SIDA (AIDS): síndrome de inmunodeficiencia adquirida S/P: sample to positive SPARC: secreted protein, acidic and rich in cysteine T: timina TE: Tris-EDTA TGF: transforming growth factor TIMP: tissue inhibitor of metalloproteinase TLC: thin layer chromatography TMB: tetra-methylbenzidine TNF: tumor necrosis factor TRAF: TNF receptor-associated factor tRNA: RNA transferente UK: United Kingdom USA: United States of America VNTR: variable-number tandem repeat 25 INTRODUCCIÓN GENERAL INTRODUCCIÓN GENERAL La paratuberculosis o enfermedad de Johne es una enfermedad crónica del intestino causada por Mycobacterium avium subsp. paratubeculosis (Map). Esta bacteria patógena pertenece al género Mycobacterium, grupo en el que también se incluyen los agentes etiológicos de la tuberculosis y la lepra. Es una micobacteria del complejo M. avium, de gran importancia en veterinaria y medicina por su implicación en infecciones de animales de granja y pacientes inmunodeprimidos. Sus rasgos distintivos son la dependencia de micobactina, la baja velocidad de crecimiento, la resistencia a condiciones adversas, y el elemento genético IS900. La paratuberculosis afecta principalmente a rumiantes domésticos y salvajes, adquiriendo mayor importancia entre las especies típicas explotadas por el hombre (bovino, ovino y caprino) y entre otras menos habituales como el ciervo. No obstante Map ha sido aislado de infinidad de animales, de otras especies monogástricas como el hombre, el conejo o el jabalí, y de insectos, lombrices, nemátodos y amebas. El mecanismo de transmisión principal de la enfermedad es la vía fecal-oral, por ingestión de alimentos contaminados con heces de animales infectados. También se conocen otras formas de transmisión como la intrauterina, por ingestión de leche o calostro de madres infectadas o por semen de toros infectados. La paratuberculosis se encuentra extendida por todo el mundo, y a pesar de que la dificultad de su diagnóstico enmascara la realidad, las prevalencias que se calculan son muy elevadas. En el estado español, donde se conoce su existencia desde hace tiempo, se considera ampliamente distribuida, y según las aproximaciones de los estudios más recientes la prevalencia se sitúa entre el 10 y el 86% de explotaciones infectadas según la especie y la región. Las principales pérdidas económicas ocasionadas por la paratuberculosis se deben a la reducción de la producción láctea, al sacrificio prematuro y a la devaluación de los animales sacrificados para su venta. Las pérdidas calculadas son muy elevadas en países como EEUU, Canadá, Australia, Holanda o Dinamarca. La posible vinculación de Map en el proceso inflamatorio del intestino humano conocido como enfermedad de Crohn, fue propuesta hace mucho tiempo, sin embargo, su frecuente detección mediante el cultivo o técnicas moleculares en pacientes de esta enfermedad, incluso a partir de muestras de leche y sangre de estos pacientes, han incrementado notablemente el interés sobre este microorganismo. A pesar de la existencia de múltiples estudios, ninguno de ellos ha conseguido demostrar o desmentir totalmente la hipotética implicación de la bacteria causante de paratuberculosis en la enfermedad de Crohn. La preocupación por el posible riesgo en salud pública, ha promovido la realización de estudios sobre la presencia de Map en la cadena alimentaria humana. La presencia de esta micobacteria ha sido investigada principalmente en leche, queso y agua como posibles vehículos de transmisión a la especie humana. Gracias a 29 INTRODUCCIÓN GENERAL este tipo de estudios se ha comprobado la relativamente alta incidencia de Map en estos productos, así como la ineficacia de tratamientos como la pasterización o la cloración a la hora de eliminar sus células viables. En consecuencia, la preocupación en relación con la enfermedad de Crohn sigue en aumento, y se desarrollan nuevos estudios para garantizar la ausencia de Map en los productos destinados al consumo humano. El genotipado de cepas es esencial para comprender la epidemiología de microorganismos patógenos. En el caso de Map la técnica más utilizada en este campo es la IS900-RFLP, gracias a la que fueron diferenciados por primera vez dos grupos generales de cepas, las bovinas y las ovinas, así denominados por la aparente mayor prevalencia de cada tipo en la especie hospedadora. Posteriormente se han desarrollado otros procedimientos mucho más sencillos para diferenciar esos dos grandes grupos, como la IS1311 PCR-REA. Además, según algunos trabajos, otra técnica similar a la del RFLP como es la PFGE también da buenos resultados para llevar a cabo un tipado más detallado. Antes que la caracterización genotípica, ya se habían observado ciertas dificultades en el cultivo de esta bacteria de muestras de algunos casos ovinos de paratuberculosis, y algunos investigadores recomendaban el uso de medios de cultivo diferentes para sembrar ese tipo de muestras. La distribución regional y de hospedadores de las diferentes cepas varía según los autores, pero es evidente que las cepas de tipo bovino están más extendidas y son capaces de infectar a una gran variedad de especies hospedadoras. La patogénesis de la paratuberculosis comienza con la entrada de las bacterias a través del tejido linfoide del intestino delgado (placas de Peyer principalmente) por mediación de las células M epiteliales. Los bacilos son fagocitados por macrófagos, en cuyo interior sobreviven y se multiplican, evitando los mecanismos bactericidas de estas células. Aún no están claros todos los eventos que suceden en la interrelación hospedador-parásito, ni los posibles factores de virulencia de Map. Según los conocimientos actuales, tras la infección se abre un período de dos años o más sin signos de enfermedad, estadios iniciales en los que predomina una respuesta inmune celular (Th1). Según avanza la enfermedad a estadios clínicos, la respuesta inmune va haciéndose más específica e incluye ya un componente humoral con producción de anticuerpos específicos. El cuadro clínico clásico de la paratuberculosis es una diarrea más o menos intermitente según la especie, acompañada de pérdida de peso y condición corporal progresiva, y muerte, pero en estadios subclínicos, los signos son más sutiles y normalmente pasan desapercibidos. Esta enfermedad provoca una enteritis granulomatosa cuyas lesiones más evidentes se localizan en los últimos tramos del intestino delgado y en los nódulos linfáticos asociados. Entre las técnicas de diagnóstico de la paratuberculosis, se pueden diferenciar las histopatológicas que identifican las lesiones tisulares, las etiológicas que detectan la 30 INTRODUCCIÓN GENERAL presencia de la micobacteria (cultivo, PCR,...), y las inmunológicas que tratan de detectar la respuesta inmune específica del hospedador (interferón-γ, intradermorreación, ELISA,...). Los métodos más ampliamente utilizados in vivo son el cultivo fecal y el ELISA, aunque otros como la detección de interferón-γ (IFN- ) van tomando mayor protagonismo ya que trata de identificar animales infectados antes de que presenten sintomatología clínica. No obstante, los métodos actuales más específicos como la histopatología o el ELISA adolecen de falta de sensibilidad precisamente por su ineficacia en la identificación de animales con paratuberculosis subclínica, mientras que los más sensibles como el cultivo, (que es considerado como técnica de referencia pero que es muy lento y costoso), la estimulación de la producción de IFN- o la PCR parecen ser demasiado inespecíficos al menos en términos prácticos de predicción de la enfermedad clínica. En general los tratamientos con fármacos en animales no son ni eficaces ni rentables, por lo que no se recomienda su uso. En el control de esta enfermedad lo más importante es llevar un manejo encaminado a evitar la introducción y la transmisión de la enfermedad en el rebaño, haciendo especial hincapié en la higiene en los partos, la separación de la reposición y de los animales infectados. Las estrategias para erradicar la enfermedad basadas en programas de detección y eliminación de positivos, han fracasado principalmente por la falta de sensibilidad de los métodos de diagnóstico y la mala aplicación de las medidas higiénicas, lo que ha provocado grandes pérdidas. La estrategia de vacunación ha proporcionado resultados satisfactorios en relación con el mantenimiento de la producción y la economía del rebaño, sin embargo no es capaz de eliminar la infección. Actualmente se trabaja en programas que subrayan la caracterización de los factores de riesgo y la concienciación de ganaderos y veterinarios, así como en el estudio de nuevos programas de vacunación. 31 ESCENARIO Y PLANTEAMIENTO DEL TRABAJO DE LA TESIS ESCENARIO Y PLANTEAMIENTO DEL TRABAJO DE LA TESIS Tal y como refleja la revisión bibliográfica, el trabajo de investigación llevado a cabo en torno a la paratuberculosis es muy extenso, y el interés sobre ésta y otras micobacteriosis continúa creciendo. A pesar de este esfuerzo, también quedan reflejadas las dificultades que entraña la búsqueda de soluciones al gran problema que supone la paratuberculosis, camino en el que todavía queda mucho por avanzar. El impacto mundial de esta enfermedad infecciosa en el sector primario es muy importante, como demuestran su amplia distribución y las pérdidas económicas que derivan de la misma. Map, la micobacteria responsable de esta afección crónica típica de los rumiantes, ha sido detectada en infinidad de medios y hospedadores (ya sean transitorios o definitivos), lo que confirma su éxito de diseminación en ecosistemas diferentes, y hace más compleja su epidemiología. Los modelos sobre su patogénesis son poco explicativos, y gran parte del conocimiento sobre este aspecto, está basado en hipótesis aún sin confirmar. Los mecanismos por los que esta bacteria esquiva las defensas del organismo hospedador no están claros, pero sus características fisiológicas parecen estar estrechamente relacionadas con el fallo de la respuesta inmunitaria. Hasta la actualidad no se han realizado suficientes estudios que contemplen un potencial componente genético del hospedador que pueda explicar la resistencia/susceptibilidad al desarrollo de la enfermedad, ni la asociación de ciertos genotipos de Map a determinadas especies o razas hospedadoras. Por el momento, ninguna de las estrategias de control que se han llevado a la práctica ha proporcionado resultados totalmente satisfactorios. Una parte muy importante del fracaso en el entendimiento y el control de esta micobacteriosis, radica precisamente en la dificultad que implica su correcto diagnóstico, en la incapacidad de diferenciar a tiempo animales infectados o portadores de animales libres de la bacteria, en la falta de especificidad y sensibilidad de los métodos empleados. A raíz de la preocupación generada por el hipotético nexo entre Map y la enfermedad de Crohn, la paratuberculosis ha adquirido aún más importancia si cabe. La presencia y el aislamiento de este patógeno en muestras (incluso de sangre) procedentes de pacientes de Crohn con mayor frecuencia que de personas no aquejadas de ese mal, han fortalecido esa idea, y la detección de células viables de Map en vehículos potenciales de transmisión para la especie humana, ha puesto en evidencia la ineficacia de los tratamientos de desinfección que se aplican y la exposición del ser humano a la bacteria. Estas cuestiones obligan a la cautela y a establecer una actitud preventiva para evitar ése contacto. Neiker lleva muchos años trabajando en el diagnóstico de la paratuberculosis y de otras micobacteriosis, durante los que ha adquirido una gran experiencia y conocimiento sobre la enfermedad. Ha trabajado conjuntamente con otros centros nacionales e internacionales de investigación en este campo y ha organizado reuniones y congresos también de nivel nacional e internacional. Conoce la situación de la enfermedad en las explotaciones ganaderas del País Vasco y de otras zonas incluidas en su radio de acción, además de estudiar la fauna silvestre. Aparte de diagnosticar la enfermedad, en Neiker 35 ESCENARIO Y PLANTEAMIENTO DEL TRABAJO DE LA TESIS se ha trabajado en la obtención de indicadores de la prevalencia de la enfermedad, en la mejora de las técnicas de diagnóstico, en la caracterización de la respuesta inmune frente a la infección, y en la creación y evaluación de medidas de control, principalmente la vacunación. OBJETIVOS Como fruto de los conocimientos previamente adquiridos en Neiker y de las inquietudes que estos han generado en la investigación de la paratuberculosis y de su agente etiológico Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, se marcaron una serie de nuevos objetivos: 1. Confirmar la existencia de bacteriemia (o “DNA-hemia”) en el caso de la paratuberculosis y estudiar su potencial para el diagnóstico epidemiológico en comparación con el método ELISA. 2. Desarrollar, validar y aplicar métodos de caracterización genética de aislamientos de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. 3. Evaluar el uso de métodos alternativos al tratamiento térmico para la inactivación de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis en leche destinada al consumo humano. ESTUDIOS LLEVADOS A CABO El presente trabajo aborda varias cuestiones de interés diagnóstico y epidemiológico en las que el nexo es su perspectiva microbiológica convencional o molecular. Éste se ha llevado a cabo mediante cinco estudios diferentes no contemplados en la revisión bibliográfica, por ser el objeto de esta tesis: I. Ramón A. Juste, Joseba M. Garrido, Mariví Geijo, Natalia Elguezabal, Gorka Aduriz, Raquel Atxaerandio, Iker Sevilla. 2005. Comparison of blood polymerase chain reaction and enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection in cattle and sheep. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 17:354–359: Comparación entre la PCR y el ELISA de sangre para la detección de la infección de Map en bovino y ovino. Estudio relacionado con el diagnóstico de la enfermedad en vacas y ovejas, en el que se evalúa la detección de Map en la sangre de los animales y se compara con los resultados de ELISA. 36 ESCENARIO Y PLANTEAMIENTO DEL TRABAJO DE LA TESIS II. Iker Sevilla, Shoor V. Singh, Joseba M. Garrido, Gorka Aduriz, Sara Rodríguez, María V. Geijo, Richard J. Whittington, Vanessa Saunders, Robert H. Whitlock, Ramón A. Juste. 2005. Molecular typing of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis strains from different hosts and regions. Revue Scientifique et Technique (International Office of Epizootics), 24(3):1061-1066: Tipado molecular de cepas de Map procedentes de diferentes hospedadores y regiones. Estudio preliminar de tipado de cepas de Map por medio de IS1311 PCR-REA, para evaluar su utilidad en el estudio de la epidemiología molecular de la paratuberculosis. III. Iker Sevilla, Joseba M. Garrido, Mariví Geijo, Ramón A. Juste. 2006. Pulsed-field gel electrophoresis profile homogeneity of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis isolates from cattle and heterogeneity of those from sheep and goats. BMC Microbiology, 2007, 7:18: Homogeneidad de perfiles de electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) de los aislados bovinos de Map, y heterogeneidad de los de ovejas y cabras. Caracterización exhaustiva de un importante número de aislados de Map por medio de PFGE e IS1311 PCR-REA, para conocer aspectos epidemiológicos de las cepas de paratuberculosis aisladas en varias regiones (principalmente en la Península Ibérica). IV. Iker Sevilla, Martha I. Murcia, Joseba M. Garrido, Douwe Bakker, Maria J. García, Ramón A. Juste. 2006. Detection and pathological implications of the presence of IS900 in human Mycobacterium avium isolates. Preparando su envío a Journal of Clinical Microbiology: Detección e implicaciones patológicas de la presencia de IS900 en aislados humanos de Mycobacterium avium. Estudio en el que se informa de la presencia de la secuencia de inserción IS900 específica de Map en aislados de Mycobacterium avium procedentes de pacientes de SIDA de Colombia, y las consecuentes implicaciones en el diagnóstico y la patología de las técnicas de detección molecular basadas en IS900. V. Tomás López-Pedemonte, Iker Sevilla, Joseba M. Garrido, Gorka Aduriz, Buenaventura Guamis, Ramón A. Juste, Artur X. Roig-Sagués. 2006. Inactivation of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in cow’s milk by means of high hydrostatic pressure at mild temperatures. Applied and Environmental Microbiology, 72(6):4446–4449: Inactivación de Map en leche de vaca por medio de altas presiones hidrostáticas a temperaturas moderadas. Estudio sobre la alternativa del uso de la presión para inactivar Map en la leche, como medida de control en relación con la enfermedad de Crohn, que podría ser aplicado también a otros productos. 37 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA ETIOLOGÍA Género Mycobacterium El agente causal de la paratuberculosis o enfermedad de Johne, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map), es una bacteria perteneciente al género Mycobacterium (Lehmann y Neumann 1896). En ocasiones, las micobacterias presentan un crecimiento filamentoso o pseudomiceliar, y aunque no forman estructuras de tipo fúngico (esporas, conidias, cápsulas, hifas), el género debe su denominación al aspecto fungoide de las colonias de M. tuberculosis. Además de micobacterias patógenas estrictas de los humanos y los animales como M. tuberculosis, M. leprae, M. bovis, M. caprae o Map, también existen micobacterias patógenas oportunistas y micobacterias saprofitas ambientales. M. avium y M. intracellulare son importantes patógenos causantes de diversas enfermedades que también afectan a un amplio rango de hospedadores, entre ellos, el hombre. Estas y otras especies como M. haemophilum, M. kansasii, M. malmoense, M. simiae, M. szulgai, M. xenopi, M. genavense son causantes de infecciones en individuos inmunodeprimidos o inmunocompetentes con predisposición a la infección. M. scrofulaceum provoca linfoadenitis en niños, M. ulcerans es responsable de lesiones graves de la piel, y M. marinum causa el granuloma de estanque. Otras como M. fortuitum y M. abscessus son responsables de infecciones más esporádicas relacionadas con heridas traumáticas o quirúrgicas, e infecciones de piel o de los pulmones (Falkinham III 1996, Rastogi y cols. 2001, Tortoli 2003). Morfología externa Se trata generalmente de bacilos rectos o ligeramente curvados de 1-10 µm de largo y 0,2-0,6 µm de ancho, inmóviles y considerados Gram positivos a pesar de la escasa penetración de colorante por medio de esta técnica. Esto es debido a la presencia de ácidos micólicos en la compleja envoltura celular de que están provistos, gracias a la cual poseen su característica resistencia (Figura 1). Esta envoltura está constituida por tres componentes (Rastogi y cols. 2001): La cápsula, cuya síntesis parece estar controlada por mecanismos reguladores dependientes del huésped en micobacterias patógenas. La pared celular, formada por unión covalente entre peptidoglicano, arabinogalactano y los ácidos 41 Figura 1. Detalle de los componentes de la pared celular de M. tuberculosis: ácidos micólicos, lipoarabinomanano (LAM), peptidoglicano, fosfatidil-inositolmanósido (PIM),… [http://oregonstate.edu/~mahmudt/pictures/ Mycobacterium%20cell%20envelope.jpg] ETIOLOGÍA micólicos. Y por último, la membrana citoplasmática, cuya composición es similar a la de otras bacterias. El lipoarabinomanano es un fosfolípido unido a la membrana que atraviesa toda la envoltura celular y cuya composición difiere entre las distintas especies micobacterianas (Daffe y cols. 1998). Metabolismo Las micobacterias son microorganismos aerobios o microaerófilos, quimioorganotrofos, y su temperatura óptima de crecimiento se sitúa entre 30 y 45ºC (Wayne y cols. 1986, Levy-Frebault y cols. 1992). Utilizan glicerol o piruvato como fuente de carbono y energía, y como fuente de nitrógeno pueden utilizar asparagina, glutamato y amonio (Goodfellow y cols. 1998). Son prototrofas para todos los aminoácidos, purinas, pirimidinas y vitaminas del complejo B. Producen exoquelina y micobactina, dos sideróforos necesarios para metabolizar el hierro. Los medios sólidos de cultivo en los que son aisladas son con base de huevo (Herrold, Löwenstein-Jensen, Stonebrink, Petragnani, Coletsos, Ogawa kudoh,...) o con base sintética (Middlebrook 7H10 o 7H11). También crecen en medios líquidos como Middlebrook 7H9, Watson-Reid, Dubos, Sula, Sauton, o Proskauer-Beck. Dependiendo de la especie que se pretenda cultivar se puede suplementar los medios con micobactina, hemina, ácido oleico, albúmina, dextrosa, catalasa u otras sustancias (Goodfellow y cols. 1998). A pesar de ello, la aplicación de métodos convencionales de microbiología resulta dificultosa, debido a su lentitud de crecimiento y a su tendencia a formar grumos o a crecer mal en suspensión (Juste y cols. 2000). Composición genética El genoma micobacteriano es rico en guanina (G) y citosina (C) (61-71%) (LevyFrebault y cols. 1992). Se conoce la secuencia completa de dos cepas de M. tuberculosis (Cole y cols. 1998, Fleischmann y cols. 2002), y las de M. leprae (Eiglmeier y cols. 2001, Cole y cols. 2001), M. bovis (Garnier y cols. 2003) y Map (Li y cols. 2005) (Tabla 1). Contiene secuencias de inserción (IS), elementos que han resultado muy útiles en la identificación y diferenciación de especies. Estos pequeños tramos de DNA transponible que pueden encontrarse varias veces repetidas a lo largo del genoma, tienen en sus extremos secuencias flanqueantes repetidas que están involucradas en su transposición. En medio de esas secuencias terminales repetidas hay genes involucrados en la transposición y secuencias que pueden controlar la expresión de los genes, pero no presentan otros genes que no sean esenciales (Mayer 2005). Las de mayor interés en medicina son IS6110 (Thierry y cols. 1990), IS1081 (Collins y cols. 1991), IS1245 (Guerrero y cols. 1995), IS1547 (Fang y cols. 1999), IS1311 (Guerrero y cols. 1994), IS900 (Green y cols. 1989), IS901 (Kunze y cols. 1991), IS902 (Moss y cols. 1992a) y ISMav2 (Strommenger y cols. 2001). 42 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA Tabla 1. Características de los genomas de Map, M. avium, M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae, y M. smegmatis (Li y cols. 2005). Organismo Tamaño genoma (bp) Contenido G+C (%) Codifican proteínas (%) ORFs Densidad génica (bp/gen) Longitud génica media (bp) tRNAs Operones rRNA Map 4.829.781 69,30 91,30 4.350 1.112 1.015 45 1 M. avium 5.475.738 68,99 NA NA NA NA 45 1 M. tuberculosis 4.411.532 65,61 90,80 3.959 1.114 1.012 45 1 M. bovis 4.345.492 65,63 90,59 3.953 1.099 995 45 1 M. leprae 3.268.203 57,79 49,50 1.604 2.037 1.011 45 1 M. smegmatis 6.988.209 67,40 92,42 6.897 1.013 936 47 2 Aunque no se conoce bien su importancia biológica, en muchas especies micobacterianas (M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. fortuitum, M. peregrinum, M. abscessus, M. chelonae, M. xenopi, M. celatum, M. branderi) pueden encontrarse comúnmente plásmidos, de forma notable en M. avium, pero en otras como M. tuberculosis o Map no es así (Crawford y cols. 1981, Erardi y cols. 1987, Jensen y cols. 1989, Jucker y cols. 1990, Dale 1995, Picardeau y cols. 1997). A pesar de ello, se han podido demostrar ejemplos de transferencia genética lateral en Map (Marri y cols. 2006), tal y como ocurre en la mayoría de bacterias. Clasificación taxonómica En cuanto a la clasificación taxonómica de las micobacterias, el género es el único representante de la familia Mycobacteriaceae, que se integra en el suborden Corynebacterinae, orden Actinomycetales, subclase Actinobacteridae, clase Actinobacteria, división Firmacutes, y superreino Bacteria (Stackebrandt y cols. 1997). Durante años, los estándares mínimos para la inclusión en este género han sido resistencia al alcohol ácido, un rango del 61-71% de contenido G+C en el DNA cromosómico, y la presencia de ácidos micólicos que son degradados por pirolisis a metil-ésteres de ácidos grasos de C22 a C26 (Levy-Frebault y cols. 1992). Las recomendaciones actuales para la descripción de nuevos taxones micobacterianos incluyen varias pruebas (Tortoli 2003): - Pruebas de cultivo: temperatura de crecimiento, velocidad de crecimiento, tipo de pigmentación, morfología de colonias, y para los organismos de crecimiento rápido, tolerancia a NaCl y crecimiento en MacConkey. - Pruebas bioquímicas: arilsulfatasa de 3 días, reducción de nitrato, hidrólisis de Tween 80, hidrólisis de urea, catalasa a 68ºC, y catalasa semicuantitativa como más utilizados, pero sin restar importancia al análisis lipídico por medio de cromatografía de capa fina (TLC), cromatografía gas-líquido (GLC) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). - Pruebas genéticas: hibridación DNA-DNA (en desuso), y secuenciación del gen 16S rRNA completo, o de al menos las primeras 500 bp. En los últimos 50 años han sido propuestos muchos agrupamientos y modelos para la clasificación de agentes micobacterianos atendiendo a propiedades de crecimiento, 43 ETIOLOGÍA bioquímicas y moleculares (Shinnick y cols. 1994, Wayne y cols. 1996, Falkinham III 1996, Rastogi y cols. 2001, Tortoli 2003). No obstante el esquema basado en características de crecimiento y pigmentación propuesto por el grupo de Runyon (Timpe y cols. 1954, Runyon 1959), sigue vigente en la actualidad, principalmente debido a la concordancia generalizada de éste con los modelos genotípicos. Figura 2. Árbol filogenético de las micobacterias de crecimiento lento. No se incluyen las especies M. visibilis ni M. lepraemurium, de las cuales sólo se conoce parte de la secuencia del 16S rDNA. sqv., secuevar; MSR, relacionados con M. simiae; MTR, relacionados con M. terrae; SG, de crecimiento lento (Tortoli 2003). De este modo, han sido descritos dos grandes grupos de micobacterias: las de crecimiento rápido, que forman colonias claramente visibles en menos de 7 días, y las de crecimiento lento, que precisan más de 7 días para conseguirlo (Wayne y cols. 1986, Stahl y cols. 1990, Shinnick y cols. 1994). Las especies patógenas más importantes, tanto para el humano como para los animales, se encuentran entre las de crecimiento lento. Es el caso de las especies responsables de tuberculosis, lepra, linfadenitis cervical juvenil, infecciones oportunistas en pacientes inmunodeprimidos, y otras enfermedades relacionadas (Stahl y cols. 1990, Shinnick y cols. 1994). Sin embargo, la infección con micobacterias de crecimiento rápido, también ha sido descrita en la especie humana (Griffith y cols. 1993, Tortoli 2003, Freudenberger y cols. 2006) así como en especies animales (Green y cols. 2000, Malik y cols. 2000, Tortoli 2003, Malik y cols. 2004). En 44 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA la mayoría de casos M. fortuitum, M. chelonae y M. abscessus son los agentes oportunistas implicados. Este tipo de infecciones están frecuentemente relacionadas con heridas postraumáticas y/o postoperatorias, además de las asociadas a enfermedades pulmonares crónicas e infecciones cutáneas en personas inmunodeprimidas (Falkinham III 1996). Otra clasificación basada en la importancia en medicina humana es la que distingue entre el grupo de micobacterias del complejo M. tuberculosis (MTC: M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. microti y M. caprae) y las micobacterias no tuberculosas, atípicas o distintas de la tuberculosis (NTM ó MOTT) (Inderlied y cols. 1993, Falkinham III 1996, Rastogi y cols. 2001). Actualmente, el abordaje taxonómico y filogenético más ampliamente aceptado es el de la secuenciación del gen que codifica el 16S rRNA (Bercovier y cols. 1986, Boddinghaus y cols. 1990, Rogall y cols. 1990, Kirschner y cols. 1993, Turenne y cols. 2001), centrado en dos secuencias hipervariables conocidas como regiones A y B. Como resultado del análisis de todas las secuencias de 16S rDNA descritas en el género Mycobacterium, Tortoli obtuvo un árbol filogenético que clasifica las cerca de 100 especies conocidas en 5 grandes grupos (Tortoli 2003) (Figuras 2 y 3). Además, también ha sido propuesta la clasificación del género en 4 grupos, dependiendo del número de operones ribosómicos por genoma y de la longitud de la hélice 18 del 16S rDNA (Menendez y cols. 2002). Sin embargo, la concordancia entre estos grupos y los caracterizados en base a su velocidad de crecimiento no es total. Identificación Debido a la similitud entre especies, la identificación de miembros del género es a veces dificultosa, a lo que se suma la incapacidad de los métodos microbiológicos clásicos. Los avances en métodos moleculares están facilitando este proceso, algo que resulta imprescindible a la hora de intentar controlar las infecciones causadas por estos microorganismos. Los eventos evolutivos de los organismos quedan impresos en las secuencias del rRNA. El análisis de estas secuencias, forma la base para la identificación de los microorganismos (Kirschner y cols. 1998). La secuenciación de ciertas regiones del 16S rDNA permite identificar con fiabilidad la especie a la que pertenece una bacteria en particular. Sin embargo, existen entre las micobacterias excepciones como M. kansasii y M. gastri cuya secuencia es idéntica, a pesar de ser fenotípicamente diferentes (Kirschner y cols. 1998, Soini y cols. 2001). Wilton y cols. describieron un método de PCR por el que se puede determinar si un aislado pertenece al género Mycobacterium e identificar la especie concreta simultáneamente (Wilton y cols. 1992). Se basa en la amplificación de regiones conservadas y variables del 16S rDNA, método que en combinación con la amplificación del gen que codifica para la proteína MPB70 45 ETIOLOGÍA (específica del MTC) permite la identificación de micobacterias clínicamente importantes en una sola PCR. Este gen ribosómico también ha resultado de utilidad por medio de análisis de restricción con endonucleasas de los productos de PCR (PCR-REA o PRA) (Thierry y cols. 1990). Figura 3. Árbol filogenético de las micobacterias de crecimiento rápido. sqv., secuevar; TTRG, termotolerantes de crecimiento rápido; RG, de crecimiento rápido (Tortoli 2003). Otra posibilidad con el material genético ribosómico, es la secuenciación de la región intergénica 16S-23S (ITS-1), zona muy variable aun entre grupos taxonómicos relacionados (Gurtler y cols. 1996). Mediante esta técnica es posible diferenciar varios taxones intra-especie (secuevares) en función de las distintas secuencias que se obtienen 46 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA de esa región (De Smet y cols. 1995). Esta zona es de gran variabilidad entre las micobacterias de crecimiento lento (Roth y cols. 1998). Los resultados obtenidos dentro del complejo M. avium-intracellulare han sido satisfactorios (Frothingham y cols. 1994), y se han descrito 7 secuevares de M. avium (de Mav-A a Mav-G), y 35 secuevares en total dentro del complejo (De Smet y cols. 1995, Novi y cols. 2000, Mijs y cols. 2002, Tortoli y cols. 2004, Lebrun y cols. 2005, Murcia y cols. 2006). Se ha observado una fuerte asociación entre M. avium secuevar Mav-B, con SIDA y con linfoadenitis en niños (De Smet y cols. 1995), aunque en pacientes HIV positivos de países como Colombia no parece que esa distribución sea tan clara (Murcia 2004). La restricción por endonucleasas de amplificados de esta región ha sido también objeto de estudio (Dvorska y cols. 2001). Existe un kit comercial renovado llamado INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 (Innogenetics) que se basa en la detección de esos secuevares por hibridación inversa (Tortoli y cols. 2003). La secuenciación y/o PCR-REA de los genes recA (asociado a reparación del DNA) y rpoB (codificante para la RNA polimerasa) ha resultado de utilidad en la identificación de M. leprae, M. aurum, M. mucogenicum, M. kansasii, M. gastri, M. xenopi, M. asiaticum, M. shimoidei, M. gordonae, M. celatum, M. fortuitum y miembros del MTC (Dvorska y cols. 2001). La caracterización del gen que codifica la proteína de choque térmico de 65 kDa (hsp65) también ha sido utilizada a la hora de identificar y diferenciar especies y subespecies de micobacterias, ya sea por medio de análisis de restricción de amplificados o de secuenciación (Telenti y cols. 1993, Swanson y cols. 1997, Devallois y cols. 1997, Ringuet y cols. 1999, Leao y cols. 1999, Oliveira y cols. 2000, Leclerc y cols. 2000, Smole y cols. 2002, Oliveira y cols. 2003, McNabb y cols. 2004, Murcia y cols. 2004, Cavusoglu y cols. 2005, Turenne y cols. 2006). Los mismos métodos han dado resultados parecidos al ser aplicados al gen dnaJ, que codifica para una proteína de choque de frío (Dvorska y cols. 2001). Algunos genes relacionados con la resistencia-sensibilidad de las micobacterias a ciertas drogas y medicamentos (katG, pncA, oxyR, ahpC) también han sido utilizados para diferenciar cepas, principalmente del MTC (Dvorska y cols. 2001). Otra posibilidad en la identificación de aislados de interés clínico (MTC, M. aviumintracellulare, M. kansasii, M. gordonae) es la utilización de sondas comerciales AccuProbe (GenProbe) (Reisner y cols. 1994, Devallois y cols. 1997, Hall y cols. 2004), en las que sondas quimioluminiscentes de DNA de cadena simple hibridan con RNA de la especie problema. Su inconveniente principal es su elevado coste (Soini y cols. 2001). Como ya se ha indicado anteriormente, las secuencias de inserción también han demostrado su validez a la hora de identificar especies, por medio de la amplificación de un fragmento por PCR (Dvorska y cols. 2001). Otros genes o secuencias específicas 47 ETIOLOGÍA de especie o subespecie también son utilizados en la identificación de algunas micobacterias, como en el caso del gen mtp40 exclusivo de M. tuberculosis y la región JB21-JB22 de M. bovis, o PCR-REA del gen gyrB del MTC (Dvorska y cols. 2001). Una buena manera de determinar la especie o subespecie es hacer varias PCRs que amplifiquen fragmentos del 16S rDNA, secuencias de inserción (IS901, IS1245, IS900,...) y genes específicos (hspX), como el panel de PCRs descrito por Ellingson y cols. (Ellingson y cols. 2000). Tipado molecular El tipado molecular de los microorganismos tiene por objeto determinar la relación entre aislamientos de un mismo grupo, saber si proceden del mismo foco, cómo circula en el ecosistema, y cómo es transmitido, en definitiva, estudiar parte de su epidemiología. En micobacteriología, el tipado de cepas por métodos basados en la detección de secuencias de inserción ha sido de gran ayuda. El análisis de polimorfismos en la longitud de fragmentos de restricción (RFLP) cortados con diferentes endonucleasas, y detectados con diferentes sondas, es el método más extendido y estandarizado. Existen protocolos estándares para el tipado de miembros del MTC (IS6110-RFLP) (Thierry y cols. 1990, Van Embden y cols. 1993), algunos del complejo M. avium (IS1245-RFLP, IS1311-RFLP, IS901-RFLP) (Roiz y cols. 1995, van Soolingen y cols. 1998, Dvorska y cols. 2003), y Map (IS900-RFLP) (Pavlik y cols. 1999a). En el caso del IS6110-RFLP, la técnica no se puede aplicar a todas las cepas de ese complejo, pues hay algunas que no poseen ninguna copia de la misma (Cave y cols. 1991, Agasino y cols. 1998). Según Kremer y cols. (Kremer y cols. 2002) esta técnica junto con la PCR “mixed-linker” relacionada con esta misma secuencia, poseen el mayor poder discriminatorio cuando se trata de cepas con muchas copias de IS6110. Cuando son menos copias por genoma, puede obtenerse un resultado mejor por medio de otras técnicas. En el caso de Map, fue diseñada posteriormente la PCR múltiple de los loci de IS900 (MPIL), que daba resultados parecidos a los del RFLP (Bull y cols. 2000). Una de las técnicas más populares que se ha desarrollado es el espoligotipado (Groenen y cols. 1993), que se basa en polimorfismos en un locus cromosómico caracterizado por su elevado número de repeticiones directas (DR) conservadas. Mediante este método han sido tipadas cepas de M. tuberculosis, M. bovis, M. caprae, M. microti y M. canetti (Dvorska y cols. 2001). Recientemente, ha sido demostrada la utilidad de otro método denominado “unidades repetitivas intercaladas micobacterianas-repeticiones en tándem de número variable” (MIRU-VNTR), en estudios de tipado de cepas de M. tuberculosis y M. bovis (Supply y cols. 2006, Allix y cols. 2006). Está basado en la variabilidad del número de repeticiones en tándem que al mismo tiempo conforman lo que se conoce como 48 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA unidades intergénicas micobacterianas (Supply y cols. 1997, Frothingham y cols. 1998). Estos son similares a los minisatélites de las células eucariotas (Supply y cols. 1997). En el caso de MTC, se trata de amplificar y determinar por el tamaño el número de copias en tándem en 12 loci polimórficos conocidos que se encuentran presentes en todas las cepas (Supply y cols. 2000, Mazars y cols. 2001). Este método también ha sido empleado con Map y M. avium (Bull y cols. 2003b), especies en las que se han detectado 18 loci conservados, de los cuales 6 son diferentes para las dos especies. Por este método las cepas de Map y las de M. avium se diferenciaban en 2 y 5 grandes grupos respectivamente. Overduin y cols. consiguieron subdividir el grupo de IS900RFLP mayoritario de Map en 6 subgrupos, por medio de análisis multilocus-VNTR (MLVA) (Overduin y cols. 2004). Sin embargo, 17 tipos diferentes de RFLP compartían un mismo tipo de MLVA. Con este método, detectaron diferencias en el número de repeticiones en tándem, así como mutaciones en las secuencias de esas unidades y en las regiones que las flanquean. También se ha usado recientemente en el tipado de aislados de M. ulcerans (Ablordey y cols. 2005). Por un método muy similar de amplificación y secuenciación de zonas repetitivas en busca de polimorfismos, ha sido descrito el análisis de repeticiones multilocus de secuencia corta (MLSSR) para el tipado de Map (Amonsin y cols. 2004), y posteriormente se ha reducido al análisis de los loci con mayor poder de discriminación (Motiwala y cols. 2003, Motiwala y cols. 2004, Ghadiali y cols. 2004, Motiwala y cols. 2005, Corn y cols. 2005). En la puesta a punto, se detectaron 78 repeticiones perfectas de las que 11 polimórficas fueron seleccionadas, con 3,2 posibles alelos por locus. Según el índice de Simpson calculado (Amonsin y cols. 2004), este es el método con mayor poder de discriminación para el tipado de cepas de Map, por encima del IS900-RFLP, el MPIL y el análisis de polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados (AFLP). A pesar de ello, su fiabilidad deberá ser probada comparando sus resultados con los del resto de técnicas en un número representativo de cepas y de orígenes. Otra técnica utilizada frecuentemente en el tipado de micobacterias, es el análisis de DNA polimórfico aleatoriamente amplificado (RAPD) (Mazurier y cols. 1992). Su ventaja es que se basa en la amplificación arbitraria de fragmentos de DNA no determinados previamente, por lo que no es necesario conocer bien el genoma de las bacterias. Ha sido de utilidad en el tipado de M. tuberculosis (Linton y cols. 1994) y otras especies como M. avium (Matsiota-Bernard y cols. 1997, Matsiota-Bernard y cols. 2000, Pillai y cols. 2001), M. abscessus, M. chelonae (Zhang y cols. 1997), M. szulgai (Zhang y cols. 2002) y M. malmoense (Kauppinen y cols. 1994). No obstante, puede resultar poco reproducible, y en el caso de Map no aporta información adicional (Pillai y cols. 2001). Otra posibilidad muy extendida en el tipado de micobacterias es la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE). Se extrae todo el DNA genómico del aislamiento dentro de bloques de agarosa, se digiere con un enzima de restricción, y los fragmentos 49 ETIOLOGÍA resultantes se separan en un gel de agarosa por medio de pulsos eléctricos alternos en tiempo y dirección. Esto permite separar fragmentos de gran tamaño, y se puede realizar con diferentes enzimas sobre la misma cepa, con lo que se obtienen perfiles con patrones múltiples. Ha sido aplicado con éxito en el tipado de M. fortuitum (Burns y cols. 1991), M. tuberculosis (Zhang y cols. 1992, Singh y cols. 1999), M. avium, M. intracellulare (Levy-Frebault y cols. 1989, Coffin y cols. 1992, Mazurek y cols. 1993, Feizabadi y cols. 1997a), M. chelonae, M. abscessus (Wallace, Jr. y cols. 1993), M. haemophilum (Yakrus y cols. 1994), M. bovis (Feizabadi y cols. 1996), M. kansasii (Iinuma y cols. 1997) y Map (Stevenson y cols. 2002, de Juan y cols. 2005). La reproducibilidad es muy buena y sus resultados son muy consistentes ya que explora el genoma completo. Gracias al PFGE fueron demostradas infecciones policlonales de M. avium en pacientes de SIDA (Arbeit y cols. 1993, Slutsky y cols. 1994). Para emplear este método es necesario contar con cultivos puros de calidad y cantidad, lo que se complica en el caso de algunas micobacterias. El inconveniente principal es su elevado coste, tanto en material y reactivos, como en tiempo y mano de obra. Complejo M. avium Un importante grupo entre las micobacterias de crecimiento lento es el complejo M. avium o MAC (complejo M. avium-intracellulare o MAIC, para algunos), donde se incluye Map. Todos los componentes del complejo son de crecimiento lento, y pertenecen al grupo NTM (Inderlied y cols. 1993). En la actualidad, se acepta que MAC está compuesto de las especies M. avium y M. intracellulare, aunque una importante proporción de las cepas incluidas en el complejo no pueda ser clasificada en ninguna de las dos (Wayne y cols. 1993, Frothingham y cols. 1994), y se han denominado como “otras MAC” (Smole y cols. 2002). Entre estas “otras MAC” han sido recientemente elevadas a nivel de especie M. chimaera (Tortoli y cols. 2004) y M. colombiense (Murcia y cols. 2006). M. avium es responsable de cerca del 90% de las infecciones por MAC en pacientes infectados por el HIV, y provoca infecciones en animales (muy importantes en aves) (Thorel y cols. 1990, Falkinham III 1996, Pavlik y cols. 2005). M. intracellulare se asocia con infecciones pulmonares menos patógenas que las producidas por M. avium, y se aísla más frecuentemente de enfermos no afectados por el SIDA (Yamori y cols. 1992, Falkinham III 1996). También infecta animales, a veces de manera persistente, pero normalmente la infección no desencadena enfermedad clínica, y sólo se detecta en la necropsia (Thorel y cols. 2001). M. chimaera ha sido únicamente aislado de humanos con infecciones pulmonares no infectados por el HIV, y su denominación se debe a que comparte características de las dos especies principales del complejo (Tortoli y cols. 2004). Se diferencia de éstas en base a su HPLC, pues los secuevares de 16s rDNA y de ITS-1 se corresponden con secuevares incluidos en alguna de esas dos especies. Por último, M. colombiense ha sido aislada en pocas ocasiones de sangre (o esputos) de 50 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA pacientes colombianos infectados por el HIV (Murcia y cols. 2006). Produce ureasa, a diferencia del resto de miembros de MAC. También se diferencia del resto por su HPLC, su secuevar de ITS-1, su secuevar de 16s rDNA, y por medio de hibridación DNA-DNA. Historia En la primera descripción de la enfermedad de la paratuberculosis (Johne y cols. 1895), el agente fue caracterizado como una micobacteria de tipo aviar. Posteriormente, debido a las particularidades de la afección, pasó a considerarse como una enteritis pseudotuberculosa bovina, y la bacteria, una entidad diferenciada de la de tipo aviar y designada Mycobacterium enteriditis chronicae pseudotuberculosae bovis (Twort y cols. 1912). Más tarde, el microorganismo recibió la denominación de M. paratuberculosis (Bergey y cols. 1923) y M. johnei (Francis 1943), nombres que actualmente aún son utilizados. En general, la identificación de las micobacterias es dificultosa, y el desacuerdo surgido a la hora de determinar si Map es una especie independiente de M. avium o no, provocó una gran polémica en torno a su nomenclatura y situación taxonómica (Juste y cols. 2000). Las peculiaridades fenotípicas de la bacteria hicieron que ésta fuese contemplada como un agente diferente de la micobacteria aviar durante largo tiempo, hasta que la alta homología genética detectada entre estas dos entidades y las llamadas micobacterias de la paloma torcaz (Saxegaard y cols. 1988), reabriera el debate al sugerir que se trataba de la misma especie. Los resultados de ese estudio concluían en la recomendación de clasificar los tres agentes como subespecies diferentes dentro del mismo complejo. Finalmente, en 1990, Thorel y cols. propusieron la taxonomía oficialmente aceptada en la actualidad, apoyándose en los estudios previos de caracterización genética y fenotípica, y en su exhaustivo trabajo de taxonomía numérica (Thorel y cols. 1990). De este modo, M. avium quedaba dividido en las subespecies M. avium subsp. avium (Maa), Map y M. avium subsp. silvaticum (Mas), garantizando así la representación de la homología observada entre ellas, pero sin olvidar las propiedades distintivas de cada una. Dejando a un lado las características comunes a las 3 subespecies, las diferencias más marcadas son las relativas a sus requerimientos de cultivo, su poder patógeno y su rango de hospedadores (Thorel y cols. 1990). Maa se aísla frecuentemente de muestras ambientales y crece sin necesidad de micobactina. Es la responsable de tuberculosis en aves, puede causar infección a un amplio espectro de animales, y en humanos las principales patologías son infección pulmonar en adultos, adenopatías submandibulares en niños y septicemia en pacientes de sida. La cepa tipo es la ATCC 25291 ó CIP 104244. El distintivo más práctico de Map es su dependencia de micobactina para crecer in vitro y su extremadamente baja velocidad de crecimiento. Es patógena obligada, afecta principalmente a rumiantes causándoles enteritis crónica 51 ETIOLOGÍA (paratuberculosis) y parece estar implicada en la enfermedad de Crohn. La cepa tipo es la ATCC 19698 ó CIP 103963. En Mas destaca su incapacidad de propagación en medios de cultivo con base de huevo, la estimulación de crecimiento inducida por un pH 5,5 y su independencia de micobactina (excepto en el aislamiento primario, según distintos autores). Es también patógena obligada, provocando tuberculosis en aves y paratuberculosis en mamíferos (Thorel y cols. 1990). Recientemente, se ha planteado distinguir taxonómicamente las cepas de Maa halladas en humanos y otros mamíferos como el cerdo, de las cepas de Maa típicamente responsables de la tuberculosis aviar (Mijs y cols. 2002), sustentándose en diferencias genéticas y fenotípicas. Se propone mantener la designación de Maa para las cepas típicas aisladas de aves, y llamar a las de origen humano-porcino M. avium subsp. hominissuis (Mah). Según Mijs y cols. además de la preferencia por el hospedador, las características distintivas de Maa serían un IS1245-RFLP típico de 3 bandas (8.7, 3.2, 2.9 kbp), ser tipo Mav-A en ITS-1 (C en la posición 228), poseer 7-11 copias de IS901, y la incapacidad de crecer a 24 y 45 ºC. Mientras que las características de Mah serían patrones polimórficos en IS1245-RFLP con múltiples copias de la IS, predominancia del secuevar Mav-B (G en la posición 228) en la ITS-1, ausencia casi siempre de la IS901, y capacidad de crecer tanto a 24 como a 45 ºC. Parece estar ya ampliamente aceptado el nombre de Mah para designar las cepas humano-porcinas (Mobius y cols. 2006, Bartos y cols. 2006), sin embargo, la descripción de cepas de M. avium que no encajan completamente en esas definiciones (Pavlik y cols. 2000e, Murcia 2004), mantiene abierta la posibilidad de más cambios, a medida que se vayan descubriendo nuevos agrupamientos. El grupo de Pavlik y cols. además de usar el serotipado, distinguen los miembros de MAC por métodos moleculares: Maa da positivo en IS901PCR y IS1245-PCR, y negativo en FR300-PCR (secuencia flanqueante de IS901; aquí negativo es cuando se obtiene una banda de 1742 bp), Mah en cambio no posee IS901, y es positivo en IS1245-PCR y FR300-PCR (Pavlik y cols. 2005, Bartos y cols. 2006). Para añadir mayor controversia a este asunto, se ha descubierto recientemente que 2 de las 3 bandas del patrón de IS1245-RFLP típico de las cepas aviares se debe a la hibridación inespecífica de la sonda utilizada con copias de la IS1311 (Johansen y cols. 2005). Además, los resultados de un detallado estudio en el que son caracterizadas (ITS1, IS901, hsp65, RFLP) varias cepas de M. avium, sugieren que Maa y Mas son diferentes cepas de una misma entidad y que su diferenciación en subespecies puede no estar suficientemente justificada (Turenne y cols. 2006). Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Morfología y metabolismo El agente causal de la paratuberculosis (Figura 4) es un bacilo de 1-2 µm de longitud por 0,5 µm de anchura, que normalmente forma colonias rugosas. 52 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA Generalmente presenta una tinción homogénea con los métodos de tinción y decoloración con alcohol ácido (como el de Ziehl-Neelsen), aunque en el caso de formas de pared deficiente o inexistente (McGee y cols. 1971, Imaeda 1984, Chiodini y cols. 1986b) y en formas más largas (Wayne y cols. 1986) no sea así. Estas células de pared deficiente o esferoplastos parecen tener gran importancia en la patogénesis de la paratuberculosis (García Marín y cols. 1992a, Hulten y cols. 2000c, Hines y cols. 2003), y probablemente en la enfermedad de Crohn (Hulten y cols. 2000b, Hulten y cols. 2001). Tal y como puede observarse en extensiones de heces y tejidos, los bacilos tienden a agruparse en grumos, supuestamente debido a la disposición que adoptan al replicarse dentro de los macrófagos que infectan (Thoen y cols. 1979). La mayoría de las cepas son no fotocromógenas y el crecimiento de algunas se estimula con piruvato. Carece de fosfatasa alcalina y es resistente a la D-cicloserina y la ansamicina. Los requerimientos nutricionales para el cultivo de Map son similares a los del resto de micobacterias. Aunque generalmente no necesiten factores de crecimiento, algunos componentes como detergentes, Figura 4. Micrografía de triglicéridos, ácidos palmítico y oleico, albúmina sérica Map obtenida con bovina, yema de huevo o dióxido de carbono, pueden microscopio electrónico de barrido en la Universidad potenciarlo. La fuente de carbono más utilizada de Wisconsin (MT Collins). tradicionalmente es el glicerol, aunque el piruvato puede ser el elegido en algunas circunstancias. Pueden también utilizar hidrocarburos, especialmente alcanos (excepto metano), y los ácidos grasos derivados, así como alcoholes, cetonas, y ácidos mono-, di- o tricarboxílicos. La asparagina es la fuente de nitrógeno preferida, sin embargo, ésta puede ser sustituida por glutamina, glutamato, ácido aspártico, o sales de amonio. Entre los minerales, los macroelementos que requieren en grandes cantidades son potasio, magnesio, azufre y fósforo. Mientras, los microelementos y oligoelementos que cabe destacar son hierro, zinc, manganeso, y molibdeno, muchas veces añadidos al medio como impurezas (Ratledge 1982). La micobactina Tal y como se ha comentado anteriormente, existe un ingrediente que ha sido considerado factor de crecimiento en el aislamiento de Map (Twort y cols. 1913, Francis y cols. 1949, Snow 1970): la micobactina. Las micobactinas son un grupo de compuestos estrechamente relacionados entre ellos y asociados a la célula, que producen las micobacterias en condiciones limitantes de hierro, para poder transportar el metal al interior de la célula (Snow 1965, Snow y cols. 1969). Está demostrado que Map puede crecer perfectamente sin aporte exógeno de micobactina si el medio contiene suficiente hierro y otros nutrientes disponibles (Merkal y cols. 1974, Juste y cols. 1993), y que además tiene la facultad de sintetizar el sideróforo (Merkal y cols. 1982a, Barclay 53 ETIOLOGÍA y cols. 1985). Por lo tanto, la incapacidad de crecer sin micobactina añadida que muestran algunas micobacterias (Map, ciertas cepas de M. avium, y algunas especies no patógenas), no residiría en la imposibilidad real de ser sintetizada, sino en la represión de su producción, o en la presencia de sustancias quelantes en el medio (Merkal y cols. 1974). Existen cepas de campo de paratuberculosis que son aisladas incluso con mayor facilidad en medios sintéticos sin micobactina añadida (Aduriz y cols. 1995a, Motiwala y cols. 2004), y otras de las que se ha comprobado su independencia tras sucesivos subcultivos (Morrison 1965, Merkal y cols. 1974, Pavlas 1990, Lambrecht y cols. 1992). Mientras algunos autores achacaban la pérdida de tal dependencia en los casos de pases sucesivos a la estimulación inducida por pH ácido (5,5) o a la formación de compuestos promotores del crecimiento tras el autoclavado del medio (Morrison 1965), otros han afirmado que se debe a que el compuesto es transportado en la propia pared bacteriana desde el medio del cultivo primario a los siguientes (Lambrecht y cols. 1992). Sin embargo, la cepa de referencia de Map ATCC 19698 crece bien en el medio líquido Middlebrook 7H9 sin micobactina suplementado con oleico-albúmina-dextrosacatalasa (OADC) (Aduriz 1993) y en subcultivos posteriores en el mismo medio, lo que descartaría esta última justificación, al menos en ciertos casos. Al comparar el grupo de genes que controlan la síntesis de la micobactina en M. tuberculosis (Quadri y cols. 1998), M. avium y la cepa K10 de Map, sólo se ha detectado una diferencia en un gen (mbtA) supuestamente iniciador del proceso, que podría encontrarse atenuado en Map (Li y cols. 2005), pero no ha sido probado aún. Al margen de todas estas observaciones, la adición de micobactina es muy eficaz a la hora de identificar el agente en medios a base de huevo como son el de Herrold (HEY) o el de Lowënstein-Jensen (LJ), resultando de gran utilidad a la hora de descartar otro tipo de micobacterias en estos medios, que por otro lado han demostrado ser muy sensibles para el aislamiento primario de ciertas cepas (Juste y cols. 1991b). Aparte de las micobactinas, las exoquelinas son imprescindibles en la captación de hierro de las micobacterias, y su estudio está posibilitando la comprensión del metabolismo férrico micobacteriano (Macham y cols. 1975, Barclay y cols. 1988, Ratledge y cols. 1996, Gobin y cols. 1996, Matzanke y cols. 1997, Ratledge 2004). Además, Homuth y cols. descubrieron una reductasa extracelular de Map capaz de movilizar hierro a partir de citrato férrico de amonio, ferritina y transferrina, que podría suponer una alternativa para la captación de hierro (Homuth y cols. 1998). Incluso se propuso que esta reductasa podría tener un papel importante en la evasión de los mecanismos de defensa intracelulares de los macrófagos que infecta Map. Los medios de cultivo Los medios de cultivo aptos para Map son los mencionados anteriormente para el resto de micobacterias, con la salvedad de la adición de micobactina exógena. De todos 54 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA modos, los más ampliamente extendidos son el HEY y el LJ enriquecidos con micobactina, y distintas variantes de los de Middlebrook (7H11, 7H9,...) con OADC y micobactina. En medios sólidos, las colonias aparecen normalmente pequeñas, firmes, convexas, húmedas y de color blanco-crema (menos firmes y más blancas cuando comienzan a aparecer) (Merkal y cols. 1974). Pero algunas cepas pueden presentar colonias más lisas, suaves, y brillantes, coloreadas de un pigmento amarillo anaranjado (Benazzi y cols. 1996, Stevenson y cols. 2002). La aparición de colonias puede tardar entre 3 semanas y un año (Taylor 1951, Merkal y cols. 1974, Wayne y cols. 1986, Whittington y cols. 2001d), aunque el crecimiento puede ser perceptible en un par de semanas en medios líquidos (Collins y cols. 1990b). Resistencia y persistencia En comparación con otras bacterias, incluidas el resto de micobacterias, Map se caracteriza por su extremadamente baja actividad metabólica, lo que conlleva una velocidad de crecimiento en condiciones óptimas 24 veces inferior que la de bacterias como Escherichia coli (Juste y cols. 1993). Esa cualidad de metabolismo ralentizado en combinación con la defensa que le confiere la compleja pared celular (Minnikin 1982), hace de Map una bacteria muy resistente a condiciones adversas, al mismo tiempo que le permite ser la primera en estar allí cuando estas sean más favorables (Ratledge 1982). Es capaz de sobrevivir en agua de estanque esterilizada 9 meses y 163 días en agua de río (Lovell y cols. 1944), en agua corriente con pH no neutro hasta 14 meses (Larsen y cols. 1956) y en agua destilada hasta 15 meses, reduciéndose la concentración inicial en 1 Log10 cada 68.5 días (Sung y cols. 1998). Un reciente estudio realizado en el Reino Unido, ha demostrado la presencia de células viables de la bacteria en aguas de un embalse del río Taff (Pickup y cols. 2005). La supervivencia en heces puede llegar hasta los 246 días (Lovell y cols. 1944), en purines hasta 287 días (Jorgensen 1977) y entre 21 y 28 días durante la digestión anaeróbica de purines de una planta de biogás (Olsen y cols. 1985), aunque supuestamente la mezcla de heces y orina produce un efecto bactericida (Chiodini y cols. 1984a). También permanece 55 semanas en ambientes secos y sombríos, y 48 semanas en agua de presa no expuesta a luz solar (Whittington y cols. 2004, Whittington y cols. 2005). Pueden recuperarse células viables después de largos períodos de congelación (Richards y cols. 1977, Juste y cols. 1990a), y es capaz de sobrevivir e incluso replicarse en el interior de protistas ambientales (Mura y cols. 2006). Además, su resistencia le permite soportar tratamientos de esterilización aplicados a la leche y al agua destinada al consumo humano (Whan y cols. 2001, Grant y cols. 2002a) (tema revisado en el apartado de Epidemiología. Implicaciones en salud pública). Por el contrario, parece sensible a la luz solar, las altas temperaturas, la desecación, la elevada concentración de calcio y el hervido (Merkal y cols. 1982c, Blood y cols. 1983, Schroen y cols. 2003, Whittington y cols. 2004, Whittington y cols. 2005). 55 ETIOLOGÍA También puede ser inactivado por medio de desinfectantes en suspensión acuosa como el amonio (3%), el formol (5%), compuestos cresólicos (1:32), el fenol (1:40), el bicloruro de mercurio (1:1000), el hipoclorito cálcico (1:50), el cloro, cianamida cálcica o el etanol (Merkal y cols. 1982c, Chiodini y cols. 1984a, Böhn y cols. 1994, Katayama y cols. 2003). El efecto de estas sustancias es mucho menor en heces secas, aunque puede incrementarse si se combinan con detergentes (Merkal y cols. 1982c). Composición genética La secuenciación del genoma completo de la cepa de origen bovino K10 ha revelado un cromosoma circular de 4.829.781 pares de bases que codifica para 4.350 ORFs, 45 tRNAs, y un operón rRNA. El análisis in silico ha identificado más de 3.000 genes con homólogos en M. tuberculosis, y 161 regiones genómicas únicas que codifican 39 genes de Map desconocidos hasta el momento (Li y cols. 2005) (Figura 5). Figura 5. Representación linear de las regiones repetidas y de las regiones únicas en el genoma de la cepa K10 de Map. De arriba a abajo: repeticiones VNTR/DR histograma azul; repeticiones SSR histograma rojo; regiones únicas histograma verde; secuencias de inserción histograma multicolor (IS900, azul; MAP01, aguamarina; MAP02, gris; MAP03, rosa; MAP04, verde; MAP05, púrpura; MAP06, negro, MAP07, naranja; MAP08, rojo; MAP09, rosa claro; MAP10, púrpura claro; MAP11, beige; MAP12, marrón; MAP13, fucsia; MAP14, aguamarina claro; MAP15, gris claro; MAP 16, verde oscuro; IS1311, granate; Mav2, azul claro; REP, verde claro); contenido GC histograma púrpura. Figura generada con el programa informático GENESCENE (DNAstar, Madison, WI). (Li y cols. 2005). 56 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA Esta cepa de referencia no presentaba plásmidos. Map tiene insertadas en su genoma entre 14 y 18 copias de IS900 (Green y cols. 1989, Bull y cols. 2000), de 7 a 10 copias de IS1311 (Whittington y cols. 1999a), al menos tres copias de ISMav2 (Strommenger y cols. 2001), 3 copias de ISMpa1 (Olsen y cols. 2004), y 6 copias de ISMap02 (Stabel y cols. 2005). Map no contiene la IS1245 a pesar de que en algunos trabajos se obtuvieran bandas en el IS1245-RFLP, bandas producidas en realidad por hibridación inespecífica con la IS1311 (Johansen y cols. 2005). Otros genes o dianas de interés específicos de Map son el locus 251 (Bannantine y cols. 2002a, Motiwala y cols. 2003), el hspX (Ellingson y cols. 1998, Ellingson y cols. 2000) y el F57 (Poupart y cols. 1993, Cocito y cols. 1994, Coetsier y cols. 2000). La IS900 pertenece a una familia de elementos IS relacionados entre sí que se encuentran en microorganismos del orden Actinomycetales, y entre las que se incluyen IS901/902, IS110, IS116, IS1110, IS1626 y IS1613 (Bull y cols. 2003a). Además, el conocimiento progresivo del genoma de Map incluyendo la secuencia completa de la cepa K10 está proporcionando el conocimiento de regiones genéticas únicas de la bacteria, que además de servir para la identificación y el diagnóstico, permitirán revelar los procesos genéticos de la interacción patógeno-hospedador (Bannantine y cols. 2002a, Bannantine y cols. 2003b, Paustian y cols. 2004, Bannantine y cols. 2004a, Bannantine y cols. 2004b, Li y cols. 2005, Paustian y cols. 2005, Marsh y cols. 2006, Bannantine y cols. 2006b). EPIDEMIOLOGÍA Hospedadores La paratuberculosis afecta principalmente a rumiantes tanto domésticos como salvajes (Chiodini y cols. 1984a). Adquiere mayor importancia en las especies bovina (Bos taurus), ovina (Ovis aries) y caprina (Capra hircus) debido a los intereses adquiridos por el ser humano sobre ellas. Últimamente, la enfermedad ha pasado a ser junto con la tuberculosis una de las más preocupantes en cérvidos (familia Cervidae) (Mackintosh y cols. 2004), infectando distintas especies (Cervus elaphus, Capreolus capreolus, Odocoileus virginianus, Axis axis, Dama dama, Cervus nippon, Rangifer tarandus, Cervus unicolor, Alces alces) de orígenes variados (Hillerma 1966, Libke y cols. 1975, Temple y cols. 1979, Riemann y cols. 1979, Jessup y cols. 1981, Chiodini y cols. 1983, Richards y cols. 1983, Shulaw y cols. 1986, Weber y cols. 1992b, de Lisle y cols. 1993, Power y cols. 1993, Fawcett y cols. 1995, Rohonczy y cols. 1996, Stehman 1996, Cook y cols. 1997, Manning y cols. 1998, Moreira y cols. 1999, Nebbia y cols. 2000, Godfroid y cols. 2000, Pavlik y cols. 2000a, Quist y cols. 2002, Marco y cols. 2002, Motiwala y cols. 2004, Machackova y cols. 2004). Su presencia también ha sido confirmada en otros rumiantes como el 57 EPIDEMIOLOGÍA bisonte (Bison bison) (Whitlock y cols. 1999, Ellingson y cols. 1999, Buergelt y cols. 2000, Mackintosh y cols. 2002, Leid y cols. 2002, Ellingson y cols. 2005b), el búfalo (Bubalus bubalis) (Lillini y cols. 2003, Sivakumar y cols. 2005), el borrego cimarrón (Ovis canadensis), la cabra de las montañas rocosas (Oreamnos americanus) (Williams y cols. 1979, Richards y cols. 1983), el muflón (Ovis musimon) (Boever y cols. 1974, Richards y cols. 1983, Weber y cols. 1992a, Pavlik y cols. 2000a, Machackova y cols. 2004, Deutz y cols. 2005), el íbice (Capra ibex) (Richards y cols. 1983, Weber y cols. 1992a, Giacometti y cols. 1995, Ferroglio y cols. 2000), la cabra salvaje (Capra aegagrus) (Machackova y cols. 2004), el borrego audad (Ammotragus lervia) (Richards y cols. 1983), el camello (Camelus bactrianus) (Richards y cols. 1983, Paling y cols. 1988, Stehman 1996), la llama (Lama glama) (Blood y cols. 1983, Richards y cols. 1983, Belknap y cols. 1994, Miller y cols. 2000), la alpaca (Lama pacos) (Ridge y cols. 1995a, Miller y cols. 2000, Cousins y cols. 2000, Lucas y cols. 2003), distintas especies de antílopes (Saiga tatarica, Addax nasomaculatus, Damaliscus albifrons, Damaliscus lunatus, Kobus ellipsiprymnus, Oryx gazella, Antidorcas marsupialis, Aepyceros melampus, Tragelaphus angasi, Tragelaphus spekei, Gazella thomsoni, Connochaetes gnou) (Richards y cols. 1983, Steinberg 1988, Dukes y cols. 1992, Burton y cols. 2001, Motiwala y cols. 2004), el urial (Ovis vignei), el duíquero bayo (Cephalophus dorsalis), el muntjac de Reeve (Muntiacus reevesi), y el markhor (Capra falconeri) (Motiwala y cols. 2004). Map también ha sido aislado de otros animales no rumiantes, siendo el conejo uno de los más importantes (Oryctolagus cuniculus) (Fuentes y cols. 1988, Angus 1990, Fernández de Luco y cols. 1995, Greig y cols. 1997, Greig y cols. 1999, Beard y cols. 2001b, Daniels y cols. 2003d, Raizman y cols. 2005, Judge y cols. 2006). Debido a las altas prevalencias detectadas en este animal (Greig y cols. 1997), se ha sugerido que esta especie puede jugar un importante papel en la epidemiología de la enfermedad en el Reino Unido (Greig y cols. 1999, Daniels y cols. 2001, Daniels y cols. 2003a, Daniels y cols. 2003b, Daniels y cols. 2003c, Daniels y cols. 2003d, Judge y cols. 2005, Judge y cols. 2006). También han sido hallados casos naturales de infección en cerdo y jabalí (Sus domesticus y Sus scrofa) (Ringdal 1963, Richards y cols. 1983, Thoen y cols. 1996b, Machackova y cols. 2003b, Machackova y cols. 2004, Alvarez y cols. 2005, Aurtenetxe y cols. 2005), en burro (Equus asinus) (Dierckins y cols. 1990), en perro (Canis familiares) (Vogel 1977), en gatos asilvestrados (Palmer y cols. 2005), en primates (Pitcock y cols. 1961, McClure y cols. 1987), en liebre (Lepus europaeus), en zorro (Vulpes vulpes), en mustélidos (Mustela erminea, Mustela minuta, Meles meles), en ratón de campo y rata (Apodemus sylvaticus, Rattus norvegicus), y en córvidos (Corvus corone, Corvus frugilegus, Corvus monedula) (Beard y cols. 1999, Beard y cols. 2001a). A parte de los experimentos llevados a cabo con las tres especies principales de rumiantes domésticos (Stuart 1965, Angus y cols. 1971, Allen y cols. 1974a, Thoen y 58 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA cols. 1983, Williams y cols. 1983, García Marín y cols. 1988a, García Marín y cols. 1988b, Juste 1990, Saxegaard 1990, Juste y cols. 1994, Begara-McGorum y cols. 1998, Sigurdardottir y cols. 1999, Waters y cols. 2003, Reddacliff y cols. 2003b, Chacon y cols. 2004, Emery y cols. 2004), la infección ha sido inducida artificialmente en experimentos con rumiantes salvajes (Williams y cols. 1983) y no rumiantes como animales de laboratorio, cerdos, caballos, gallinas, y otras especies (Francis 1943, Jorgensen 1969, Larsen y cols. 1971, Larsen y cols. 1972a, Larsen y cols. 1972b, Larsen y cols. 1978a, Mokresh y cols. 1990, Van Kruiningen y cols. 1991, Hamilton y cols. 1991, Chiodini y cols. 1993, Mutwiri y cols. 2001, Mutwiri y cols. 2002, Stabel y cols. 2002a, Chacon y cols. 2004, Vaughan y cols. 2005). Por otro lado, Map ha sido señalado como agente etiológico de la enfermedad de Crohn humana, materia que se revisa en el apartado de Epidemiología. Implicaciones en salud pública. Transmisión A pesar de que el mecanismo más importante de transmisión de la paratuberculosis es el fecal-oral, es decir, ingiriendo heces procedentes de animales infectados contaminadas con la bacteria (Sweeney 1996), también existen otras vías. Los animales portadores pueden contaminar con sus heces los pastos, la comida y el agua, lo que provoca un alto riesgo de exposición para el resto de animales, ya sea en rumiantes domésticos o salvajes (Boever y cols. 1974, Riemann y cols. 1979, Jessup y cols. 1981, Chiodini y cols. 1984a, Steinberg 1988, Stehman 1996, Manning y cols. 1998, Daniels y cols. 2003c). Los animales recién nacidos, que son los más susceptibles, pueden estar expuestos a la ingesta de grandes cantidades de la micobacteria vía calostro, leche, o al mamar de las ubres sucias de las madres (Riemann y cols. 1983, Chiodini y cols. 1984a, Thoen y cols. 1988, Sweeney 1996). El riesgo de infección es muy grande en explotaciones intensivas donde existe un contacto frecuente entre recién nacidos y animales eliminadores. Según Whittington y cols., en la especie ovina, la cantidad de bacterias eliminadas en heces parece estar directamente relacionada con el tipo de lesiones. De este modo, ovejas con lesiones multibacilares excretarían los bacilos de manera constante, mientras que con otro tipo de lesiones la excreción sería intermitente (Whittington y cols. 2000c). Así, si cada oveja elimina al día más de 108 unidades formadoras de colonia (CFU) por gramo de heces de media (según el cultivo fecal), el medio de estos rebaños está permanentemente contaminado con la bacteria. La transmisión vertical prenatal ha sido suficientemente documentada y demostrada. Map ha sido aislada de tejidos fetales (membranas, cotiledones,…) y de tejidos maternos (endometrio, mucosa uterina,…), aunque esta posibilidad parece ceñirse en su gran mayoría a casos de madres clínicamente enfermas (Alexejeff-Goloff 1929, Hole 1953, Pearson y cols. 1955, Lawrence 1956, Doyle 1958, Seitz y cols. 1989, Rohde y 59 EPIDEMIOLOGÍA cols. 1990, Lambeth y cols. 2004). Sin embargo, algunos autores la han observado en casos de madres subclínicas (Lawrence 1956, Kopecky y cols. 1967), mientras que otros correlacionan la presencia de la bacteria en fetos con madres aparentemente sanas, pero que excretan grandes cantidades de Map en las heces (Sweeney y cols. 1992b). En esta misma línea, un reciente estudio retrospectivo de Aly y cols. (Aly y cols. 2005) demuestra que la probabilidad de que una vaca sea seropositiva es 6,6 veces mayor para hijas de vacas seropositivas que para hijas de vacas seronegativas, ya sea por transmisión congénita o vía calostro/leche posparto. Así, se podría pensar que los ovocitos y embriones pueden ser portadores del patógeno a la hora de ser implantados en madres receptoras, no obstante, los resultados de un trabajo sobre esta materia, sugieren que los ovocitos y fetos derivados de madres eliminadoras moderadas no suponen una vía de transmisión, a pesar de la pequeña muestra utilizada en ese estudio (Kruip y cols. 2003). Por el contrario, los recientes hallazgos de van Kooten y cols. (van Kooten y cols. 2006), indican un alto riesgo de transmisión intrauterina en ciervos, y sugieren que ésta puede jugar un importante papel en la amplia distribución de la paratuberculosis. La placenta puede también suponer un vehículo de contagio en época de partos (Pearson y cols. 1955, Lawrence 1956, Doyle 1958) especialmente en explotaciones intensivas, por lo que se debe evitar el contacto con los recién nacidos. Map puede aislarse de leche de vacas clínicamente afectadas con relativa frecuencia (Alexejeff-Goloff 1929, Smith 1960, Taylor y cols. 1981, Giese y cols. 2000), pero también de vacas asintomáticas o subclínicas con cultivo fecal positivo (Sweeney y cols. 1992a, Streeter y cols. 1995). En definitiva, la leche puede servir como vía de transmisión de la paratuberculosis, especialmente si se trata de animales que eliminen grandes cantidades del bacilo en las heces (Sweeney 1996). Una vaca seropositiva puede eliminar una media de 42,33 ± 19,67 CFUs por 100 ml de leche (Herman y cols. 2006). El semen de toros afectados por la enfermedad puede contener la bacteria (Larsen y cols. 1970, Larsen y cols. 1981, Eppleston y cols. 2001, Glawischnig y cols. 2004), provocando infección intrauterina en hembras receptoras, que al mismo tiempo puede ser trasladada al cigoto, y según Merkal y cols. (Merkal y cols. 1982b), genera hipersensibilidad en vacas receptoras. Como en el caso de Mycobacterium bovis (Serraino y cols. 1999), otra hipotética ruta de contagio sería por las vías respiratorias (Corner y cols. 2004) o por ingestión de presas o cadáveres contaminados en animales carnívoros o carroñeros como el zorro y el jabalí (Beard y cols. 2001a, Machackova y cols. 2004). En cuanto al conejo se refiere, la transmisión vertical, pseudovertical (por la ingestión de leche y/o heces maternas) y horizontal (tanto intra-especies como interespecies) son posibles, como demuestran los resultados de un estudio que afirma que la existencia de tales vías de transmisión contribuyen al mantenimiento de la enfermedad en las poblaciones de estos lagomorfos, y como resultado, en el medio (Judge y cols. 2006). Además de todas las fuentes mencionadas, Map también puede ser aislada de 60 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA insectos (Fischer y cols. 2001, Fischer y cols. 2003b, Fischer y cols. 2004a, Fischer y cols. 2004b), lombrices (Fischer y cols. 2003a), nemátodos (Lloyd y cols. 2001, Whittington y cols. 2001a) y amebas de vida libre (Mura y cols. 2006), por lo que estos invertebrados también podrían tener un papel en la transmisión de la paratuberculosis, y consecuentemente, en su epidemiología. Distribución y prevalencia La paratuberculosis es una enfermedad de creciente prevalencia en especies ganaderas que está ampliamente distribuida por todo el mundo (Chiodini y cols. 1984a, Kennedy y cols. 2001). Sin embargo, la prevalencia real de esta enfermedad puede estar enmascarada por las dificultades que plantea su diagnóstico. Las técnicas utilizadas en la detección de animales infectados en general no son especialmente sensibles, a lo que hay que añadir el largo período de latencia desde la infección hasta la aparición de síntomas, y la variabilidad del curso de la enfermedad entre animales. Entre las técnicas serológicas utilizadas para estimar la prevalencia destaca la del inmunoanálisis ligado a enzimas o ELISA, aunque la inmunodifusión en gel de agarosa (AGID) también haya sido popular con pequeños rumiantes (Juste y cols. 1991a, Aduriz 1993, Mainar-Jaime y cols. 1998, Reviriego y cols. 2000, Michel y cols. 2000, Sergeant y cols. 2002b). Las técnicas microbiológicas más importantes para ese mismo fin son el cultivo y la PCR de muestras fecales o de tejidos (en caso de estudios de matadero). Las técnicas histopatológicas también proporcionan resultados satisfactorios (Juste y cols. 1991a, Aduriz 1993, García Marín y cols. 1994, Pérez y cols. 1997, González 1998, Pérez y cols. 1999, Corpa y cols. 2000a, Garrido 2001, Balseiro y cols. 2003, González y cols. 2005). En la Tabla 2 se indica el porcentaje de animales y/o rebaños positivos detectados por medio de diferentes técnicas en varias especies hospedadoras procedentes de numerosos países de todo el mundo. A nivel estatal, aunque fue por primera vez mencionada en 1915 (Farreras 1915) y posteriormente en 1935 (Roca Soler 1935), la paratuberculosis no fue adecuadamente descrita hasta 1973 en ovino de León (Aller y cols. 1973), 1983 en bovino del País Vasco (Juste y cols. 1983) y 1984 en caprino de Andalucía (León y cols. 1984) (aunque en esta especie fueron comunicados resultados positivos de serología en 1979 (Garrido y cols. 1979)). Se considera ampliamente distribuida por todo el estado (Aduriz y cols. 1991, Corpa y cols. 1997), tal y como indica la descripción de la enfermedad en varias comunidades y especies hospedadoras (Badiola y cols. 1980, Badiola y cols. 1986, Villanueva 1989, Díaz 1989, Carrera y cols. 1989, Santamaría 1989, Garrido y cols. 1989, Guijarro 1990, Juste y cols. 1990c, Molina y cols. 1991, Aduriz y cols. 1991, Pérez 1992, Aduriz 1993, Mainar-Jaime y cols. 1998, Reviriego y cols. 2000, Rodríguez 2000, Garrido 2001, Marco y cols. 2002, Balseiro y cols. 2003, González 2003, Balseiro 2004, Alvarez y cols. 2005, de Juan y cols. 2006a). Varios de estos estudios aportan además información sobre la prevalencia de la enfermedad. 61 Región Alemania Argentina Australia Nueva Gales del Sur Zona Sur Totalidad Austria Bélgica Brasil Río de Janeiro Río Grande do Sul Canadá Alberta Notario Québec Saskatchewan Zonas atlánticas Corea Costa Rica Croacia Dinamarca Estados Unidos Alabama California Colorado Florida Georgia Louisiana Maine Michigan Missouri Nueva York Texas Wisconsin Sureste Sin especificar Escocia Eslovaquia Eslovenia Finlandia Técnica(s) ELI ELI+TTC HP; HP matadero CF/ ELI/ TFC todas ELI ELI ELI ELI ELI/ CFL CF/ CF/ ELI; ELI/ELIL HP ELI ELI; HP+CT ELI ELI ELI+TFC ELIL; ELI ELI ELI ELI ELI ELI ELI HP+CT ELI ELI CF ELI ELI CT/ ELI/ AGID ELI CFóT/ HP/ CFóT+HP CFóT ELI CF ó ELI ó HP Año(s) <2004 1993-2001 <1996; hasta 2000 1990-93 2001; 2004 1995-97; 2002-03 1997-98 <2002 <2005 <2003 1986-89; 2003 1999-2000 2001; 1999 1998-99; 2001 1999 1990 1987-96 1998 1998-99 1988-89; 2000 1999 1986-87 2000 1988 2001 1996 1993-94 1989-93 2000-01 1989-90 1998-2000 1996;97 1996 1982-87 1997/ 98;2000-01 2001 Bov (carne) Bov (leche/carne); Bov Bov Bov (leche/ carne) Bov (leche/ carne) Bov Bov Bov Bov (leche/ carne) Bov Bov (carne) Bov Ciervo de Virginia Bov (leche); Bov (carne) Conejo Bov (con sospecha) Bov Bov (leche/ carne) Bov Bov Ovi Bov (leche); Bov (carne) Bov Bov Bov Bov Bov Bov Bov Ovi Bov Ovi; Bov (leche/ carne) Bov Bov Especie Bov Bov 8 7/ 6; 4,6 0-7,82 17,1/ 8,6 9,58/ 3,95 4,4 21,7 6,87 8/ 5 0,7-28,2 3 7,29 0,3/ 2/ 0 3,4; 0,4 7,14/ 16,19/ 19,52 41,2 2,84/ 6,48; 0,44 0/ ≈0 7/ 1,1-3,4 5,5/ 0,1/ 15,2; 2,6/ 1,7 3 2,7; 0,8 2,6; 15,1 3,2-5,3 11,9 1,36 -; 8,8 18 44,6 2; 19 1,18 9-23; 0,43/ -/ - Animales (%) 12,2 0,07-1,75 0,41/ 1,16; 11,59 21,6; 7,9 18,18/ 50/ 50 55 74/ 40 57,57 43,8 50 30 63,29 60/ 60; 77,33 73,33 70; 86 43,3; 15,2 43,3; 84,7-90,6 18,7 40/ 20,4 -; 58/ 34 82 97,2 -; 0,04-39 1,39/ 0,64/ 7,47 0-43; 11,9/ 0,08 7; 0,87 Rebaños (%) 84.7 Tabla 2. Porcentaje de animales y/o rebaños positivos según las técnicas, especies hospedadoras y regiones mencionadas. (Hill y cols. 2003) (Behymer y cols. 1991); (Adaska y cols. 2003) (Hirst y cols. 2004) (Braun y cols. 1990) (Pence y cols. 2003) (Olcott y cols. 1992) (McKenna y cols. 2004) (Johnson-Ifearulundu y cols. 1999a) (Thorne y cols. 2000) (Obasanjo y cols. 1997) (Roussel y cols. 2005) (Collins y cols. 1994) (Davidson y cols. 2004) (Wells y cols. 2000); (Dargatz y cols. 2001b) (Greig y cols. 1999) (Hanzlikova y cols. 1989) (Ocepek y cols. 1998); (Ocepek y cols. 2003) (Seuna y cols. 2003) (Sorensen y cols. 2003) (McNab y cols. 1991); (Hendrick y cols. 2005a) (Arsenault y cols. 2003) (VanLeeuwen y cols. 2005); (Waldner y cols. 2002) (VanLeeuwen y cols. 2001); (McKenna y cols. 2004) (Pak y cols. 2003) (Dolz y cols. 1999) (Cvetnic 2000) (Nielsen y cols. 2000b); (Jakobsen y cols. 2000) (Ferreira y cols. 2003) (Gomes y cols. 2006) (Marshall y cols. 1997); (Sergeant y cols. 2002a) (Vandegraaff y cols. 1995) (Sergeant 2003); (Kennedy y cols. 2006) (Gasteiner y cols. 1999); (Khol y cols. 2006) (Boelaert y cols. 2000) Bibliografía (Hacker y cols. 2004) (Holzmann y cols. 2004) Uruguay TFC; CFóT AGID CF/ ELI ELI; ELI PCRL; PCRL ELI 1992-98; 1999-2001 1996 1993-98 1994; <95 2001; 02 <2002 ELI ELI+AGID ELI CT ELI ELI CF/ ELISA CF/ TFC 1998-2002 2000-01 <2005 1995-2002 <1996 2003-04 <2005 2004 ELI CF/ ELI CF y ELI <2005 1997 2003 ELI CT ó PCR; CT ó PCR;- CT/ PCRT encuesta 1994 1997 1992-99 1986-2000; 2001-04; 1995 ELI CF; ELIL; - 1998-99 1995;98; <2000 Bov; Bov Bov; Cap/ Ovi Bov Ovi Ovi Ovi Bov (importada); ciervo/ corzo/ gamo/ muflón/ bezoar Ovi Bov Ciervo Bov Bov Bov Ovi Alce/ Ciervo/ Corzo/ Reno Ciervo; Ciervo; Ovi Búfalo/ Bov/ Cap Bov (importada) Bov Bov Bov Bov Bov 17,4 68 51;55; - 16 0,7; 6 1,3/ 2 -; 15/ 0,2/ 1/ 3,8/ 0 5,6 0-10,3 1,9/ 3,8/ 12,2/ 3,4 29,8/ 29,2 48,2 3,5 1,8 8; 1,7-49,2; 23/ 23,8 72 12,2; 2,72 46,7 27 6; 12; 6,4 65 42 1,7-10,4/ 7,5-60,3 25,5-40,3/ 25-42,6/ 15-50 4,07/ 3,55 37,5/ 25 61 2,6/ 3,5 3,3 -; 2,5; 5-13 (Stark y cols. 1997); (Meylan y cols. 1995) (Corti y cols. 2002); (Muehlherr y cols. 2003) (Piaggio y cols. 2003) (Pavlik y cols. 2000b); (Machackova y cols. 2004) (Michel y cols. 2000) (Bolske y cols. 1999) (Coelho y cols. 2006) (Mendes y cols. 2006) (Seixas y cols. 2006) (Tryland y cols. 2004) (de Lisle y cols. 2003); (de Lisle y cols. 2006); (West 1997) (Fraqueli y cols. 2006) (Robbi y cols. 2003) (Lillini y cols. 2006) revisado en (Cavirani y cols. 2006) (Benazzi y cols. 1996) (Singh y cols. 2006) (O'Doherty y cols. 2002a) (Koren y cols. 2006) (Çetinkaya y cols. 1996) (Çetinkaya y cols. 1998) (Petit 2001) (Kalis y cols. 1999a); (Muskens y cols. 2000); (Nielsen y cols. 2000a) Abreviaciones: Bov=bovino, Cap=caprino, CF=cultivo fecal, CFóT=cultivo fecal o de tejidos, CFL=cultivo fecal por lotes, CT=cultivo de tejidos, ELI=ELISA de sangre, ELIL=ELISA de leche, HP=análisis histopatológico, AGID=inmunodifusión en gel de agarosa, Ovi=ovino, PCRL=PCR de leche, PCRT=PCR de tejidos, TFC=test de fijación del complemento, TTC=test de la tuberculina comparada, <=antes de. República Checa Sudáfrica Suecia Suiza Nueva Zelanda Portugal Noroeste Lisboa Serra da Estrela Noruega Holanda Inglaterra Suroeste Totalidad India Uttar Pradesh Irlanda Israel Italia Trentino Veneto Centro Norte Marruecos Francia Yonne EPIDEMIOLOGÍA En un estudio realizado sobre 201 vacas de desvieje procedentes del matadero de Bilbao, se detectaron porcentajes de positivos individuales del 0,5, 0,5, 4,7, 15,4, y 19,4% por medio del cultivo de tejidos y heces, AGID, histopatología, PCR y ELISA, respectivamente, lo que situó la prevalencia en un 31,3% al combinar los resultados de las distintas técnicas (Garrido 2001). Otro estudio similar, realizado sobre 134 vacas sacrificadas en mataderos asturianos, arroja una prevalencia individual del 28,35% mediante histopatología, inmunohistoquímica y PCR (Balseiro y cols. 2003). Posteriormente, se ha ampliado este estudio sobre bovino procedente de Asturias, detectando una prevalencia (ELISA) media del 1,23% entre los años 1995 y 2001, que asciende hasta un 44,39% por medio de técnicas histopatológicas (Balseiro 2004). En el mismo, también se señala una prevalencia intra-rebaño de 0-22% detectada por medio de ELISA. Según un estudio preliminar sobre la prevalencia de Map en explotaciones bovinas lecheras en España por medio de PCR de muestras de leche de tanque, hasta un 18% (10 ± 8%) de las mismas podía estar infectado (Sevilla y cols. 2003). En Aragón se observó que el 46,7% de los más de 150 rebaños ovinos estudiados estaban infectados, tal y como indicó la combinación de técnicas bacteriológicas, anatomopatológicas y serológicas empleadas (Juste y cols. 1991a). Los resultados de ELISA de rebaños caprinos procedentes de Huelva, Córdoba e Islas Canarias, indicaron porcentajes de animales positivos del 41, 13 y 0,5% respectivamente (Molina y cols. 1991). El estudio anatomopatológico del desecho de rebaños ovinos afectados en León, señaló un 46% de animales con lesiones (Pérez 1992). En el País Vasco, tras el análisis de muestras de 4.504 ovejas procedentes de 226 rebaños, según los resultados de AGID y ELISA, el 2% de animales fueron positivos con la primera técnica y el 5,8% con la segunda (Aduriz 1993), mientras que la seroprevalencia de rebaños fue del 23,5 y 31,4% respectivamente. En pequeños rumiantes de Zaragoza se observó que el 10,8% de ovejas y el 22,5% de cabras era positivo a alguno de los métodos diagnósticos empleados (cultivo, AGID y anatomía patológica) (García Marín y cols. 1994). Otro estudio lesional realizado en León sobre ovejas de desecho detectó un 24,3% de estos animales con lesiones compatibles con esta enfermedad (González 1998). La utilización de AGID reveló un 44% de pequeños rumiantes infectados en Madrid (Mainar-Jaime y cols. 1998), y un 56% de rebaños afectados en Ávila (Reviriego y cols. 2000). Más tarde, a pesar de la posible interferencia por vacunaciones frente a paratuberculosis no declaradas, se han observado prevalencias del 97% de rebaños con una incidencia intrarebaño del 49,7% en la especie caprina en Córdoba (Rodríguez 2000). Las altas seroprevalencias observadas en caprino de Salamanca (44,12% de animales y 86,66% de explotaciones) reflejan la importante incidencia de la paratuberculosis en esta especie en España (Fernández y cols. 2001). 64 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA Trascendencia Económica A la hora de calcular el impacto económico de la paratuberculosis, las pérdidas pueden ser clasificadas como directas, indirectas o inaparentes (Merkal 1983, Hutchinson 1996, Kennedy y cols. 2001). Dentro de los costos directos, entrarían las pérdidas derivadas de la reducción productiva de animales clínicos y subclínicos, bien por descenso en las cantidades de leche producidas, por descenso del valor del animal en el matadero, o por el sacrificio prematuro de los mismos. Los costos derivados del control de la enfermedad, como la contratación de servicios veterinarios, la realización de pruebas diagnósticas o los generados por cambios de manejo del rebaño, también pueden clasificarse como directos. Se pueden considerar costos indirectos, aquellos derivados de restricciones de acceso al mercado (muy importantes en algunas regiones de Australia), los gastos de testado de animales para venta o exportación, así como los originados por la adopción de medidas preventivas de manejo en los grupos de cría. Entre los costos inaparentes, se encuentran la pérdida de potencial genético debido al sacrificio prematuro (Buergelt y cols. 1978a) y las restricciones en la compraventa de animales de alto valor genético. Debido tanto al desconocimiento del alcance real de la enfermedad, como a las diferencias de producción y de valoración de precios existentes entre países, no existen datos absolutamente fiables de las pérdidas que provoca la paratuberculosis. La reducción en la producción de leche en vacas clínicamente afectadas, varía de un 14,6% a un 15,9%, alcanzando hasta un 19,5% en la última lactación (Buergelt y cols. 1978a, Benedictus y cols. 1987, Spangler y cols. 1992a). En la penúltima lactación de animales con paratuberculosis subclínica, se ha observado una reducción en la producción de leche del 4-6% (Nordlund y cols. 1996), ascendiendo la pérdida hasta un 14% en la última lactación antes del sacrificio (Benedictus y cols. 1985b, Wilson y cols. 1997). Sin embargo, según Johnson y cols., en rebaños con una media de dos partos o menos, las pérdidas de producción lechera apenas tienen importancia (Johnson y cols. 2001). En cambio, un reciente estudio llevado a cabo sobre 9 explotaciones lecheras, concluye que la paratuberculosis es responsable de una importante reducción en la producción de leche y en la longevidad de las vacas (Hendrick y cols. 2005c). Las pérdidas asociadas a animales subclínicos pueden estar relacionadas con el incremento en la incidencia de mamitis e infertilidad, y con las tasas de eliminación de animales del rebaño (Merkal y cols. 1975, Wilson y cols. 1997). Se ha estimado que las pérdidas económicas derivadas de la paratuberculosis en las granjas lecheras de Estados Unidos puede exceder los 1,5 billones de dólares por año (Jones 1989). Un reciente estudio con datos de 1996 sobre el impacto económico producido por la reducción en la producción de leche debida a la paratuberculosis, determina que ésta fue de 580 ± 460 millones de kg, lo que supuso una pérdida total de 200 ± 160 millones de dólares para la economía de Estados Unidos (Losinger 2005). Los rebaños positivos a paratuberculosis (≥1 animal positivo a ELISA) experimentan una pérdida de casi 100 dólares por vaca en comparación con los libres de paratuberculosis, y en los 65 EPIDEMIOLOGÍA rebaños con al menos un 10% declarado de bajas por esta enfermedad, las pérdidas ascienden hasta 200 dólares y 700 Kg de leche por vaca y año (Ott y cols. 1999). La presencia de paratuberculosis en las explotaciones lecheras del estado de Michigan, supondrían unas pérdidas directas anuales de 1.600-4.400 dólares (Johnson-Ifearulundu y cols. 1999a, Johnson-Ifearulundu y cols. 1999b). En Canadá, el promedio de los costos anuales directos para un rebaño lechero tipo de 50 vacas asciende a 2.472 dólares según lo calculado por Chi y colaboradores (Chi y cols. 2002). La depreciación en la venta de los animales en el matadero puede variar de un 5 a un 100% en función del estado de la infección (de temprana a clínica) (Weber y cols. 2006). En pequeños rumiantes no se cuenta con tantos estudios sobre el impacto económico de esta enfermedad. En los años 80, en Inglaterra se realizó una estimación de las pérdidas basándose en el seguimiento de un rebaño ovino con una tasa de bajas anuales del 9%, lo que reveló unas pérdidas por sacrificio prematuro y reducción del potencial genético de 6.000 libras en dos años (Cranwell 1988). Denholm y colaboradores pronosticaron unas pérdidas de 92 millones de dólares australianos anuales para el año 2010 en Nueva Gales del Sur (Australia) (Denholm y cols. 1997). Los problemas y las pérdidas derivadas de la enfermedad de Johne ovina en este país, pasaron a tener gran relevancia en la industria, y promovieron un programa nacional de control de la enfermedad de 6 años de duración que comenzó en 1999, y con una inversión de 40 millones de dólares australianos (Sergeant 2001). En Nueva Zelanda, el promedio anual de pérdidas se estimó en 20-22 dólares por oveja (Brett 1998). Estudios llevados a cabo en el País Vasco demostraron un descenso del 10% en la producción de leche de oveja Latxa seropositiva, cuya venta habría producido un beneficio de 25 millones de pesetas en 1991 (Aduriz y cols. 1995b). Asimismo, se calculó una pérdida de 100.000 pesetas anuales en rebaños destinados a producción cárnica. Se ha estimado que las pérdidas ocasionadas por casos clínicos en ovino de carne y de leche ascienden a 75 y 125 dólares respectivamente (Juste 1997b). En explotaciones intensivas de ciervos, la paratuberculosis puede llevar a importantes pérdidas económicas por la muerte de animales (Temple y cols. 1979, Fawcett y cols. 1995). Implicaciones en salud pública Enfermedad de Crohn La enfermedad de Crohn es un proceso inflamatorio del intestino que afecta a la especie humana (Dalziel 1913, Crohn y cols. 1932), que ha sido relacionada con la paratuberculosis debido a las semejanzas entre ambas (Patterson y cols. 1972, Chiodini 1983, Chiodini y cols. 1984c, Chiodini 1997). Se agrupa dentro de las denominadas enfermedades inflamatorias digestivas (IBD), junto con la colitis ulcerosa y otras. 66 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA Los síntomas más típicos de la enfermedad son la diarrea, el dolor abdominal y la pérdida de peso. La lesión característica es una inflamación granulomatosa en el tramo final del íleon y zona ileocecal, caracterizada histológicamente por agregados de células epiteliales, linfocitos, y células plasmáticas, que afectan a la mucosa y submucosa intestinal (Anderson 1980). Los jóvenes de entre 16 y 25 años son los típicamente afectados, pero puede aparecer antes o después en la vida (Podolsky 2002). Su impredecible curso clínico se caracteriza por una alta incidencia de recurrencia (Yamamoto 2005). Cerca del 80% de los pacientes que la padecen requieren cirugía durante su vida (Olaison y cols. 1990). Pero los pacientes de Crohn son un grupo heterogéneo, y la etiología puede no ser la misma para todos los individuos (Grant 2005). Con datos obtenidos en Olmsted (Minnesota, EEUU) entre 1940 y 1993, se calculó que cada año había 5,8 casos más por cada 100.000 habitantes, mientras que la prevalencia en 1993 ascendía a 133/100.000, un 46% más elevada que en 1980 (Loftus, Jr. y cols. 1998). El número de nuevos casos anuales en Croacia pasó de 0,34/100.000 en 1973 a 3,47/100.000 en 1994 (Jovanovic 1999). La incidencia anual de casos pediátricos de Crohn en Suecia aumentó en más del doble en una década (Askling y cols. 1999). En Manitoba (Canadá) registraron un incremento anual de 14,6/100.000 en el período 1984-1995, y una prevalencia de 198,5/100.000 en 1994 (Bernstein y cols. 1999). La prevalencia en una población de Israel era de 25,5/100.000 en 1987 y de 65,1/100.000 en 1997, lo que supone una incidencia anual de nuevos casos para ése período de 5/100.000 (Niv y cols. 1999). El estudio del tratamiento de la enfermedad de Crohn ha dado como fruto un ingente número de publicaciones, siendo menos los trabajos dedicados a determinar su etiología. Esta última materia parece indispensable a la hora de tratar de conocer y controlar cualquier enfermedad, y en el caso de la de Crohn, la comunidad científica no ha llegado a un consenso (Van Kruiningen 1999, Hermon-Taylor y cols. 2000, Greenstein 2003). Existen tres teorías principales sobre su etiología (Chamberlin y cols. 2006), o combinación de varias (Shanahan 2002): la teoría de autoinmunidad, la de inmunodeficiencia y la micobacteriana. Según la teoría de autoinmunidad o de desregulación de la inmunidad, las bacterias comensales de la flora normal provocan una activación inapropiada y dañina del sistema inmune de la mucosa, en un huésped genéticamente susceptible. La teoría de la inmunodeficiencia sugiere que el fenotipo de Crohn se debe a que defectos de la inmunidad innata comprometen la funcionalidad de los neutrófilos, lo que hace posible que los microbios sobrevivan por más tiempo, activando asimismo una respuesta Th1 compensatoria excesiva. Por último, la teoría micobacteriana, ha venido sugiriendo desde los inicios del descubrimiento de esta patología humana la implicación de un agente micobacteriano, hasta el punto de señalar a Map como agente causal. Map estaría 67 EPIDEMIOLOGÍA localizado en el interior de los macrófagos, en forma de esferoplasto, y con una extremadamente baja velocidad de crecimiento (Hermon-Taylor 2002). Para Chamberlin y cols. (Chamberlin y cols. 2006), las tres teorías tienen mucho en común, pero difieren a la hora de interpretar los datos o de dar mayor énfasis a los diferentes aspectos del proceso de la enfermedad. A pesar de haberse llevado a cabo numerosos trabajos para apoyar o desmentir esta hipotética relación entre Map y el síndrome de Crohn, ninguno de ellos ha sido concluyente hasta hoy. Algunos han tratado de demostrar la presencia de Map buscando su DNA por medio de PCR, hibridación in situ u otros métodos, en muestras de tejido, de biopsias y de fluidos biológicos de pacientes. Aunque los resultados de algunos de estos trabajos, apoyarían la relación Map-Crohn (Moss y cols. 1991, Sanderson y cols. 1992a, Moss y cols. 1992b, Wall y cols. 1993, Fidler y cols. 1994, Lisby y cols. 1994, Dell'Isola y cols. 1994, Mishina y cols. 1996, Collins y cols. 2000, Ikonomopoulos y cols. 2000, Sechi y cols. 2001, Hulten y cols. 2001, Naser y cols. 2002, Ryan y cols. 2002, Bull y cols. 2003a, Naser y cols. 2004, Sechi y cols. 2004, Romero y cols. 2005, Autschbach y cols. 2005, Sechi y cols. 2005), los resultados de otros tantos o no lo apoyarían o irían en contra (Yoshimura y cols. 1988, Suenaga y cols. 1995, Rowbotham y cols. 1995, Murray y cols. 1995, Kreuzpaintner y cols. 1995, Dumonceau y cols. 1996, Frank y cols. 1996, Cummins y cols. 1996, Al Shamali y cols. 1997, Clarkston y cols. 1998, Chiba y cols. 1998, Cellier y cols. 1998, Kallinowski y cols. 1998, Kanazawa y cols. 1999, Fujita y cols. 2002, Ellingson y cols. 2003, Baksh y cols. 2004, Ryan y cols. 2004, Tzen y cols. 2006). En los trabajos en que se ha detectado el DNA de esta bacteria, el porcentaje de positivos en el grupo de pacientes de Crohn varía en el rango 4,7-100%, en el grupo de colitis ulcerosa el rango es 0-100%, y en los controles es 087,5%. Las diferencias más significativas probablemente sean las publicadas por Bull y cols., al obtener amplificación en el 92% de los pacientes de Crohn frente al 20% de los controles (Bull y cols. 2003a). Es necesario señalar que la gran mayoría de estos estudios se basa en la detección del elemento genético IS900. Algo similar sucede con los estudios serológicos. Mientras unos detectan anticuerpos específicos (p35, p36, antígeno protoplasmático, 65KD HSP, MPP14,…) frente a Map en enfermos de Crohn (Elsaghier y cols. 1992, Vanuffel y cols. 1994, ElZaatari y cols. 1995, Juste y cols. 1995, Suenaga y cols. 1999, El-Zaatari y cols. 1999, Collins y cols. 2000, Naser y cols. 2000a, Olsen y cols. 2001c, Shafran y cols. 2002b, Olsen y cols. 2003, Barta y cols. 2004, Nakase y cols. 2006), lo que demostraría una respuesta inmunológica frente a esa infección, otros o no los detectan o no observan diferencias significativas con los grupos control (McFadden y cols. 1988, Kobayashi y cols. 1989, Brunello y cols. 1991, Ibbotson y cols. 1992, Stainsby y cols. 1993, Walmsley y cols. 1996, Bernstein y cols. 2004). 68 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA Esta divergencia de resultados también se refleja en ensayos clínicos con tratamientos antimicobacterianos (Hulten y cols. 2000a). Así, algunos apoyan la implicación de Map tras comprobar que estos tratamientos mejoran la situación de los pacientes (Warren y cols. 1986, Hermon-Taylor 1998, Hermon-Taylor 2002, Borody y cols. 2002, Shafran y cols. 2002a), y otros en cambio, no detectan diferencias significativas (Thomas y cols. 1998). Ni siquiera el aislamiento de Map de muestras humanas ha podido esclarecer definitivamente este polémico asunto. Los primeros aislamientos de Map de muestras procedentes de pacientes de Crohn, se obtuvieron en 1984 a partir de secciones de íleon terminal extraídas quirúrgicamente a dos niños de 15 y 12 años, y a un anciano de 78 años (cepas Linda, Dominic y Ben, respectivamente) (Chiodini y cols. 1984b, Chiodini y cols. 1984c, McFadden y cols. 1987). En un trabajo posterior sobre muestras de tejidos de 18 pacientes de Crohn, 5 con colitis ulcerosa y 6 controles, Map fue aislado y confirmado por PCR en el 33,3% de los enfermos de Crohn y en el 16,7% de los controles (Moss y cols. 1992b). Además también se obtuvieron cultivos positivos de Mas en 2 pacientes de Crohn, 2 de colitis ulcerosa y 2 controles. La bacteria no era detectada en su forma habitual de bacilo ácido-alcohol resistente, sino en forma de esferoplasto, de la que tras su cultivo in vitro podía revertir a la bacilar (Chiodini y cols. 1984b, Chiodini y cols. 1986b, Graham y cols. 1987, Gitnick y cols. 1989, Naser y cols. 2000b, Markesich y cols. 2004, Naser y cols. 2004). Esta forma pleomórfica que presenta Map tanto en animales como en humanos es de crecimiento extraordinariamente lento y podría ser importante en la interacción con el sistema inmunitario del hospedador, posiblemente en la presentación de antígenos, haciendo posible su infección persistente (Imaeda 1984, García Marín y cols. 1992a, Hulten y cols. 2000b, Hulten y cols. 2000c, Hulten y cols. 2001). Map fue después aislado incluso de leche materna de mujeres afectadas por este síndrome (Naser y cols. 2000b). El mismo equipo de investigación, aisló el microorganismo en tejidos del 37% de los pacientes y del 5,6% de los controles cuando estudiaron muestras de 27 pacientes y 36 controles (Schwartz y cols. 2000). El grupo de Bull y Hermon-Taylor, presentó junto con los resultados de PCR de tejidos ileocolónicos, unos porcentajes de aislamiento de un 42% en los enfermos y un 9% entre los controles (Bull y cols. 2003a). Sechi y cols. (Sechi y cols. 2005) obtuvieron recientemente un 63,3 y un 10,3% de cultivos positivos, respectivamente. Pero sin duda el hallazgo más interesante de los últimos tiempos sobre el aislamiento de Map en relación con esta enfermedad, ha sido el cultivo de la bacteria a partir de células blancas procedentes de sangre periférica de pacientes (Naser y cols. 2004). El 50% de los enfermos de Crohn y el 22% de los afectados por colitis ulcerosa albergaban células viables de Map en su sangre, mientras que los cultivos realizados de controles sanos eran todos negativos. Esto demostraría una bacteriemia en enfermos de Crohn (y en menor número en pacientes con colitis ulcerosa), y consecuentemente, 69 EPIDEMIOLOGÍA contribuye a la idea de que Map es una causa de la enfermedad de Crohn. Sin embargo, muchos investigadores no han conseguido aislar la bacteria de muestras de pacientes con enfermedad digestiva inflamatoria (Graham y cols. 1987, Kreuzpaintner y cols. 1995, Clarkston y cols. 1998, Kallinowski y cols. 1998, Collins y cols. 2000), por lo que algunos de ellos no apoyan esa hipótesis. Algunos trabajos (Kallinowski y cols. 1998, Tiveljung y cols. 1999, Fujita y cols. 2002) sobre la detección de otros microorganismos a parte de Map (Escherichia coli, Yersinia spp., Helicobacter spp., Listeria monocytogenes, Bacteroides vulgatus, …), sugieren la posible implicación de otros agentes, o el rechazo de la hipótesis de la relación Map-Crohn, pudiéndose clasificar la presencia de Map como secundaria. Si existiera esa relación, se podría pensar que la exposición a paratuberculosis clínica bovina, supone un factor de riesgo, y que la prevalencia de Crohn en grupos de personas expuestas sería mayor. No obstante, esta hipótesis no encuentra confirmación en un reciente trabajo (Jones y cols. 2006). Por otro lado está el factor de susceptibilidad-resistencia que explicaría por qué esta micobacteria, a pesar de ser detectada tanto en pacientes como en controles, sólo provoca la enfermedad en ciertos individuos. En el año 2001, tres grupos de investigación independientes publicaron el hallazgo de mutaciones en el gen NOD2/CARD16 del cromosoma 16, asociadas con la enfermedad de Crohn, pero no con la colitis ulcerosa (Grant 2005). Este gen parece estar relacionado con el reconocimiento de muropéptidos bacterianos que derivan del peptidoglicano de la pared celular. Las tres mutaciones principales detectadas, han demostrado alterar profundamente las vías metabólicas pro-inflamatorias en respuesta a muropéptidos sintéticos. NOD2 ha sido propuesto como factor antibacteriano en las células epiteliales del intestino humano, provocando la muerte directa de Salmonella typhimurium intracelular. De todos modos, la estimación de la proporción de casos de Crohn atribuibles a mutaciones en este gen es del 15-30%, lo que implicaría otros factores genéticos y/o ambientales en la patogénesis de esta enfermedad (Grant 2005). Tal y como concluyen los grupos de expertos de la Comisión Europea y otros organismos, atribuir la responsabilidad etiológica de Crohn a Map, simplemente por ser detectada con mayor frecuencia en el aparato digestivo de estos enfermos, no está suficientemente justificado (European Commission 2000). Se puede pensar en varios motivos que posiblemente explicarían ese hecho. Sin embargo, existen evidencias que sugieren algún tipo de asociación entre Map y al menos algunos casos de Crohn, por lo que ésa vinculación continúa siendo convincente (Grant 2005). Más información acerca de la epidemiología y la posible relación Map-Crohn puede ser consultada en el informe de la “Food Standards Agency” (Rubery 2001). Map también ha sido relacionado con la sarcoidosis (El Zaatari y cols. 1996). Además, en el último congreso internacional sobre paratuberculosis (8th International Colloquium on Paratuberculosis, agosto 2005, Copenhague, Dinamarca), un estudio que 70 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA detectó el DNA de Map (IS900 y hspX) (Ellingson y cols. 1998) en 6 pacientes con síndrome de Blau ha atribuido a esta bacteria parte de la etiología de esta afección, una enfermedad autosómica dominante, sistémica, e inflamatoria, similar a una sarcoidosis juvenil (Dow 2006b). El propio autor postuló que Map es un “súper-antígeno”, y que también podría estar implicado en la diabetes mellitus tipo 1 (Dow 2006a). Map en la cadena alimentaria del ser humano. La leche, el agua y otros productos. Inactivación de Map en leche Debido al creciente interés y preocupación suscitados en torno a la posible asociación entre Map y la enfermedad de Crohn, han sido investigados varios hipotéticos vehículos de transmisión para el ser humano. El producto más veces estudiado hasta el momento es la leche. Tal y como se ha mencionado en el apartado de Transmisión, Map ha sido cultivada de leche de vacas con paratuberculosis clínica o subclínica (Giese y cols. 2000, Pillai y cols. 2002). La contaminación de ésta en las explotaciones puede producirse por eliminación directa en la leche de vacas infectadas, o por contacto con heces infectadas en el procesado. Ha sido calculado que la leche de tanque de un rebaño con casos de paratuberculosis puede encontrarse contaminada con 11,67 ± 12,33 CFUs por cada 100 ml (Herman y cols. 2006). Varios estudios demuestran por medio de PCR y/o cultivo la presencia de Map en leche destinada al consumo humano (Tabla 3). El primer trabajo publicado, reveló la presencia de IS900 en el 7% de 312 muestras de leche pasterizada procedentes del Reino Unido, además de encontrar la micobacteria en el 4,8% de los cultivos realizados (Millar y cols. 1996). Posteriormente, Map ha sido detectada en leche ovina y/o caprina de tanque o individual en el Reino Unido (Grant y cols. 2001a), Noruega (Djonne y cols. 2003) y Suiza (Muehlherr y cols. 2003), así como en leche bovina de tanque o individual en Suiza (Stephan y cols. 2002, Corti y cols. 2002, Bosshard y cols. 2006), España (Sevilla y cols. 2003), Estados Unidos (Pillai y cols. 2002, Stabel y cols. 2002b, Jayarao y cols. 2004), Reino Unido (Grant y cols. 2002a), Irlanda (O'Reilly y cols. 2004) y República Checa (Ayele y cols. 2005). En el único estudio que se ha publicado sobre carne picada para consumo humano, no han sido halladas células viables de Map (Maher y cols. 2004). Tampoco se obtuvieron resultados positivos en el estudio realizado sobre muestras de músculo de 100 bovinos procedentes del matadero de Bilbao (Neiker, datos sin publicar). Dada la alta persistencia de esta bacteria en el medio, también está siendo investigado el posible papel del agua como vehículo de infección para el ser humano. Experimentos del efecto del cloro utilizado para potabilizar el agua sobre la viabilidad de Map, indican una reducción de células viables en el rango 1,32-2,82 log10 (2 mg/ml cloro) (Whan y cols. 2001), que se ven reducidas a 0,94 log10 al encontrarse en el interior de protozoos de vida libre, donde incluso pueden hasta multiplicarse (Mura y 71 EPIDEMIOLOGÍA cols. 2006, Whan y cols. 2006). Map ha sido detectado por PCR en el 32,3% de las 96 muestras de agua del río Taff (Reino Unido) analizadas y aislado del 12,5% de las mismas (Pickup y cols. 2005). En Irlanda del Norte se aisló en el 4,16% de 192 muestras de agua del afluente de entrada a plantas potabilizadoras, además de encontrar su DNA en el 8% de ellas (Whan y cols. 2005b). Pickup y cols. han demostrado la presencia de este patógeno en zonas de captación de aguas, en agua de río para uso doméstico y en el efluente de plantas de aguas residuales (Pickup y cols. 2006). Tabla 3. Estudios sobre la detección de Map en productos lácteos. Estudio (Millar y cols. 1996) (Grant y cols. 2001a) País Reino Unido Reino Unido (Muehlherr y cols. 2003) Suiza (Stephan y cols. 2002) Suiza (Corti y cols. 2002) Suiza (Bosshard y cols. 2006) Suiza España (Gral.Norte) Tipo de muestra Leche comercial pasterizada bovina Leche tanque ovina-caprina Leche tanque ovina-caprina Leche tanque bovina Leche tanque bovina Leche tanque bovina Leche tanque bovina Leche individual (Pillai y cols. 2002) EEUU bovina Leche tanque (Stabel y cols. 2002b) EEUU bovina Reino Leche tanque (Grant y cols. 2002a) Unido bovina Leche comercial Reino pasterizada (Grant y cols. 2002a) Unido bovina (O'Doherty y cols. Leche tanque Irlanda 2002b) bovina Leche comercial (O'Doherty y cols. pasterizada 2002b) Irlanda bovina-caprina Leche individual (Djonne y cols. 2003) Noruega caprina Leche tanque (Jayarao y cols. 2004) EEUU bovina Leche tanque (O'Reilly y cols. 2004) Irlanda bovina Leche comercial pasterizada (O'Reilly y cols. 2004) Irlanda bovina Leche comercial República pasterizada Checa bovina (Ayele y cols. 2005) Leche comercial pasterizada bovina (Ellingson y cols. 2005a) EEUU (Ikonomopoulos y cols. 2005) Grecia Queso Feta (Ikonomopoulos y cols. República Queso de leche 2005) Checa bovina Países Leche en polvo (Hruska y cols. 2005) europeos infantil Leche comercial pasterizada (Paolicchi y cols. 2006) Argentina bovina Requesón de (Clark, Jr. y cols. 2006) EEUU leche bovina (Sevilla y cols. 2003) PCR+/total (%) 22/312 (7) Cultivo+/total (%) descontaminación 0,1% Cloruro de 9/18 (50) PCR+ Benzalkonio ó 6/36 (16) PCR0,1/0,7% HPC, 18 h. 0/14 (0) - 1/90 (1,1) 15/63 (23,8) 79/344 (23) 0/14 (0) - 0/90 (0) 0,75% HPC, 5 h. - - 112/501 (22,4) - - 273/1384 (19,7) - - 3/100 (3) - - 7/70 (10) 16/200 (8) - - 10/20 (50) 1/20 (5) 0,75% HPC, 18 h. 35/52 (67,3) 0/52 (0) 0,9% HPC, 18 h. (37ºC) 19/244 (7,8) 4/244 (1,6) 0,75% HPC, 5 h. 67/567 (11,8) 10/567 (1,8) 0,75% HPC, 5 h. - 0/310 (0) 0,75% HPC, 5 h. - 0/77 (0) – 0/9 (0) 0,75% HPC, 5 h. 24/340 (7,1) 0/340 (0) 0,75% HPC, 5 h. 8/29 (27,5) 6/29 (20,6) 0,75% HPC, 18 h. 50/389 (12,9) 1/389 (0,25) 0,75% HPC, 5 h. 35/357 (9,8) 0/357 (0) 0,75% HPC, 5 h. - 4/244 (1,6) 0,75% HPC, 5 h. (37ºC) 452/702 (64) 20/702 (2,84) no 21/42 (50) 2/42 (4,7) 0,75% HPC, 5 h. 5/42 (11,9) 1/42 (2,4) 0,75% HPC, 5 h. 25/51 (49) 18/51 (35,3) 0,75% HPC, 4 h. 2/70 (2,9) 2/70 (2,9) 0,75% HPC, 18 h. 5/98 (5) 0/98 (0) no 72 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA Como consecuencia de todos estos hallazgos la preocupación sobre la salud pública ha crecido considerablemente, y los estudios sobre inactivación de Map se han multiplicado. En 1996 fue demostrada su persistencia en leche pasterizada por dos métodos diferentes (estándar y estático: 63,5ºC durante 30 min.; HTST o alta temperatura corto tiempo: 71,7ºC durante 15 s.) al ser inoculada con grandes cantidades de la bacteria (Grant y cols. 1996). Posteriormente, Stabel y cols. publicaron un trabajo en el que se afirmaba que el método HTST era suficientemente efectivo para la inactivación de Map (Stabel y cols. 1997). Mientras algunos autores afirmaban aislar el bacilo de leche tratada por HTST hasta con concentraciones iniciales de 10 CFU/ml (Sung y cols. 1998, Grant y cols. 1998a), otros defendían la total inactivación de Map al menos cuando se tata de concentraciones esperables en leche cruda natural (Keswani y cols. 1998, Stabel 2000b). La ampliación de los tiempos de pasterización (72ºC, 25 s.) sí parecía ser suficiente para acabar con todas las CFUs (Grant y cols. 1999), pero el incremento en la temperatura y duración de este tipo de tratamientos incide negativamente en las propiedades y características organolépticas de la leche. En estudios recientes (a nivel de laboratorio, en plantas piloto o en plantas industriales) sobre una variedad de condiciones térmicas y temporales, la HTST ha conseguido una reducción considerable de células viables de Map en general (4-7 log10). Sin embargo, exceptuando los trabajos de Pearce y cols. y de Stabel y cols. (Pearce y cols. 2001, Stabel 2001) donde descontaminan la muestra tratada antes de ser cultivada, se ha podido observar la supervivencia de pequeñas cantidades de Map, tanto en estudios donde se ha inoculado artificialmente la bacteria (Gao y cols. 2002, Hammer y cols. 2002, Stabel y cols. 2004b, McDonald y cols. 2005, Grant y cols. 2005a, Hammer y cols. 2006), como en los que se ha utilizado leche infectada de modo natural (Grant y cols. 2002b, Ayele y cols. 2005). Estos hallazgos invitan a proseguir la búsqueda de métodos más eficaces de esterilización. En vista de las diferencias que se observan entre los resultados y conclusiones de todos estos trabajos, la propuesta de varios grupos de investigación ha sido la adopción de métodos consensuados que contemplen las posibles causas de esas diferencias (Klijn y cols. 2001, Hasting y cols. 2001, Lund y cols. 2002). El trabajo realizado para tratar de mejorar y/o unificar los métodos de detección de Map en leche, en otros productos lácteos, y en agua, es muy abundante (Grant y cols. 2000, Odumeru y cols. 2001, Dundee y cols. 2001, Stratmann y cols. 2002, Smith y cols. 2003, Grant y cols. 2003, Donaghy y cols. 2003a, Donaghy y cols. 2003b, Grant y cols. 2004, Sasahara y cols. 2004, Rodriguez-Lazaro y cols. 2004, O'Mahony y cols. 2004, Khare y cols. 2004, Wiszniewska y cols. 2004, Tasara y cols. 2005, Rodriguez-Lazaro y cols. 2005, Whan y cols. 2005a, Stratmann y cols. 2006, Bosshard y cols. 2006, Metzger-Boddien y cols. 2006). 73 EPIDEMIOLOGÍA Map es también resistente al curado de los quesos, aunque durante el proceso los recuentos de células viables van disminuyendo lenta pero progresivamente (Sung y cols. 2000, Spahr y cols. 2001, Donaghy y cols. 2004). En la viabilidad de Map durante el curado influyen factores como las temperaturas de procesado, el pH, la cantidad de agua, y evidentemente, el grado de contaminación de la leche utilizada para su elaboración. Es necesario tener en consideración el efecto concentrador del curado, lo que puede suponer pasar de 10 CFU Map/ml de leche a 100 CFUs Map/g de queso (Donaghy y cols. 2004). El tiempo necesario para obtener una reducción de 1 log10 en los recuentos de Map (valor de supervivencia D10) es de 36,5-59,9 días para el queso fresco (Sung y cols. 2000), 45,5 días para el Tilsiter suizo (Spahr y cols. 2001), 27,8 días para el Emmental suizo (Spahr y cols. 2001), 90-107 días para el Cheddar (Donaghy y cols. 2004). Según Grant y cols., el fracaso observado en el aislamiento de Map tanto en estudios de detección en productos lácteos como de supervivencia a tratamientos de esterilización, puede deberse a bajas concentraciones de células viables, métodos de cultivo ineficaces, o al mal procesamiento de muestras (Grant y cols. 2004). Factores como el volumen de muestra analizado, la descontaminación química de la muestra, o el tiempo transcurrido desde el tratamiento térmico hasta el análisis (inmediatamente o refrigeración hasta su uso) parecen tener efecto en la eficacia de aislamiento de Map a partir de leche pasterizada (Grant y cols. 2004, Gao y cols. 2005). La tendencia de formar grumos que presenta esta micobacteria, ha sido señalada como posible mecanismo de resistencia a los tratamientos térmicos (Klijn y cols. 2001), proponiendo que las bacterias del interior del grumo estarían protegidas del calor (>104 bacterias/grumo). Aunque esta hipótesis ha sido ampliamente descartada, sí parece que este fenómeno pueda influir en la supervivencia de Map, como demostraría la mayor inactivación de células observada al romper estos grumos por medio de homogenización antes de ser pasterizadas (Grant y cols. 2005a). Herman y cols. descartan totalmente la hipótesis de Klijn y cols. (2001), pues dicen no detectar grumos tan grandes en leche ni en heces de vaca en casos de paratuberculosis natural (Herman y cols. 2006). Además, demuestran una activación de Map en leche por medio de calentamiento, lo que explicaría su persistencia a este tipo de tratamientos, hipótesis previamente propuesta por Hammer y cols. (2002). La homogenización que se aplica a la leche para prevenir la formación de nata rompiendo los glóbulos de grasa, favorece la inactivación de Map en el proceso de pasterización, sin embargo no garantiza la muerte del 100% de estas bacterias (Grant y cols. 2002b, McDonald y cols. 2005, Grant y cols. 2005a). Otro proceso normalmente aplicado a la leche es la centrifugación (bactofugación), con el fin de precipitar esporas de clostridios (Torres-Anjel y cols. 1971) y otras partículas. En condiciones de laboratorio, una centrifugación de 10 segundos a 7.000 g (precalentada a 60ºC) también parece ser capaz de eliminar una media de 85 a 93% o de 74 a 79% de las células de 74 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA Map de leche artificialmente inoculada, dependiendo de si el inóculo estaba formado por células libres o grumos (Grant y cols. 2005b). Es necesario estudiar otros procesos de esterilización que no alteren las cualidades organolépticas y nutritivas de la leche, y que consigan eliminar completamente las células viables de Map. En algunos países ya se vende leche microfiltrada (PurFiltreTM), y aunque las primeras pruebas de laboratorio con Map parezcan prometedoras (Grant y cols. 2005b), el principal inconveniente es que la microfiltración sólo es aplicable a leche desnatada. El uso de irradiación gamma (Stabel y cols. 2001a), de campos eléctricos pulsados (Rowan y cols. 2001) y de luz de láser de ultravioletas (Smith y cols. 2002), son algunos de los métodos potenciales para la esterilización de la leche, que ya han sido objeto de estudios preliminares con Map. La aplicación de altas presiones también ha sido empleada en la inactivación de microorganismos patógenos (Staphylococcus aureus, Listeria sp., Escherichia coli,...) que se encuentran en alimentos (Timson y cols. 1965, Butz y cols. 1986, Hoover y cols. 1989, Mertens y cols. 1992, Cuoghi 1993, Trujillo 2002), sin embargo no existían trabajos sobre sus efectos sobre Map. La leche cruda presurizada con 400-600 MPa posee una calidad microbiológica similar a la de la pasterizada (72 ºC, 15 s) (Mussa y cols. 1997, Buffa y cols. 2001, Trujillo 2002), y aunque no destruye las esporas bacterianas (por ejemplo Bacillus sp.), se puede estimular su germinación con presiones entre 50-300 MPa, convirtiéndose en susceptibles a los tratamientos térmicos o de presión posteriores (Smelt 1998). La efectividad de los tratamientos de leche con altas presiones puede incrementarse si se combinan con el uso de bacteriocinas (nisina, lacticina, lisocima,...) y/o con temperaturas de 30-50 ºC (García-Graells y cols. 1999, Morgan y cols. 2000, Lopez-Pedemonte y cols. 2003, Rodriguez y cols. 2005, Arques y cols. 2005). Epidemiología molecular Las estrategias de prevención y control de enfermedades deben asentarse en el entendimiento epidemiológico de la enfermedad, para lo que es necesario conocer las posibles adaptaciones evolutivas entre el hospedador y el parásito, que permiten a éste multiplicarse en las poblaciones susceptibles. Estas adaptaciones se reflejan en el genoma del parásito y son susceptibles de ser detectadas por medio de técnicas llamadas genéricamente de genotipado. Las micobacterias han sido objeto de numerosos trabajos de investigación en este campo debido principalmente a su implicación en importantes enfermedades animales y humanas. La dificultad en la diferenciación fenotípica por medio de los métodos estándares clásicos ha generado una gran controversia en la clasificación taxonómica de las especies y subespecies de este género. La distinción a nivel de cepa, ha sido posible gracias a la caracterización genética de estos microorganismos por medio de técnicas moleculares. Tal y como se ha comentado anteriormente, la identificación de los aislamientos de Map se basa en la alcohol-ácido resistencia, su extremadamente baja tasa de crecimiento, la dependencia de micobactina 75 EPIDEMIOLOGÍA exógena, y a la presencia de varias copias de la secuencia IS900 insertadas en su genoma. No obstante, esto podría no ser suficiente debido a la descripción de algunas cepas no dependientes de micobactina (Aduriz y cols. 1995a, Motiwala y cols. 2004), y a la presencia de elementos similares a la IS900 (IS900-like) en otras bacterias (Cousins y cols. 1999, Naser y cols. 1999, Englund y cols. 2002, Motiwala y cols. 2004). En el caso de Map, la técnica de tipado genético más utilizada es el análisis RFLP por medio de sondas específicas de IS900, tras la digestión del DNA cromosómico con diferentes enzimas (IS900-RFLP). En el primer trabajo publicado de IS900-RFLP, fueron analizadas 4 cepas de referencia y 46 aislamientos de vacas, ovejas y cabras procedentes de Nueva Zelanda, Australia, Canadá, Islas Feroe y Noruega (Collins y cols. 1990a). Tras digerir el DNA micobacteriano con la endonucleasa BstEII, obtuvieron 10 patrones de hibridación diferentes que fueron clasificados en dos grandes grupos. Estos pasaron a denominarse tipo bovino (“cattle type”, C) y tipo ovino (“sheep type”, S), debido a su aparente predominancia en esas especies hospedadoras, a pesar de no ser estrictamente específicas. Dos ovejas procedentes de Canadá, estaban infectadas por un tipo de cepa que designaron intermedio (I). La dificultad en el cultivo de las cepas de tipo S quedó claramente patente. Desde entonces se ha mantenido esta hipótesis de que existen dos principales grupos de cepas de Map. Un estudio estadounidense posterior que incluía 29 cultivos de origen bovino, y sólo 4 procedentes de pequeños rumiantes, no pudo identificar los dos grupos de cepas detectados en el trabajo de Collins (Whipple y cols. 1990), probablemente por ser una muestra más sesgada. No obstante, se subrayó el poder discriminatorio de BstEII sobre el de otros enzimas de restricción (BclI, PstI y PvuII). Más tarde, el genotipado de 5 aislamientos de ovejas surafricanas reveló que estos pertenecían al tipo intermedio (de Lisle y cols. 1992). En Nueva Zelanda, tras analizar 20 aislamientos obtenidos de ciervos de explotaciones establecidas en pastos previamente utilizados por vacas y ovejas, se observó que el 15% de las cepas se incluía en el tipo S, mientras el 85% restante lo hacía en el tipo C (de Lisle y cols. 1993). El análisis PvuII-IS900-RFLP de aislamientos procedentes de 16 cabras de Noruega, 5 vacas y 2 ciervos de Dinamarca, una oveja de Grecia, y una oveja de las Islas Feroe, demostró que todos ellos eran similares entre sí, exceptuando el de la oveja de las Islas Feroe, que era marcadamente diferente (Thoresen y cols. 1994b). Pavlik y cols. detectaron 3 grupos de patrones PstIIS900-RFLP consistentes con los descritos hasta el momento con otros enzimas, al estudiar 84 cultivos aislados de 70 animales (56 vacas, 13 ovejas y una cabra) procedentes de Europa (principalmente Eslovaquia y República Checa), uno de un paciente de Crohn estadounidense, y 5 de vacas australianas (Pavlik y cols. 1995). En otro trabajo, fueron tipados y clasificados 28 aislamientos ovinos procedentes de África (26 de Marruecos y 2 de Sudáfrica), 7 caprinos y 9 bovinos de Alemania, y 12 bovinos de Marruecos y EEUU, en base a la velocidad de crecimiento y el análisis PvuII-IS900RFLP (Bauerfeind y cols. 1996). Los cinco patrones diferentes hallados fueron 76 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA clasificados en dos grupos. Los del primer grupo, los denominados 1, 2 y 3, sólo fueron detectados en ovejas, y fenotípicamente eran de crecimiento lento. Contrariamente, todos los cultivos bovinos y caprinos fueron de crecimiento rápido, y todos compartían el mismo patrón de hibridación (4) a excepción de uno (5). Las micobacterias obtenidas de raspados de mucosa intestinal de 5 ovejas australianas pertenecían al tipo S1 previamente descrito por Collins y cols. (Choy y cols. 1998). El tipado de 15 aislamientos de conejo en Escocia reveló que 14 de ellos tenían el mismo patrón PstIBstEII-IS900-RFLP (B-C17) de tipo bovino (Greig y cols. 1999). Posteriormente, este método (PstI-BstEII-IS900-RFLP) fue propuesto por Pavlik y cols. como técnica estándar para el tipado de cepas de Map, siendo aplicado a 1008 aislamientos de diversos hospedadores y regiones (Pavlik y cols. 1999a). En ese trabajo fueron detectados los mismos dos grupos principales y el intermedio (Figuras 6 y 7), pero según los autores no existía relación de especificidad o correlación entre cepas, velocidad de crecimiento y hospedadores. Entre 61 aislados de vacas y ciervos procedentes de Argentina, fueron diferenciados 4 patrones de BstEII y 2 de PstI, todos de tipo bovino (Moreira y cols. 1999). Además el 75% de los mismos pertenecían a un único PstI-BstEII-IS900-RFLP, el B-C17, prevalente en el Reino Unido. Figura 6. A la derecha, representación gráfica de los patrones de bandas IS900-RFLP obtenidos con la endonucleasa PstI por Pavlik y cols., al analizar más de 1000 aislamientos de Map (Pavlik y cols. 1999a). A cada patrón se le asigna una letra correlativa. Las flechas indican bandas que aparecen o desaparecen en comparación con el tipo C1. A la izquierda, el dendrograma que representa el grado de similitud entre los distintos patrones de bandas. En el año 2000 se llevaron a cabo dos importantes trabajos sobre epidemiología molecular en Australia, y ambos subrayaron la restringida diversidad de cepas observada (Cousins y cols. 2000, Whittington y cols. 2000b). Todos los cultivos ovinos analizados fueron cepas de tipo S, y casi todos tenían exactamente el mismo patrón (S1), al contrario que los obtenidos de bovino, caprino, alpaca, rinoceronte y humano, que eran de tipo C. En el trabajo de Cousins y cols. el 66% de todos los aislados y el 59% de los de origen bovino eran del tipo C3. Mientras, las cepas de tipo C3 y C1 conjuntamente, representaron el 85% de los aislados en el de Whittington y cols., en el 77 EPIDEMIOLOGÍA que además detectaron la ausencia de cepas C3 en bovino de carne y otras diferencias interesantes en la distribución de las cepas de vacas de leche y de vacas de carne que relacionaron con la diferenciación entre el mercado lechero y el cárnico. En la República Checa, han sido analizados por el método RFLP propuesto previamente como estándar aislamientos obtenidos de animales salvajes libres o de explotaciones (Pavlik y cols. 2000a, Machackova y cols. 2004). Estos estudios sugieren que la prevalencia del tipo B-C1 es la más alta entre las especies ganaderas tradicionales, y que va en aumento entre especies salvajes. Más recientemente, la idea de una diversidad genética restringida entre aislamientos de Map se ha visto reforzada en Noruega al haber detectado que el 84% de los cultivos tipados (51 de caprinos y 4 bovinos) eran del mismo tipo (B-C1) (Djonne y cols. 2005). Figura 7. A la derecha, representación gráfica de los patrones de bandas IS900-RFLP obtenidos con la endonucleasa BstEII por Pavlik y cols., al analizar más de 1000 aislamientos de Map (Pavlik y cols. 1999a). A cada patrón se le asigna un nombre compuesto de una letra (indica si es tipo C, S o I) y un número correlativo. Las flechas indican bandas que aparecen o desaparecen en comparación con el tipo C1. A la izquierda, el dendrograma que representa el grado de similitud entre los distintos patrones de bandas. 78 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA Un grupo de investigación australiano desarrolló en 1999 una técnica rápida y sencilla (IS1311 PCR-REA) que permite diferenciar entre M. avium y las cepas C y S de Map basada en la detección de mutaciones puntuales en la secuencia IS1311 presente en estas bacterias (Marsh y cols. 1999). En un trabajo posterior se pudo observar que existía un cuarto polimorfismo en la IS1311 en aislados de Map obtenidos de bisontes de EEUU (Whittington y cols. 2001b), que denominaron tipo B (“bison type”, B). Las cepas tipo B dan patrones de RFLP agrupables con las de tipo C. Otra técnica prometedora para realizar el tipado genético de esta bacteria parásita, es la electroforesis en gel de campo pulsado del genoma digerido. Tal y como se ha revisado anteriormente, el PFGE ha sido de gran utilidad para el tipado de otras importantes micobacterias como M. avium y M. tuberculosis. En el primer trabajo publicado de tipado de Map por medio de PFGE, fueron comparados los patrones de restricción de 35 aislamientos (27 bovinos, 5 de alpacas, 2 ovinos y uno caprino) con varias endonucleasas (Feizabadi y cols. 1997b). No se detectó ninguna variabilidad con DraI, sin embargo, XbaI y SpeI diferenciaron los cultivos en dos grupos muy similares entre sí. Un estudio escocés sobre conejos mencionado anteriormente, obtenía resultados parecidos al del IS900-RFLP (Greig y cols. 1999). Figura 8. Fotografía de los patrones de bandas PFGE obtenidos con la endonucleasa SnaBI por Stevenson y cols. al analizar 93 aislamientos de Map (Stevenson y cols. 2002). Los rótulos de encima corresponden al nombre del aislamiento. Los números de abajo corresponden al nombre asignado a cada pulsotipo (patrón de bandas) diferente. Los patrones que figuran en el panel de la izquierda se agrupan en el Tipo II, y los de la derecha en el Tipo I. En un intento de estandarizar el PFGE para el tipado de cepas de Map, Stevenson y cols. llevaron a cabo la caracterización molecular de 5 aislamientos pigmentados (todos ovinos) y 88 no pigmentados (18 ovinos y el resto procedentes de vacas, conejos, cabras, ciervos y otras especies silvestres) por varios métodos (Stevenson y cols. 2002). Los enzimas elegidos para PFGE fueron SnaBI y SpeI, y los patrones distintos con cada 79 EPIDEMIOLOGÍA enzima se designaron con un número, lo que da como resultado un perfil múltiple de campo pulsado con dos números para cada aislado (nº patrón SnaBI-nº patrón SpeI). De ese modo, en esa muestra fueron descritos 16 perfiles múltiples que se agrupaban en dos grandes grupos o tipos (Tipo I y II; Ver Figuras 8 y 9). Figura 9. Fotografía de los patrones de bandas PFGE obtenidos con la endonucleasa SpeI por Stevenson y cols. al analizar 93 aislamientos de Map (Stevenson y cols. 2002). Los rótulos de encima corresponden al nombre del aislamiento. Los números de abajo corresponden al nombre asignado a cada pulsotipo diferente. Los patrones que figuran en el panel de la izquierda se agrupan en el Tipo II, y los de la derecha en el Tipo I. Figura 10. Fotografías de los nuevos patrones de bandas PFGE obtenidos con las endonucleasas SnaBI (izquierda) y SpeI (derecha) por de Juan y cols. al analizar 44 aislamientos de Map (de Juan y cols. 2005). Los números de arriba corresponden al nombre asignado a cada pulsotipo. Patrones SnaBI nuevos, del 12 al 19, y patrones SpeI nuevos, del 10 al 13. 80 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA Las cepas comprendidas en el Tipo I, son de crecimiento más lento, con una fuerte preferencia de hospedador por la especie ovina, y aparentemente más virulenta para este tipo de hospedador. Las cepas comprendidas en el Tipo II son de crecimiento más rápido, y son comúnmente aisladas de vacas, cabras, ciervos y otras especies, incluyendo la humana. Figura 11. Dendrograma representando la similitud entre todos los perfiles múltiples de PFGE de Map (nº patrón SnaBI-nº patrón SpeI) descritos hasta el momento (de Juan y cols. 2005). Según éste, las cepas se agrupan dentro de tres tipos diferentes: el Tipo I, donde se incluyen todos los aislados pigmentados ovinos descritos por Stevenson y cols. (Stevenson y cols. 2002), el Tipo II, que incluye cepas de varias especies hospedadoras, y el Tipo III, sólo detectado en dos aislamientos caprinos de España (de Juan y cols. 2005). El tipado por medio de SnaBI-SpeI-PFGE de 44 nuevos aislamientos procedentes de cabras de España, Escocia, y Noruega (30, 11 y 3, respectivamente), reveló 10 nuevos perfiles múltiples (de Juan y cols. 2005) (Figura 10). Uno de ellos fue hallado sólo en dos cabras españolas, y al diferir de los comprendidos en los Tipos I y II, fue descrito el 81 EPIDEMIOLOGÍA Tipo III, un tipo intermedio considerado más cercano al Tipo I (Figura 11). Así, el Tipo I se podía considerar comparable al tipo S, el Tipo II al C, y el Tipo III al I. Más recientemente, de Juan y cols. han observado por medio de PCR cepas de Tipo I/III o IS1311-S infectando tanto a la especie ovina como a la caprina y a la bovina en España (de Juan y cols. 2006a). En la Tabla 4 se puede consultar el tipo de cepa que se ha descrito en varias especies hospedadoras de Map procedentes de varios países, independientemente de la técnica utilizada. Tabla 4. Distribución de los tipos de cepas de Map en hospedadores y regiones, según la bibliografía. CEPAS DE TIPO BOVINO Países Bibliografía Nueva Zelanda, (Whipple y cols. 1990, Australia, EEUU, Collins y cols. 1990a, Dinamarca, República Thoresen y cols. 1994b, Checa, Eslovaquia, Pavlik y cols. 1995, Hungría, Alemania, Bauerfeind y cols. 1996, Francia, Marruecos, Moreira y cols. 1999, Reino Unido, Austria, Greig y cols. 1999, Italia, Países Bajos, Pavlik y cols. 1999a, Eslovenia, España, Cousins y cols. 2000, Suecia, Argentina y Whittington y cols. Noruega 2000b, Djonne y cols. 2005) Canadá, EEUU, (Whipple y cols. 1990, República Checa, Collins y cols. 1990a, Francia, Grecia, Thoresen y cols. 1994b, Australia, España y Pavlik y cols. 1995, Reino Unido Pavlik y cols. 1999a, Stevenson y cols. 2002) CEPAS DE TIPO OVINO O INTERMEDIO Países Bibliografía Australia, Islandia (Whittington y cols. y España 2001d, de Juan y cols. 2006a) Caprino Nueva Zelanda, Noruega, Argentina, Alemania, Dinamarca, Italia, Reino Unido, Australia, EEUU, y España Nueva Zelanda, República Checa, y España Cérvidos Nueva Zelanda, República Checa, Reino Unido y Argentina Lagomorfos Reino Unido y República Checa Alpacas Rinocerontes Jabalí Australia Australia República Checa Muflón República Checa Humanos EEUU, República Checa, Países Bajos y Australia Hospedadores Bovino Ovino (Whipple y cols. 1990, Collins y cols. 1990a, Thoresen y cols. 1994b, Bauerfeind y cols. 1996, Pavlik y cols. 1999a, Cousins y cols. 2000, Djonne y cols. 2005, de Juan y cols. 2005, de Juan y cols. 2006a) (de Lisle y cols. 1993, Moreira y cols. 1999, Pavlik y cols. 1999a, Pavlik y cols. 2000a, Machackova y cols. 2004) (Greig y cols. 1999, Beard y cols. 2001a, Machackova y cols. 2004) (Cousins y cols. 2000) (Cousins y cols. 2000) (Machackova y cols. 2004) (Machackova y cols. 2004) (Collins y cols. 1990a, Pavlik y cols. 1999b, Naser y cols. 2000b, Whittington y cols. 2000b, Ghadiali y cols. 2004) 82 Canadá, Nueva Zelanda, Islas Feroe, Sudáfrica, Marruecos, Australia, Islandia, Noruega, Reino Unido, EEUU y España Nueva Zelanda y República Checa (Collins y cols. 1990a, de Lisle y cols. 1992, Thoresen y cols. 1994b, Bauerfeind y cols. 1996, Choy y cols. 1998, Cousins y cols. 2000, Whittington y cols. 2000b, Whittington y cols. 2001d, Stevenson y cols. 2002, Motiwala y cols. 2004, de Juan y cols. 2006a) (Collins y cols. 1990a, Pavlik y cols. 1995, de Juan y cols. 2005, de Juan y cols. 2006a) (de Lisle y cols. 1993, Machackova y cols. 2004) REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA Se han desarrollado otras técnicas de caracterización genética para intentar aumentar el poder de discriminación de los análisis de RFLP y de PFGE (Bull y cols. 2000, Pillai y cols. 2001, Motiwala y cols. 2003, Ghadiali y cols. 2004, Overduin y cols. 2004, Amonsin y cols. 2004). Sin embargo, algunas de ellas no proporcionan suficiente información adicional, y la proporcionada en otros casos no parece del todo fiable. Otras pueden ser interesantes, pero deben ser examinadas con una muestra representativa de cepas de distintos orígenes que tengan RFLP y/o PFGE conocidos, con el fin de verificar su fiabilidad y reproducibilidad para ser utilizadas en posteriores estudios de epidemiología molecular de paratuberculosis. Tal y como se comentaba en el apartado de Etiología. Tipado molecular, el método con mayor poder discriminatorio es el análisis MLSSR, según indicó el índice de diversidad de Simpson (hasta 0,96), por encima de IS900-RFLP, MPIL y AFLP (Motiwala y cols. 2003, Motiwala y cols. 2004, Amonsin y cols. 2004). En la actualidad se está trabajando en la comparación de resultados de PFGE y MLSSR (NeikerUniversidad de Minesota). PATOGÉNESIS Y PATOLOGÍA La patogénesis estudia la manera de originarse y desarrollarse una enfermedad. El agente patógeno entra en el hospedador y trata de replicarse para después ser liberado y poder diseminarse, mientras que el hospedador lucha por minimizar los daños causados y por eliminar el patógeno. Es necesario comprender con claridad la patogénesis de la enfermedad para poder llegar a prevenir la infección o tratar adecuadamente los animales infectados. En el proceso patogénico de la paratuberculosis influyen varios factores entre los que destacan los factores genéticos y el estatus inmune del hospedador 9(Clarke y cols. 1996b, Clarke 1997a, Koets y cols. 2000). Map es una bacteria intracelular facultativa que al infectar a especies rumiantes causa la enteritis granulomatosa fatal que conocemos como paratuberculosis o enfermedad de Johne. La dificultad en el aislamiento de la bacteria (tiempo, cepas de cultivo complicado,…), el largo período de incubación de la enfermedad (normalmente más de 2 años) y la dificultad en reproducir las características típicas de ésta de manera experimental (a pesar del éxito de Map en la naturaleza o precisamente por ello), han obstaculizado el estudio de sus mecanismos patogénicos, con lo que el conocimiento sobre esta materia es reducido (Coussens 2004, Stevenson 2006). Entrada e invasión de Map en el hospedador Está ampliamente aceptado que el mecanismo natural y principal de introducción de Map en el organismo es oral, por transmisión fecal-oral, en animales de menos de un año (Chiodini y cols. 1984a, Blood y cols. 1989, Sweeney 1996), aunque también existen otras vías de infección (materia revisada en el apartado Transmisión). El 83 PATOGÉNESIS Y PATOLOGÍA motivo de que animales jóvenes sean más susceptibles a la infección que aquellos de más edad, parece residir en la extensa superficie que abarcan las placas de Peyer intestinales en animales jóvenes, que va reduciéndose gradualmente con la edad, ya que ése parece ser el punto de entrada de la bacteria al organismo (Momotani y cols. 1988, Liebler y cols. 1988a, Liebler y cols. 1988b). Map se localiza y reside preferentemente en fagosomas o endosomas inmaduros de los macrófagos del hospedador, con predominio de aquellos asociados a las placas de Peyer ileales y yeyunales (Bendixen y cols. 1981, Momotani y cols. 1988, Pérez 1992, Peris 1992, Corpa y cols. 2000a), después de traspasar las barreras de la mucosa por endocitosis (Lugton 1999). A pesar de que algunos autores proponen como localización inicial las tonsilas y ganglios retrofaríngeos (Payne y cols. 1961, Lugton 1999), estas parecen ser transitorias y desaparecen sin ocasionar trastornos (García Marín y cols. 2000). No obstante, según avanza la enfermedad, los fagocitos infectados diseminan las micobacterias por otras partes del cuerpo al ser transportados en los vasos sanguíneos y linfáticos (Merkal 1984, van der Giessen y cols. 1995, Lugton 1999). Se ha detectado la presencia de Map en sangre, hígado, nódulos retrofaríngeos y mandibulares, bazo, pulmones, riñones, ubres, glándulas supramamarias, útero, testículos, epidídimo, y semen (Alexejeff-Goloff 1929, Doyle 1954, Tunkl y cols. 1965, Larsen y cols. 1970, Merkal y cols. 1982b, Merkal 1984, Koenig y cols. 1993, van der Giessen y cols. 1995, Collins 1997, Whitlock y cols. 1997, Pavlik y cols. 2000c, Eppleston y cols. 2001, Ayele y cols. 2004). La entrada de Map en el organismo está mediada por las células M epiteliales que recubren las cúpulas de las placas de Peyer del íleon y yeyuno (Momotani y cols. 1988, García Marín y cols. 1992a), y depende de la expresión de la proteína de membrana de 35 kDa de la bacteria (Bannantine y cols. 2003a), del puente de unión de fibronectina entre la proteína de acoplamiento de fibronectina (FAP) de Map y las integrinas de las células M (Secott y cols. 2002, Secott y cols. 2004), o de ambos eventos. Schleig y cols. mediante un modelo in vitro han demostrado la capacidad de Map para acoplarse a diferentes zonas del tracto intestinal sin encontrar diferencias significativas, aunque sí las han observado al emplear diferentes cepas del patógeno (Schleig y cols. 2005). Parece que también los enterocitos yeyunales no asociados a placas de Peyer son vía de entrada para los bacilos, al menos en cabras (Sigurdardottir y cols. 2005). Una vez que las bacterias han logrado entrar, son transportadas transcelularmente de manera libre o en leucocitos dentro de vacuolas, y posteriormente se introducen en fagosomas de macrófagos sub- e intra-epiteliales adyacentes a la placa de Peyer (Momotani y cols. 1988, Kaufmann 1995, Fujimura y cols. 1996, Lugton 1999, Valentin-Weigand y cols. 1999, Sigur-Dardottir y cols. 2001, Tessema y cols. 2001). Hipotéticamente, los antígenos se presentan a los linfocitos T (LT) “de memoria” en ese momento (Momotani y cols. 1988, García Marín y cols. 1992a), lo que se asocia a una resistencia 84 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA de animales de más edad, coincidiendo con la involución del tejido linfoide del íleon (Larsen y cols. 1975). La supervivencia y replicación de Map dentro de los macrófagos depende del grado de activación y diferenciación de los mismos. A pesar de que los macrófagos son capaces de controlar la propagación de Map, grandes cantidades de la micobacteria son citotóxicas y provocan su apoptosis (Bannantine y cols. 2002b). Durante la respuesta inmune celular (mediada por los LT auxiliares 1; LTh 1) se da la multiplicación y eliminación intracelular de bacilos de forma simultánea (Zhao y cols. 1997). Estos bacilos son capaces de sobrevivir inhibiendo la acidificación del fagosoma, lo que impide su maduración a fagolisosoma (Cheville y cols. 2001, Kuehnel y cols. 2001, Pieters 2001, Hostetter y cols. 2002, Hostetter y cols. 2003, Weiss y cols. 2004a). Map soporta los enzimas lisosómicos, el óxido nítrico y los demás mecanismos bactericidas que producen los macrófagos, ayudada entre otras cosas por su envoltura celular lipídica (Zhao y cols. 1997, Harris y cols. 2001, Tessema y cols. 2001). La bacteria libera súperóxido dismutasa (Liu y cols. 2001), suprime la presentación de antígenos a los LT (Weiss y cols. 2001), y altera la expresión de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad tipo II y de integrinas tipo LFA-1 (Alzuherri y cols. 1997). Los mecanismos de defensa que muestran los macrófagos hasta este punto, pueden ser considerados como inmunidad innata. La iniciación de la respuesta inmune (de inmunidad adquirida) frente a Map puede verse obstaculizada por una producción defectuosa de citoquinas proinflamatorias (como el factor de necrosis tumoral, TNF), y por un incremento en la expresión de interleuquina-10 (IL-10) (Weiss y cols. 2002, Coussens y cols. 2004). Las proteínas de choque térmico (hsp) probablemente actúan como activadoras de las células presentadoras de antígeno, pues parece ser que la hsp de 70 kDa micobacteriana es reconocida por estas células y provoca un incremento en la producción de IL-10 (Langelaar y cols. 2005a, Langelaar y cols. 2005b). Las células “natural killer” (NK) bovinas han sido recientemente caracterizadas, y podrían jugar un importante papel en la transición de inmunidad innata a inmunidad adquirida, por medio de la producción de interferón (IFN) en respuesta a los antígenos micobacterianos (Storset y cols. 2003, Olsen y cols. 2005). Factores de virulencia Se ha tratado de identificar factores de virulencia de Map principalmente a través de estudios sobre proteínas antigénicas de la bacteria, pues se cree que éstas son la llave de los mecanismos patogénicos, además de ser específicos (no todos) y potencialmente útiles en el desarrollo de vacunas y métodos diagnósticos (Stevenson 2006). Al principio este proceso se llevó a cabo creando bibliotecas de expresión (“expression libraries”) con antisueros de animales experimentalmente o naturalmente infectados (método hoy día conocido como IVIAT; tecnología de antígenos inducidos in vivo). Algunas de las proteínas identificadas por IVIAT han sido utilizadas posteriormente en 85 PATOGÉNESIS Y PATOLOGÍA pruebas serológicas, pero no han elucidado los mecanismos patogénicos (Stevenson 2006). Tal y como ha sido comentado anteriormente, la inmunogenicidad de las proteínas de choque térmico ha sido ampliamente estudiada (Koets y cols. 1999, Langelaar y cols. 2005a, Langelaar y cols. 2005b). La hsp de 70kDa parece jugar un importante papel con respecto a la protección celular, además de haber sido probada su utilización para producir una vacuna (Koets y cols. 2006a). La hsp de 34kDa es una posible serina proteasa, que aumenta la supervivencia de Map en el interior de macrófagos (Stevenson 2006). La proteína de membrana de 35 kDa interviene en la invasión de las células epiteliales bovinas (Stevenson 2006). Miembros de entre 30 y 32 kDa de la familia micolil-transferasa (Ag85) de Map son antígenos inmunodominantes para las células T, y son rápidamente reconocidos tanto en infecciones experimentales como naturales, lo que los hace buenos candidatos para su uso como vacuna (Rosseels y cols. 2006). El operón de proteínas transportadoras ABC específico de Map que se encuentra en una isla genética de patogenicidad de 38 kbp junto a otros genes relacionados con el metabolismo del hierro y con un posible papel patogénico, es expresado in vivo e in vitro en la superficie micobacteriana, y dichas proteínas son reconocidas por el sistema inmune de animales infectados (Stevenson 2006). Gracias a la secuenciación del genoma completo de Map, es posible llevar a cabo arrays de proteínas (para identificar aquellas con poder inmunogénico), como han hecho Bannantine y cols. al haber detectado recientemente 10 proteínas (de las cuáles 7 no eran conocidas) reconocidas por el sistema inmune de vacas infectadas (Bannantine y cols. 2006a). Por medio de la prueba de IFN-gamma (IFN-γ) con células mononucleares de sangre periférica bovina, Nagata y cols. han identificado tres proteínas recombinantes de las cuales 2 son de la familia PPE (Pro-Pro-Glu) (Stevenson 2006, Nagata y cols. 2006). La versión recombinante de otra lipoproteína recientemente identificada de 22 kDa (P22) provocó secreción de IFN-γ en la sangre de 8 de 9 ovejas vacunadas con la cepa atenuada de Map 316F, que no provocó el mismo efecto en el grupo de 5 no vacunadas (Dupont y cols. 2005). También se están dando avances en la identificación de posibles factores de virulencia mediante análisis de electroforesis en dos dimensiones y espectrometría de masas por medio de ionización-desorción por laser asistida por matriz acoplada a un analizador de tiempo de vuelo (MALDI-tof) (Hughes y cols. 2006). Otro abordaje posible es la creación de bibliotecas genéticas a partir de cepas mutantes, método hasta ahora no usado por la incapacidad de manipular genéticamente a Map, pero que ya está dando los primeros resultados utilizando transposones (Stevenson 2006, Shin y cols. 2006). Respuesta inmune del hospedador Como es típico en casos de paratuberculosis natural, tras la infección se abre una fase asintomática de dos años o más, durante la que no es posible observar una respuesta inmunológica celular ni humoral diferenciada, ni detectar la excreción de la bacteria en 86 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA heces (Clarke 1997b). En casos de paratuberculosis inducida experimentalmente, se ha observado la producción de anticuerpos anti-Map que incluso preceden a la respuesta celular inicial típica (Waters y cols. 2003). Los estadios iniciales y subclínicos de la enfermedad se caracterizan por una alta respuesta inmune celular (CMI), mientras en estadios clínicos avanzados predomina la respuesta inmune humoral (Bendixen 1978, Chiodini y cols. 1984a, Pérez y cols. 1996, Burrells y cols. 1998, Stabel 2000a, Stabel 2000c). Los primeros signos de la infección son la producción de IFN- y la proliferación de linfocitos en respuesta a la inoculación de antígenos micobacterianos como el derivado proteico purificado (PPD). Esto indica la activación de la inmunidad celular, y la excreción intermitente de la bacteria en heces. Esta respuesta irá en incremento junto con la carga micobacteriana excretada en las heces, mientras, los anticuerpos de la respuesta humoral pueden ir apareciendo. Esta fase de aparente equilibrio entre patógeno y hospedador puede durar años. Al final, la respuesta celular cae y la excreción de bacterias aumenta, lo que lleva al estado clínico de la enfermedad (Chiodini 1996). En la especie bovina se distinguen bajos excretores, excretores moderados y grandes excretores (o súper-excretores) (Whitlock y cols. 2006b). En comparación con los menos excretores, el grupo de grandes excretores se asocia con animales de baja respuesta celular (sobre todo en las fases iniciales de infección), asentamiento más temprano de la enfermedad y títulos de anticuerpos (respuesta humoral) más altos (Koets y cols. 2006b). Se considera que la inmunidad de protección contra Map viene dada por la respuesta inmune celular, con lo que esa protección depende de las interacciones entre las células T y las células presentadoras de antígeno infectadas (Kaufmann 2001). En la respuesta inmune celular, las células T excretan citoquinas que activan la eliminación de Map en los macrófagos (Stabel 2000c). Los macrófagos presentan los antígenos de Map a las células T, que liberan IL-2. Esta interleuquina impulsa la propagación de los LT CD8+ citolíticos y los CD4+LTh1 (Chiodini y cols. 1992), y estos últimos, liberan más IL-2, -IFN, TNF y factor estimulante de colonias de granulocitos de macrófago (GM-CSF), con el objetivo de activar el poder bactericida de los macrófagos (Kaufmann 1995, Stabel 1995, Begara-McGorum y cols. 1998, Valentin-Weigand y cols. 1999, Flesch y cols. 1999, Lee y cols. 2001, Zur y cols. 2003). Después, la población de CD4+LTh1 cae impulsada al final por la proliferación de las células T gamma-delta (γδ), entrando así en una fase anérgica (Chiodini y cols. 1992, Koets y cols. 2002, Langelaar y cols. 2002). Los cometidos de estos LT-γδ no están del todo claros, y parece que hay distintas subpoblaciones de estas células con comportamientos diferentes (Park y cols. 2000, Koets 2006). Hipotéticamente, el descenso de la respuesta inmune celular refleja un cambio de respuesta de tipo 1 (con LTh1) a tipo 2 (con LTh2) (Chiodini 1996, Clarke 1997b), de acuerdo con la dicotomía de las células T auxiliares (Mosmann y cols. 1986). Los estudios realizados con animales con paratuberculosis no han sido capaces de demostrar ese hipotético cambio de Th1 protector a Th2 permisivo, sin embargo el 87 PATOGÉNESIS Y PATOLOGÍA descenso de IFN-γ, y el incremento de IL-10 y TGF-β parecen más evidentes (Lee y cols. 2001, Stabel y cols. 2002a, Coussens y cols. 2005, Pérez y cols. 2006). La neutralización de la IL-10 con anticuerpos monoclonales provoca un importante incremento en la producción de IFN-γ, lo que demuestra el efecto supresor de esta citoquina sobre la respuesta inmune (Buza y cols. 2004). En macrófagos bovinos cultivados en presencia de Map se ha observado además el incremento de GM-CSF e IL-8, así como el descenso de IL-12 y TNF-α (Weiss y cols. 2002). En la última fase, la fase clínica, los CD4+LTh2 producen citoquinas (IL-4 e IL-10 entre otras) que suprimen la respuesta celular y activan la respuesta humoral (González 1998), con el aumento de los linfocitos B (LB) y la producción de anticuerpos (Burrells y cols. 1999, Ostrowski y cols. 2003, Langelaar y cols. 2005b), quedando establecida la respuesta humoral. Coussens y cols. han llevado a cabo varios estudios para comprender las interacciones hospedador-patógeno valiéndose de la tecnología de la PCR a tiempo real cuantitativa (Q-RT-PCR) y los “expressed sequence tag microarrays” (EST) y cDNA (Yao y cols. 2001, Coussens y cols. 2002, Coussens y cols. 2003, Coussens 2004, Coussens y cols. 2004, Coussens y cols. 2005). Demostraron la represión de 83 genes relacionados con la respuesta inmune celular (que codifican para la proteína de microesférula 1, el factor de crecimiento de fibroblastos, la proteína quinasa Lyn B,...) en células mononucleares de sangre periférica de vacas clínicamente afectadas, mientras que en vacas con paratuberculosis subclínica 71 de estos genes mostraron sobreexpresión (codificantes para CD40L, varias metaloproteinasas de matriz, y la proteína secretada ácida y rica en cisteína o SPARC) (Coussens y cols. 2002). Posteriormente también se observaron diferencias en la expresión de estos genes al comparar células mononucleares de sangre periférica de vacas infectadas y de no infectadas (Coussens y cols. 2003). La ampliación del estudio por parte de Aho y cols. demostró la activación de la citoquina proinflamatoria IL-1 (que se asocia a la formación y mantenimiento de granulomas) y del señalizador proapoptótico intracelular denominado proteína asociada al receptor TNF 1 o TRAF1, así como la expresión de proteínas en íleon de vacas infectadas (Aho y cols. 2003). TRAF1 se encuentra en altos niveles ante todo en los macrófagos del infiltrado, mientras IL-1α parece ser secretada por células de dentro de la lesión en animales infectados (Coussens y cols. 2006). En el último trabajo publicado de este grupo sobre las células de dentro de células mononucleares de sangre periférica en casos de paratuberculosis bovina, se resaltan tres conceptos (Coussens y cols. 2005): La adopción del fenotipo predominante Th2 por las células T. Aparente incremento de los inhibidores de tejido de la metaloproteinasa de matriz (TIMP) 1 y 2 y descenso de la metaloproteinasa de matriz (MMP) 14, que ocasiona deficiencias de remodelación de tejidos. Y por último, que estas células están probablemente preparadas para una rápida apoptosis. Weiss y cols. también han utilizado esta tecnología para caracterizar la respuesta inmune de macrófagos derivados 88 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA de monocitos bovinos (Weiss y cols. 2004a, Weiss y cols. 2004b). Sus resultados tienen puntos de discrepancia con los de Coussens y cols., muy probablemente por el uso de diferentes equipos y protocolos, y por la mezcla de linfocitos y monocitos utilizada por Coussens y cols. (a diferencia de los macrófagos derivados de monocitos usados por Weiss y cols.). En los últimos trabajos de este grupo se habla de un posible estado de tolerancia en el intestino de vacas subclínicamente afectadas (Weiss y cols. 2006), y del posible papel de la quinasa de terminal-Jun N/proteína quinasa activada por estrés (JNK/SAPK) y de la proteína quinasa p38 activada por mitógeno (MAPK p38) de Map en la regulación de los mecanismos inmunitarios de los monocitos para evitar sus efectos antimicobacterianos (Souza y cols. 2006a, Souza y cols. 2006b). A nivel histopatológico se compara la paratuberculosis con la lepra, en la que fueron establecidos 5 tipos inmunopatológicos principales que correlacionan las lesiones histológicas y la respuesta inmune (Ridley 1974): tuberculoide, tuberculoide intermedio, intermedio, lepromatoso intermedio y lepromatoso. En las formas tuberculoides existe una fuerte resistencia a la infección detectable por pruebas de inmunidad celular y una baja (o muy baja) cantidad de bacilos, mientras en las formas lepromatosas se da todo lo contrario. Estudios en paratuberculosis confirman un modelo similar para esta patología (Buergelt y cols. 1978b, Chiodini y cols. 1984a, Clarke 1997b), y sugieren que se da una evolución de una respuesta tuberculoide (lesiones iniciales en el punto de infección) hacia otra de tipo lepromatoso dependiendo del estado inmunitario del hospedador (Stamp y cols. 1954, Buergelt y cols. 1978b, Paliwal y cols. 1985, Pérez 1992, Pérez y cols. 1997, Pérez y cols. 1999, Corpa 1999, Corpa y cols. 2000a, González 2003, González y cols. 2005). Aunque nunca se ha descartado que esta evolución siga una secuencia temporal. En el caso de la paratuberculosis se han diferenciado las formas focales, las multifocales, y las formas difusas/graves, entre las que se distinguen las multibacilares, las linfocíticas y las intermedias, en relación al espectro inmunopatológico (Tabla 5) y a la especie. Tabla 5. Relación entre formas lesionales de paratuberculosis y espectros inmunopatológicos. PARATUBERCULOSIS Formas focales en la placa de Peyer Formas multifocales ESPECTRO INMUNOPATOLÓGICO • formas tuberculoides extremas • respuesta inmune celular y no humoral (o ausencia de ambas periféricamente) • presencia muy escasa de micobacterias • formas tuberculoides • respuesta inmune celular y ausencia o débil de la humoral • presencia escasa de micobacterias Formas difusas y graves: a. Multibacilar • formas intermedias-lepromatosas • respuesta inmune humoral intensa y ausencia o débil de celular • presencia de numerosas micobacterias b. Linfocítica • formas intermedias-tuberculoides • respuesta inmune celular intensa y escasa o nula humoral • presencia escasa de micobacterias c. Intermedias • formas intermedias • respuesta inmune humoral y celular • presencia moderada de micobacterias *Las formas focales lepromatosas puras no han sido descritas en paratuberculosis. Extraído de García Marín y cols. (García Marín y cols. 2000). 89 PATOGÉNESIS Y PATOLOGÍA Como en el caso de la enfermedad de Crohn, otro aspecto muy interesante es la hipotética influencia de la genética del hospedador en la resistencia a la paratuberculosis, campo en el que ya se están dando los primeros pasos que servirán como base para futuros estudios (Koets y cols. 2000, Mortensen y cols. 2004, Estonba y cols. 2006, Gonda y cols. 2006). Tras observar diferencias significativas en la distribución de un alelo del gen NRAMP1 entre animales seropositivos y seronegativos, Estonba y cols. sugieren que éste puede estar envuelto en la evolución de las lesiones (Estonba y cols. 2006). Cuadro clínico El cuadro clínico clásico de la paratuberculosis es una diarrea más o menos intermitente según la especie, acompañada de consunción progresiva y muerte. Sin embargo, estas formas representan un porcentaje relativamente bajo de la casuística de la paratuberculosis, ya que la fase más prolongada es subclínica. Durante el estadio subclínico, los síntomas que pueden llevar a su sospecha son principalmente pérdidas de producción, que en bovino lechero como ya se ha mencionado puede variar de un 4 hasta un 14% de leche dependiendo de la lactación en que se encuentre (Benedictus y cols. 1985b, Nordlund y cols. 1996, Wilson y cols. 1997). Otros síntomas relacionados con paratuberculosis subclínica son problemas reproductivos y mastitis (Merkal y cols. 1975, Wilson y cols. 1997, Valentin-Weigand y cols. 1999). Otros autores señalan además baja forma muscular de ciertas zonas o la aparición intermitente de un edema mandibular como signos de enfermedad subclínica (Dunkin 1934). La mayoría de animales infectados en una explotación son animales subclínicos que no muestran signos evidentes de la enfermedad (aparte de los mencionados de producción, infertilidad y mastitis, que pueden ser más o menos evidentes), aunque sí lesiones microscópicas (Pérez y cols. 2000). En la especie bovina los síntomas clínicos no suelen aparecer hasta los dos años de edad, coincidiendo con los partos y el inicio de las lactaciones, y aunque en pequeños rumiantes pueden comenzar antes, su aparición también está asociada a la introducción de estos estreses (Chiodini y cols. 1984a, Blood y cols. 1989, García Marín y cols. 1994). El signo clínico de paratuberculosis común a todas las especies es la pérdida progresiva de peso y condición corporal (Taylor 1945, McEwen y cols. 1958, Jakob y cols. 1969, Aller y cols. 1973, Newsholme y cols. 1981, Seaman y cols. 1984, Chiodini y cols. 1984a, Gilmour y cols. 1991, García Marín y cols. 1994), aparentemente como consecuencia de la insuficiente absorción de proteínas que causan los infiltrados celulares y edemas del intestino (Allen y cols. 1974b). Este extremo no está claro pues se ha podido observar que no hay pérdidas sustanciales de digestibilidad en ovinos con formas clínicas (Juste y cols. 1994). La formación constante o intermitente de heces diarreicas homogéneas, no hemorrágicas y no mucosas, es otro síntoma típico en vacas con paratuberculosis clínica (Merkal y cols. 1970, Buergelt y cols. 1978b). No obstante, 90 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA en las especies ovina y caprina sólo aparece en algunos casos en la fase final de la enfermedad, cuando las lesiones afectan ampliamente el intestino, y muchas veces como un sutil reblandecimiento de las heces (Stamp y cols. 1954, Brugère-Picoux 1987, Carrigan y cols. 1990, García Marín y cols. 1994, Clarke y cols. 1996a). La caída de la producción (principalmente en bovino lechero) es otro rasgo indicativo (Blood y cols. 1989, Aduriz y cols. 1995b, Clarke 1997b), así como el deterioro del pelo o la lana. Otros posibles síntomas más avanzados son la formación de edemas submandibulares o en otras zonas, empalidecimiento de las mucosas, fiebre intermitente, alteración de algunos valores hemáticos y séricos, sangre en heces, anemia, caquexia extrema y atrofia muscular (Behrens 1955, Kopecky y cols. 1971, Badiola y cols. 1980, Chiodini y cols. 1984a, Sherman 1985, Scott y cols. 1995, Clarke 1997b). Finalmente el animal queda postrado y muere (Pérez y cols. 2000). Lesiones macroscópicas La paratuberculosis provoca lesiones macroscópicas comunes a las que se producen en otros procesos caquectizantes. En la necropsia de animales con avanzados signos clínicos puede observarse una falta muy importante de depósitos grasos que pueden mostrar atrofia de la serosa, atrofia de la masa muscular, formación de edemas, ascitis y acumulación de líquidos en otras cavidades (Buergelt y cols. 1978b, Chiodini y cols. 1984a, Cranwell 1988, Gilmour y cols. 1991, Clarke y cols. 1996a). Más específicos de la paratuberculosis son los fenómenos relacionados con el sistema digestivo, principalmente las lesiones que afectan al íleon, al yeyuno, a la válvula ileocecal, a los nódulos linfáticos mesentéricos, e incluso al ciego y a la primera parte del colon (McEwen 1939, Stamp y cols. 1954, Prudvi Reddy y cols. 1984, Chiodini y cols. 1984a, Van Kruiningen y cols. 1986, Carrigan y cols. 1990). El engrosamiento de la pared intestinal es el rasgo característico de la enfermedad en la especie bovina, principalmente en el íleon. Presenta unas mucosas edematosas, tumefactas, con aspecto carnoso, formando gruesos pliegues, que pueden presentar grietas, áreas congestivas, petequias o ulceraciones (Buergelt y cols. 1978b, Juste y cols. 1983, Chiodini y cols. 1984a, Jubb y cols. 1985, Blood y cols. 1989). Los vasos linfáticos que conectan la serosa con los ganglios, pueden aparecer visiblemente inflamados o dilatados, a modo de cordón retorcido con aspecto blanquecino (McEwen 1939, Buergelt y cols. 1978b, Badiola y cols. 1980, Chiodini y cols. 1984a, Blood y cols. 1989, Carrigan y cols. 1990), aunque a menudo no sean tan evidentes (Juste y cols. 1983, Pérez y cols. 2000, González 2003). Los ganglios mesentéricos (los yeyunales e ileocecales sobre todo) presentan normalmente un incremento en su tamaño, tumefacción y aspecto edematoso, y en la sección de los mismos la zona medular adquiere un color marrón verdoso. La aparición de lesiones en otras zonas es menos frecuente. Pueden aparecer granulomas en el hígado y ganglios asociados, depleción 91 PATOGÉNESIS Y PATOLOGÍA linfoide del timo, o lesiones arterioscleróticas en corazón o aorta (Clarke 1997b, González 2003). En pequeños rumiantes las lesiones intestinales pueden suponer desde pequeños nódulos hasta áreas centrales con caseificación, el engrosamiento de la pared y los pliegues suelen ser menos evidentes. En cambio, la tumefacción de la mucosa, la linfangitis y linfangiectasia son normalmente muy marcadas, especialmente en cabras, especie en la que puede observarse calcificación. Los nódulos linfáticos presentan un aspecto similar al de los bovinos, pero aparecen caseificaciones y calcificaciones con mayor frecuencia, sobre todo en cabras (Stamp y cols. 1954, Rajya y cols. 1961, Badiola y cols. 1980, Seaman y cols. 1981, Lepper 1989, Carrigan y cols. 1990, García Marín y cols. 1994, Pérez y cols. 1996, Clarke y cols. 1996a, Tafti y cols. 2000, Corpa y cols. 2000a). En algunos casos ovinos el intestino puede aparecer coloreado de un tono amarillento, debido a la presencia masiva de bacilos pertenecientes a cepas pigmentadas de Map (Taylor 1945, Taylor 1951, Taylor 1953, Stamp y cols. 1954, Benazzi y cols. 1996, Clarke y cols. 1996a, Stevenson y cols. 2002). Lesiones microscópicas Se trata de una enteritis granulomatosa cuyas lesiones más evidentes se localizan en los últimos tramos de intestino delgado, primeros del grueso, y nódulos y vasos linfáticos asociados. La lesión característica es un infiltrado celular compuesto por macrófagos, linfocitos, y células epiteloides y plasmáticas. Los macrófagos aparecen normalmente llenos de bacilos, acompañados frecuentemente de células gigantes también con numerosas bacterias en su interior (Buergelt y cols. 1978b, Badiola y cols. 1980, Chiodini y cols. 1984a, Jubb y cols. 1985). Las formas lesionales muestran una gran variabilidad, de focales a difusas, y dependen de factores como la dosis infectante, el estado inmunológico y la susceptibilidad/resistencia del hospedador, y el tipo de cepa implicado (Chiodini y cols. 1984a, Aduriz 1993, Clarke 1997b). Debido a esa variabilidad, las lesiones han sido clasificadas de acuerdo con la especie afectada, la gravedad de las mismas, y los tipos celulares implicados. De este modo, las clasificaciones más completas serían: - en bovino, las de Buergelt y cols. (Buergelt y cols. 1978b) y González y cols. (González y cols. 2005), - en ovino, las de Stamp y Watt (Stamp y cols. 1954), Rajya y Singh (Rajya y cols. 1961), García Marín y cols. (García Marín y cols. 1992c), Clarke y Little (Clarke y cols. 1996a) y Pérez y cols. (Pérez y cols. 1996), - en caprino, las de Paliwal y Rajya (Paliwal y cols. 1984), García Marín y cols. (García Marín y cols. 1992b), Menchén (Menchén 1995) y Corpa y cols. (Corpa y cols. 2000a). 92 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA En este sentido, a partir de un primer estudio con corderos vacunados (Juste y cols. 1994), los trabajos que ha venido desarrollando el grupo de anatomía patológica veterinaria de la Universidad de León (Pérez 1992, García Marín y cols. 1995a, Pérez y cols. 1996, Pérez y cols. 1997, Corpa 1999, Corpa y cols. 2000a, González 2003, González y cols. 2005, García-Pariente y cols. 2006, Muñoz y cols. 2006), proporcionan un modelo inmunohistopatológico general y específico de hospedador de gran utilidad en la evaluación de las lesiones naturales o experimentales de la paratuberculosis. Tal como se ha mencionado anteriormente, éstas se clasifican en focales o multifocales relacionadas con formas iniciales, latentes o subclínicas con baja carga micobacteriana, y en difusas o severas con alta carga micobacteriana en los tejidos. También han introducido el recuento de granulomas, la estimación de su área y su localización para caracterizar la gravedad de las lesiones. DIAGNÓSTICO Actualmente, los métodos de diagnóstico más utilizados son aquellos basados en la detección e identificación de Map y los basados en la detección de la respuesta inmunológica originada en el hospedador. Los métodos clínico-epidemiológicos resultan poco específicos, y principalmente son de utilidad para asentar la sospecha, mientras que los anatomopatológico-histopatológicos se realizan mayoritariamente post mortem (Garrido y cols. 2000a). La visualización de lesiones macroscópicas relacionadas con la paratuberculosis y de los signos clínicos típicos de ésta, es un método bastante específico que sirve para establecer un diagnóstico de rebaño, pero puede ser insuficiente o simplemente impracticable para la detección de infecciones subclínicas (Vialard y cols. 1994, Pérez y cols. 1996, Clarke y cols. 1996a, Corpa 1999). Diagnóstico basado en las técnicas histopatológicas convencionales Las zonas donde más frecuentemente se asientan las lesiones son los últimos tramos del intestino delgado, y primeros del grueso, nódulos linfáticos mesentéricos y vasos linfáticos aferentes, en correspondencia con las alteraciones macroscópicas. Para detectar las alteraciones microscópicas típicas de esta enfermedad granulomatosa, se utilizan normalmente métodos rutinarios como la tinción hematoxilina-eosina, que complementada con la tinción de Ziehl-Neelsen puede revelar la presencia de los bacilos asociados a las lesiones (Garrido y cols. 2000a). El método de Ziehl-Neelsen no es capaz de teñir las micobacterias con pared celular defectuosa o de esferoplasto. En tales casos, es posible recurrir a técnicas de inmunohistoquímica u otras técnicas (Massone y cols. 1990, Thoresen y cols. 1994a, Condron y cols. 1995, Balseiro y cols. 2003). Dada la especificidad de las características histológicas de las lesiones 93 DIAGNÓSTICO paratuberculosas, este método también goza de una buena especificidad, y realizando una buena selección de la muestra, también puede presentar una buena sensibilidad (Jubb y cols. 1985, Whitlock y cols. 1992a, Clarke 1997a), incluso en animales con paratuberculosis subclínica, y a veces superior a la del cultivo (Huchzermeyer y cols. 1992, Pérez y cols. 1996, Corpa y cols. 2000a, Dimareli-Malli y cols. 2001, González 2003). Alternativamente al análisis post mortem, ha sido propuesto como método de diagnóstico el análisis histopatológico y bacteriológico de biopsias de ganglios o íleon (Benedictus y cols. 1985a, Benedictus y cols. 1986, Coetsier y cols. 1998, Brumbaugh y cols. 2000). No obstante, es de momento un método poco interesante fuera de su uso experimental o con animales de gran valor (Garrido y cols. 2000a). Diagnóstico basado en la detección bacteriológica Tinción y detección al microscopio Se realiza un frotis o impronta de heces o de cualquier tejido susceptible de contener las micobacterias, o bien se utilizan preparaciones de cortes histológicos. Figura 12. Fotografía de la vista al microscopio (x 1000) de la tinción Ziehl-Neelsen de una impronta intestinal ovina en la que se pueden apreciar claramente los bacilos de Map (fucsia) formando grumos. Se tiñe por medio de la técnica de Ziehl-Neelsen que se basa en la retención de la fucsina (colorante) por las bacterias ácido-alcohol resistentes, en las que a diferencia de otras bacterias, el decolorante (ácido-alcohol) no penetra, y se visualiza en el microscopio, pudiéndose observar la morfología típica de las células micobacterianas 94 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA (Garrido y cols. 2000a) (Figura 12). Es útil, rápido y barato, pero tiene una baja sensibilidad y no es específico de Map. Análisis inmunohistoquímico de preparaciones histológicas Es una técnica basada en la unión específica entre anticuerpos marcados y los antígenos que estos reconocen, y se aplica sobre cortes histológicos. En el caso de la paratuberculosis, se utilizan anticuerpos monoclonales o policlonales frente a Map, que generalmente se obtienen de forma artesanal y que pueden dar reacciones cruzadas en caso de infección con otras micobacterias (Stabel y cols. 1996, Coetsier y cols. 1998, Brees y cols. 2000, González 2003). Aun así es más específica que la tinción ZiehlNeelsen, y es especialmente útil en la detección de esferoplastos o cuando la presencia de bacilos es mínima (Massone y cols. 1990, Navarro y cols. 1991, García Marín y cols. 1992a, Thoresen y cols. 1994a, Brees y cols. 2000, Balseiro y cols. 2003, González 2003). Aislamiento Se considera como la técnica de referencia para el diagnóstico de la paratuberculosis. El primer aislamiento de Map se consiguió en 1911 (Twort y cols. 1911). Desde entonces se ha tratado de mejorar la técnica del cultivo, con el objetivo de hacerlo más rápido, eficaz y sensible. Igual que en la tinción, las muestras patológicas normalmente utilizadas para diagnóstico son heces, ganglios mesentéricos o raspados de mucosa intestinal (Garrido y cols. 2000a), y a veces, leche. Cuando se trata de muestras intestinales obtenidas en la necropsia de un animal, algunos autores obtienen mejores resultados con raspados de válvula ileocecal y ganglios ileocecales o yeyunales, que con otras localizaciones (Chiodini y cols. 1986a, Merkal y cols. 1987), pero también puede influir la especie del animal. El cultivo tradicional puede llegar a un límite de detección de 50-100 células de Map por gramo de heces y se considera 100% específico (Merkal 1973, Jorgensen 1982, Whitlock 1998). Aunque la sensibilidad del método varía mucho, esta suele ser relativamente baja, sobre todo por falsos negativos con animales subclínicamente infectados, que se ve aún más reducida al emplear menos de cuatro tubos de cultivo o por la aparición de cepas de difícil aislamiento (Merkal 1973, Chiodini y cols. 1984a, Chiodini y cols. 1986a, Juste y cols. 1991b, Huchzermeyer y cols. 1992, Benazzi y cols. 1996, Whitlock 1998, Whittington y cols. 1999b, Eamens y cols. 2000, Whitlock y cols. 2000, Whittington y cols. 2000a, Corpa y cols. 2000a, Whittington y cols. 2000c, Whittington y cols. 2001d, Crossley y cols. 2005). Además es un método caro, lento y laborioso (Collins y cols. 1990b, Kalis y cols. 2002). Generalmente el cultivo requiere un tratamiento previo de la muestra para evitar su contaminación por microorganismos que crecen más rápido que Map. Han sido varios los tratamientos probados con Map aprovechando su elevada resistencia a ciertos agentes descontaminantes. Se han utilizado distintos compuestos corrosivos (Merkal y 95 DIAGNÓSTICO cols. 1964), cloruro de benzalconio (Merkal y cols. 1964, Merkal y cols. 1972, Lagadic y cols. 1983), ácido oxálico (Brotherston y cols. 1961a, Karpinski 1972, Gunnarsson y cols. 1979, Saxegaard 1985), ácido oxálico con hidróxido sódico (Jorgensen 1982), y finalmente el más extendido de todos, el cloruro de hexadecil piridinio (HPC) (Whipple y cols. 1983, Merkal 1984, Juste y cols. 1991b, Whitlock y cols. 1992a, Stabel 1997). A pesar de que el HPC es el agente utilizado prioritariamente, la concentración de uso, y el tiempo y condiciones térmicas de incubación empleadas pueden variar sustancialmente, hecho que puede influir en el éxito del cultivo de determinado tipo de muestra o cepa (Whitlock y cols. 1992a, Stabel 1997, Pavlik y cols. 1999a, Whitlock y cols. 2000, Dundee y cols. 2001, Stabel y cols. 2002b, Whitlock y cols. 2003, Reddacliff y cols. 2003a, Donaghy y cols. 2003a, Grant y cols. 2004, Ayele y cols. 2005). En algunos métodos, la muestra se incuba adicionalmente con infusión de cerebro y corazón (BHI) para favorecer la germinación de estructuras resistentes (esporas,...) haciéndolas susceptibles al HPC (Whitlock 1992). En otros protocolos tras realizar una concentración de las micobacterias por centrifugación, paso que al mismo tiempo parece incrementar el número de contaminaciones (Whipple y cols. 1991, Aduriz y cols. 1995a, Eamens y cols. 2000), tratan la muestra con antibióticos antes de ser cultivada (Stabel 1997, Whittington y cols. 1999b, Whitlock y cols. 2000). Los métodos principales de concentrar las micobacterias que se hallan en la muestra son la sedimentación, la centrifugación (Kim y cols. 1988, Whitlock y cols. 1992a) y la captura inmunomagnética (Grant y cols. 1998b). Para los medios sin base de huevo es necesario centrifugar y lavar con agua la muestra una vez descontaminada para eliminar el HPC, ya que éste no es neutralizado por los fosfolípidos del huevo, y sigue actuando inhibiendo la propagación de Map en el medio (Garrido y cols. 2000a). Los medios más ampliamente utilizados para el aislamiento de Map son el HEY (Merkal y cols. 1964) y el LJ (Jorgensen 1982) adicionados con micobactina J, y que están hechos a base de huevo. El medio de Dubos a base de suero y con micobactina es otra alternativa (Gunnarsson y cols. 1979, Saxegaard 1985). Los medios sintéticos sólidos de Middlebrook (7H10 y 7H11) también dan buenos resultados, ya sea con (Merkal y cols. 1974) o sin micobactina (Aduriz y cols. 1995a). Para el cultivo en medio líquido han sido utilizadas varias versiones de Middlebrook (7H9, 7H10, 7H12) (Damato y cols. 1982, Merkal y cols. 1982a, Damato y cols. 1984, Damato y cols. 1987), y a veces el medio Watson-Reid. En los casos positivos, Map puede tardar entre 3 semanas y un año en crecer de manera visible en los medios sólidos (Taylor 1951, Merkal y cols. 1974, Wayne y cols. 1986, Whittington y cols. 2001d). Los sistemas automáticos de cultivo líquido que detectan variaciones en la concentración de ciertas sustancias (dióxido de carbono, oxígeno,...) como resultado de la respiración de las micobacterias, que en un principio fueron diseñados para aislar las especies que infectan al ser humano (M. tuberculosis principalmente), están basados en el caldo Middlebrook 7H9. La composición de los mismos ha ido modificándose para cubrir los 96 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA requerimientos especiales de Map (Whittington y cols. 1998, Whittington y cols. 1999b). Normalmente todos estos medios líquidos son suplementados con micobactina, y enriquecidos con albúmina sérica bovina, ácido oleico, dextrosa, catalasa y otros ingredientes como yema de huevo y antibióticos. Los de mayor renombre son los radiométricos BACTEC (Damato y cols. 1982, Damato y cols. 1990, Collins y cols. 1990b), y los no radiométricos MGIT (fluorométrico) (Schwartz y cols. 2000, Bull y cols. 2003a), TREK ESP (barométrico) (Kim y cols. 1988, Ellingson y cols. 2004), y MB/BacT (colorimétrico) (Stich y cols. 2004). La ventaja de estos sistemas es que detectan más rápido y de manera automatizada el crecimiento micobacteriano, además de ser teóricamente más sensibles (Collins y cols. 1988, Damato y cols. 1990, Collins y cols. 1990b, Cousins y cols. 1995, Whittington y cols. 1999b, Eamens y cols. 2001, Grant y cols. 2003, Gumber y cols. 2006), sin embargo, tienen varios inconvenientes. Por una parte, suelen contaminarse con mayor frecuencia (Collins y cols. 1990b, Whittington y cols. 1999b), y para evitarlo se utilizan antibióticos que al final pueden retrasar el crecimiento de las propias micobacterias (Gumber y cols. 2006). Son aún más caros que los tradicionales, y requieren un mayor equipamiento (Whitlock 1998). No resultan tan específicos y normalmente se necesita confirmar la identidad del crecimiento por métodos moleculares (Cousins y cols. 1995, Whittington y cols. 1998). Para demostrar la independencia de micobactina es necesario realizar un subcultivo en un medio sólido sin este ingrediente, y algunos autores repiten esta operación desde el primer medio sólido a un segundo tubo para confirmar que no se arrastre el sideróforo del medio líquido al sólido (Eamens y cols. 2000, Motiwala y cols. 2004). Y por último, señalar que no se obtienen colonias puras por lo que es necesario su subcultivo en medios sólidos si se precisa de organismos clónicos para estudios posteriores. Con el fin de evadir los costos económicos y de procesado del cultivo individual, algunos investigadores han optado por realizar cultivos por lotes (incluyendo muestras de distintos animales en un mismo cultivo), que aunque menos sensible, es una herramienta útil para detectar rebaños afectados. De todos modos, la necesidad de realizar el cultivo individual de todos los componentes de los lotes con resultado positivo, y la influencia del número de animales del rebaño y de la prevalencia del mismo en la sensibilidad, son aspectos que limitan su uso (Vialard y cols. 1993, Kalis y cols. 1999a, Kalis y cols. 2000, Whittington y cols. 2000a, Wells y cols. 2002, Sergeant y cols. 2002b, Van Schaik y cols. 2003b). Desde los inicios de los métodos de cultivo de la paratuberculosis, se han detectado diferencias importantes en el éxito de aislamiento de Map. Normalmente, las muestras bovinas producen colonias más rápido, que crecen mejor en HEY con micobactina y piruvato que en cualquiera de los restantes medios sólidos (Merkal y cols. 1964, Chiodini y cols. 1984a, Juste y cols. 1991b, Nielsen y cols. 2004). Sin embargo, tal y como refleja la bibliografía, las muestras procedentes de pequeños rumiantes resultan más problemáticas, especialmente las ovinas. Las colonias suelen tardar más en 97 DIAGNÓSTICO aparecer, e incluso se habla de cepas incultivables (Dunkin y cols. 1935, Taylor 1951, Brotherston y cols. 1961a, McCausland 1980, Seaman y cols. 1981, Juste y cols. 1991b, Huchzermeyer y cols. 1992, Shulaw y cols. 1993, Benazzi y cols. 1996, Dimareli-Malli y cols. 2001, Machackova y cols. 2003a). Juste y cols. obtenían mejores resultados utilizando LJ con micobactina pero sin piruvato, q con cualquiera otra combinación de los medios HEY y LJ (Juste y cols. 1991b), lo que alimentaba la idea de una posible diferencia entre hospedadores, cepas y preferencias. Algunos autores no se muestran de acuerdo con estas observaciones (Pavlik y cols. 1999a) (materia revisada en el apartado de Epidemiología molecular), pero estudios más recientes parecen confirmarlo (de Juan y cols. 2006b). En un estudio posterior del grupo de Neiker, quedó demostrada la eficacia del medio Middlebrook 7H11 con OADC y sin micobactina para el aislamiento de Map a partir de muestras ovinas (Aduriz y cols. 1995a). En la Figura 13 se muestra el aspecto de colonias de tipo bovino y de colonias pigmentadas ovinas sobre la superficie de diferentes medios sólidos. Figura 13. A la izquierda, fotografía del crecimiento de una cepa ovina pigmentada en medio LJ, que fue aislada de los intestinos amarillentos (debido al color del aislamiento) de una oveja procedente del País Vasco. A la derecha, dos tubos HEY (el de arriba más viejo que el de abajo) con colonias típicas bovinas. Detección de DNA La detección de DNA específico de un microorganismo implica su presencia en la muestra que se está analizando. Existen otras técnicas como los diferentes sistemas de hibridación (algunos, como la hibridación in situ, muy utilizados en los casos de Crohn) (Hulten y cols. 2001, Chamberlin y cols. 2001, Harris y cols. 2001), pero la técnica reina en este campo es la reacción en cadena de la polimerasa o PCR (Mullis y cols. 1986), que permite amplificar in vitro y de manera específica cantidades mínimas de DNA gracias a la acción de la DNA polimerasa, haciendo que puedan ser detectadas con facilidad. Su especificidad diagnóstica depende de que el fragmento de DNA escogido sea específico del microorganismo en cuestión, y de la especificidad de los cebadores (fragmentos de unas 18-24 pares de bases de DNA que hibridan con el DNA molde o diana y funcionan como iniciadores de la amplificación) por ése fragmento concreto. La selección de la muestra, el proceso para concentrar los organismos que se 98 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA quieren detectar, y la extracción y purificación del DNA, condicionarán la cantidad de DNA diana obtenida, y por lo tanto la sensibilidad de la técnica. El descubrimiento de la secuencia de inserción específica de Map IS900 (Green y cols. 1989, Collins y cols. 1989) abrió todo un horizonte de posibilidades para la detección de esta bacteria por métodos genéticos. Gracias a este elemento genético la PCR puede ser una técnica de gran sensibilidad, ya que cada bacilo de Map cuenta con 14-18 copias del mismo (Bull y cols. 2000), lo que multiplica las posibilidades de detección en comparación con genes o secuencias con una única copia por genoma bacteriano. A pesar de que se cuenta con otras técnicas, la PCR es el método molecular más utilizado en el diagnóstico de la paratuberculosis (Vary y cols. 1990, Moss y cols. 1992b, Sanderson y cols. 1992b). La principal ventaja que confiere la PCR sobre el cultivo es la velocidad en la obtención de resultados (Garrido y cols. 2000a), además es capaz de detectar la presencia de la bacteria aun cuando no es viable en cultivo. Sin embargo difícilmente puede suplantarlo, ya que la sensibilidad del cultivo parece todavía mayor (Whitlock 1998), y que la presencia de inhibidores de la PCR sobre todo en muestras de heces producen falsos negativos (Collins y cols. 1993a, Harris y cols. 2001). Estos problemas van siendo solventados con la introducción de controles internos de amplificación que garantizan el buen funcionamiento de la reacción sobre la muestra descartando falsos negativos (Englund y cols. 1999, Chevallier y cols. 2003, Ozbek y cols. 2003, Rodriguez-Lazaro y cols. 2004, Bartos y cols. 2006, Brey y cols. 2006), además de mejorar los protocolos de extracción y purificación del DNA para evitar la copurificación de esas sustancias inhibidoras. La sensibilidad de la PCR aumenta con la realización de una segunda PCR que amplifica una región interna del producto de la primera reacción, lo que se conoce como PCR anidada (Bascuñana y cols. 1996, Frank y cols. 1996, Englund y cols. 1999, Gao y cols. 2002, Bull y cols. 2003a, Buergelt y cols. 2004, Stabel y cols. 2005, Romero y cols. 2005). No hay que olvidar que existen otras bacterias distintas de Map con secuencias parecidas (IS900-like) que pueden dar amplificados que se toman por positivos en la PCR IS900, aunque son distinguibles por secuenciación (Cousins y cols. 1999, Englund y cols. 2002, Motiwala y cols. 2004). En casos de aislados humanos de M. avium no ha quedado claro si se trataba de secuencias parecidas, o de si realmente se trataba de la IS900 (Roiz y cols. 1995, Naser y cols. 1999). Se ha buscado y actualmente se sigue buscando regiones o secuencias genéticas que sean específicas de la micobacteria y que puedan suplir a la IS900, o al menos complementarla. Han sido descritas unas cuántas secuencias alternativas (revisado en Map. Composición genética), pero de momento ninguna goza de la sensibilidad que proporciona la IS900. En caso de identificación en cultivos, esto no supone un problema pues el DNA micobacteriano es abundante, o al menos suficiente. Pero en muestras patológicas el número de micobacterias puede ser mínimo, y el número de copias por genoma de la secuencia diana puede ser determinante a la hora de dar un diagnóstico (van der Giessen y cols. 1992b). En 99 DIAGNÓSTICO cultivos, se consigue una identificación correcta confirmando la presencia de la IS900 y del locus 251 (Rajeev y cols. 2005). La alternativa con mayores posibilidades para detectar DNA de Map en otro tipo de muestras es complementar la PCR IS900 con la PCR ISMap02 (Stabel y cols. 2005), o incluso con la PCR-REA IS1311 (Marsh y cols. 1999). Además de los aislamientos, las muestras que se suelen analizar por medio de la PCR, son las heces, tejidos y leche. La PCR de heces no ha conseguido reemplazar al cultivo fecal, a pesar de ser muy eficiente para algunos autores, principalmente en la especie ovina por la dificultad que entraña el cultivo a partir de muestras ovinas (Collins y cols. 1993a, Pérez y cols. 1995a, Stevenson y cols. 1997, Garrido y cols. 2000a, Garrido y cols. 2000b, Sivakumar y cols. 2005). La sensibilidad en heces varía mucho debido a la heterogeneidad de técnicas que se usan en diferentes laboratorios (Garrido y cols. 2000a). Lo que sí parece conferir rapidez y solidez al diagnóstico es el uso del cultivo y posterior análisis por PCR, antes de que haya crecimiento visible o confirmando los tempranos cultivos positivos de los sistemas automáticos de detección (Cousins y cols. 1995, Whittington y cols. 1998, Secott y cols. 1999, Paolicchi y cols. 2003). La leche parece también una buena muestra para la detección de DNA de Map, aunque parece más interesante para ser utilizada en muestras agrupadas o de tipo lote, como la leche de tanque, con la aplicación potencial de estimar prevalencias de explotaciones o realizar estudios de vigilancia (Stephan y cols. 2002, Corti y cols. 2002, Grant y cols. 2002a, Sevilla y cols. 2003, Muehlherr y cols. 2003, O'Reilly y cols. 2004, Jayarao y cols. 2004). En el análisis de muestras individuales el cultivo parece seguir siendo más eficaz (Giese y cols. 2000). En algunos trabajos de PCR IS900 se habla de límites de detección de hasta 1-100 CFU/g heces, o de 10-20 CFU/ml leche (Grant y cols. 2000, Garrido y cols. 2000b, Odumeru y cols. 2001, Halldorsdottir y cols. 2002, Stabel y cols. 2004a). En caso de utilizar tejidos, las muestras más interesantes son las que mayor número de micobacterias puedan contener, como la válvula ileocecal, porciones de íleon y yeyuno, y los ganglios asociados, como en el caso del cultivo. El uso de estas muestras en comparación con las heces mejora la sensibilidad de la prueba, además de haber menos riesgo de inhibiciones (Challans y cols. 1994, Gwozdz y cols. 1997, Stevenson y cols. 1997), aunque cuando se usan biopsias de hígado no se obtiene el mismo resultado. Otra muestra posible para PCR sobre la que existen pocos trabajos publicados es la sangre, más concretamente las células blancas obtenidas de sangre periférica, fracción de la sangre donde cabe esperar encontrar las micobacterias con mayor facilidad (van der Giessen y cols. 1995, Hanna y cols. 1995) (y según lo revisado en el apartado de Patogénesis). Esta es una muestra fácil de tomar, y que se recoge habitualmente para llevar a cabo pruebas serológicas, lo que la hace muy interesante. La sensibilidad de la PCR en sangre de ovejas clínicamente afectadas puede ser del 66% con una especificidad del 100% (Gwozdz y cols. 1997), y del 40% en vacas subclínicamente 100 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA afectadas (Barrington y cols. 2003). Es un método con grandes posibilidades, que incluso puede servir para un primer tipado de las cepas infectantes que se detectan (Bhide y cols. 2006), a pesar de los resultados contradictorios de Gwozdz y cols. (Gwozdz y cols. 2000c). Además la PCR de sangre puede servir de método precoz de detección de animales subclínicos o expuestos antes de que comiencen a excretar bacterias en sus heces y supongan un foco de infección para el resto de animales del rebaño (Buergelt y cols. 2004). En la especie humana también ha sido escasamente empleado este método, aunque con resultados de gran importancia y calado en relación con la etiología de la enfermedad de Crohn (Naser y cols. 2004). Otra manera de analizar tejidos, es realizar la PCR a partir de tejidos fijados e incluidos en parafina preparados para estudios histológicos, cuya sensibilidad está limitada entre otras cosas por el efecto degradante de la fijación con formol sobre el DNA (Plante y cols. 1996). Esto permite el análisis de tejidos ya testados por otras técnicas (tinción hematoxilina-eosina + Ziehl-Neelsen, inmunohistoquímica,...) a modo de confirmación, o realizar estudios de carácter retrospectivo, incluso utilizando cebadores para diferentes dianas, posterior hibridación, o enzimas de restricción que diferencian especies y subespecies (Plante y cols. 1996, Miller y cols. 1999, Marsh y cols. 1999, Whittington y cols. 1999d, Coetsier y cols. 2000, Ikonomopoulos y cols. 2000, Sanna y cols. 2000, Miller y cols. 2002, Ellingson y cols. 2005b). En los trabajos con muestras de pacientes de Crohn, la PCR IS900 de tejidos fijados e incluidos en parafina, junto con la hibridación in situ con porciones de IS900, son las técnicas moleculares más extendidas (Fidler y cols. 1994, Lisby y cols. 1994, Hulten y cols. 2000b, Sechi y cols. 2001, Hulten y cols. 2001, Naser y cols. 2002, Ellingson y cols. 2003, Sechi y cols. 2004, Baksh y cols. 2004) para detectar DNA de Map. Cabe destacar que en la técnica de hibridación in situ, la sonda IS900 marcada es capaz de penetrar en los esferoplastos o formas de pared defectuosa de esta bacteria e hibridar con su DNA haciéndolas visibles, pero no detecta los bacilos ácido-alcohol resistentes (Hulten y cols. 2000b, Hulten y cols. 2000c, Hulten y cols. 2001). Los métodos de extracción y purificación de DNA cada vez son más sofisticados, aunque parte del éxito depende de los métodos de concentración de las bacterias de la muestra que suelen ser similares a los empleados en el cultivo (Garrido y cols. 2000a). Entre los métodos de concentración micobacteriana destacan los que utilizan la centrifugación (Vary y cols. 1990, Garrido y cols. 2000b, Odumeru y cols. 2001, Stephan y cols. 2002, Corti y cols. 2002, Halldorsdottir y cols. 2002, Ozbek y cols. 2003), la separación inmunomagnética (Grant y cols. 2000, Mason y cols. 2001, Djonne y cols. 2003, O'Reilly y cols. 2004, Khare y cols. 2004, Whan y cols. 2005a, Whan y cols. 2005b, Metzger-Boddien y cols. 2006), el procesado C18-carboxipropilbetaina (Thornton y cols. 2002, Ozbek y cols. 2003), y la separación magnética mediada por un péptido (Stratmann y cols. 2002, Stratmann y cols. 2006). 101 DIAGNÓSTICO Los problemas iniciales para extraer el DNA de las resistentes estructuras celulares micobacterianas se superaron con el uso de métodos más agresivos, por ejemplo, las perlas de zirconio (van der Giessen y cols. 1992a, Collins y cols. 1993b, Challans y cols. 1994, Odumeru y cols. 2001), tratamiento con tampones de lisis (Marsh y cols. 1999, Odumeru y cols. 2001, Chevallier y cols. 2003), el hervido (Whittington y cols. 1998, Marsh y cols. 1999, Whittington y cols. 1999d, Odumeru y cols. 2001, Chevallier y cols. 2003, O'Mahony y cols. 2004) y la congelación-hervido (Miller y cols. 1997, Garrido y cols. 2000b, Odumeru y cols. 2001). En la purificación de DNA se han probado varios métodos que incluyen el uso de otros reactivos u otros sistemas de captura de DNA. Por ejemplo, sustancias como el dodecil-sulfato de sodio (SDS), el TE-Triton X100 (Garrido y cols. 2000b, Garrido 2001), el bromuro de cetil-trimetil-amonio (CTAB) (Pavlik y cols. 1999a), ácido etilendiamin-tetra-acético (Christopher-Hennings y cols. 2003) o el isotiocianato de guanidina (Whittington y cols. 1998, Garrido y cols. 2000b). Para captar el DNA extraído se han empleado métodos como la dispersión en matriz con fase sólida (MSPD; que también consta de un paso de lisado mecánico de células) (Hines y cols. 1995), la captura por hibridación en fase sólida y/o líquida (Millar y cols. 1995, Marsh y cols. 2000, Marsh y cols. 2001), columnas de sílice (Whittington y cols. 1998, Chevallier y cols. 2003), otros sistemas magnéticos patentados (Chui y cols. 2004), filtros que retienen el DNA (Blanchard y cols. 2005), o las tarjetas de tecnología FTA® de Whatman (Jaravata y cols. 2006). Incluso se ha probado la adición de sustancias como la albúmina sérica bovina (BSA) (Odumeru y cols. 2001), el dimetil sulfóxido (DMSO) (Bull y cols. 2003a) o el mercaptoetanol (Marsh y cols. 1999) a la reacción de PCR. La PCR a tiempo real está siendo ampliamente introducida en la detección de Map, con la ventaja que supone la cuantificación del DNA, o la amplificación del cDNA complementario al RNA que se halla en células vivas por medio de la RT-PCR. Son abundantes las publicaciones al respecto, y aunque todavía no parecen mostrar sensibilidades mucho mayores que las PCRs tradicionales (Kim y cols. 1989, Kim y cols. 2002, Fang y cols. 2002, Christopher-Hennings y cols. 2003, Khare y cols. 2004, Rajeev y cols. 2005, Stabel y cols. 2005, Bogli-Stuber y cols. 2005, Brey y cols. 2006, Jaravata y cols. 2006), deberá transcurrir cierto tiempo mientras se obtienen los primeros resultados de diagnóstico a gran escala, con lo que se podrá determinar qué métodos son los más apropiados. Aún así, algunos ya le atribuyen una mayor sensibilidad que al cultivo (Bogli-Stuber y cols. 2005). Diagnóstico basado en la respuesta inmunológica del hospedador Las pruebas diagnósticas de inmunidad tratan de detectar la respuesta inmunológica que se produce en el hospedador a consecuencia de la infección. La infección con Map 102 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA provoca respuestas inmunes de tipo espectral, empezando con una de tipo celular que evoluciona hacia una de tipo humoral, donde el tiempo de transición de una a otra es variable, aunque suele ser bastante largo. Por ello, existen pruebas enfocadas a la detección de la infección en sus fases iniciales donde predomina la respuesta inmune celular, y pruebas enfocadas a la detección de infecciones más avanzadas que muestran un respuesta fuerte de tipo humoral. Detección de la inmunidad celular in vivo: Intradermorreacción Se basa en la reacción inflamatoria local que se produce al inyectar intradérmicamente un antígeno en el animal infectado, como respuesta retardada de hipersensibilidad (Chiodini y cols. 1984a). Es similar a la prueba que se realiza para detectar la tuberculosis bovina (Real Decreto 1047/2003), con la diferencia de que los extractos proteicos purificados (PPD) que se utilizan a modo de antígeno, son la johnina o la PPD (o tuberculina) aviar, derivados de Map o de M. avium respectivamente (Johnson y cols. 1949, Stuart 1962, Collins 1996). El uso de la tuberculina aviar está más extendido ya que los resultados son muy similares a los de la johnina pero su producción es más sencilla (Juste y cols. 1990a). También se ha probado el uso del complejo A36 de Map con buenos resultados (Gilot y cols. 1992, De Kesel y cols. 1992). El punto de inoculación recomendado en las especies bovina y caprina es la zona de las tablas del cuello, y en la ovina el pliegue de la cola, y el resultado se suele chequear a las 48 horas (Chiodini y cols. 1984a, Blood y cols. 1989, Juste y cols. 1990a). La sensibilidad de la prueba es bastante baja, y debido a las reacciones cruzadas que surgen con otras micobacterias y otros microorganismos, también se la considera de baja especificidad (Larsen y cols. 1965, Larsen 1972, de Lisle y cols. 1980, Chiodini y cols. 1984a, Blood y cols. 1989). Esta prueba puede dar falsos positivos en animales vacunados de paratuberculosis (Blood y cols. 1989). Sin embargo, hasta el momento los problemas más significativos son los derivados de los falsos positivos a la intradermorreacción simple con tuberculina bovina (tuberculosis bovina, M. bovis) por animales infectados con Map o vacunados de paratuberculosis, interferencias que tratan de evitarse por medio de la intradermorreacción comparada (inoculando al animal con ambas tuberculinas, la aviar y la bovina) (Chiodini y cols. 1984a, Blood y cols. 1989, Kohler y cols. 2001, Balseiro 2004). Aunque también han sido propuestos otros medios, como la prueba del interferón-γ y la prueba de aglutinación con bolas de látex (Balseiro 2004, Koo y cols. 2004). Detección de la inmunidad celular in vitro Algunas de las pruebas como la de la transformación linfocitaria o la de la inhibición de la migración leucocitaria están en desuso (Garrido y cols. 2000a), y otras como la del receptor de IL-2 (Whist y cols. 2000) prácticamente no se utilizan, y no se revisan en este trabajo. 103 DIAGNÓSTICO • Prueba del IFN-γ En este caso la técnica consiste en la detección de la citoquina IFN- que liberan los linfocitos T sensibilizados al ser estimulados con un antígeno, por medio de un ELISA con anticuerpo primario monoclonal específico. Como siempre, en el caso de la paratuberculosis los antígenos de elección son PPDs, que parecen dar mejores resultados que los sonicados celulares crudos (Robbe-Austerman y cols. 2006c), al menos en ovino. La prueba fue desarrollada primero para la detección de infecciones subclínicas de tuberculosis bovina (Rothel y cols. 1990, Wood y cols. 1990a, Wood y cols. 1990b), y fue modificada para su uso en el diagnóstico de la paratuberculosis (Billman-Jacobe y cols. 1992). La cantidad de IFN- que producen los linfocitos T varía de acuerdo con el tipo de respuesta y con el estadio de la infección, siendo más alta en respuestas iniciales de tipo celular en animales subclínicamente afectados (Wood y cols. 1990b, Pérez y cols. 1995b, Stabel 1996, Sweeney y cols. 1998, McDonald y cols. 1999, Corpa 1999, García Marín y cols. 1999a, Stabel 2000a, Stabel 2000c, Stabel y cols. 2001b, Jungersen y cols. 2002, Huda y cols. 2003b), o en infecciones más avanzadas pero de tipo tuberculoide o focal (Pérez y cols. 1999, Burrells y cols. 1999, Corpa 1999, González 2003, Huda y cols. 2003b). En general, al contrario que en animales con infección clínica avanzada, a la hora de revelar la manifestación de la respuesta celular, la sensibilidad de la técnica en relación con el cultivo o las observaciones patológicas, es bastante alta (75-100%) (Billman-Jacobe y cols. 1992, Pérez y cols. 1999, Corpa 1999, González 2003). En otros trabajos donde la técnica es comparada con el cultivo, la sensibilidad es más baja (Stabel y cols. 2001b). La especificidad puede ser elevada, sin embargo, puede verse reducida por las interferencias que provocan las reacciones cruzadas con otros microorganismos más o menos relacionados (Billman-Jacobe y cols. 1992, Pérez y cols. 1999, Gwozdz y cols. 2000b, Gwozdz y cols. 2002, Jungersen y cols. 2002, Kalis y cols. 2003a). Existen otros factores como la temperatura o el tiempo que pasa antes de realizar la prueba, que afectan a la viabilidad de los linfocitos, problema que se pretende controlar con el uso de la concanavalina (Stabel y cols. 2001b) o la IL-12 (Jungersen y cols. 2006). Otros opinan que de todos modos la sangre debe estar a temperatura ambiente y ser estimulada dentro de las 12 horas después de su recolección para que los resultados sean fiables (Robbe-Austerman y cols. 2006b). Como conclusiones de los estudios de IFN-γ con muestreos repetidos de los mismos animales, en los que esta prueba se compara con el cultivo y las pruebas de inmunidad humoral, Huda y cols. recomiendan el uso de este test en animales de 1-2 años, y el ELISA para los de 3 años (Huda y cols. 2003a, Huda y cols. 2004). No obstante, la variabilidad en los resultados que proporcionan estas pruebas inmunológicas también ha quedado patente (Huda y cols. 2003a), lo que da pie a otros investigadores para pensar que actualmente la prueba del IFN-γ continúa siendo una promesa de análisis válido más que una realidad (Collins 2006). En estudios recientes se han probado otros antígenos de Map (Olsen y cols. 2000, Olsen y cols. 104 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA 2001a, Vesosky y cols. 2004, Olsen y cols. 2005, Rosseels y cols. 2006), lo que ha demostrado entre otras cosas la posible interferencia de la inmunidad innata de células NK que inducen algunas proteínas excretadas de Map en las pruebas diagnósticas de IFN-γ (Olsen y cols. 2001a, Olsen y cols. 2005). Detección de la inmunidad humoral Se trata de revelar la presencia de los anticuerpos que genera el sistema inmune del hospedador infectado. En la paratuberculosis actualmente se utilizan dos tipos de prueba de inmunidad humoral, la AGID y el ELISA, aunque esta última es la más extendida (Harris y cols. 2001). La fijación del complemento (CF) fue una de las técnicas más utilizadas hasta los años 90, pero actualmente no se emplea (Garrido y cols. 2000a) y no será revisada. Son técnicas rápidas, baratas, fáciles de ejecutar sin mucho equipamiento, automatizables para su uso a gran escala (ELISA), y la toma de muestras no entraña dificultades (Juste y cols. 1990a, Garrido y cols. 2000a). La respuesta humoral suele ser fuerte y fácil de detectar en los estadios avanzados de paratuberculosis, por la que la sensibilidad de estas pruebas alcanza su máximo en animales con lesiones lepromatosas, con síntomas clínicos o que excretan grandes cantidades de la bacteria en sus heces. En cambio, son incapaces de identificar con precisión animales en fases iniciales de la infección, aunque por lo general son bastante específicas (Harris y cols. 2001). • Prueba de AGID En un gel de agarosa se enfrenta el suero problema con un antígeno específico. Éstos difunden por el gel, y en caso de haber anticuerpos para ese antígeno, el complejo antígeno-anticuerpo precipita haciéndose visible. El antígeno utilizado normalmente para la AGID de paratuberculosis es el de la proteína protoplasmática o PPA3 de la cepa Strain 18 (St18) (Juste y cols. 1990a), cepa de M. avium que fue identificada en un principio como Map (Chiodini 1993). En comparación con la histopatología y el cultivo la técnica presenta una sensibilidad baja tanto en bovino (Sherman y cols. 1984, Colgrove y cols. 1989, Kormendy 1990, Sockett y cols. 1992, Ferreira y cols. 2003), como en pequeños rumiantes (Hope y cols. 2000, Sergeant y cols. 2003), aunque parece mejor en estos últimos (Juste y cols. 1988). Su baja sensibilidad se debe a la incapacidad de detectar animales con paratuberculosis subclínica, ya que detecta correctamente animales con síntomas clínicos que excretan grandes cantidades de la bacteria en las heces (Juste y cols. 1988, Huchzermeyer y cols. 1992, García Marín y cols. 1992b, García Marín y cols. 1992c, Clarke y cols. 1996b, Pérez y cols. 1997, García Marín y cols. 1999a, Pavlik y cols. 1999c). Esta prueba presenta mejor correlación con el cultivo fecal que la CF o la intradermorreacción (Thomas 1983), pero es menos sensible que el ELISA (Cocito y cols. 1994, Collins 1996, Whittington y cols. 2003). Para algunos autores, el ELISA no puede reemplazar completamente a la AGID porque cada uno de ellos detecta una población diferente de animales infectados 105 DIAGNÓSTICO (Robbe-Austerman y cols. 2006a). La especificidad obtenida en estos estudios es muy alta, aunque parece ser incapaz de diferenciar claramente las infecciones producidas por Map, Maa, y Mas (Kormendy y cols. 1984, Chávez 1993, Pérez y cols. 1995b). • Prueba de ELISA Existen dos tipos de ELISA, el directo, en el que se detecta un determinado antígeno por medio de anticuerpos, y el indirecto, en el que lo detectado son los anticuerpos frente a un determinado antígeno. El ELISA indirecto consiste en capturar por unión Ag-Ac los anticuerpos presentes en un fluido biológico (suero, plasma, orina, leche) por medio de un antígeno fijado a un sustrato que sea reconocido por estos. Su revelado se realiza mediante un conjugado entre anticuerpo o proteína con afinidad específica por las inmunoglobulinas y un enzima. Al unirse este conjugado al complejo Ag-Ac, éste queda igualmente fijado, y tras añadir un sustrato para el enzima, se produce un cambio de color, cuya densidad óptica es proporcional a la cantidad de complejo fijado. Fue introducida en el diagnóstico de la paratuberculosis por Jorgensen y cols. (Jorgensen y cols. 1978), y es actualmente la técnica serológica más utilizada (Harris y cols. 2001). Su éxito radica en su bajo coste, rapidez, versatilidad, y adaptabilidad (Juste y cols. 1990a, Collins 1996, Pérez y cols. 1997, Garrido y cols. 2000a, Collins 2002). Probablemente, los antígenos más extendidos para el ELISA de paratuberculosis sean el PPA3 (Lyle y cols. 1983, Yokomizo y cols. 1983) y el lipoarabinomanano (LAM) (Sugden y cols. 1989). Como se ha dicho antes, el PPA3 es un derivado crudo de una cepa de M. avium que al principio fue considerada Map, aún así no da resultados menos específicos que otro antígeno derivado de la cepa VRI 316 de Map (Nielsen y cols. 2001). Se ha recurrido a la elaboración de antígenos no purificados similares por medio de tratamientos físico-químicos de cultivos de Map (Milner y cols. 1987, Colgrove y cols. 1989, Cox y cols. 1991, Hilbink y cols. 1994, Sweeney y cols. 1995, Pavlik y cols. 1999c, Hope y cols. 2000, Speer y cols. 2006). Hoy en día se pueden encontrar unos cuántos de manera comercial (Allied Monitor, CSL,...). En la busca de antígenos más específicos, han sido probados otros muchos candidatos: A y D (Sugden y cols. 1988, Sugden y cols. 1991), polipéptido a362 (Vannuffel y cols. 1994), las proteínas constitutivas AhpC y AhpD, y la secretada de 14 kDa (Olsen y cols. 2001b), proteínas de choque térmico (Stevenson y cols. 1991, Stevenson y cols. 1992, Colston y cols. 1994, Koets y cols. 2001), proteína de 35 kDa (Shin y cols. 2004), IS900glutatione-S-transferasa (Nakase y cols. 2006), y otros muchos que se están investigando actualmente (Griffin y cols. 2005, Bannantine y cols. 2006a, Cho y cols. 2006a, Bannantine y cols. 2006b, Cho y cols. 2006b). La parte del conjugado encargada de unirse a los anticuerpos captados por el antígeno de la placa de ELISA pueden ser anti-IgG o anti-IgM específicos de especie, o proteínas con alta afinidad por las inmunoglobulinas de diferentes especies como la proteína A o la G (Garrido y cols. 1999a, Garrido y cols. 2000a). Como enzima suele utilizarse o peroxidasa de rábano 106 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA (HRP) o fosfatasa alcalina (AP), y como sustrato orto-fenil-diamina (OPD), tetrametilbencidina (TMB), ácido sulfónico 2,2’-anzino-di(3-etil)benzotiazolina (ABTS), ácido 5aminosalicílico (ASA), o para-nitrofenil fosfatasa alcalina (PNPP) (Garrido y cols. 2000a). En comparación con otras técnicas serológicas, es más sensible y específica (Yokomizo y cols. 1991, Sockett y cols. 1992, Meylan y cols. 1994, Sweeney y cols. 1995, Kalis y cols. 2002), aunque su sensibilidad puede variar considerablemente, presentando valores en el rango de 15-98% en bovino (Colgrove y cols. 1989, Milner y cols. 1990, Collins y cols. 1993c, Meylan y cols. 1994, Sweeney y cols. 1995, Garrido 2001, Dargatz y cols. 2001a, Ferreira y cols. 2002, Pak y cols. 2003, Garrido y cols. 2003, McKenna y cols. 2005b, Eda y cols. 2006), y de 40-100% en pequeños rumiantes (Juste y cols. 1988, Sugden y cols. 1989, Molina y cols. 1991, Molina Caballero y cols. 1993, Pérez y cols. 1997, Hope y cols. 2000, Sergeant y cols. 2003). Como en las otras pruebas de detección de inmunidad humoral, generalmente su sensibilidad aumenta con el grado de excreción de bacterias en heces y el grado de difusión de las lesiones (Milner y cols. 1990, Sockett y cols. 1992, Billman-Jacobe y cols. 1992, Ridge y cols. 1992, Spangler y cols. 1992b, Collins y cols. 1993c, Sweeney y cols. 1995, Clarke y cols. 1996b, Pérez y cols. 1997, Reichel y cols. 1999, García Marín y cols. 1999a, Pavlik y cols. 2000d, Dargatz y cols. 2001a, Kalis y cols. 2002, González 2003, Sergeant y cols. 2003). En comparación con el cultivo la sensibilidad general del ELISA puede ser de un 14-30% (Collins y cols. 2005, McKenna y cols. 2005a), muy baja para muchos. No obstante, la frecuencia de detección de animales eliminadores en heces es alta, y además, la magnitud de los resultados (S/P o el valor de densidad óptica) del ELISA están directamente relacionadas con la probabilidad de que el animal esté infectado y excretando micobacterias en sus heces, lo que permite detectar los animales infecciosos de un rebaño (Collins y cols. 2005). También es un buen instrumento para predecir qué vacas se encuentran probablemente sufriendo una supresión importante en su producción de leche (Lombard y cols. 2005). Como la mayoría de antígenos utilizados eran mezclas no específicas, la especificidad del ELISA fue mejorada de forma revolucionaria gracias al trabajo de Yokomizo y cols. (Yokomizo y cols. 1983, Yokomizo y cols. 1985). En vista de las reacciones inespecíficas que detectaban con muestras de campo, pensaron en eliminar los anticuerpos correspondientes a otras micobacterias y microorganismos mediante la preadsorción de los sueros con M. phlei, lo que dio muy buenos resultados. Normalmente su especificidad no baja del 90% (Harris y cols. 2001). Teóricamente si el antígeno es específico no sería necesario realizar el paso de adsorción de Yokomizo y cols. Parece que se pueden conseguir mejores resultados con antígenos realmente específicos de Map, sin preadsorber los sueros (Griffin y cols. 2005). El ELISA con los antígenos AhpC y AhpD específicos de Map, y la proteína de 14 kDa específica de MAC, permiten detectar animales infectados de paratuberculosis sin reacciones 107 DIAGNÓSTICO cruzadas en casos de animales con tuberculosis (Olsen y cols. 2001b). Al miso tiempo, el ensayo de polarización de fluorescencia (FPA) con el antígeno MPB70 de M. bovis es capaz de detectar animales infectados por esa micobacteria sin interferencias en animales con paratuberculosis (Surujballi y cols. 2002). El ELISA también se puede aplicar a muestras de leche (Sweeney y cols. 1994), incluso como indicador de la estimación de la prevalencia de rebaños utilizando muestras de leche de tanque (Nielsen y cols. 2000b, Beyerbach y cols. 2004). En comparación con los resultados de ELISA de suero sanguíneo, la sensibilidad es menor aunque parece mantener una concordancia aceptable (Sweeney y cols. 1994, Winterhoff y cols. 2002, Klausen y cols. 2003, Munjal y cols. 2004, Salgado y cols. 2005, Hendrick y cols. 2005a, Hendrick y cols. 2005b, Lombard y cols. 2006), pero no para todos los autores (Hardin y cols. 1996). En cuanto a los resultados del cultivo se refiere, para algunos, los resultados del ELISA de leche muestran una concordancia superior que los del ELISA de suero (Hendrick y cols. 2005b). En otros trabajos, ha sido analizada la probabilidad de ser positivo en suero y leche en relación con la fase de lactación y de parto. Se ha observado que la positividad aumenta en suero al final de la lactación, en leche al principio de la misma, y tanto en suero como en leche a partir del segundo parto (Nielsen y cols. 2002a, Nielsen y cols. 2002b, Kudahl y cols. 2004). Sigue la mejora del ELISA con antígenos que otorgan mayor especificidad y sensibilidad (Eda y cols. 2006, Speer y cols. 2006). Una nueva técnica serológica basada en citometría de flujo, ha mostrado una sensibilidad y especificidad prometedoras (95,2 y 96,7%) al ser comparada con un ELISA comercial (Eda y cols. 2005), y es capaz de detectar animales con infección subclínica. Gracias al uso de análisis estadísticos (método Bayesiano, “likelihood ratio”, “receiver operation characteristic curve” [curva ROC], ...) y de la incorporación de otra información (edad, datos de producción,...) al análisis, se pueden hacer predicciones más precisas del estado de los animales (Collins 2002, Nielsen y cols. 2002c, Nielsen y cols. 2003, Van Schaik y cols. 2003a, Wang y cols. 2006, Nielsen y cols. 2006, Berghaus y cols. 2006a). En conclusión, el carácter multifásico o espectral de la enfermedad, hace imposible la adopción de una técnica de referencia única, y si se pretende obtener un diagnóstico de gran sensibilidad y especificidad, debe aplicarse una combinación de técnicas, y hacerlo de manera repetida si es posible (Pérez y cols. 1997, García Marín y cols. 1999a, Pavlik y cols. 2000d, Garrido 2001, Barrington y cols. 2003, Toft y cols. 2005). TRATAMIENTO Y MEDIDAS DE CONTROL En vista del elevado coste y de la ineficacia de los tratamientos disponibles, actualmente no se recomienda el uso de ningún tratamiento contra la paratuberculosis en ganado, a pesar de que ofrezcan buenos resultados in vitro (Aduriz y cols. 2000, Harris y cols. 2001). Únicamente sería aceptable para la recuperación temporal de animales de 108 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA alto valor genético (Gezon y cols. 1988, St Jean 1996), teniendo en cuenta que los animales tratados pueden suponer un importante foco de contagio (Juste y cols. 1990b), pues aunque su situación clínica puede mejorar durante el suministro de los fármacos, la excreción de micobacterias en heces continúa (Larsen y cols. 1953, Gilmour y cols. 1971, Merkal y cols. 1973, Hendrick y cols. 2006). Otros autores en cambio, aseguran que los animales tratados con estreptomicina, rifampicina, y pirazinamida o levamisol, no dan cultivos fecales positivos (Das y cols. 1992, Belloli y cols. 1995). Se han probado muchos fármacos o combinaciones de los mismos in vivo, entre otros, isoniazida, rifampizina, rifabutina, gentamicina, etambutol, claritromicina, amikacina y monensina (St Jean y cols. 1991, Chiodini y cols. 1993, Cocito y cols. 1994, St Jean 1996, Williams y cols. 1999, Brumbaugh y cols. 2000, Whitlock y cols. 2006a), pero ninguno de ellos es capaz de eliminar permanentemente la infección. En el caso de la enfermedad de Crohn también se han probado varios tratamientos (revisado en Implicaciones en salud pública. Enfermedad de Crohn), presuponiendo una etiología en la que Map estaría involucrado. Un tratamiento de 17-54 meses de duración, en el que se combina rifabutina y claritromicina, con y sin clofaximina, es capaz de inducir la remisión de los síntomas, aunque ni cura la enfermedad ni garantiza la desaparición de nuevas recaídas (Hulten y cols. 2000a, Borody y cols. 2002, Shafran y cols. 2002a). Otra hipotética alternativa sería llevar a cabo tratamientos con micobacteriófagos (virus bacteriófagos que infectan a las micobacterias), pero su utilización in vivo tiene muchas limitaciones: necesidad de rebajar la acidez del abomaso para garantizar la supervivencia de los fagos, monitorización constante de la resistencia-sensibilidad de Map a los fagos, evidencia experimental de que las bacterias intracelulares se encuentran protegidas de los fagos (tendrían que atacarlas en fase extracelular), falta de evidencia experimental in vivo sobre la efectividad de este tratamiento sobre bacterias intracelulares obligadas causantes de enfermedades crónicas, y el potencial peligro de que la transducción o transfección con fagos incremente la virulencia de Map (Emery y cols. 2004). Entre las medidas de control aplicables, la primera a tener en cuenta y de cumplimiento constante durante cualquier plan de control de la paratuberculosis, es llevar correctamente un manejo encaminado a evitar la introducción y la transmisión de la enfermedad en el rebaño (Juste y cols. 1990b). Son especialmente importantes las costumbres de manejo que afectan a la reposición, los partos, los terneros, los animales con infección detectada, la higiene y los purines (Aduriz y cols. 2000). La introducción de nuevos animales debería hacerse con las máximas garantías (Chiodini y cols. 1984a, Aduriz y cols. 2000, Carpenter y cols. 2004). Las vías de transmisión fecal-oral y láctea deberían ser atajadas evitando o restringiendo el contacto entre madres y crías, y entre adultos y jóvenes en general, evitando el contacto de los purines con los animales, los alimentos y la bebida, realizando tratamientos efectivos del calostro y de la leche (o usar preparados artificiales), manteniendo unas buenas medidas higiénicas generales, además 109 TRATAMIENTO Y MEDIDAS DE CONTROL de eliminando o aislando los animales con sintomatología clínica (Blood y cols. 1983, Chiodini y cols. 1984a, Goodger y cols. 1996, Rossiter 1996, Obasanjo y cols. 1997, Johnson-Ifearulundu y cols. 1999a, Muskens y cols. 2000, Pavlik y cols. 2000d, Kalis y cols. 2001, Beyerbach y cols. 2001, Gerlach 2002, Muskens y cols. 2003, Groenendaal y cols. 2003b). En casos de madres que excreten micobacterias en heces, puede ser aconsejable la eliminación de su descendencia pues puede encontrarse infectada por vía intrauterina (Chiodini y cols. 1984a). La mayoría de estas medidas son económicamente sostenibles y rentables, y su adopción reduce considerablemente la prevalencia del rebaño (Groenendaal y cols. 2003a), aunque no siempre funcionan, principalmente por incumplimiento de alguna. Durante el último congreso internacional sobre paratuberculosis (8th International Colloquium on Paratuberculosis, 14-17 de agosto de 2005, Copenhague, Dinamarca), se subrayó la importancia de una correcta aplicación de este tipo de medidas, de la caracterización de los factores de riesgo, del uso de sistemas de certificación, así como de la concienciación de las partes implicadas. Además de contemplar estos factores, los planes de control de la paratuberculosis se basan en la detección y eliminación de animales infectados y/o en la vacunación. Programas de detección y eliminación de positivos El objetivo de este método es el de erradicar la enfermedad, por medio del sacrificio de los animales que den resultado positivo en la prueba (o pruebas) de seguimiento seleccionada (“test and cull”). Al margen de otras apreciaciones, la primera limitación de este sistema yace en la propia ineficacia de las técnicas de diagnóstico (Whitlock y cols. 2000), ya que hay animales infectados que pasan inadvertidos, y otros que no lo están y pueden ser equivocadamente identificados como positivos. El cultivo fecal ha sido la base de varios programas de control en los que no se ha logrado alcanzar ese propósito (Moyle 1975, Rossiter 1992, Whitlock y cols. 1992b, Whitlock y cols. 1995, Ridge y cols. 1995b, Rossiter 1996, Kalis y cols. 1999a, Kalis y cols. 2000, Benedictus y cols. 2003, Pavlik y cols. 2003). Las pruebas serológicas utilizadas al principio (CF e intradermorreacción) tampoco dieron buenos resultados por sí solas (Benedictus 1984). Posteriormente se introdujo el ELISA combinado con el cultivo y a veces con otras pruebas serológicas como la del interferón-γ (Rossiter y cols. 1992, Whitlock y cols. 1995, Collins 1995, Ridge y cols. 1995b, Bulaga y cols. 1999, Kalis y cols. 1999a, Kalis y cols. 2000, Luyven y cols. 2002, Kalis y cols. 2003b), que junto con la aplicación de medidas higiénico-sanitarias ha dado mejores resultados (Kalis y cols. 2003b). No obstante, las estimaciones sobre la sensibilidad del ELISA y del cultivo en estadios preclínicos, no superan el 15-25% y el 30% respectivamente, además de que el ELISA puede identificar erróneamente como positivos hasta un 4% de animales (Whitlock y cols. 2000, Collins y cols. 2005). A pesar de la introducción de métodos moleculares (Thoen y cols. 1996a), en vista de la sensibilidad de estos métodos tampoco es esperable una gran mejora del sistema, aunque sí más rapidez. 110 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA Los costes de la monitorización de rebaños pueden resultar muy elevados (Aduriz y cols. 2000), por lo que se han buscado varias estrategias para reducirlos, como por ejemplo, el cultivo fecal de muestras agrupadas (Kalis y cols. 1999a, Whittington y cols. 2000a), el análisis de muestras ambientales del rebaño (Raizman y cols. 2004, Berghaus y cols. 2006b), o el análisis de subpoblaciones concretas del rebaño (Gardner y cols. 2006). El éxito económico de este tipo de programas depende de la situación específica de cada rebaño, y no resultan rentables para la mayoría de rebaños que se basan en ELISAs actualmente disponibles (Groenendaal y cols. 2003a). Aparentemente la erradicación de la paratuberculosis bovina no es posible con los conocimientos actuales, pero sí se logra reducir su prevalencia, y haciendo hincapié en la concienciación e implicación de ganaderos y veterinarios (Kalis y cols. 1999a, Kennedy y cols. 2001, Whittington y cols. 2001c, Benedictus y cols. 2003, Kennedy y cols. 2006, Caldow 2006, Wells 2006) se puede llegar a un escenario mucho más optimista. A pesar de que existen casos puntuales en los que se ha alcanzado la erradicación de la enfermedad por el método de detección y eliminación, todos los programas generales de este tipo han fracasado (Fridriksdottir y cols. 2000, Kennedy y cols. 2001, Benedictus y cols. 2003, Bakker y cols. 2006). Programas que incluyen la vacunación El objetivo inicial de una vacuna es el de inmunizar a un hospedador potencial mediante la inoculación de antígenos del agente infeccioso, para que cuando éste último entre en el organismo del hospedador su respuesta inmunológica no permita que se produzca la infección. La primera vacuna contra la paratuberculosis, que estaba compuesta por una mezcla de bacilos atenuados, parafina, aceite de oliva y piedra pómez, se utilizó en Francia para inmunizar vacas (Vallée y cols. 1926). Tras su seguimiento, observaron la reducción de animales excretores así como la disminución de la prevalencia de casos clínicos (Vallée y cols. 1934), resultados que animaron a continuar con estas pruebas. Su utilización se extendió a otros países como Inglaterra (Wilesmith 1982), Holanda (Huitema 1967, Benedictus y cols. 1988, Wentink y cols. 1992, Kalis y cols. 1992), Islandia (Sigurdsson 1960) o Dinamarca (Jorgensen 1983), además de mantenerse en Francia (Marly y cols. 1988, Saint-Marc y cols. 1992a, SaintMarc y cols. 1992b). Tras la introducción de la enfermedad en Islandia, la inusitada difusión que alcanzó en su cabaña ovina sólo pudo ser adecuadamente controlada con el uso de la vacuna (Sigurdsson 1960, Fridriksdottir y cols. 2003a). Las reducciones en el número de animales con síntomas clínicos o excretores es variable según los autores y difícil de comparar en función de los diferentes métodos y períodos de aplicación, pero en programas de 5 o más años, ésta puede situarse entre un 89 y un 99% (Sigurdsson 1960, Wilesmith 1982, Hurley y cols. 1983, Jorgensen 1983, Benedictus y cols. 1988, Kormendy 1994). Sin embargo parece que nunca desaperecen completamente los animales excretores (Kalis y cols. 1992), por lo que parece evidente 111 TRATAMIENTO Y MEDIDAS DE CONTROL la necesidad de combinar la vacunación con medidas higiénico-sanitarias y de detección y eliminación de animales excretores (Kalis y cols. 1999b). Tal y como demuestran diferentes trabajos experimentales y de campo, la vacunación ha proporcionado mejores resultados en pequeños rumiantes que en bovino, principalmente en ovejas (Sigurdsson 1960, Brotherston y cols. 1961a, Brotherston y cols. 1961b, Nisbet y cols. 1962, Gilmour y cols. 1973, Crowther y cols. 1976, Pérez 1992, Aduriz 1993, Juste y cols. 1994, Tellechea y cols. 1994, García Marín y cols. 1995b, Pérez y cols. 1995c, García Marín y cols. 1997, Corpa y cols. 1999, Tharaldsen y cols. 2003, Reddacliff y cols. 2006, Hines y cols. 2006). Esto se debe en parte a que las ovejas son resistentes a la tuberculosis, con lo que la vacunación de paratuberculosis en esta especie no se ha visto restringida por las interferencias en las pruebas diagnósticas de las campañas de control de la tuberculosis (intradermorreacción), permitiendo así un amplio seguimiento y contrastado de resultados de múltiples trabajos (Aduriz y cols. 2000). Sin embargo, los casos positivos pueden volver a aparecer en zonas supuestamente libres si se deja de vacunar (Djonne 2003, Fridriksdottir y cols. 2003b). Algo semejante ha ocurrido en Holanda, donde gracias al programa de vacunación en explotaciones bovinas con elevadas prevalencias (vacuna que también fue utilizada en rebaños de pequeños rumiantes), la prevalencia y las pérdidas fueron reducidas, pero el programa fue parado por informes conflictivos sobre su eficacia y por interferencias con la intradermorreacción de la tuberculosis, lo que generó problemas severos en la industria caprina principalmente (Bakker y cols. 2006). En el estado español se han otorgado varios permisos especiales para realizar estudios de vacunación en la especie bovina con una vacuna comercial (SILIRUM®), y parecen obtenerse resultados equiparables a los obtenidos en trabajos con otras especies hospedadoras (Garrido y cols. 2006, García-Pariente y cols. 2006, Muñoz y cols. 2006). Según los hallazgos inmunopatológicos del grupo de Veterinaria de la Universidad de León, la vacunación reduce la tasa de sacrificios por paratuberculosis, reduce la incidencia de la enfermedad clínica, y en la mayoría de los casos, limita la extensión y severidad de las lesiones, todo ello, en las tres especies rumiantes domésticas más importantes (Pérez 2006). En definitiva, se puede decir que la vacuna no evita la infección con Map, pero la incidencia de casos clínicos se ve reducida, además de ser una medida muy económica. Favorece la aparición de respuesta celular y humoral tempranas, controlando la evolución de las lesiones a tuberculoides, provocando su focalización, reduciendo la cantidad de bacilos presentes en las mismas, así como la cantidad que se excreta en las heces (Nisbet y cols. 1962, Jorgensen 1983, García Marín y cols. 1988b, Juste y cols. 1994, Kormendy 1994, Pérez y cols. 1995c, Van Schaik y cols. 1996, Gwozdz y cols. 2000a, García-Pariente y cols. 2003). Estas respuestas interfieren al mismo tiempo con las pruebas serológicas de diagnóstico (Aduriz y cols. 2000). 112 REVISIÓN DE LA BIBLIOGRAFÍA Los resultados que se obtienen con vacunas inactivadas o vivas atenuadas son similares (Larsen y cols. 1964, Wilesmith 1982, Marly y cols. 1988, García Marín y cols. 1999b), aunque actualmente se encuentra más extendido el uso de las inactivadas por miedo a la reactivación de las vivas (Aduriz y cols. 2000). También se han probado vacunas compuestas de fracciones de microorganismos (Larsen y cols. 1978b, Hurley y cols. 1983), antígenos purificados de Map (Mullerad y cols. 2002, Mullerad y cols. 2003, Koets y cols. 2006a), vacunas de DNA (Bannantine y cols. 2001, Huntley y cols. 2005, Sechi y cols. 2006), y a pesar de que algunas de ellas permiten diferenciar entre animales infectados y vacunados, o no son tan efectivas como las celulares completas, o su efectividad no ha sido demostrada. Por otro lado, hasta el momento los ensayos de revacunación no han mostrado una mayor protección, y la vacuna se administra sólo una vez en la vida del animal, lo que parece ser suficiente (Aduriz y cols. 2000). Normalmente se recomienda administrar la vacuna durante el primer mes de vida con el fin de proteger al animal antes de ser infectado y de minimizar la interferencia en el diagnóstico posterior de tuberculosis (Doyle 1956, Stuart 1962, Leslie y cols. 1988, Aduriz y cols. 2000). A pesar de ello, la vacunación de animales adultos también es beneficiosa, incluso más efectiva en algunos casos, aunque los animales ya se encuentren infectados (Sigurdsson 1960, Crowther y cols. 1976, Benedictus y cols. 1988, Pérez 1992, García Marín y cols. 1995b, García Marín y cols. 1997, Corpa y cols. 2000b, García-Pariente y cols. 2003, García-Pariente y cols. 2006). La vía de administración más eficiente es la subcutánea (Vallée y cols. 1926, Larsen y cols. 1978b, Marly y cols. 1988) y preferiblemente en el pliegue del pecho para evitar molestias al animal (Juste y cols. 1990b, Aduriz 1993), pero también se ha inoculado en la axila (Peris 1992, Corpa y cols. 1999). Aunque las vías pueden ser otras como la oral (Brotherston y cols. 1961a), la conjuntival (Marly y cols. 1988), o la intradérmica (Saint-Marc y cols. 1992b), estas no dan mejores resultados (Aduriz y cols. 2000). Transcurridos varios días desde la aplicación de la vacuna, se forma un nódulo fibrocaseoso en el punto de inoculación, debido en parte a la composición oleica de los adyuvantes, que muestran ciertas diferencias entre unos y otros (Hagan 1935, Reyes y cols. 2003). Si la vacuna se administra adecuadamente, el inconveniente que puede suponer la formación del nódulo vacunal se ve reducido a un efecto estrictamente estético, que con el tiempo puede incluso desaparecer (Hagan 1935, Sigurdsson y cols. 1949, Spears 1959, Gilmour y cols. 1966, Reddacliff y cols. 2006), y no produce pérdidas económicas de importancia (Eppleston 2006). Si se inyecta incorrectamente pueden aparecer lesiones problemáticas desde el punto de vista tanto patológico como económico (Windsor y cols. 2006). La autoinoculación en personal encargado de su administración es otro problema a tener en cuenta, pues los casos más graves requieren cirugía y drenaje para evitar la necrotización de los tejidos afectados (Sherman 1985, Patterson y cols. 1988, Windsor y cols. 2005). 113 ESTUDIOS ESTUDIO I Comparison of blood polymerase chain reaction and enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection in cattle and sheep Ramón A. Juste, Joseba M. Garrido, Mariví Geijo, Natalia Elguezabal, Gorka Aduriz, Raquel Atxaerandio and Iker Sevilla Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario (NEIKER), Berreaga, 1, 48160 Derio, Bizkaia, Spain. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, Vol. 17, 2005, pp. 354–359 ESTUDIOS Abstract A study was carried out to compare the performance of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and blood polymerase chain reaction (PCR) for diagnosis of paratuberculosis in cattle and sheep. For cattle, a set of 278 samples from one paratuberculosis affected Friesian farm was used; it included 80 ELISA-positive samples and 198 ELISA-negative samples from an age-matched group. Ninety-four samples were from heifers and 184 were from 2-5-year-old cows. The overall analysis showed a clear association (Fisher exact test [FET] p = 0.0049) but a weak negative agreement (45.3%, kappa = -0.1665 ± 0.0994) between the two tests. It reflected a moderate agreement among heifers (87.7%, kappa = 0.4471 ± 0.2435) and a moderate disagreement among cows (62.7%, kappa = -0.3670 ± 0.1057). For sheep, 496 single blood samples from 53 Latxa dairy flocks; 180 of the blood samples were from dam/offspring pairs. The overall association between the 2 tests on ovine samples was strong (FET, p < 0.0005), whereas the agreement was low (kappa = 0.1622 ± 0.1188). There was slightly better agreement for ewes (kappa = 0.2135 ± 0.1992) than for lambs (kappa = 0.1193 ± 0.1301). There was also a highly unlikely proportion of dam/offspring positive results (FET p < 0.0001, kappa = 0.6269 ± 0.1854). Four of 6 lambs that were necropsied one year after testing had paratuberculosis microscopic lesions in the ileocecal valve (3 lambs) or a PCR positive result (4 lambs). These results suggest that blood PCR testing might be a potentially useful new approach in paratuberculosis diagnosis, especially in young animals. Introduction It is widely accepted that the most reliable method for diagnosis of paratuberculosis in live animals is fecal culture (Collins y cols. 1993b). However, this method has the drawbacks that it takes several weeks to yield a result and there is no good interlaboratory standardization (RH Whitlock, personal communication). Although the use of new growth detection methods can significantly reduce this time (Whittington y cols. 1998), fecal culture is still an expensive and labor intensive technique. The alternative use of serological methods such as the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has become more popular because blood is a very convenient sample. Moreover, ELISA tests are fast and inexpensive and can be easily automated for processing large numbers of samples. However, the usefulness of serological tests is compromised by the variability of the immune response depending on the immunopathological form of paratuberculosis. For this reason, although several commercial ELISA tests are available, it is generally accepted that their sensitivity in detecting infected animals is only about 50% (Meylan y cols. 1994). In fact, because of its low sensitivity, the ELISA test is rarely positive in animals under 2 years of age and frequently fails to detect individuals in the early phases of infection. Detection of 119 ESTUDIO I Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map) by polymerase chain reaction (PCR) in fecal samples has been reported as an alternative to fecal culture because it allows quick detection based on amplification of IS900, an insertion sequence considered to be highly specific to Map. However, this method has not gained widespread use probably because of high costs and low throughput as well as problems caused by PCR inhibitors present in feces (Collins y cols. 1993a, Harris y cols. 2001). The advantage of PCR methods is that they can be easily adapted to a variety of samples. Because there have been several reports on the use of PCR in blood samples in cattle (van der Giessen y cols. 1992b, Gwozdz y cols. 1997), this method was applied to a set of field samples to determine whether PCR testing of blood could be of any value in some stages of the infection as a complement to the ELISA test. Materials and methods A set of 278 ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) blood samples of 1,016 tested in a Friesian dairy farm severely affected with paratuberculosis was used. All ELISApositive animals were included (80 samples) as well as an age-matched ELISA-negative set (198 samples). Ninety-four samples originated from 6-month to 2-year-old heifers, and 184 were from 2- to 5-year-old cows. A total of 496 single EDTA blood samples from Latxa dairy sheep in 53 flocks in the Basque Country of Spain were used. A total of 316 samples originated from 3- to 8month-old lambs, whereas 180 were from ewes between 2 and 6 years of age. Of these, 180 lamb samples belonged to animals whose dam was also included in the study, and therefore, allowed a dam/offspring pair comparison. Ten milliliters of blood was drawn from the caudal vein in cattle, or from the jugular vein in sheep, into EDTA vacuum tubes. After low-speed centrifugation, the plasma was transferred to an Eppendorf tube, and the cellular fraction was incubated with 0.83% ammonium chloride (1:2, vol:vol) for 20 minutes to lyse the red blood cells. Then, the tube was centrifuged for 10 minutes at 200 X g, and the cell pellet was washed twice with phosphate-buffered saline (PBS) by centrifugation under the same conditions. Thereafter, the cells were transferred to 2-ml tubes and submitted to 3 freeze and boiling cycles before DNA extraction by chloroform–octanol separation (Garrido y cols. 2000b). Both the plasma and the purified DNA were stored at -20ºC until use. The absorbed ELISA test was performed to detect antibodies against Map in the bovine and ovine samples following protocols reported previously for each species (Garrido 2001). In brief, high absorption capacity polystyrene microtiter plates were coated with 100 l/well of 0.04 mg/ml solution of paratuberculosis protoplasmatic antigen 3 (PPA-3) and frozen at -20ºC until use. The plasma samples were adsorbed (1:1) with a saline suspension of Mycobacterium phlei (5 g/liter) (laboratory grown strain from Dr. O. Fuentes, INIA, Madrid, Spain) to remove nonspecific anti- 120 ESTUDIOS Mycobacterium spp. antibodies. After an overnight incubation at 4ºC, the supernatants were diluted in PBS-Tween (0.05% Tween 80) pH 7.6 to 1/600 and 1/200 for cattle and sheep, respectively, and 100 l was added into duplicate wells of the antigen-coated plate. Cattle and sheep positive and negative control sera were included in every plate in duplicate according to the species tested. The positive control sera were obtained from 1 single culturally and histopathologically infected cattle or sheep. The negative sera were obtained from single animals from a herd or flock without any clinical history of paratuberculosis that were negative both by culture and by histopathological examination. After a 2-hour incubation period at room temperature (RT) in a humidified chamber, the plates were washed thrice with PBS-Tween. Protein G horseradish peroxidase conjugate (0.025 g/ml) was added and incubation was repeated at RT for 2 hours. After 3 washes with PBS-Tween, 100 l of 2,2’-azino-di-(ethyl-benzythiazoline sulfonate) (ABTS) substrate was added and plates were further incubated 20 minutes in the dark. The reaction was stopped with 50 l/well (2%) hydro-fluoric acid, and optical density (OD) was measured in a spectrophotometer at double wave length (405/450 nm). The mean serum OD value was divided by the mean positive control OD, and this ratio was used as the final serum reading for scoring the sample as negative or positive. The ELISA cut-off was set by a sensitivity versus specificity plotting method (Dohoo y cols. 2003) at the highest semi-sum of sensitivity and specificity for a specificity of at least 90%. It was 0.345 (95.1% specificity) in cattle and 0.200 (96.9% specificity) in sheep as determined by combined results of fecal culture and microscopic lesions from a set of 42 and 51 positive and 244 and 26 negative cattle and sheep, respectively (Garrido 2001). A 2.5 l aliquot of extracted DNA was added to a PCR mix containing primers P90 and PT91 and Taq polymerase in a final volume of 25 l in 200- l tubes (Garrido y cols. 2000b). The tubes were placed in a thermal cycler and subjected to a cycling profile consisting of 1 cycle at 96ºC for 2 minutes, 45 cycles of 96ºC for 15 seconds, 55ºC for 15 seconds, and 72ºC for 15 seconds, followed by an additional extension period of 10 minutes at 72ºC (Garrido y cols. 2000b). Cross-contaminations were checked by intercalating 1 distilled water blank after each group of 23 samples during the extraction procedure. One additional negative control was included for every 46 samples during the PCR setup. The products were resolved by electrophoresis in a 2% agarose gel for 50 minutes at 150 V. A band of the expected 389 bp size matching the positive control was considered as a positive result. The target band from 6 positive samples was cut out, purified with a GFX PCR DNA and Gel Band purification kit, submitted to a nested PCR (Naser y cols. 2004), repurified, and sent to a commercial subcontractor for sequencing to verify the specificity of the reaction. The overall and age-group ELISA and PCR results were compared in a 2X2 table by using Fisher exact test (FET). The agreement between the 2 methods was tested by the kappa index test at a 95% confidence interval (Dohoo y cols. 2003). Both analyses were 121 ESTUDIO I carried out with the FREQ procedure of SAS statistical package. Furthermore, a variable called complementary sensitivity (CS) was calculated as the ratio of positive results in only one method to the total number of positive results in the other method. This variable was meant to represent the additional detection efficacy of one method over the other, assuming both were highly specific. Results A total of 136 cattle samples had a positive result by ELISA or PCR (48.9%). Of these, only 10 were positive by both methods, whereas 70 were positive only by ELISA and 56 only by PCR (Table 1). The FET indicated that this distribution had a chance probability of 0.0049. The kappa coefficient had a value of -0.1665 ± 0.0994 (95% confidence interval), indicating a low degree of negative agreement (45.3%). The CS for PCR and ELISA were, respectively, 106.1% and 70.0%. When results were analyzed according to age, heifers had a total of 18 positive results of which 6 were positive in both tests, 12 were positive by PCR alone, and none by ELISA alone (Table 1). The FET indicated a probability of less than 0.0001, with a kappa value of 0.4471 ± 0.2435, indicating a moderate agreement (87.7%). For this age group, the PCR CS was 200.0%, whereas the ELISA CS was 0.0%. When only adult cows were considered, there were 118 samples with a positive result in any method. Of these, only 4 were positive by both methods, 44 by PCR alone, and 70 by ELISA alone. The FET showed a probability of less than 0.0001, with a kappa value of -0.3670 ± 0.1057, indicating a clear disagreement (62.0%). The PCR CS (59.5%) was much lower than the ELISA CS (145.8%). Table 1. Cattle results. All Heifers Cows ELISA + ELISA + ELISA – ELISA – PCR + PCR - PCR + PCR - Total * FET ‡ Kappa Agreement ELISA § CS § CS PCR 10 † 70 † 56 † 142 † 278 0.0049 -0.1665 54.7% 106.1% 70.0% (3.6%) (25.2%) (20.1%) (51.1%) 6† 0† 12 † 76 † 87.7% 0.0% 200.0% (6.4%) (0%) (12.6%) (80.9%) 4† 70 † 44 † 99 † 38.0% 145.8% 59.5% (2.2%) (38.0%) (23.9%) (53.8%) (0.099) 94 <0.0001 0.4471 (0.244) 184 <0.0001 -0.3670 (0.106) * FET: Fisher exact test for comparison of frequencies given as the probability of the distribution resulting from chance. § CS: Complementary sensitivity. † In parentheses, percent of each cell related to total. ‡ Kappa: kappa index of agreement. In parentheses, kappa 95% confidence error. A total of 74 sheep samples had a positive result in any test. Of these, only 9 were positive in both tests, whereas 13 were positive by ELISA alone and 52 by PCR alone (Table 2). The FET indicated a probability of less than 0.0005. The kappa index was 0.1622 ± 0.1188 indicating a low degree of agreement (86.9%). The overall PCR CS was 236.4%, whereas the ELISA CS was only 21.3%. Among the lambs, 3 were positive by both tests, 1 by ELISA alone, and 36 by PCR alone (Table 1). The FET 122 ESTUDIOS indicated that this distribution was unlikely to be due to chance (P = 0.0064), and the kappa index (0.1193 ± 0.1301) indicated a lack of significant agreement (88.3%). For this age group, the CS was 900.0% for PCR and only 2.6% for ELISA. The ewes had 6 positive results by both tests, 12 by ELISA alone and 16 by PCR alone. The FET for these results indicated a probability of 0.0117. The kappa index indicated a fair agreement (0.2135 ± 0.1992). The PCR and ELISA CS were 88.9% and 54.5%, respectively. Table 2. Sheep results. a) PCR and ELISA comparison. b) Dam/offspring PCR results. a) All ELISA + ELISA + ELISA – ELISA – PCR + PCR - PCR + PCR - Total * FET ‡ Kappa 9† 13 † 52 † 422 † 496 <0.0005 0.1622 (1.8%) (2.6%) (10.5%) (85.1%) 1† 36 † 276 † 316 0.0064 (1.0%) (0.3%) (11.4%) (87.3%) 6† 12 † 16 † 146 † 180 0.0117 (3.3%) (6.7%) (8.9%) (81.1%) Dam + Dam + Dam - Dam - Offs + Offs - Offs + Offs - Total * FET 13 † 9† 4† 154 † 180 <0.0001 (7.2%) (5.0%) (2.2%) (85.6%) Lambs 3 † Ewes b) § CS § CS Agreement ELISA PCR 86.9% 21.3% 236.4% 88.3% 2.6% 900.0% 84.4% 54.5% 88.9% ‡ Kappa Agreement Dam pr Offs pr 0.6269 92.8% 76.5% 61.9% ( 0.119) 0.1193 (0.130) 0.2135 (0.199) (0.185) * FET: Fisher exact test for comparison of frequencies given in probabilities of the distribution resulting from chance. § CS: Complementary sensitivity. † In parentheses, percent of each cell related to total. ‡ Kappa: kappa index of agreement. In parentheses, kappa 95% confidence error. Pr: probability; Offs: Offspring. The dam/offspring analysis carried out on 180 ewe/lamb pairs indicated that there was substantial agreement (92.8%) between PCR results (kappa = 0.6269 ± 0.1854) indicating a clear association between dam and offspring with regard to Map apparent presence in peripheral blood (Table 2). Of the 6 PCR-positive lambs necropsied 1 year after the tests were carried out, 3 showed small focal lesions in the ileocecal valve. All 3 lambs plus a fourth lamb that had no lesions were PCR positive in this tissue. The 6 PCR products that were sequenced showed over 98–99% homology with published sequences of the IS900 gene (GenBank accession numbers X16293, AF416985). Discussion and conclusions Because the absorbed ELISA with PPA-3 (Harris y cols. 2001) has generally been found to be much more specific than sensitive, it can be assumed that positive results are likely to correspond to truly infected animals (Meylan y cols. 1994). The specificity of the PCR test, including the IS900-based test on fecal samples, is generally considered to be very high, although there are a few reports of false-positive results (Cousins y cols. 1999, Englund y cols. 2002). Use of PCR on bacteria-free sample such as blood should be even more specific because unlike feces, blood should normally not contain bacteria that might share some homology with the Map PCR target sequence. In fact, 123 ESTUDIO I the cattle samples originated from a herd with a high incidence of clinical paratuberculosis, which provides a good degree of certainty that the animals were exposed to Map. The fact that sequencing confirmed all 6 cases tested suggests that false-positive results were probably not a problem. Therefore, although no gold standard confirmation method was used, it was assumed that both methods correctly identified infected animals. Thus, the concept of CS introduced for paratuberculosis in this study appears to be useful tool when no gold standard is available, and the methods being compared are known to be highly specific. In this situation, the CS provides a measure of the efficiency of combining methods to increase sensitivity. The agreement between the 2 tests was low in general, and this was interpreted to mean that each method would detect different forms or stages of Map infection because their respective targets (bacteria and antibodies) might not have parallel dynamics. This interpretation is consistent with the finding that young animals were more easily detected by PCR than by ELISA, possibly because Map-loaded phagocytic cells would physiologically recirculate from the intestinal lymphoid tissue to other lymphoid locations very early after the infection, reinfection, or reactivation (van der Giessen y cols. 1995). This should be expected to be more frequent among young animals newly exposed to Map than in adults who are known to be more resistant to infection. On the contrary, because the antibody response is slow to develop and highly dependent on the total number of mycobacteria, only the most advanced cases should have detectable antibody responses (Juste y cols. 1994). The ELISA-positive and PCR-negative results are more difficult to explain under this hypothesis because they should correspond to animals with large numbers of mycobacteria. One likely explanation is that paratuberculosis pathogenesis might not be a progressive process, but it may rather have alternating peaks and troughs in the antibody levels (Barrington y cols. 2003) and bacteremia corresponding to successive relapses or reinfections. It would be important to further investigate this hypothesis because it implies change in the current Map pathogenesis paradigm. The results of this study indicate that blood PCR may have a high potential as a complementary diagnostic test to ELISA because it might pick up the fraction of infected animals that ELISA tests usually fail to detect. In cattle, ELISA seemed to perform at similar levels of detection as PCR. However, in sheep, the blood PCR test clearly outperformed the ELISA in terms of positive results. This can be most likely related to the characteristics of the samples which, in the case of cattle, originated from a single paratuberculosis-affected herd and, in the case of sheep, originated from 53 different flocks of generally unknown Map infection status. On the other hand, the age seemed to have a major effect on detection by both methods. Indeed, the only test detecting all positive cases in heifers and almost all the positive cases in lambs was PCR, whereas in adults, the ELISA test yielded more positives. 124 ESTUDIOS From an epidemiological standpoint, the high prevalence of PCR-positive results in sheep blood might indicate that there are many Map-carrier sheep that may sometimes develop very limited focal lesions but remain clinically normal. This situation would call into question the effectiveness of full eradication in paratuberculosis-control programs. The close association between PCR results in ewes and lambs is noteworthy because it indicates that the offspring of positive animals may be a greater risk of infection. In conclusion, the data in this report present a new approach for paratuberculosis diagnosis on the basis of the complementary use of ELISA on plasma or serum samples and PCR on blood samples to increase overall sensitivity. There is a need for further research on the pathogenesis of Map to determine whether bacteremia occurs and to validate the use of blood as a diagnostic sample. Acknowledgements We thank Drs. Belén Extramiana, Mercedes G. Goti, and Lorenzo Gonzalez for their participation in the sheep study from which some of the samples used in this study were obtained. We also thank Dr. Eduardo Berriatua for his useful critical comments on this article. 125 ESTUDIO II Molecular typing of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis strains from different hosts and regions Iker Sevilla,1 Shoor V. Singh,2 Joseba M. Garrido,1 Gorka Aduriz,1 Sara Rodríguez,3 María V. Geijo,1 Richard J. Whittington,4 Vanessa Saunders,5 Robert H. Whitlock6 and Ramón A. Juste1 1 Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario (NEIKER), Berreaga 1, 48160 Derio, Bizkaia, Spain. 2 Goat Health Division, Central Institute for Research on Goats, Makhdoom, Post Farah Dist. Mathura, (UP) 28 11 22, India. 3 Universidad de Córdoba, Facultad de Veterinaria, Campus Universitario de Rabanales, Ctra. Madrid-Cádiz, km. 396, 14071 Córdoba, Spain. 4 Faculty of Veterinary Science, University of Sydney, NSW 2006, Australia. 5 6 NSW Agriculture, Camden NSW 2570, Australia. USDA-ARS-National Animal Disease Center, New Bolton Center, Kennett Square, PA 19348-1692, United States of America. Revue Scientifique et Technique (International Office of Epizootics), Vol. 24, No. 3, 2005, pp. 1061-1066 ESTUDIOS Summary The IS1311 polymerase chain reaction-restriction endonuclease analysis was used to detect genetic differences among 38 Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map) isolates from cattle, sheep, goats and bison from distinct regions of Spain, India and the United States of America (USA). In Spain, all eight bovine isolates, three out of six caprine isolates and one of ten ovine isolates were of the C type, while the other nine ovine isolates and three caprine isolates were of the S type. In India, all five ovine isolates and six caprine isolates were of the B type, and so were all three isolates from bison (Bison bison) from the USA. These results show that there are genetic differences between Map isolates related to geographic and host factors that have a potential use in the epidemiological tracing of new paratuberculosis isolates. Introduction Genotypic differences have been used to characterise isolates of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map), the agent of paratuberculosis in ruminants. According to Collins et al. (Collins y cols. 1990a), these differences make possible a classification of isolates into two groups: cattle-type strains and sheep-type strains. Although the most widely used typing methods are IS900 restricted fragment length polymorphisms (RFLP) (Pavlik y cols. 1999a) analysis and restricted genome on pulsed field gel electrophoresis (Stevenson y cols. 2002), Marsh et al. (Marsh y cols. 1999) developed a polymerase chain reaction-restriction endonuclease analysis (PCR-REA) based on polymorphisms in IS1311, an insertion sequence present in Map and in Mycobacterium avium subsp. avium (Maa) in seven to ten copies. This technique provides an easy and rapid method of distinguishing between Maa and both cattle and sheep Map strains. In a later study, Whittington et al. (Whittington y cols. 2001b) discovered a new IS1311 restriction band pattern in bison isolates from Montana in the United States of America (USA). In that study, this IS1311 PCR-REA typing method was applied to a series of mycobacterial isolates in order to detect any genetic differences related to host or geographical origin. Materials and methods The identity and origin of each isolate is shown in Table 1. Sample processing for culture was performed as described by Aduriz et al. (Aduriz y cols. 1995a). While the Indian ovine and caprine samples were cultured on Herrold’s egg yolk medium (HEYM) without sodium pyruvate, the Spanish bovine paratuberculosis isolates were grown on HEYM supplemented with sodium pyruvate. The Spanish ovine and caprine paratuberculosis strains were grown on Middlebrook 7H11 medium supplemented with Oleic acid-albumin-dextrose-catalase (OADC) (7H11) (Difco, Detroit, Michigan, USA) 129 ESTUDIO II and on Löwenstein-Jensen (L-J) (Difco). Bison Map isolates grew on L-J or on 7H9, and the remaining mycobacteria were isolated on Coletsos (Bio-Mérieux, Marcyl’Etoile, France). All media except Middlebrook and Coletsos were supplemented with mycobactin J (Allied Monitor, Inc., Fayette, Missouri, USA). Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis was identified on the basis of time of incubation to visible colonies, colony and bacilli morphology including acid fastness, mycobactin dependance on egg-based media, and IS900 PCR. Table 1. Characteristics of the isolates studied. Geographic origin Spain India USA Host Sample Species Primary culture No. of isolates Isolate code IS900 PCR IS1311 PCRREA Basque Country Cattle Faeces Map HEYM+ 5 341/02, 3515/02, 2059/03, 2226/03, 2702/03 Pos C Castilla y León Cattle Tissues Map HEYM+ 2 2484/02-7, 2484/02-18 Pos C Madrid Cattle Faeces Map HEYM+ 1 181/02 Pos C Andalucía Goat Tissues Map L-J 3 s/n, 43, 52504 Pos S Andalucía Goat Tissues Map L-J 3 242, 392, 485 Pos C Basque Country Sheep Tissues Map 7H11 1 P38I Pos C Basque Country Sheep Tissues Map 7H11 8 9G, 12I, 14I, 17G, 18I, 19I, 21I, 269ov Pos S Andalucía Sheep Tissues Map L-J 1 27 Pos S Basque Country Cattle Tissues Maa Coletsos 1 3321/00 Neg Maa pattern Andalucía Goat Tissues Maa Coletsos 1 Cap 120 Neg Maa pattern Basque Country Badger Tissues M. intracellulare Coletsos 1 2974/03 Neg 275 + 245 bp Basque Country Cattle Tissues M. bovis Coletsos 1 320/03 Neg Neg PCR Cantabria Cattle Tissues M. chelonae Coletsos 1 858/03 Neg Neg PCR Castilla y León Goat Tissues M. bovis Coletsos 1 887/00 Neg Neg PCR Farah Goat Faeces Map HEYM– 6 S3, S5, T7, S2, S28, S4 Pos B Mathura Sheep Faeces Map HEYM– 5 3812, S9, V95, V16, 43 Pos B Mathura Sheep Faeces M. asiaticum HEYM– 1 V 30 Neg Neg PCR Montana Bison Tissues Map L-J 3 6.1, 8.3, 10.3 Pos B Montana Bison Tissues Maa 7H9 1 13.1 Neg Maa pattern HEYM+: HEYM with Na pyruvate; HEYM–: HEYM without Na pyruvate. See rest of abbreviations in introduction and material and methods sections. 130 ESTUDIOS For DNA extraction, colonies were suspended in 500 µl of TE-Triton X100 (Calbiochem, Bad Soden, Germany), subjected to three cycles of freezing and boiling, and treated according to the protocol described by Garrido et al. (Garrido y cols. 2000b). Final DNA concentration was measured in a NanoDrop‚ ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Inc., Rockland, Delaware, USA). Five microlitres of the resuspended DNA were used in a IS1311 PCR mix containing 0.8 µM of primers M56 and M119 (Marsh y cols. 1999), 200 µM of each of the nucleotides dATP, dTTP, dGTP and dCTP, 20 mM of Tris-HCl, 50 mM of KCl, 2.5 mM of MgCl2 and 2 U of Taq polymerase (Invitrogene Ltd, Paisley, UK). The assay was performed in a GeneAmp 9,600 PCR system (Applied Biosystems, Foster City, California, USA) under the following conditions: one cycle of 3 min at 94ºC and 37 cycles of 30 s at 94ºC, 15 s at 62ºC and 1 min at 72ºC. In order to confirm Map identification by IS1311 PCR, an IS900 PCR was also performed, using primers and conditions described by Garrido et al. (Garrido y cols. 2000b). DNA bands of 608 bp and 389 bp were considered PCR positive results for IS1311 and IS900, respectively, after separation in a 2% agarose gel stained with ethidium bromide. An IS1311 REA was performed to detect the C/T polymorphism at base pair 223 between Map strains. Eight microlitres of the positive IS1311 PCR solution was digested for 2 h at 37ºC in a 16 µl reaction containing 2 U of each endonucleases HinfI and MseI supplemented with buffers provided by the manufacturer (New England Biolabs, Inc., Beverly, Massachusetts, USA). Band patterns visualised after electrophoresis on 4% agarose gels stained with ethidium bromide were interpreted in the manner indicated by Whittington et al. (Whittington y cols. 2001b): Map S strains were defined by two bands of 285 bp and 323 bp (all IS1311 copies have a C at 223 bp); Map C strains were characterised by four bands of 67 bp, 218 bp, 285 bp and 323 bp (some copies with a C and some with a T); Map B strains were identified by three bands of 67 bp, 218 bp and 323 bp (T in all copies); and finally, isolates showing three bands of 134 bp, 189 bp and 285 bp were considered as Maa (C at base pair 223 and T at base pair 422). After purification with a GFX™ PCR DNA purification kit (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK), IS1311 PCR products of two ovine (3812, S9) and two caprine (S3, S5) isolates from India, and one ovine (269ov.) and one bovine (3515/02) isolates from Spain were sent to the DNA Automatic Sequencing Service of the Centro de Investigaciones Biológicas-Consejo Superior de Investigaciones Científicas in Madrid to confirm the DNA sequence of the amplicons and the point mutations between strains. Both forward and reverse strands were sequenced with M56 and M119 PCR primers, respectively. Vector NTI v 8.0 software (InforMax Inc., Oxford, UK) was used to analyse and compare these sequences with those described 131 ESTUDIO II earlier for Maa and Map C, S and B strains (GeneBank U16276, and EMBL AJ223974, AJ223975, AJ308375). The DNA from cultures of eight mycobacteria other than Map (Maa, M. intracellulare, M. bovis, M. chelonae, M. asiaticum) was used as a negative control for IS900 and IS1311 PCR tests. Identification of non-Map mycobacteria was performed by the National Reference Laboratory at the Centro Nacional de Microbiología (Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spain) by bacteriological and molecular methods. Results Both IS900 and IS1311 PCR and REA results are given in Table 1. As expected, all Map isolates yielded positive results in both PCR assays, and all Maa isolates were also positive in IS1311 PCR. None of the other isolates was positive in any of the PCR assays performed, except M. intracellulare, which yielded a band of approximately 520 bp in the IS1311 PCR. Although the 67 bp band of C and B type digests is difficult to see, all samples submitted to restriction analysis gave unmistakable band patterns (Figure 1) which corresponded to the four possibilities described above, except for the M. intracellulare isolate which produced two bands of approximately 275 bp and 245 bp. Figure 1. Photograph of IS1311 polymerase chain reaction-restriction endonuclease analysis electrophoresis on 2% agarose gel stained with ethidium bromide. Lanes 1 and 10, 1Kb DNA size marker. Lane 2 shows an S pattern from a Spanish ovine isolate (269ov). Lane 3 shows a C type pattern from a Spanish bovine isolate (3515/02). Lane 4 shows a type B pattern from an American bison isolate (8-3). Lanes 5 and 6 show type B pattern from Indian caprine isolates (S5 and T7). Lanes 7 and 8 show type B pattern from Indian ovine isolates (3812 and S9). Lane 9 corresponds to an avian type isolate from a Spanish goat (Cap120). 132 ESTUDIOS All Map isolates from India were identified as B type strains regardless of whether they were of ovine or caprine origin. With regard to the Spanish cultures, while all the bovine isolates gave a type C REA pattern, only one (P38I) of the ten ovine isolates analysed was of C type, while all the others were of S type. Three of the six caprine paratuberculosis isolates were S type and three were C type. Finally, the three bison Map isolates from the USA were classified as B strains. MseI endonuclease recognised the T at base position 422 of the two Maa isolates (substituted by a C in paratuberculosis strains), which produced Maa type REA patterns. The DNA sequences obtained from the amplified products matched exactly with those published previously for each strain type. The ovine Map isolate from Spain, which was S type in restriction analysis, had a C at base position 223. A mixed C/T signal was detected at the same base position in the sequence of the Spanish bovine paratuberculosis isolate (Figure 2), classified as C type by REA. And finally, all four Indian ovine and caprine PCR products sequenced possessed a T in all copies at this position, which had only been found before in bison isolates from the USA. Figure 2. Sequences obtained from IS1311 amplicons of S, C and B type isolates matched exactly with those described before. Point mutations are indicated. Discussion Results of this study confirm previous findings (Whittington y cols. 1999a) that both IS900 and IS1311 PCR techniques are suitable for use in Map confirmation and typing. The unique amplification observed in M. intracellulare IS1311 PCR, is easily distinguishable and can be confirmed by REA. 133 ESTUDIO II The cultural characteristics and restriction patterns of Spanish paratuberculosis isolates analysed in the authors’ laboratory to date are in accordance with part of the literature (Marsh y cols. 1999, Whittington y cols. 2001b). These results indicate that cattle are mainly infected with type C Map, which is readily isolated on HEYM, although the presence of S type strains cannot be ruled out in this species since primary cultures of bovine samples are usually performed only on this medium. Most of the ovine Map isolates (nine out of ten) were of the S type and difficult to grow in primary cultures, but a C type strain (in one case out of ten) was also detected in sheep. Goats appeared to be affected by both C and S types, much as have been found in other studies (Pavlik y cols. 1999a, Whittington y cols. 2001b, Stevenson y cols. 2002). There is a certain discrepancy in the distribution patterns according to host species that were found in this study and the results reported by other authors (Pavlik y cols. 2000a, Stevenson y cols. 2002). The latter conclude that C type strains are commonly isolated from sheep in Europe, while in the present study only 10% of the sheep isolates were found to be of C type. This could be for the same reason that was discussed above with regard to the fact that only type C strains were isolated from cattle in the present study. It is likely that our isolates might represent a less biased sample of strains infecting Spanish sheep since we used L-J and 7H11 for primary isolation. According to Juste et al. (Juste y cols. 1991b), L-J might improve primary isolation of ovine strains by about 90%, but decrease primary isolation of bovine strains by approximately 37% in relation to HEYM. The other authors either did not report the media used for primary isolation (Stevenson y cols. 2002) or used HEYM (Pavlik y cols. 2000a). A larger, more specifically designed study that avoids primary isolation bias is needed in order to draw any definitive conclusions on this subject. It has been reported that culture of Map from bison samples is more difficult than from cattle but easier than from sheep, and that it can be improved by the use of HEYM without sodium pyruvate (Whitlock y cols. 1999). In the case of the Indian isolates, such differences were not noticed because only HEYM without added pyruvate was used for primary isolation. The observation of Map colonies produced from sheep samples cultured in HEYM (Das y cols. 1991, Singh y cols. 1996, Dimareli-Malli y cols. 2001) contradicts the findings of some other authors, who reported that the culture of Map colonies from sheep samples was unrewarding (Juste y cols. 1991b, Whitlock y cols. 1999). These findings led to the suspicion that a strain different from S could be involved in the Indian cases in the present study, probably a C strain. However the molecular methods used in this study proved that they were B type strains, which had previously only been found in bison from Montana (USA). Nevertheless, the preliminary results from RFLP analysis of genomic DNA indicate that these isolates are not the same as those from bison and probably represent a new biotype, as yet not seen outside India (Whittington, unpublished observations). In summary, this study confirms the existence of Map genetic differences related to geographic and host factors that 134 ESTUDIOS would help to explain the variable success rates in the primary isolation of Map from some host species on some culture media in previous reports. These differences could also prove useful for the epidemiological tracing of new paratuberculosis cases. Acknowledgements We thank V. Kumar and S. Hajra, from the College of Veterinary Science and Animal Husbandry of C. S. Azad University of Agriculture and Technology (Kanpur, Mathura), for performing primary cultures, and A.K. Bhatia, Director of the Central Institute for Research on Goats, for providing necessary facilities. Samples from Castilla-León were provided by the Pathology Unit of the Faculty of Veterinary Medicine of León. The Centro Nacional de Microbiología of the Instituto de Salud Carlos III kindly made the non-Map mycobacteria identification. We also thank Mertxe Bascones for technical help at NEIKER. While conducting this study, I. Sevilla held a fellowship from the Department of Agriculture and Fisheries, and currently holds a fellowship from the Department of Industry of the Basque Government. 135 ESTUDIO III Pulsed-field gel electrophoresis profile homogeneity of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis isolates from cattle and heterogeneity of those from sheep and goats Iker Sevilla, Joseba M. Garrido, Marivi Geijo and Ramon A. Juste Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario (NEIKER), Berreaga, 1, 48160 Derio, Bizkaia, Spain. BMC Microbiology, 2007, 7:18 ESTUDIOS Abstract Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map) causes paratuberculosis in animals and is suspected of causing Crohn’s Disease in humans. Characterization of strains led to classify paratuberculosis isolates in two main types, cattle type strains, found affecting all host species, and sheep type strains, reported affecting mainly sheep. In order to better understand the epidemiology of paratuberculosis a large set of Map isolates obtained from different species over the last 25 years have been characterized. Five-hundred and twenty isolates from different hosts (cattle, sheep, goats, bison, deer and wild boar) and origins had been cultured and typed by IS1311 restrictionendonuclease-analysis. Two-hundred and sixty-nine isolates were further characterized by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) using SnaBI and SpeI endonucleases. Differences in strain isolation upon various media conditions were also studied. All bovines, 4 and 26% of Spanish sheep and goats, respectively, and the deer and wild boar studied, carried IS1311-Cattle type strains. IS1311-Sheep type encompassed 96% and 74% of Spanish sheep and goats, and all three Portuguese sheep. Thirty-seven distinct multiplex PFGE profiles were found, giving 32 novel profiles. Profiles 2-1 and 1-1 accounted for the 85% of cattle isolates. Ten distinct profiles were detected in Spanish sheep, none of them with an incidence higher than 25%. Profile 16-11 (43%) and another three profiles were identified in Spanish caprine cultures. The hierarchical analysis clustered all profiles found in cattle, “wild” hosts and some small ruminants within the same group. The other group included 11 profiles only found in Spanish sheep and goats, including Spanish pigmented profiles. Differences in growth requirements associated with isolate genotype were observed. Cattle in Spain are infected with cattle type strains, while sheep and goats are mainly infected with sheep type strains. Although 7H9 broth based culture media seem to broadly cover the growth requirements of most Map strains, the use of various solid media is recommended to reduce any recovery biases. High genetic homogeneity of isolates from cattle, and heterogeneity of those from sheep and goats have been detected. Background Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map) is an obligate pathogen causing paratuberculosis in ruminants and other animal species, and suspected of being responsible for Crohn’s Disease in humans. Paratuberculosis causes significant economic losses to farmers and is becoming prevalent among livestock populations world-wide (Kennedy y cols. 2001). Strategies for paratuberculosis prevention and control require an understanding of the epidemiology of the disease. In particular, strain 139 ESTUDIO II genotyping is a valuable tool for epidemiological tracing of pathogenic microorganisms. Map isolates are generally identified by acid fast staining, the size of the bacilli, extremely slow growth, dependence on mycobactin, and the presence of several copies of the IS900 element in its genome. However, the description of some Map strains that are not dependent on mycobactin (Aduriz y cols. 1995a, Motiwala y cols. 2004) and the presence of IS900-like insertion sequences in bacteria other than Map (Cousins y cols. 1999, Naser y cols. 1999, Englund y cols. 2002, Motiwala y cols. 2004) mean that more reliable methods of characterization would be valuable. The most commonly used typing method is the analysis of restriction fragment length polymorphism using IS900 specific probes (IS900-RFLP). IS900-RFLP classified isolates from cattle, sheep and goats into two major groups using BstEII endonuclease (Collins y cols. 1990a). These were called sheep (S) and cattle (C) types because of their apparent predominance in those host species. An intermediate (I) group was also detected in two sheep from Canada. S strains are difficult to culture (Stamp y cols. 1954, Whittington y cols. 1999c), making further strain classification difficult. BstEII-C or cattle types have been described in cattle from New Zealand, Australia, the USA, Denmark, the Czech Republic, Slovakia, Hungary, Germany, France, Morocco, the United Kingdom, Austria, Italy, the Netherlands, Slovenia, Spain, Sweden, Argentina and Norway (Whipple y cols. 1990, Collins y cols. 1990a, Thoresen y cols. 1994b, Pavlik y cols. 1995, Bauerfeind y cols. 1996, Moreira y cols. 1999, Greig y cols. 1999, Pavlik y cols. 1999a, Cousins y cols. 2000, Whittington y cols. 2000b, Djonne y cols. 2005). These RFLP types have also been found infecting sheep from Canada, the USA, the Czech Republic, France, Greece, Australia, Spain and the United Kingdom (Whipple y cols. 1990, Collins y cols. 1990a, Thoresen y cols. 1994b, Pavlik y cols. 1995, Pavlik y cols. 1999a), and goats from New Zealand, Norway, Argentina, Germany, Denmark, Italy, the United Kingdom, Australia and the USA (Whipple y cols. 1990, Collins y cols. 1990a, Thoresen y cols. 1994b, Bauerfeind y cols. 1996, Pavlik y cols. 1999a, Cousins y cols. 2000, Djonne y cols. 2005). These strains have also been found in cervids from New Zealand, the Czech Republic, the United Kingdom and Argentina (de Lisle y cols. 1993, Moreira y cols. 1999, Pavlik y cols. 1999a, Pavlik y cols. 2000a, Machackova y cols. 2004), in lagomorphs from Scotland and the Czech Republic (Greig y cols. 1999, Machackova y cols. 2004), in alpaca and rhinoceros from Australia (Cousins y cols. 2000) and in Czech moufflon and wild boar (Machackova y cols. 2004). In contrast, the literature contains little evidence of BstEII-S strains and BstEII-I strains being as distributed in animal species: they have been reported in sheep from Canada, New Zealand, the Faroe Islands, South Africa, Morocco and Australia (Collins y cols. 1990a, de Lisle y cols. 1992, Thoresen y cols. 1994b, Bauerfeind y cols. 1996, Choy y cols. 1998, Cousins y cols. 2000, Whittington y cols. 2000b), in goats from New Zealand and the Czech Republic (Collins y cols. 1990a, Pavlik y cols. 1995), cattle from the Czech 140 ESTUDIOS Republic (Pavlik y cols. 1995), and deer from New Zealand and the Czech Republic (de Lisle y cols. 1993, Machackova y cols. 2004). IS1311 PCR-restriction endonuclease analysis (REA) (Marsh y cols. 1999) led to the identification of S strains in Australian and Icelandic sheep and cattle (Whittington y cols. 2001d) and Spanish sheep and goats (Sevilla y cols. 2005). A recent study based on IS1311 PCR-REA and other two PCR methods reported infection of Spanish goats and bullfighting cattle with S (Type I/III) strains (de Juan y cols. 2006a). Another promising technique for typing this parasitic bacterium is pulsed-field gel electrophoresis of digested genomic DNA (PFGE). It has been useful for typing other important mycobacteria including M. avium and M. tuberculosis (Levy-Frebault y cols. 1989, Coffin y cols. 1992, Feizabadi y cols. 1996, Kim y cols. 1997, Singh y cols. 1999). Pigmented and non-pigmented isolates from a wide variety of hosts and origins were analyzed by SnaBI-SpeI PFGE in an effort to standardize the technique for paratuberculosis strain typing (Stevenson y cols. 2002). Subsequently, caprine isolates from Spain, Scotland and Norway were analyzed (de Juan y cols. 2005). Thus, 26 multiplex profiles have been described and clustered into 3 major types. Other genotyping techniques have been investigated in an attempt to improve upon the discriminatory power of RFLP and PFGE (Bull y cols. 2000, Pillai y cols. 2001, Motiwala y cols. 2003, Overduin y cols. 2004, Amonsin y cols. 2004). However, some of them do not provide enough additional information and others need to be validated with larger numbers of strains already characterized by RFLP and/or PFGE and from diverse host and geographic origins to assess their value for further epidemiological studies on paratuberculosis. There have been few studies reporting molecular characterization of Spanish paratuberculosis isolates (Sevilla y cols. 2005, de Juan y cols. 2005, de Juan y cols. 2006a). Our aim in this work was to characterize by IS1311 PCR-REA and PFGE typing a large set of Map isolates obtained at Neiker from different species over the last 25 years to serve as a basis for a better understanding of the epidemiology of paratuberculosis. Methods Sources and growth of isolates Feces and tissue samples from cattle, sheep and goats were collected for routine paratuberculosis confirmation and for research purposes between 2000 and 2005. Twelve samples from sheep and one from a goat date from 1984-1999, and isolates obtained from these samples were maintained as glycerol stocks at -80ºC. Most strains were from animals in northern regions of Spain, but strains from other Spanish regions were also included (see Figure 1). Four-hundred and forty-four paratuberculosis isolates were recovered from cattle (n=409; 178 herds), 27 from sheep (n=27; 15 flocks) 141 ESTUDIO II and 21 from goats (n=19; 11 flocks). Four of the ovine isolates were yellow pigmented (Figure 2). Map was also cultured from one deer (2 isolates from 2 different tissue samples) and one wild boar. Eight bovine cultures from Argentina, one from France and 3 ovine cultures from Portugal were also included, as well as isolates from American bison (n=3) and Indian sheep (n=2) and goats (n=8). Samples were processed for culture of Map as described elsewhere (Aduriz y cols. 1995a). Bovine samples were cultured on Herrold´s egg yolk medium supplemented with mycobactin J (2 mg/l in all media containing the mycobactin) (Allied Monitor, Inc., Fayette, MO, USA) and sodium pyruvate (HEY). To avoid any bias in the recovery of strains from cattle, additional tubes of mycobactin J-supplemented Lowënstein-Jensen medium (LJ) were inoculated with bovine samples collected after 2002. Some bovine samples were also used to inoculate Middlebrook 7H11 supplemented with 1% Middlebrook OADC Enrichment (Becton, Dickinson and Company, MD, USA) (7H11) and mycobactin J. Figure 1. Regions mentioned in the study are indicated as follows: An= Andalucia; Ar= Aragón; As= Asturias; BC= Basque Country; Can= Cantabria; Cat= Cataluña; CL= Castilla y León; CM= Castilla-La Mancha; Ex= Extremadura; Ga= Galicia; IB= Balearic Islands; Ma= Madrid; Na= Navarra. Figure 2. Pigmented colonies of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis on a LowënsteinJensen slant, isolated from the yellow-colored intestines of one sheep with clinical paratuberculosis from the Basque Country (Spain). Ovine and caprine samples were cultured on HEY, on LJ and/or on 7H11 (alternatively with mycobactin J), depending on when they were collected. Some of these cultures failed in the first attempt, and material stored at -20 ºC was subsequently cultured again on Middlebrook 7H9 broth supplemented with OADC, 0.05% Tween 80 (Panreac Quimica SA, Barcelona, Spain) (7H9) with or without added mycobactin J, and then sub-cultured on 7H11. Indian samples were initially grown on HEY without added pyruvate and bison samples on LJ. Deer samples were cultured on HEY and LJ, and wild boar samples on these two media and on 7H11 with mycobactin J. 142 ESTUDIOS Cultures for PFGE High quality DNA could not be prepared from all samples due to loss of viability of some of the older isolates. Sufficient growth was obtained for PFGE typing with 232 isolates from cattle (n=228; 131 herds), 17 isolates from sheep (n=17; 10 flocks), seven isolates from goats (n=6; 5 flocks), two from deer, one from wild boar, three from American bison and seven from Indian small ruminants (two from sheep and five from goats). Nearly 85% of the bovine isolates were from Holstein (dairy) cattle, 10% from Limousin (beef) cows, 3% from Pyrenean (beef) cows, and 2% from Lidia (bullfighting) cattle. Spanish sheep were Latxa (dairy; n=14), Rasa-Aragonesa (meat; n=2) and Carranzana (dairy; n=1). Goat breeds were Payoya (dairy/meat; n=3), MurcianoGranadina (dairy/meat; n=3) and Saanen (dairy; n=1). The Indian sheep (Muzzafarnagari) and goats (Barbari) were all meat breeds. Isolate identification: IS900 PCR and Locus 251 PCR Map was identified on the basis of time of incubation to visible colonies, colony and bacillus morphology including acid fastness, and mycobactin dependence on egg-based media. Isolates were screened for the presence of IS900 and Locus 251 (Bannantine y cols. 2002a) as follows. The method described by Garrido et al. (Garrido y cols. 2000b) was used to extract DNA from single colonies or if there was no visible growth on solid media from broth culture pellets obtained by centrifugation of 5 ml at 2000 x g for 15 min. A GeneAmp 9600 PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) with specific primers were used for amplification under standardized conditions as described previously (Garrido y cols. 2000b, Bannantine y cols. 2002a). PCR products were subjected to electrophoresis in 2 % (w/v) agarose gels and stained with ethidium bromide to reveal DNA bands. IS1311 PCR-REA A segment of IS1311 element was amplified and digested with HinfI and MseI (MseI only to rule out presence of Mycobacterium avium subsp. avium) endonucleases as described by Marsh et al. (Marsh y cols. 1999). DNA fragments were separated by electrophoresis in 4% (w/v) agarose gels stained with ethidium bromide. Isolates were classified as cattle (C), sheep (S) or bison (B) Map types according to previously published criteria (Marsh y cols. 1999, Whittington y cols. 2001b). SnaBI-SpeI PFGE analysis A protocol described previously (Stevenson y cols. 2002) was used to prepare mycobacterial DNA. Ten ml of 7H9 broth was inoculated and incubated at 37 ºC in a static 25 cm3 cell culture flask (Corning Inc., Corning, NY, USA). When sufficient growth was observed at the bottom of the flask, the culture was homogenized by 143 ESTUDIO II vigorous shaking and the optical density measured using a Densimat (Bio-Mérieux, Marcy L’Etoile, France). An appropriate volume of culture was centrifuged at 2000 x g for 15 min, and the pellet washed and resuspended in modified spheroplasting buffer to obtain a bacterial suspension of approximately 6 x 109 bacteria/ml. This suspension was heated to 55 ºC and mixed with an equal volume of molten 1.5 % (w/v) low-meltingpoint agarose (Biorad, Hemel Hempstead, Hertfordshire, United Kingdom) in 50 mM EDTA, then poured into plug molds (Biorad), and allowed to solidify at 4 ºC. The plugs were incubated in a Tris-EDTA (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA; pH 8) lysis solution containing 1.5 mg/ml lysozyme at 37 ºC for 16-20 h. They were then placed with ESP solution (0.5 M EDTA, 1 % (w/v) lauryl sarcosine and 1.5 mg/ml proteinase K) and incubated at 55 ºC for at least 3 days. The ESP solution was discarded and the agarose plugs were washed in pH 8 Tris-EDTA 6 times for 20 min each. The plugs were equilibrated in the restriction buffer supplied by the enzyme manufacturer (1 x NE buffer and 0.1 mg/ml bovine serum albumin; New England Biolabs, Inc., Beverly, MA, USA) and then subjected to digestion with 20 U of the appropriate endonuclease in fresh buffer at 37 ºC (SnaBI, 3 h; SpeI, overnight). The plugs were placed in pH 8 TrisEDTA and loaded into a 1 % (w/v) pulsed field certified agarose gel (Biorad). Lambda midrange II PFG markers (New England Biolabs) and the type strain ATCC 19698 were included in every gel. Electrophoresis was carried out in a CHEF-DRII apparatus (BioRad). SnaBI restricted DNA was separated with initial and final switches of 6.8 and 26.3, respectively, and for separation of SpeI digests the values were 2.2 and 35.4, respectively. The electrophoresis time for SnaBI was 28 h to allow rapid screening of isolates, and samples with different and/or doubtful patterns were then electrophoresed for 40 h under the same conditions. Electrophoresis for SpeI gels was for 23 h. The gradient applied was always 6 V/cm. DNA bands were visualized and photographed in a Fluor-S MultiImager (BioRad) after ethidium bromide staining. Nomenclature of novel patterns was as recommended elsewhere (Stevenson y cols. 2002, de Juan y cols. 2005). The first number refers to the SnaBI profile and the second to the SpeI profile, giving consecutive numbers to new profiles. Both molecular size markers and ATCC 19698 SnaBI and SpeI profiles were used as between-gel references for band identification. Phylogenetic analysis of PFGE profiles and estimation of genetic diversity PFGE images were analyzed with the Quantity One Software package version 4.5 (BioRad). Similarities between different multiplex profiles were calculated as Jaccard coefficients on the basis of band presence/absence scores with the SPSS software for Windows version 11.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). An agglomerative hierarchical cluster analysis of the data using the unweighted pair group method with arithmetic averages was used to construct a dendrogram. Simpson’s Index of Diversity was calculated as follows to compare the genetic diversity of the isolates between host species and to asses the discriminatory power of the SnaBI-SpeI-PFGE typing: 144 ESTUDIOS 1-[Σ(no. of isolates with a particular multiplex profile/total no. of isolates)2] Results All bovine isolates grew in 2-4 months on HEY, and some cultured after 2002 also grew on LJ or in 7H11 with mycobactin J. Ovine isolates grew in 3-7 months on LJ, 7H11 (with or without mycobactin J) and/or 7H9 (with or without mycobactin J), but only from tissue samples. None of the ovine samples used to inoculate HEY produced Map colonies. Goat isolates grew in 2-7 months on the same media as sheep isolates, and some of them were also successfully isolated on HEY. Mycobacterial cells were not successfully propagated from several cases in small ruminants, although the presence of Map was identified on the basis of acid fastness, IS900 and locus 251 PCR results, and IS1311 PCR-REA result. Indian isolates grew in 2-4 months on HEY with no added pyruvate. Deer isolates grew in 3 months on HEY and LJ, and wild boar isolates grew in 2-3 months on HEY and 7H11 with mycobactin J. The isolation media for cultures typed by PFGE are given in Table 2. Subcultures in liquid medium of C and B strains grew faster than those of S strains (data not shown). IS900 PCR and Locus 251 PCR PCR amplification detected both IS900 and Locus 251 in all 520 isolates used in the study. These findings and the phenotypic characteristics (see “Methods” section) allowed all bacterial isolates used to be identified as Map. IS1311 PCR-REA The IS1311 insertion sequence was successfully amplified from all isolates. Restriction analysis of amplicons assigned each isolate to one of the 3 strain types previously described by this method. 145 wild boar isolates, exhibited band 100 type proportion All bovine isolates, as well as the deer and patterns corresponding to C type strains (Table 1, Figure 3). In contrast, 96.3% and 73.7% of Spanish sheep and goats, respectively, gave isolates with banding patterns corresponding to the S type strains; all sheep isolates from Portugal were also classified in this group. The other Spanish sheep (3.7%) and goats (26.32%) were infected by C type strains. Interestingly, two goat flocks were infected by both types, some goats carrying a C strain and others an S strain. All isolates from Indian sheep and goats and from American bison were typed as B 80 60 40 20 0 Sheep Goat S TYPE Cattle Wildlife C TYPE Figure 3. Graphic representation showing the clear polarization of C and S strain types found in Spanish bovine, ovine, caprine and “wild” species. ESTUDIO II strains. Table 1. IS1311 classification of Map strains. The 520 Map isolates from different host species classified as C (cattle), S (sheep) or B (bison) type according to IS1311 PCR-REA. Numbers of isolates from particular regions in Spain are specified in brackets following the region abbreviation. Abbreviations: An= Andalucía; Ar= Aragón; As= Asturias; BC= Basque Country; Can= Cantabria; Cat= Cataluña; CL= Castilla y León; CM= Castilla-La Mancha; Ex= Extremadura; Ga= Galicia; IB= Balearic Islands; Ma= Madrid; Na= Navarra. Geographic origin Spain ·Ar (19), As (9), BC (228), Can (22), CL (92), CM (2), Cat (9), Ex (1), Ga (13), Ma (4), Na (46) ·Ar ·An (1), Ar (2), BC (17), Na (5) ·An (4), BC (3; 1 goat) ·An (11), CL (1), Ga (1), IB (1) ·CM ·CM Argentina France ·Lys Portugal ·Trás-os-Montes India ·Mathura ·Farah USA ·Montana Host sp. Cattle no. of isolates 444 no. of animals(%) 409 (100.0) no. of herds/flocks(%) 178 (100.0) IS1311 type C Sheep Sheep Goat Goat Deer Wild boar Cattle Cattle Sheep Sheep Goat Bison Total 1 26 7 14 2 1 8 1 3 2 8 3 520 1 (3.7) 26 (96.3) 5 (26.32) 14 (73.68) 2 (100.0) 1 (100.0) 8 (100.0) 1 (100.0) 3 (100.0) 2 (100.0) 8 (100.0) 3 (100.0) 483 1 (6.67) 14 (93.33) 4 (36.36) 9 (81.82) 1 (100.0) 1 (100.0) 1 (100.0) 2 (100.0) 1 (100.0) 1 (100.0) 1 (100.0) C S C S C C C C S B B B SnaBI-SpeI PFGE analysis Restriction endonucleases SnaBI and SpeI differentiated 26 and 24 pulsotypes, respectively (Figures 4 and 5). Thus, a total of 37 different multiplex PFGE profiles were identified among the 269 Map isolates analyzed. 146 ESTUDIOS M W 1 2 15 20 21 22 23 24 27 28 29 31 32 M M W W M 33 37 40 16 25 26 30 34 35 36 38 39 41 W 388 339.5 291 242.5 194 145.5 97 48.5 cattle type profiles sheep type profiles Figure 4. SnaBI restriction profiles. Photographs of two gels comprising the 26 different SnaBI pulsotypes detected. Numbers above the lanes correspond to the PFGE nomenclature. Arrows and asterisks indicate differences (band loss and new band, respectively) between type 1 and cattle type profiles, and between type 16 and sheep type profiles. MW= molecular weight standards, in Kilobases (Kb). M W M M W 1 5 10 12 14 15 16 19 20 25 26 27 30 W M 1 31 11 17 18 21 22 23 24 28 29 32 W 339.5 242.5 194 145.5 97 48.5 cattle type profiles sheep type profiles Figure 5. SpeI restriction profiles. Photographs of two gels comprising the 24 different SpeI pulsotypes detected. Numbers above the lanes correspond to the PFGE nomenclature. Arrows and asterisks indicate differences (band loss and new band, respectively) between type 1 and cattle type profiles, and between type 11 and sheep type profiles. MW= molecular weight standards, in Kilobases (Kb). Twenty-two of the patterns identified with SnaBI (20-41) and 19 of those obtained with SpeI (14-32) have not been described previously; the two endonucleases together 147 ESTUDIO II giving 32 novel PFGE multiplex profiles in our collection of isolates (see Table 2 and Figure 6). Twenty-three different multiplex profiles were detected in Spanish cattle, 10 in Spanish sheep and 4 in Spanish goats. Profiles 2-1 and 1-1 included 52.16 and 32.33% of cattle isolates, found in 58.02 and 30.53% of herds analyzed, respectively. The calculated incidence for each of the other profiles identified in cattle was lower than 1%, except for profile 23-16 which included 3% of bovine isolates. In Spanish sheep, strain type 39-17 was the most frequently found with four isolates detected in 40% of ovine flocks. Four pigmented sheep isolates exhibited novel restriction patterns (26-24 and 25-23), and accounted for the 23.5% of sheep isolates. The other types observed in Spanish sheep appeared only once or twice. Profile 16-11 was found in three goats, and profiles 2-1, 15-1 and 34-28 were identified in a single animal each. The two isolates from deer had profile 37-1, and the wild boar isolate was typed as 2-1. All the Indian isolates gave the same multiplex profile regardless of their host species. All bison isolates from USA were 2-1. Several herds/flocks carried strains of different profiles: up to 3 in 3 bovine herds and 3 sheep flocks (34 bovine herds, 4 sheep flocks and 1 goat flocks gave more than one isolate). Eleven bovine and one goat herds gave isolates with two different profiles. The other flocks/herds each gave isolates with a single multiplex pattern within the same herd/flock. PFGE typing results according to host species breeds are reported in Table 3. Table 2. SnaBI-SpeI PFGE classification of Map strains. Details of SnaBI-SpeI multiplex profiles of the 269 Map isolates studied by PFGE: geographic origin, number of isolates, number of herds/flocks of the indicated host species, primary isolation media and IS1311 PCR-REA type. Profiles in boldface correspond to pigmented isolates. *novel profiles found in this study. Abbreviations: An= Andalucía; Ar= Aragón; As= Asturias; BC= Basque Country; Can= Cantabria; Cat= Cataluña; CL= Castilla y León; CM= Castilla-La Mancha; Ex= Extremadura; Ga= Galicia; IB= Balearic Islands; Ma= Madrid; Na= Navarra. HEY= Herrold's Egg Yolk Medium with mycobactin J; LJ= Löwenstein-Jensen Medium with mycobactin J; 7H11= OADC supplemented Middlebrook 7H11 Medium without mycobactin J; 7H11*= OADC supplemented Middlebrook 7H11 Medium with mycobactin J; 7H9+7H11= OADC supplemented Middlebrook 7H9 Broth without mycobactin J, subcultured on 7H11; 7H9*+7H11= OADC supplemented Middlebrook 7H9 Broth with mycobactin J, subcultured on 7H11. PFGE Country profile Spain 1-1 *1-10 *1-20 *1-27 2-1 *2-5 2-10 *2-12 *2-14 *2-15 *2-25 *2-31 *20-27 Locations Host sp No. of isolates (%) No. of herds or flocks (%) Other types in same herd/flock (No. of herds/flocks) BC, As, Ar, Na, Cat BC Na BC BC, As, Can, Ga, CL, Ar, Na, Cat, CM As Can, CL, Ex BC Ga BC, Ma CL CL BC Cattle 75 (32.33) 40 (30.53) 1-20 (1), 2-1 (6), 22-1 (1), 23-16 (1), 28-30 (1), 31-1 (1) Cattle Cattle Cattle Cattle 1 (0.43) 1 (0.43) 3 (1.29) 121 (52.16) 1 (0.76) 1 (0.76) 1 (0.76) 76 (58.02) Cattle Cattle Cattle Cattle Cattle Cattle Cattle Cattle 1 (0.43) 3 (1.29) 1 (0.43) 1 (0.43) 3 (1.29) 2 (0.86) 1 (0.43) 2 (0.86) 1 (0.76) 3 (2.29) 1 (0.76) 1 (0.76) 3 (2.29) 1 (0.76) 1 (0.76) 2 (2.29) 148 1-1 (1), 31-1 (1) 1-1 (6), 2-10 (2), 2-15 (1), 2-31 (1), 22-1 (1), 23-16 (2), 28-30 (1) 2-1 (2) 2-1 (1), 23-16 (1) 2-1 (1) Primary Isolation IS1311 type HEY, LJ, 7H11* C type HEY HEY HEY HEY, LJ, 7H11* C type C type C type C type HEY HEY HEY HEY HEY HEY HEY HEY C type C type C type C type C type C type C type C type ESTUDIOS *21-1 *22-1 *23-16 *24-19 *27-26 *28-30 *31-1 *32-1 *33-1 *40-1 2-1 *25-23 *26-24 *30-11 *35-29 *36-18 *38-22 *39-17 Can Ar BC Ma BC BC Na BC, Na BC CL Ar Ar BC, Na BC BC BC BC BC, Na Cattle Cattle Cattle Cattle Cattle Cattle Cattle Cattle Cattle Cattle Sheep Sheep Sheep Sheep Sheep Sheep Sheep Sheep 1 (0.43) 1 (0.43) 7 (3.02) 1 (0.43) 1 (0.43) 1 (0.43) 1 (0.43) 2 (0.86) 1 (0.43) 1 (0.43) 1 (5.88) 1 (5.88) 3 (17.65) 2 (11.76) 1 (5.88) 1 (5.88) 1 (5.88) 4 (23.53) 1 (0.76) 1 (0.76) 7 (5.34) 1 (0.76) 1 (0.76) 1 (0.76) 1 (0.76) 2 (1.53) 1 (0.76) 1 (0.76) 1 (10.0) 1 (10.0) 2 (20.0) 2 (20.0) 1 (10.0) 1 (10.0) 1 (10.0) 4 (40.0) HEY HEY HEY HEY HEY HEY HEY HEY HEY HEY LJ LJ LJ, 7H9*+7H11 7H11 7H11*, 7H9+7H11 7H11 7H11 7H11 C type C type C type C type C type C type C type C type C type C type C type S type S type S type S type S type S type S type *39-21 *41-32 2-1 15-1 16-11 *34-28 *37-1 2-1 BC BC BC An CL, An, IB An CM CM Sheep Sheep Goat Goat Goat Goat Deer Wild Boar 2 (11.76) 1 (5.88) 2 (28.57) 1 (14.29) 3 (42.86) 1 (14.29) 2 (100.0) 1 (100.0) 2 (20.0) 1 (10.0) 1 (20.0) 1 (20.0) 3 (60.0) 1 (20.0) 1 (100.0) 1 (100.0) 7H11 7H11 HEY, 7H11* 7H11*, 7H9+7H11 LJ, 7H9+7H11 7H9+7H11 HEY HEY, 7H11* S type S type C type C type S type S type C type C type India *29-1 *29-1 Mathura Farah Sheep Goat 2 (100.0) 5 (100.0) 1 (100.0) 1 (100.0) HEY HEY B type B type USA 2-1 Montana Bison 3 (100.0) 1 (100.0) LJ B type 1-1 (1), 2-1 (1) 1-1 (1), 2-1 (2), 2-15 (1) 1-1 (1), 2-1 (1) 1-1 (1), 1-20 (1) 39-17 (2), 39-21 (1), 41-32 (1) 38-22 (1), 39-17 (1) 36-18 (1), 39-17 (1) 30-11 (2), 36-18 (1), 38-22 (1), 39-21 (1), 41-32 (1) 30-11 (1), 39-17 (1) 30-11 (1), 39-17 (1) 34-28 (1) 15-1 (1) In five cases, more than one isolate cultured from the same animal was available. Two cows, one goat and one deer yielded two isolates each one but the restriction patterns of isolates from the same animal were identical. In contrast, an isolate cultured in 2002 from the feces of one Holstein bull was of 1-1 type, whereas the two isolates cultured in 2003 from the small intestine and mesenteric lymph nodes of the same animal, were of 2-1 and 28-30 profiles, respectively. Table 3. Distribution of Map genotypes among the different breeds of host species. Number of isolates, animals and farms in Spain giving isolates of each SnaBI-SpeI multiplex profile/IS1311 type according to the host species breed. Percentages are in brackets. CATTLE (232 isolates & 228 animals) Breed Isolates Animals Herds/Flocks 1-1 / C 1-10 / C 1-20 / C 1-27 / C 2-1 / C 2-5 / C 2-10 / C 2-12 / C 2-14 / C 2-15 / C 2-25 / C Holstein 197 (84.91) 193 (84.65) 100 (76.34) 68 (34.52) 1 (0.51) 3 (1.52) 103 (52.28) 1 (0.51) 1 (0.51) 1 (0.51) 1 (0.51) 3 (1.52) Limousin 23 (9.91) 23 (10.09) 22 (16.79) 3 (13.04) Pyrenean 7 (3.02) 7 (3.07) 6 (4.58) 4 (57.14) 1 (14.29) 15 (65.22) 2 (28.57) Bullfight 5 (2.16) 5 (2.19) 3 (2.29) SHEEP (17 isolates & 17 animals) RasaLatxa Aragonesa Carranzana 14 (82.35) 2 (11.76) 1 (5.89) 14 (82.35) 2 (11.76) 1 (5.89) 7 (70.0) 2 (20.0) 1 (10.0) 1 (20.0) 1 (50.0) 2 (40.0) 2 (40.0) 149 GOAT (7 isolates & 6 animals) MurcianoPayoya Granadina Saanen 3 (42.86) 3 (42.86) 1 (14.29) 3 (50.0) 2 (33.33) 1 (16.67) 2 (40.0) 2 (40.0) 1 (20.0) 2 (66.67) ESTUDIO II 2-31 / C 15-1 / C 20-27 / C 21-1 / C 22-1 / C 23-16 / C 24-19 / C 27-26 / C 28-30 / C 31-1 / C 32-1 / C 33-1 / C 40-1 / C 16-11 / S 25-23 / S 26-24 / S 30-11 / S 34-28 / S 35-29 / S 36-18 / S 38-22 / S 39-17 / S 39-21 / S 41-32 / S 1 (0.51) 1 (33.33) 2 (8.70) 1 (0.51) 1 (0.51) 6 (3.05) 1 (4.35) 1 (4.35) 1 (0.51) 1 (0.51) 1 (0.51) 2 (1.02) 1 (4.35) 1 (0.51) 1 (33.33) 1 (33.33) 1 (100.0) 1 (50.0) 3 (21.43) 2 (14.29) 1 (33.33) 1 (100.0) 1 (7.14) 1 (7.14) 4 (28.57) 2 (14.29) 1 (7.14) Phylogenetic analysis of PFGE profiles and estimation of genetic diversity Phylogenetic analysis of the multiplex profiles obtained produced a dendrogram with two main branches (Figure 6). One includes all profiles found in cattle, deer, wild boar, Indian small ruminants and American bison, for a total of 26 profiles. Previously described profiles 1-1, 2-1, 2-5, 2-10 and 15-1, were part of this group. The other main branch includes 11 profiles only found in sheep and goats from Spain, including the 1611 profile identified previously and both profiles detected in pigmented isolates (25-23 and 26-24). The discriminatory power for this PFGE strain typing method calculated as Simpson’s Index of Diversity, taking into account all isolates and profiles described, was 0.693. The index value was 0.621 for Spanish cattle, and 0.666 for Spanish goats, but much higher, 0.865, for Spanish sheep. 150 ESTUDIOS Rescaled Distance Cluster Combine 0 5 10 15 20 25 SnaBI -SpeI+ --------- +--------- +--------- +--------- +--------- + 1-1 __ *40-1 __ *31-1 __ *1-27 __ *1-20 ____ *1-10 __ _ 2-10 __ _ 2-1 __ _ *32-1 __ _ *2-25 __ _ *20-27 ____ *22-1 ____ *2-14 ____ *29-1 ____ *33-1 __ ___ *21-1 ____ _ *2-12 ____ _ *2-5 ______ *27-26 __ _ *2-31 _______ _ *28-30 ______ ___ *2-15 ______ _ _ 15-1 ________ _ CATTLE TYPE PROFILES *37-1 ____ ________________________________________ _ *23-16 _________ _ _ *24-19 _________ _ _ 16-11 ______ _ *30-11 __ _ _ *39-17 __ ___ _ *39-21 ____ _ _ _ *41-32 __ ___ ___ _ *38-22 ____ _ ___ _ *34-28 _______ _ _ _____ _ *36-18 _________ _ _ ___ _ SHEEP TYPE PROFILES *26-24 ___________ _ _ ________________________________ _ *25-23 _______________ _ _ *35-29 _________________ _ Figure 6. Dendrogram showing the similarities between multiplex PFGE profiles of isolates in the collection studied. The agglomerative hierarchical cluster analysis of the data using the unweighted pair group method with arithmetic averages divided strain profiles in two main branches, cattle type profiles and sheep type profiles. Profiles in boldface correspond to pigmented isolates. *novel profiles found in this study. Discussion Differences in the success of Map isolation and, more specifically, difficulties in culturing this micro-organism from ovine specimens, have been repeatedly reported in many countries (reviewed in reference (Whittington y cols. 1999c)). Some authors suggest that different host species preferentially carry different strains, and the differing cultivation requirements of these strains causes the divergent efficacy of isolating the organism (Collins y cols. 1990a, Juste y cols. 1991b, Aduriz y cols. 1995a, Bauerfeind y cols. 1996). In contrast, other researchers did not report any links between host species, strain type and/or culture characteristics (Thoresen y cols. 1994b, Pavlik y cols. 1999a, Stevenson y cols. 2002). Our study does not resolve this issue because we did not use the same methods for all cultures, and culture attempts were carried out with the 151 ESTUDIO II concrete objective of isolating Map from paratuberculosis-affected animal specimens received. Nevertheless, our results are consistent with other reports on the comparison of different media for Map culture (Whittington y cols. 1999c, de Juan y cols. 2006b), and confirm the existence of different culture requirements according to Map type. IS1311 PCR-REA typing with our collection of bovine isolates — presumably the least biased due to its size and to the use of various culture media — confirms the finding of a previous study (Sevilla y cols. 2005): Holstein, Limousin and Pyrenean cattle in Spain are infected with C type strains. These strains are more easily isolated on HEY than on other solid media. This strain type was found only in one of 27 isolates from Spanish sheep, the others, like those from Portugal (n=3) being S type. This indicates that sheep in Spain and probably also in Portugal are mostly infected with S strains. Some of these were isolated with ease on 7H11 without mycobactin J, others on the same medium with added mycobactin or on LJ with longer incubation periods, and some grew in 7H9 culture flasks (with or without mycobactin J). We did not obtain any growth of such strains on HEY, but not all samples were used to inoculate HEY slants. The single C type strain isolated from sheep dates from 1993 and was cultured only on LJ. Consequently, our study does not indicate whether C strains can be readily isolated from ovine samples on HEY, but other authors report that this is feasible (Collins y cols. 1990a, Pavlik y cols. 1995). Choy et al. (Choy y cols. 1998) report that it would appear that the IS900-RFLP type is not correlated with the ability to culture isolates, as uncultivable sheep isolates from intestinal-mucosal homogenates in Australia had the same pattern (S1) as those from New Zealand grown on HEY (Collins y cols. 1990a). Other factors, including mycobacterial concentration, contamination of inocula, susceptibility to hexadecyl-pyridinium-chloride (or other decontaminants) and/or different phenotypic stages could also contribute to the difficulty of culturing these strains. Only 26% of the Spanish goats analyzed were infected with strains belonging to the C type: the other 74 % had sheep (S) type paratuberculosis. The cultural characteristics of caprine isolates depended on the strain type: C strains had bovine-like characteristics and S strains had ovine-like characteristics. This strain type distribution in goats disagrees with the findings of other authors in Spain and other countries (Thoresen y cols. 1994b, Djonne y cols. 2005, de Juan y cols. 2005) who report a very low incidence of S strains. The proportion of S type isolates previously calculated (de Juan y cols. 2006a) for Spanish goats (24.7% of goat isolates and 39.1% of flocks studied) is lower than that detected in our study (73.7% of animals and 81.8% of flocks). These differences may be due to a culture media bias, but epidemiological reasons can not be ruled out. We found several goat flocks infected with both C and S types, although this was not the case for all farms or animal species studied. Our findings suggest that goats are highly susceptible to C, S and B Map strains. Although we describe numerous multiplex PFGE profiles, nearly the 85% of bovine isolates belonged to only two different profiles, 1-1 and 2-1. The homogeneity of 152 ESTUDIOS paratuberculosis isolates, especially bovine isolates, has been described before (Bauerfeind y cols. 1996, Feizabadi y cols. 1997b, Cousins y cols. 2000, Whittington y cols. 2000b, Motiwala y cols. 2003, Djonne y cols. 2005). Apparently, particular Map strains have developed the ability to infect a wide range of types of cattle, and international trading has favored the worldwide spread of these strains. This may be accentuated by the genetic homogeneity of cattle as a result of genetic improvement programs and international trading. Indeed, bovine genotypes highly susceptible to certain strains may have spread across the world, and consequently the contact between other host species and these strains would have increased proportionally. We noted slight but interesting differences between strain types found in different bovine breeds coming from the same geographic area. Holstein cattle had the largest number of different profiles (n=18), but this is unsurprising because it was the most numerous breed. More remarkable is the absence from Holsteins of 5 profiles detected in other breeds. Limousine cattle carried more 2-1 type and less 1-1 type than Holstein cattle. In contrast, the 1-1 strain was much more prevalent in Pyrenean cows. Cattle destined to bullfighting came from a less represented geographic area. With the exception of one 2-1 type, strains isolated from these animals (n=5) showed rare profiles, suggesting a separate epidemiological context. This is in agreement with the results of the study by de Juan et al. (de Juan y cols. 2006a) reporting a high proportion of Type I/III isolates in two bullfighting cattle farms. Type 2-10 detected in 2 bullfighting and 1 Holstein animal, has only previously been reported in one goat from Norway (de Juan y cols. 2005). The novel profile 2-25 was only isolated from two bullfighting animals. The differences of geographic origin of isolates may contribute to the differences found between cattle breeds, especially in bullfighting cattle. The seven farms affected with 23-16 strains, are all in the same geographic area, some being only 30 km apart, and 5 of them also share the same veterinarian. These strains were isolated over several years (2000-2003) indicating persistence in this ecosystem. According to the phylogenetic analysis, this is one of the strains more different from the others in the bovine type sub-cluster. We are investigating probable links in food and water resources or historic introduction. Ours is not the first description of mixed infection evidenced by isolation of different strains from the same animal (Pavlik y cols. 1995, Cousins y cols. 2000, Whittington y cols. 2000b), and could be similar to Mycobacterium avium polyclonal infections in human patients (Arbeit y cols. 1993). The bull with 3 different strains belonged to a Holstein herd with clinical paratuberculosis cases. The other two isolates obtained from the herd were typed as 1-1 and 2-1. This is consistent with types found in the bull, except for the extra profile (28-30) which was not isolated in any other animal. Re-infection of the animal by different strain types is the most probable explanation, 153 ESTUDIO II because they were isolated from different biological samples and on different sampling dates. Strain diversity in the sheep population was high. All the PFGE patterns of Spanish sheep isolates were different from those found in cattle, except for one 2-1 strain from a Rasa-Aragonesa sheep from Aragon. Pigmented isolates exhibited novel restriction patterns designated 26-24 and 25-23. The first was found in Latxa flocks in Basque Country and Navarra. These were not related to the Rasa-Aragonesa sheep from Aragon infected with the other pigmented profile. This is the first report of pigmented strains in Spain. Pigmented strains were less prevalent than the 39-17 strain, found in Basque Country and Navarra. Three flocks in neighboring locations in the main area of prevalence in sheep in Basque Country, gave 3 isolates per flock. For each of the 3 flocks all 3 isolates differed from each other, but 39-17 type was found in all of them. The diversity index calculated for goats was low. However, including goat isolates reported by de Juan et al. (de Juan y cols. 2005), the index is 0.817. All isolates we cultured from goats, except one (34-28), have profiles that have previously been reported in this host species. The 16-11 type was observed throughout Spain and in numerous goat breeds. We detected the 15-1 type in goats in Cordoba (Andalucia), and it is also detected in other breeds in Madrid. In conclusion, goats in Spain are affected with a wide range of different strains, including C and S type strains. Deer isolates had a novel profile (37-1) closely related to the 15-1 type (see Figure 1 and 6), previously found in the same area. Wild boar has carrion-eating behavior, and is a possible reservoir or vector of Map, which has been isolated several times from this species (Machackova y cols. 2003b, Machackova y cols. 2004, Alvarez y cols. 2005). However, there is no evidence of diseased animals. The strain we isolated from wild boar was 2-1 type, a strain type that is widely disseminated. Cultures from India and bison isolates from USA showed different multiplex profiles, indicating they are different strains. The phylogenetic dendrogram we constructed for our collection of paratuberculosis strains shows two distinct branches. One comprises isolates from cattle sheep, goats, deer, wild boar, and bison, whereas the other includes isolates only found in sheep and goats. This is in general agreement with previous work (Stevenson y cols. 2002, de Juan y cols. 2005). Our first branch (isolates from cattle and other hosts) is the same as the previously described Type II cluster, and IS900-RFLP Cattle types. The pigmented isolates from Scotland and Faroe Islands were included in the Type I cluster. However, type 16-11 found later in Spanish goats, was not included in Type I, and they were considered to be Type III. Our pigmented strain profiles clustered together with 16-11 strains and other isolates only found in sheep and goats. It is not clear where these novel profiles should be incorporated, but apparently they are more closely related to the 1611 profile than to those previously described for pigmented isolates. Other studies 154 ESTUDIOS included both Sheep and Intermediate IS900-RFLP types within the same cluster, composed of two different sub-clusters (Pavlik y cols. 1999a, Cousins y cols. 2000). This seems to be a more accurate approach because Type III strains are very much closer to Type I than to Type II strains. Our findings confirm the soundness of the classification proposed by de Juan et al. (de Juan y cols. 2006a) into 2 major types (Type I/III and Type II). These results suggest, however, that the original classification into cattle (C) and sheep (S) strains is more descriptive, has historic priority, and is substantially confirmed by the associations between bacterial type and host species (Figure 3). It is also consistent with the widely accepted practice in bacteriology of using as species name the Latin name of the species in which the parasite is found. Consequently, we strongly encourage the use of this system with only two groups corresponding to cattle and sheep. The overall discriminatory power for this PFGE typing was not high but acceptable (0.693). The problem with this method appears to be the low degree of diversity of the bovine isolates rather than a true lack of power of the typing technique. Multiplex PFGE seems to be one of the most robust and reliable typing methods, because it explores the entire genome and only depends on the specificity of restriction endonucleases used. Other approaches depend on the distribution of repetitive DNA fragments, random amplification of certain fragments or on sequencing of variable repetitive regions; all these approaches can suffer from problems of reproducibility or reliability. However, PFGE is expensive and time consuming, in addition to the problem of obtaining typeable cultures. This method was unable to distinguish the IS1311-B type found in bison (PFGE 2-1) from other IS1311-C strains. The discrimination between IS1311-B and C is important, because these B strains (from both India and USA) share the phenotypic characteristic of preferring egg-based media without added pyruvate (Sevilla y cols. 2005). Conclusions Improved liquid culture media (based on Middebrook 7H9) seem to be appropriate for primary isolation, because they appear to provide the entire isolation requirement spectrum of all strains. Nevertheless, we recommend the use of various solid media to avoid biases in primary isolation, and subculture of liquid cultures (when used for primary isolation) onto solid media to obtain pure colonies. Alternatively, PCR-based differentiation of strain type before culture inoculation may help to decide the media to be used. High homogeneity of isolates from cattle, and heterogeneity of those from sheep and goats have been detected. Overall typing may need to be improved and this could be done by including an additional endonuclease or complementary techniques. PCR-REA typing is a powerful technique because it can both confirm Map identity and provide 155 ESTUDIO II clear microbiological and epidemiological information. Systematic use of the more sophisticated PFGE method used does not seem to be beneficial: it provides genetic information which does not appear to be clearly related to phenotypic properties but rather to limited epidemiologic details. Authors' contributions IS carried out the laboratory and field work, compiled and analysed information and data, and drafted the manuscript as part of his PhD dissertation. JMG participated in the laboratory and field work, compiled information, coordinated the study and helped to draft the manuscript. MG participated in the laboratory and field work. RAJ conceived of and coordinated the study, and helped to draft the manuscript. All authors read and approved the final manuscript. Acknowledgements We wish to thank the farmers and veterinarians who provided the samples used in this study. J.M. Plazaola from the Diputación Foral of Gipuzkoa is acknowledged for his help with data collection. Numerous samples from Castilla-León were provided by the Pathology Unit, Faculty of Veterinary Medicine of the University of León (Spain) headed by V. Pérez and J.F. García-Marín. Samples from wild boar and deer were sent by the Instituto de Investigación en Recursos Cinegéticos (IREC) in Ciudad Real (Spain) headed by C. Gortazar. Samples and cultures from Andalucía (Spain), Argentina, India, Portugal and USA were kindly provided by S. Rodríguez, A. Verna, S.V. Singh, A.C. Coelho and R. Whitlock, respectively. We are grateful to G. Aduriz for isolation and information on some strains. We also thank A. Badiola, Z. Pérez, I. del Pozo, M. Bascones, J.C. Ibabe and O. Aurtenetxe for their technical assistance. The work of I. Sevilla was supported by two research fellowships from the Department of Agriculture and Fisheries, the Department of Industry and the Department of Education, Universities and Research of the Basque Government. This study was partially supported with EU-FEDER funds. 156 ESTUDIO IV Detection and pathological implications of the presence of IS900 in human Mycobacterium avium isolates Iker Sevilla,1 Martha I. Murcia,2,3 Joseba M. Garrido,1 Douwe Bakker,4 Maria J. García,2 Ramón A. Juste1 1 Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario (NEIKER), Berreaga, 1, 48160 Derio, Bizkaia, Spain. 2 3 Dept. Medicina Preventiva, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma, c/ Arzobispo Morcillo s/n, 28029-Madrid, Spain. Dept. Microbiología, Facultad de Medicina, Universidad Nacional, Carrera 30 No.4503, Edificio 471, Bogotá, Colombia. 4 Department of Bacteriology and TSE's, CIDC-Lelystad, Edelhertweg 15, 8203 AA Lelystad, The Netherlands. Processing submission to Journal of Clinical Microbiology ESTUDIOS Abstract IS900 insertion sequence is thought to be specific of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. In the present work, the presence of IS900 in M. avium isolates from HIV-infected human patients has been demonstrated. Future studies regarding Crohn’s disease and M. avium subsp. paratuberculosis detection based on IS900 screening should be reconsidered. Introduction Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map) is a mycobacteria that has a wide host spectrum including humans. Map is mainly known for its role as the causative agent of paratuberculosis in ruminants, a chronic inflammation of the intestines (Harris y cols. 2001). Initially considered as a M. avium closely related species, it was described as M. avium subspecies after the numerical taxonomic differentiation of M. avium subsp. avium (Maa), M. avium subsp. silvaticum (Mas) and Map by Thorel et al. (Thorel y cols. 1990). In a further effort on the clarification of the M. avium complex (MAC) taxonomy, Maa designation was proposed to be reserved for bird type isolates, while pig and human isolates were classified as the fourth subspecies hominissuis (Mah) (Mijs y cols. 2002). In spite of the previous statement the clear differentiation of subspecies within M. avium is still controversial. Thus, some authors consider that Mas is not different enough from Maa to be considered as a separate subspecies (Turenne y cols. 2006); besides, not fully agreement was made by other authors on Map nomenclature (Stevenson 1997, Juste 1997a) and M. paratuberculosis designation is still in use (Bernstein y cols. 2004). Map is classically identified as an acid-fast rod with dependence on mycobactin and slow growth on primary isolation. The description of the insertion sequence IS900 in a Map human isolate (Green y cols. 1989) allowed adding a positive result in IS900 PCR testing to that definition (Harris y cols. 2001). Given its rapid turn out results and specificity, IS900 amplification became the main identification criteria of Map, even before completion of the culture. In spite of the previous statements, reports on positive IS900 PCR results were published in mycobacteria other than Map (Cousins y cols. 1999, Englund y cols. 2002, Motiwala y cols. 2004). However, because IS900 is rarely found outside Map in animal samples, its amplification is still applied with good results in the veterinary microbiology diagnostic field. A more controversial issue is the use of IS900 molecular detection as a confirmatory diagnostic tool in studies concerning Crohn’s disease in humans. Roiz et al. reported hybridization of IS900 probe in more than 19% of M. avium isolates from AIDS patients (Roiz y cols. 1995). Naser et al. detected up to 57% of M. avium isolates from HIV-infected patients also carrying that insertion sequence (Naser y cols. 1999). This finding has not been suitably considered 159 ESTUDIO II in further IS900 based studies on Crohn’s Disease (Bull y cols. 2003a, Naser y cols. 2004, Sechi y cols. 2005, Elguezabal y cols. 2006). Methods and results During the characterization of 70 MAC strains from Colombia and Spain, isolated from HIV positive and negative human patients (Murcia y cols. 2004), a pool of different genomic targets were tested. All the mycobacteria were characterized using molecular methods, selected from those frequently applied in members of the MAC. Methods applied included commercial AccuProbe (Gen-Probe Inc.), PCR restriction analysis of the hsp65 gene (hsp65-PRA) (Telenti y cols. 1993), and PCR amplification and sequencing of several selected targets, such as 16S-23S rDNA internal transcribed spacer (ITS-1) (Frothingham y cols. 1993, Novi y cols. 2000) and macrophage-induced gene (mig) (Beggs y cols. 2000). RFLP molecular typing was also performed using IS1245 (van Soolingen y cols. 1998) and IS1311 (Roiz y cols. 1995) as probes (data not shown). Finally, a panel of insertion sequences previously described within MAC was also tested by PCR. The panel and procedures were next: IS900 (Bull y cols. 2003a); IS901 (Ellingson y cols. 2000, Turenne y cols. 2006); IS1245 (Guerrero y cols. 1995); and IS1311 (Roiz y cols. 1995). Up to five of the Colombian isolates were positive to IS900 by PCR. All Spanish isolates were negatives for that target (not shown). The IS900 positive isolates, as well as two other isolates obtained from a same patient were further studied to confirm those results. The complete set of results in the molecular characterization of the seven Colombian isolates is shown in Table 1. Results obtained using the panel of molecular tests confirmed that the isolates were members of the M. avium most closely related to the subspecies hominisuis (Table 1). The IS900 PCR products from the human isolates were sequenced in both directions using primers AV1 and AV2 (Bull y cols. 2003a), and standard dye terminator chemistry, on a 3700 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). These amplified products showed a nucleotide sequence identical to that found in the genome of Map K10 bovine strain. That sequence has been recently proposed as the reference sequence of IS900 (Semret y cols. 2006). To rule out the presence of Map DNA, the isolates were tested for the presence of the Map specific locus 251, using PCR methods described earlier (Bannantine y cols. 2002a). Besides, the isolates were analysed using IS1311 PCR-REA (Marsh y cols. 1999), which allowed the differentiation of the Map cattle, sheep and bison type strains from other members of M. avium (Sevilla y cols. 2005). All the seven Colombian isolates were negatives for the locus 251 (Table 1). Moreover, all they showed IS1311 PCR-REA patterns characteristic of M. avium (Marsh y cols. 1999). These two characteristics allowed their differentiation of the subspecies Map. The five IS900-positive M. avium isolates, corresponding to 3 Colombian HIV-positive patients, represented a total of 10% of all M. avium isolates 160 ESTUDIOS included in the previous study (Murcia y cols. 2004), besides they represented the 17.4% of the HIV infected patients. Table 1. Detailed description of source (patient and specimen) and genetic results of the selected human mycobacterial isolates from Colombian patients under study. AccuProbe PCR PRA ITS-1 MAC Mav Mint Hsp65 sequevar IS1245 IS900 IS1311 PCRREA patient isolate sample IS901 Locus 251 3 20 B stools + + – Mav II Mav-A + (0) + + – avium type 4 22 B blood + + – Mav II Mav-B + (12) + – – avium type 4 23 B blood + + – Mav II Mav-B + (12) + + – avium type 4 24 B stools + + – Mav II Mav-B + (12) – – – avium type 4 25 B stools + + – Mav II Mav-B + (12) – + – avium type 11 45 B urine + + – Mav III Mav-A + (1) + – – avium type 11 46 B urine + + – Mav III Mav-A + (1) + + – avium type All the patients had HIV positive status. Samples from the same patient were obtained separated from minimum one week to maximum six months. Results from Accuprobe, hsp65 PRA, ITS-1 sequevar, and PCR amplification of several targets are indicated. The number of bands detected by RFLP using IS1245 as probe is indicated between brackets in the corresponding column. Isolates from the same patient (patients 4 and 11) showed identical RFLP pattern. None of the RFLP patterns belonged to the typical three-banded bird pattern proposed to be reserved for Maa (Mijs y cols. 2002). All isolates were PCR positive for the gene mig (not shown). MAC, Mycobacterium avium complex; Mav, Mycobacterium avium; Mint, Mycobacterium intracellulare. Discussion and conclusions Our results are in agreement with those of Naser et al. (Naser y cols. 1999) although the frequency of detection of IS900 was much lower in our set of human isolates. The distinct selection criteria and different geographical origins of both sets could explain that difference. We have detected the presence of the IS900 element in human M. avium isolates other than Map. IS900 is present in all the Map bacteria analyzed thus far, however, its detection in other M. avium subspecies is rather unusual. This difference indicates the known usefulness of IS900 in the identification of Map in veterinary medicine (Sevilla y cols. 2005, Semret y cols. 2006). The usually high copy-number of IS900 per genome in Map improves the diagnostic sensitivity using that IS as a target on these clinical samples. The amplification of IS900 in mycobacteria other than Map, and isolated from human sources, clearly points out a weakness in the usual identification strategy of the Map that needs to be taken into account. In this sense, the IS1311 PCR-REA can advantageously complement the standard IS900 PCR in the diagnostic procedures. That method directly differentiates the Map strains from other M. avium subspecies in a single analytical procedure (Sevilla y cols. 2005). 161 ESTUDIO II A rather puzzling observation is that IS900 was not always detected when sequential isolates from the same patient were studied (Table 1, patient 4). Polyclonal infection of that patient could be discarded according to the same pattern obtained by RFLP using IS1245 as probe (data not shown). It can be hypothesized that IS900 could be an unstable insertion sequence when inserted outside of its usual environmental genetics, the Map genome; thus the IS could had been lost as sequential isolates from the same patient proceeds. Considerations raised by studies on Crohn’s Disease using molecular detection of IS900 element are still controversial. The high prevalence of IS900 DNA observed in specimens from patients suffering or not Crohn’s Disease (Bull y cols. 2003a, Naser y cols. 2004, Sechi y cols. 2005, Elguezabal y cols. 2006) might be due to some degree of interference with DNA of M. avium, an ubiquitous bacteria. Our data support that statement when only HIV-positive patients are considered. On the other hand, presence of M. avium DNA other than Map could also be detected, at some stage, during IS900 PCR-based surveillance studies, in potential vehicles for human infection such as milk, dairy products, meat, water, etc. Testing on environmental or food products for Map cannot rely only on the IS900 PCR detection with full confidence. The results presented here have two implications in human health. Firstly, the amplification of this insertion element could not fully indicate detection of Map genome; however, positive IS900 amplification still appears to be associated to clinical disease. At this respect, and in addition to animal infections, IS900-carrying mycobacteria could also be considered as etiological agents in infections of susceptible human population, such as AIDS patients. As a consequence, analysis of additional specific targets could help to clarify the identity of the IS900-carrying organisms detected. Secondly, results regarding the involvement of Map in Crohn’s disease, on the basis of IS900 identification strategy, need to be re-assessed. Our data and those from previous publications are suggesting that Crohn’s disease could be associated to any IS900 or IS900-like carrying mycobacteria, which could probably be identified or be closely related to the Map bacterium in the majority of the cases. Further research broadening the scope of mycobacterial isolates studied is needed to clarify the role of IS900 in the human pathology. 162 ESTUDIO V Inactivation of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in cow’s milk by means of high hydrostatic pressure at mild temperatures Tomás López-Pedemonte,1 Iker Sevilla,2 Joseba M. Garrido,2 Gorka Aduriz,2 Buenaventura Guamis,1 Ramón A. Juste2 and Artur X. Roig-Sagués1 1 Centre Especial de Recerca Planta de Tecnologia dels Aliments, CeRTA, XiT, Departament de Ciència Animal i dels Aliments, Facultat de Veterinària, Universitat Autònoma de Barcelona, 08193 Bellaterra, Spain. 2 Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario (NEIKER), Berreaga, 1, 48160 Derio, Bizkaia, Spain. Applied and Environmental Microbiology, Vol. 72, No. 6, 2005, pp. 4446–4449 ESTUDIOS Abstract Two strains of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (3644/02 and ATCC 19698) were inoculated (approximately 6 log CFU/ml) into sterilized milk to evaluate inactivation by high hydrostatic pressure. Reductions of M. avium subsp. paratuberculosis increased with pressure level. Significant differences were also found between M. avium subsp. paratuberculosis strains and between the media used. Average reductions of 4 log CFU/ml after treatment with 500 MPa are comparable to those caused by thermal treatments. Introduction Paratuberculosis (Johne’s disease) is a chronic granulomatous enteritis caused by Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis that affects cattle and other ruminants. Its prevalence in food-producing animals is increasing globally, causing significant financial losses (Greenstein 2003). Crohn’s disease is a chronic regional enteritis affecting around 5 per 100,000 humans in developed countries (European Commission 2000, Chamberlin y cols. 2001, Chacon y cols. 2004). Due to the clinical and pathological similarities between the diseases, involvement of M. avium subsp. paratuberculosis in the etiology of Crohn’s disease has been debated for many years. The introduction of specific PCR together with optimized processing procedures significantly increased the implication of M. avium subsp. paratuberculosis in disease causation (Hermon-Taylor y cols. 2000, Greenstein 2003, Bull y cols. 2003a, Chacon y cols. 2004). Milk could be a potential vehicle of transmission of M. avium subsp. paratuberculosis from animals with Johne’s disease to humans. The presence of M. avium subsp. paratuberculosis DNA in human patients without symptoms of inflammatory bowel disease suggests that this widespread bacterium is present in contaminated water, milk, and other sources (Argueta y cols. 2000, Naser y cols. 2004). Recent reports add evidence to this hypothesis and include the isolation of M. avium subsp. paratuberculosis from breast milk and intestinal and lymph nodes from patients with Crohn’s disease. Viable M. avium subsp. paratuberculosis has also been detected in peripheral blood in a substantial proportion of individuals with Crohn’s disease (Hermon-Taylor y cols. 2000, Schwartz y cols. 2000, Naser y cols. 2000b, Naser y cols. 2004, Selby 2004). The dairy industry is also concerned about M. avium subsp. paratuberculosis due to reports that suggest it may not be effectively inactivated by high temperature, short-time pasteurization (72°C, 15 s). There is controversy regarding this particular issue, although differences in inactivation may be explained by different pasteurization times and equipment, different detection methods and selective media, separation of clumps, different initial loads, variation in heat sensitivity between M. avium subsp. paratuberculosis strains, and the use of freshly isolated or laboratory- 165 ESTUDIO V adapted strains of M. avium subsp. paratuberculosis (Grant y cols. 2001b, Lund y cols. 2002, Grant y cols. 2002b, Ayele y cols. 2005). In the last 15 years, treatment of milk and dairy products with high hydrostatic pressure (HHP) has been the subject of intensive research (O'Reilly y cols. 2001, Trujillo 2002), mostly involving gram-positive or -negative cells. However, acidresistant microorganisms such as Mycobacterium spp. have never been included in these studies. Our objective was to determine the possibility of reducing counts of M. avium subsp. paratuberculosis in milk by means of moderate HHP treatments carried out at mild temperatures. Materials and methods Strains and preparation of inocula The strains used were Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis ATCC 19698 and Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis 3644/02, a Neiker isolate from a natural case of clinical paratuberculosis in cattle, determined to be of cattle type (C) by IS1311 PCR-restriction endonuclease analysis (Marsh y cols. 1999) and of type 1-1 according to pulsed-field gel electrophoresis analysis (Stevenson y cols. 2002). Both strains were grown in Middlebrook 7H9 broth (Difco, Detroit, MI) supplemented with Middlebrook oleic acid-albumin-dextrose-catalase enrichment (Becton, Dickinson and Company, MD) and 0.05% Tween 80 (Panreac Química SA, Barcelona, Spain) (7H9 medium) for 6 and 12 weeks, and then the MacFarland scale (Densimat; Bio-Mérieux, Marcy l’Etoile, France) was used to estimate cell concentration. The final inoculums were 8.5 log CFU/ml and 8.6 log CFU/ml for strains 3644/02 and 19698, respectively. Inoculation Sixteen 30-ml aliquots of ultra-high-temperature-treated milk were inoculated with 1 ml of each strain suspension. Afterwards, the milk was dispensed in sterile, hermetic, 30-ml low-density polyethylene bottles (Azlon; Bibby Sterilin, Ltd., United Kingdom) and vacuum packed in a triple layer of plastic bags (bb4.l; Cryovac Packaging, Sant Boi de Llobregat, Spain). Inoculated samples were stored at 6 ± 2°C. HHP treatments Milk samples were pressurized 24 h after inoculation by using discontinuous HHP equipment (model S-FL-850-9-W; Stansted Fluid Power, Stansted, United Kingdom). On each run, two milk samples were placed inside the product canister. They were stabilized at the required temperature (5 or 20°C) and then immediately subjected to 10 min of HHP treatment at 300, 400, or 500 MPa (as measured on the digital and analogue pressure indicators). Control samples not subjected to HHP (0.1 MPa) were used as the 166 ESTUDIOS reference for initial M. avium subsp. paratuberculosis counts. The time of pressure buildup was 24 s per 100 MPa; the decompression time was 30 to 35 s. Microbiological analysis At 24 h after pressurization, microbiological analysis was carried out. After vigorous shaking, a 1-ml aliquot of each treated spiked milk sample was diluted in 9 ml of sterile distilled water. Further 10-fold dilutions up to 1:100,000 were made for each aliquot. Then, 0.2 ml of four dilutions (1:1, 1:10, 1:1,000, and 1:100,000) were inoculated onto two tubes of Herrold’s egg yolk medium (HEY) supplemented with 2 g/ml of mycobactin J (Allied Monitor, Inc., Fayette, MO) and onto another two tubes of agar-solidified 7H9 (Bacto Agar; Becton, Dickinson and Company, MD) and incubated at 37°C. Colonies of M. avium subsp. paratuberculosis were counted after an incubation period of 16 weeks. Some tubes were discarded due to contamination or desiccation during the incubation period. An aliquot of similarly treated, uninoculated ultra-high-temperature-treated milk and pressurization liquid were used as negative controls. Statistical analysis Colony counts per tube were transformed into number of CFU in the original milk sample. This calculated inoculum value was assigned to all tubes with 100 colonies or more because confluent growth made individual colony count beyond this number impossible. Only dilutions with different counts in at least two levels of pressure were used for statistical analysis after logarithmic transformation. This resulted in using dilutions of 1/1, 1/10, and 1/1,000 on both media for strain 3644/02 and dilutions of 1/1,000 and 1/100,000 on 7H9 and of 1/1 and 1/10 on HEY for strain 19698. The general linear models procedure of the SAS System version 8.0 (SAS Institute Inc., Cary, NC) was used to test main effects of strain, pressure, temperature, and culture medium, as well as their interactions, on the final colony count logarithm. A Dunnett test was used to assess the significance of differences between the control level and each other level of each main factor, and a Tukey-Kramer multirange test was used for testing the differences between paired-interaction marginal means. Results, discussion and conclusions The overall analysis of variance including all effects and interactions showed that strain (P < 0.0006), culture medium (P < 0.0001), and pressure (P < 0.0001) had strong effects on the colony counts. However, the assayed temperature levels had no significant effects (P = 0.2783), and therefore this effect was eliminated from further statistical analysis (data not shown). As can be deduced from Table 1 and Figure 1, observing data for both strains and culture media, 300-, 400-, and 500-MPa treatments caused significant (P < 0.05) reductions of M. avium subsp. paratuberculosis counts of 167 ESTUDIO V 0.92, 1.59, and 4.58 log CFU/ml, respectively, compared to control samples as determined by the Dunnett test. Strain 3644/02 had an average recovery of 4.54 log CFU/ml, which was 1.68 log CFU/ml higher than the recovery of strain 19698 (P < 0.05), independently of other factors. For both strains and all pressures, the tubes of 7H9 medium had a recovery rate 1.72 log CFU/ml higher than those of HEY medium. However, there was a strong interaction between strain and culture medium (P < 0.0001); nonsignificant differences in recovery occurred for strain 3644/02 in both media (5.01 log CFU/ml on 7H9 versus 4.24 log CFU/ml on HEY, for all pressures), while very few colonies of strain 19698 grew on HEY compared to 7H9 medium (4.49 versus 1.27 log CFU/ml, respectively). Therefore, another analysis was carried out, considering only results on 7H9 for strain and pressure factors. This analysis confirmed the significant differences between control and 500-MPa-treated samples for both strains (4.85 log CFU/ml; P < 0.05), but this was not the case for the other two pressure levels. The analysis of interactions further supported this result, since the differences between control and 500-MPa-treated samples were 4.07 log CFU/ml (P = 0.01) and 5.20 log CFU/ml (P < 0.001) for strains 3644/02 and 19698, respectively (Table 1). Table 1. HHP treatment effects on counts of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis strains 3644/02 and 19698 in different culture media a. Medium 7H9 HEY Both a Pressure (MPa) Strain 3644/02 Counts No. of (Log CFU/mL) replicates Mean S.D. Strain 19698 Counts No. of (Log CFU/mL) replicates Mean S.D. Both strains Counts No. of (Log CFU/mL) replicates Mean S.D. 0.1 300 400 500 30 7 19 5 5.90 5.22 4.37 1.83 1.66 2.74 2.53 1.03 20 14 13 16 6.10 5.49 5.37 0.90 2.63 3.02 3.07 1.98 50 21 32 21 5.98 5.40 4.78 1.13 2.08 2.86 2.76 1.82 All 61 5.01 2.33 63 4.49 3.37 124 4.75 2.91 0.1 300 400 500 30 19 24 21 6.28 5.66 3.94 0.39 1.24 2.00 2.67 0.65 20 15 16 14 1.98 1.23 1.11 0.50 1.43 1.06 0.93 0.83 50 34 40 35 4.56 3.70 2.81 0.44 2.50 2.76 2.55 0.72 All 94 4.24 2.87 65 1.27 1.22 159 3.03 2.75 0.1 300 400 500 60 26 43 26 6.09 5.54 4.13 0.67 1.46 2.17 2.59 0.92 40 29 29 30 4.04 3.29 3.02 0.72 2.95 3.08 3.02 1.54 100 55 72 56 5.27 4.35 3.68 0.69 2.39 2.90 2.80 1.28 All 155 4.54 2.69 128 2.86 2.98 283 3.78 2.94 There were no significant differences between treatments at 5 and 20°C. The counts of M. avium subsp. paratuberculosis obtained at 5°C were similar to those obtained at 20°C. This fact turns out to be very useful, since it means that mild HHP treatments could be applied to milk at refrigeration temperatures, thus minimizing organoleptic and nutritional alteration. As can be seen in Table 1, HHP inactivation of both strains of M. avium subsp. paratuberculosis was proportional to the increase in the 168 ESTUDIOS pressure applied, an effect which was also observed in both culture media. This is generally the tendency observed among vegetative bacteria (Smelt 1998, Gervilla y cols. 1999). However, there were strong interactions between strain and medium, which indicate that assay conditions are very important for the assessment of inactivation of M. avium subsp. paratuberculosis. This was quite evident for strain 19698 in HEY, Figure 1. Graphic representation of reductions where even the counts of control obtained according to the pressure level (MPa), the culture medium and the strain used. samples were reduced by 4.12 log CFU/ml relative to their growth on 7H9 (Table 1). In contrast, strain 3644/02 grew similarly in both media. Preference of different strains of M. avium subsp. paratuberculosis for primary isolation media has been observed before (Aduriz y cols. 1995a). Different piezotolerances between strains of the same species have been observed by many researchers (Alpas y cols. 1999, Ritz y cols. 2000, Lamo-Castellvi y cols. 2005). From the way that both M. avium subsp. paratuberculosis strains responded to HHP treatments, it seems that strain 3644/02 was slightly more pressure resistant than strain 19698. The mean reduction obtained for strain 3644/02 at 500 MPa was 4.07 log CFU/ml. This value suggests the possibility of inactivating this microorganism by means of HHP when its load in raw milk is less than 4 log CFU/ml. Many authors estimate that raw bulk tank milk could reach levels of up to 4 and 5 log CFU/ml of M. avium subsp. paratuberculosis cells (Meylan y cols. 1996, Grant y cols. 1996, Sung y cols. 1998, Grant y cols. 1998a, Grant y cols. 2001b, Gao y cols. 2002, O'Reilly y cols. 2004). This is mostly due to fecal contamination and also, to a lesser extent, to cells secreted within the udders (Sweeney y cols. 1992a, Streeter y cols. 1995, Ayele y cols. 2005); Sweeney et al. (Sweeney y cols. 1992a) found 2 to 8 CFU/ml (0.3 to 0.9 log CFU/ml) of M. avium subsp. paratuberculosis cells in milk samples aseptically obtained from the udders of nine subclinical animals. Nevertheless, HHP inactivation values are comparable to those obtained in pasteurization studies (Gao y cols. 2002, Greenstein 2003) and to those obtained with pulsed electric fields (Rowan y cols. 2001), but they have the advantage of using relatively lower temperatures. It is still possible to apply pressures higher than 500 MPa to raw milk. HHP technology could also be applied to soft-curd cheeses traditionally made from raw milk in order to improve its safety. The work of Donaghy et al. 169 ESTUDIO V (Donaghy y cols. 2004) states that M. avium subsp. paratuberculosis cells survive shortterm curing when present in high (up to 5 log CFU/ml) or low (2 log CFU/ml) numbers as well. Due to the isostatic condition of HHP treatments (which means that pressure is homogeneously applied to every point of the sample), large differences are not expected when larger samples and HHP machines are used. However, aggregated M. avium subsp. paratuberculosis cells could still interfere and modify the reductions obtained. Moreover, temperature gradients due to the adiabatic heating of the pressure chamber may vary in laboratory and industrial equipment. This is why pilot-scale experiments such as those made with pasteurization treatments (Pearce y cols. 2001, Grant y cols. 2002b) may be useful. Further research should be done in order to determine the nature of HHP injuries in this sort of vegetative cell and to evaluate the behavior of pressurized M. avium subsp. paratuberculosis cells during storage life at refrigeration temperatures. Acknowledgements Iker Sevilla held a fellowship from the Department of Industry and the Department of Education, Universities and Research of the Basque Government. 170 DISCUSIÓN GENERAL DISCUSIÓN GENERAL Actualmente los métodos rutinarios de diagnóstico in vivo de la paratuberculosis son el ELISA y el cultivo fecal, técnicas consideradas mucho más específicas que sensibles (Meylan y cols. 1994, Whitlock y cols. 2000, Collins y cols. 2005). A pesar de que el ELISA puede resultar muy rentable, el cultivo fecal es económicamente poco atractivo y lento, con lo que el diagnóstico completo se ve retrasado y resulta caro, situación problemática que se ve incrementada cuando se trata de un número importante de animales en el rebaño. La PCR es una técnica cuyo precio y ejecución es cada día más asequible, y la que se basa en la detección de un fragmento de la secuencia IS900 a partir de heces, se utiliza para sustituir o complementar al cultivo fecal (Collins y cols. 1993b, Garrido y cols. 1999b, Chevallier y cols. 2003). A pesar de que se ha informado de algunos resultados inespecíficos (Cousins y cols. 1999, Englund y cols. 2002), esta técnica se considera muy específica. Además, se puede adaptar con facilidad a otro tipo de muestras como la sangre, que puede utilizarse en otros ensayos como es el ELISA, y en la que una interferencia con DNA de otras bacterias es menos probable. En nuestro trabajo se ha detectado una falta de concordancia entre los resultados de ELISA y PCR de sangre, siendo muy evidente en animales jóvenes. Dado el carácter espectral de la enfermedad, esto puede interpretarse como indicio de que cada técnica detecta diferentes estadios de la infección. Por eso y por la especificidad que se les atribuye, se puede hablar de que estas técnicas complementan su sensibilidad mutuamente. En cualquier caso, nuestro trabajo demuestra la frecuencia de la bacteriemia celular en las poblaciones susceptibles a la paratuberculosis y el potencial de la PCR específica en esta matriz como herramienta de diagnóstico etiológico. La paratuberculosis está considerada como una enfermedad progresiva y la producción de anticuerpos se asocia a grandes cantidades de la bacteria infectando al animal, sin embargo, en este estudio hemos observado individuos con anticuerpos detectados por ELISA con resultado negativo de PCR. Probablemente la patogénesis de esta micobacteriosis sea más compleja, y los niveles de anticuerpos y bacteriemia se vean alterados por reinfecciones, recaídas o reactivaciones, que regulen la respuesta humoral o la circulación por el organismo de células fagocíticas cargadas de micobacterias. En este trabajo también hemos observado infección mixta por distintas cepas en distintos momentos de la vida de un animal, que se han aislado de distintas muestras, lo que da cierto apoyo a la idea anterior. Además el tipo de cepa también puede ser un factor importante en el desarrollo de la enfermedad, de hecho ciertas cepas de tipo bovino parecen ser muy patógenas para todas las especies, mientras que otras no lo son tanto (Taylor 1951, Taylor 1953, Stamp y cols. 1954, Stevenson y cols. 2002). Esto también puede explicar la alta prevalencia de ovejas positivas en PCR de sangre, especie que según hemos podido observar se encuentra parasitada mayoritariamente por cepas de tipo ovino, que quizá sean mejor contenidas por el sistema inmunitario de parte de los animales, y cuya infección se vea reducida a formas focales sin avanzar a clínicas. Estos portadores pueden resultar determinantes en los planes de control que 173 DISCUSIÓN GENERAL buscan la erradicación de la enfermedad, y la PCR de sangre puede mejorar sensiblemente su detección, pudiendo convertirse así en una buena herramienta de diagnóstico complementaria. La variabilidad en la detección de Map en las células fagocíticas de la sangre, deja abiertas otras cuestiones sobre la patogénesis de la paratuberculosis, como la posible existencia de factores genéticos de resistencia o susceptibilidad del hospedador, punto ya señalado en la enfermedad de Crohn (materia ya revisada). En la línea de esta discusión, parece que en el caso de la paratuberculosis la infección no conduce necesariamente a la enfermedad, hipótesis bajo la que no se cumplirían los clásicos postulados de Koch sobre la etiología de las enfermedades infecciosas. Dicho de otra manera, Map sería un factor necesario pero no único o suficiente en la etiología de la paratuberculosis. Esta hipótesis tiene importantes implicaciones en lo que se refiere al control de la paratuberculosis, que al menos por el momento, debería centrarse más en la prevención de la enfermedad que de la infección. Del mismo modo, la estrategia para demostrar el posible papel de Map en la enfermedad de Crohn debería estar orientada a la determinación de los mecanismos inmunes que en unos casos contienen la infección eficazmente y en otros conducen al desarrollo de lesiones tisulares graves, en lugar de limitarse a comparar la presencia (infección) de Map entre enfermos clínicos y población clínicamente sana. Sin embargo, en aislamientos humanos de M. avium parece bastante frecuente la presencia de secuencias similares a la IS900 (IS900-like) (Roiz y cols. 1995, Naser y cols. 1999), que pueden interferir en las técnicas de detección de Map basadas en ese elemento. La gran ventaja que proporciona la IS900 es principalmente su alto número de copias por bacteria, aumentando de manera importante la sensibilidad de estas pruebas. Dado que los procedimientos actuales pueden producir amplificaciones indistinguibles de ciertas regiones de la IS900 en aislamientos de otras micobacterias procedentes de pacientes de sida (como se ha demostrado en nuestro trabajo), parece necesario tomar con cautela los resultados de los estudios que las utilizan para detectar Map en humanos, y complementarlos si es posible incluyendo otra diana específica de esta micobacteria. Asimismo, los trabajos de vigilancia sobre la presencia de Map en distintos medios o productos, pueden verse afectados por las mismas conclusiones. Con toda la cautela necesaria debido al escaso interés que dicha secuencia ha recibido en estudios microbiológicos del género Mycobacterium desde la perspectiva humana, puede decirse que no se ha descrito la presencia de este elemento en micobacterias ambientales demostradamente apatógenas. Este estudio precisamente muestra el interés de los estudios microbiológicos comparados y confirma hallazgos previos en el sentido de que IS900 es un elemento presente en una proporción moderada de aislados distintos de Map. No obstante, todos los aislamientos de Map descritos en éste y en todos los demás trabajos poseen esta controvertida secuencia de inserción, y su detección es indicativa de la presencia de Map, o alternativamente, de micobacterias potencialmente patógenas. 174 DISCUSIÓN GENERAL Continuando con el trabajo que hemos llevado a cabo en torno a la diferenciación de cepas de Map, hay que señalar que se ha informado repetidamente de dificultades en el aislamiento a partir de muestras de ovino principalmente, y en zonas geográficas y sistemas productivos muy diversos. Esta observación, sin embargo, no es universal y algunos autores no han encontrado diferencias entre la especie hospedadora, los medios de cultivo, la velocidad de crecimiento y el tipo de cepa (Pavlik y cols. 1999a). En los trabajos anteriores de Neiker ya se apuntaban ciertas diferencias en el éxito del cultivo de muestras procedentes de vacas, cabras y ovejas en diferentes medios de cultivo (Juste y cols. 1991b, Aduriz y cols. 1995a), sin embargo no se había comprobado la posible relación entre los fenotipos y los genotipos de tales aislados. Tras comprobar la utilidad de la IS1311 PCR-REA, como resultado de los trabajos realizados con esta técnica, hemos podido verificar la asociación entre las características de crecimiento y el genotipo de estos aislados, viniendo a confirmar las conclusiones de trabajos precedentes (Bauerfeind y cols. 1996). Así, según nuestros hallazgos las cepas de tipo IS1311–C parecen tener una preferencia muy fuerte por el medio HEY con piruvato y micobactina añadidos, medio en el que nunca obtuvimos colonias de tipo IS1311–S. Estas últimas crecen mejor en LJ con micobactina o en medios Middlebrook con OADC con o sin micobactina. Las cepas IS1311–B, crecen mejor en HEY con micobactina pero sin piruvato añadido. Tal y como venimos observando en los últimos tiempos, los medios de cultivo líquido basados en 7H9 parecen cubrir el amplio abanico de requerimientos de cultivo para todas las cepas, aunque los problemas de contaminaciones siguen siendo importantes. Como ya se ha comentado, existe cierta discordancia en la bibliografía sobre la distribución de las diferentes cepas en cuanto a hospedadores y regiones. A excepción de algunos casos en los que se ha confirmado la presencia de cepas ovinas en vacuno (uno de ellos muy recientemente) (Whittington y cols. 2001d, de Juan y cols. 2006a), parece que esta especie se ve afectada principalmente por el tipo bovino de Map. En las especies ovina y caprina de numerosas regiones también se consideran más extendidas las cepas de tipo bovino que las de tipo ovino (Thoresen y cols. 1994b, Pavlik y cols. 1999b, Pavlik y cols. 2000a, Stevenson y cols. 2002, Djonne y cols. 2005, de Juan y cols. 2005), sin embargo, a la vista de los resultados de nuestro trabajo, esa no sería la distribución en la Península Ibérica. Estas diferencias, quizá puedan ser explicadas por un sesgo causado por la utilización de medios y procedimientos inadecuados para aislar cepas ovinas, aunque no se pueden descartar cuestiones epidemiológicas. En nuestro caso, hemos contado con una representación de aislados presumiblemente menos sesgada, y la polarización observada en la distribución ha sido muy clara (ver Figura 3 en estudio III). El éxito del cultivo también puede verse influenciado por otros factores (método de descontaminación, presencia de otros microorganismos que interaccionan con Map, estados metabólicos o de estrés de Map,...), algunos como los señalados para 175 DISCUSIÓN GENERAL explicar las diferencias en el aislamiento a partir de leche pasterizada (Grant y cols. 2004), o como los que hemos podido observar en el estudio de HHP (ver más adelante). Este es el trabajo con el mayor número de aislados de Map tipados por medio de SnaBI-SpeI-PFGE, aislados para los que se han podido describir numerosos patrones de restricción nuevos en varias especies hospedadoras. Entre los aislados bovinos la diversidad de cepas es muy baja (en nuestro estudio casi el 85% pertenecen a dos únicos tipos), al contrario que lo que hemos podido observar entre ovejas y cabras. Sin embargo en otros lugares los aislados son muy homogéneos en todas las especies hospedadoras (Pavlik y cols. 1999a, Cousins y cols. 2000, Whittington y cols. 2000b, Djonne y cols. 2005). La baja diversidad parece ser el reflejo de la homogeneidad en el manejo y posiblemente en la genética de los animales, provocada por el mercado internacional y por los programas de mejora genética, que quizá hayan diseminado genotipos de animales más susceptibles a ciertos genotipos de Map. Esta idea se ve reforzada por las interesantes diferencias observadas entre razas, que en el caso de la raza de lidia señala la existencia de un contexto epidemiológico distinto, a pesar de la pequeña representación de estas cepas. Del mismo modo, la alta diversidad de cepas que hemos observado en pequeños rumiantes parece reflejar la heterogeneidad genética y de manejo de los rebaños ovinos y caprinos en nuestra área de estudio. Según nuestro dendrograma de agrupamiento de genotipos de Map, la pigmentación no sería una característica fenotípica que produzca el agrupamiento genético de cepas pigmentadas por un lado y no pigmentadas por otro como se había propuesto anteriormente (Stevenson y cols. 2002), puesto que algunas pigmentadas tienen patrones más similares a otras no pigmentadas que al resto de pigmentadas. Nuestro estudio viene a confirmar el agrupamiento tradicional en dos grupos con subgrupos propuesto inicialmente (Collins y cols. 1990a). El poder de discriminación general de la PFGE empleada ha sido bajo, pero debido a la homogeneidad de las cepas bovinas. De todos modos, se trata de una técnica cuyo uso sistemático en paratuberculosis no es recomendable, ya que en ocasiones como la descrita en bovino lechero, no proporciona suficiente información adicional que justifique la dificultad y los elevados costos que origina. Esta observación apunta una línea de investigación en el desarrollo de otros sistemas de tipado más simples e informativos para los que la colección de cepas caracterizadas en este estudio puede ser una importante base de partida. La observación de diferentes patrones PFGE en un mismo animal plantea una cuestión inesperada que resulta difícil de explicar a partir de las bases teóricas de la técnica de genotipado utilizada. Es decir, no parece probable que exista una variabilidad tan alta en el genoma de Map que justifique la aparición de tantos patrones en un tiempo relativamente corto de tiempo. Por lo tanto, la explicación más simple sería asumir que pueden existir infecciones policlonales en un mismo individuo que podrían ser seleccionadas al hacer el subcultivo a partir de colonias aisladas en medio sólido. Este hallazgo sería consistente con los resultados obtenidos en colonias de M. avium aisladas 176 DISCUSIÓN GENERAL de pacientes de SIDA que se discuten más arriba y que en unas ocasiones muestran la presencia de IS900 y en otras no. La posible implicación de Map en la enfermedad de Crohn, ha favorecido el desarrollo de estudios sobre la presencia y resistencia de la bacteria en nuestra cadena alimentaria. Los niveles de la bacteria en leche de tanque de explotaciones bovinas afectadas pueden ser muy elevados (Meylan y cols. 1996, Grant y cols. 1998a, Gao y cols. 2002) debido a la contaminación fecal principalmente, y en menor medida, a la excreción en leche de vacas infectadas (Sweeney y cols. 1992a, Streeter y cols. 1995, Sung y cols. 1998). Los tratamientos con altas presiones hidrostáticas (HHP) de leche y otros productos lácteos han sido objeto de investigación intensiva durante los últimos 15 años con resultados satisfactorios (Trujillo 2002), sin embargo ninguno incluía bacterias ácido-alcohol resistentes como Map. En nuestro estudio hemos realizado una prueba preliminar a pequeña escala sobre el uso de tratamientos HHP moderados a temperaturas de 5 y 20º C, como procedimiento para eliminar de la leche las células viables de esta bacteria. El hecho de que no se hayan observado diferencias significativas entre los tratamientos a estas temperaturas es muy interesante, pues indica que se pueden obtener reducciones del mismo nivel que las de la pasterización a temperaturas de refrigeración, a las que la leche y otros productos pueden mantener sus propiedades y características organolépticas intactas. De este modo se pueden evitar tratamientos térmicos más severos y con mayores efectos no deseables sobre las cualidades de este importante producto. Como es de esperar, la inactivación es proporcional al incremento en la presión ejercida, y teniendo en cuenta que todavía pueden aplicarse presiones superiores a 500 MPa a la leche cruda, probablemente se pueda llegar a producir leche totalmente libre de células viables de Map. Asimismo, el tratamiento HHP podría aplicarse al calostro y leche con que alimentar a los animales de reposición, a la leche cruda que se utiliza para elaborar quesos (con la ventaja de que esto acelera el proceso de curado y mejora la producción (Trujillo 2002)), a los quesos directamente, y a otros muchos productos. El efecto e interacción entre cepas y medios de cultivos también ha quedado patente en el ensayo de inactivación. A pesar de que las dos cepas empleadas poseen el mismo genotipo (IS1311–C y SnaBI-SpeI PFGE–1-1), la cepa de referencia (ATCC 19698) está muy adaptada al laboratorio como consecuencia de sucesivos pases en 7H9, medio en el que ha crecido notablemente mejor, mientras que el crecimiento de la cepa de campo (recién aislada) ha sido similar en ambos medios. No obstante, el 7H9 parece haber sido más eficaz a la hora de recuperar células dañadas (por el tratamiento) de las dos cepas, tal y como se desprende de los recuentos de la leche tratada a 400 o 500 MPa. También cabe destacar la aparente mayor resistencia de la cepa de campo en comparación con la de referencia. Todos estos hallazgos demuestran la importancia de las condiciones y procedimientos que se utilizan, pues pueden influir claramente en los resultados de este tipo de estudios, cuyas conclusiones pueden tener gran alcance. Los 177 DISCUSIÓN GENERAL resultados de este ensayo son prometedores, y garantizan la ejecución de más estudios sobre la utilización de tratamientos HHP para inactivar este patógeno en leche y otros productos. Como resultado general de todo el trabajo realizado en la presente Tesis Doctoral, se han podido esclarecer varios aspectos sobre el diagnóstico, la patogénesis, la epidemiología y el control de la paratuberculosis, y lo que es más importante, se han generado nuevos conocimientos, cuestiones e hipótesis que abren nuevos caminos para la investigación de esta enfermedad. 178 CONCLUSIONES GENERALES CONCLUSIONES GENERALES 1. La PCR específica de IS900 en muestras de sangre permite detectar animales con infección paratuberculosa que no detectan otras técnicas como el ELISA, lo que demuestra la existencia de una bacteriemia (“DNA-hemia”) en distintas fases de la infección paratuberculosa y sugiere una estrategia de combinación de técnicas para aumentar la sensibilidad del diagnóstico epidemiológico. 2. La técnica denominada IS1311 PCR-REA junto con la IS900 PCR, forman una herramienta muy práctica para realizar la identificación y el genotipado general de los aislamientos de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis de manera sistemática por su fácil y económica ejecución. La IS1311 PCR-REA es capaz de diferenciar entre cepas de tipo bovino, ovino y de bisonte de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, además de distinguir éstas del resto de subespecies del complejo Mycobacterium avium. 3. La técnica denominada SnaBI-SpeI PFGE es un método de genotipado de cepas de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis con bajo poder de discriminación cuando se trata de aislamientos procedentes de bovino lechero, principalmente de vacas de raza frisona/holstein. Sin embargo, en el caso de aislados procedentes de especies y/o razas con carácter más regional, su poder de discriminación se ve sensiblemente incrementado. Debido a su complejidad, no resulta recomendable como primer método de genotipado de aislamientos de esta micobacteria. 4. El análisis de similitudes entre los perfiles SnaBI-SpeI PFGE descritos agrupa las cepas de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis en dos grandes grupos generales. Uno de ellos comprende tipos de cepas aisladas únicamente de pequeños rumiantes (tipos ovinos), mientras que en el otro se incluyen tipos de cepas aisladas de todas las especies estudiadas (tipos bovinos). 5. La colección de aislamientos de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis estudiada muestra que la especie bovina se infecta exclusivamente con cepas de tipo bovino, mientras que la especie ovina se ve principalmente infectada por cepas de tipo ovino. La especie caprina, está parasitada por ambos tipos de cepas, pero la incidencia de cepas ovinas es mucho mayor de lo que la anterior literatura reflejaba. Las cepas de tipo IS1311–B se encuentran infectando ovejas y cabras procedentes de India y bisontes de EEUU, pero según la PFGE, no son el mismo tipo de cepa. 181 CONCLUSIONES GENERALES 6. Existe un alto grado de homogeneidad genotípica entre los aislados bovinos de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis en general. Los aislados de origen caprino son más heterogéneos, pero menos que los de origen ovino, entre los que se ha detectado una diversidad muy superior a la de los bovinos. 7. Se ha confirmado la infección policlonal con tres cepas diferentes de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis en un toro semental, dos de las cuales también se hallaban infectando otros animales de la misma explotación. 8. El genotipo (IS1311 PCR-REA, SnaBI-SpeI PFGE) de las cepas de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis se correlaciona bien con las características fenotípicas de crecimiento. Así, las cepas de tipo bovino crecen mejor en HEY con micobactina y piruvato y las de tipo ovino en LJ sin piruvato con micobactina, o en 7H11 con OADC con o sin micobactina. El medio 7H9 con OADC es idóneo para la propagación de todos los tipos de cepas analizados. La utilización de varios medios para el aislamiento primario es necesaria para evitar posibles sesgos en el aislamiento de cepas diferentes a las esperadas en cada especie hospedadora. 9. Se ha detectado la presencia de IS900 en cinco aislamientos de Mycobacterium avium obtenidos de tres pacientes de SIDA procedentes de Colombia. Estos resultados obligan a interpretar con cautela los resultados de estudios previos sobre la relación entre Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis y la enfermedad de Crohn basados en la detección de IS900. Esto implica que es necesario el uso de una técnica alternativa en la identificación de los aislados de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis que no procedan de las especies de rumiantes sensibles a la paratuberculosis. 10. El tratamiento experimental de la leche con altas presiones hidrostáticas (HHP) de 500 MPa a 5 o 20ºC de temperatura, produce reducciones medias de 4,07 y 5,20 log CFU/ml en el recuento de células viables de la cepa de campo 3644/02 y de la cepa de referencia ATCC 19698 de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, respectivamente. Estas reducciones son similares a las producidas por pasterización, con la ventaja de que el tratamiento de HHP puede aplicarse en temperaturas de refrigeración que no alteran las propiedades organolépticas de la leche. 182 RESUMEN; LABURPENA; SUMMARY RESUMEN; LABURPENA; SUMMARY RESUMEN La paratuberculosis es una afección crónica del intestino causada por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map), que afecta principalmente a rumiantes. Es de difusión mundial y provoca importantes pérdidas económicas en el sector ganadero. A pesar de no haber sido demostrado de manera concluyente, Map también parece estar involucrado en la enfermedad de Crohn, y la detección de la bacteria en posibles vehículos de transmisión para el ser humano ha aumentado la preocupación en salud pública. Este trabajo consta de cinco estudios cuyos objetivos están relacionados con aspectos bacteriológicos de Map: confirmar la circulación de Map (o de su DNA) en la sangre y estudiar su potencial diagnóstico, adaptar a Neiker métodos de genotipado molecular y utilizarlos para caracterizar una colección importante de aislamientos de Map, y evaluar tratamientos alternativos a los térmicos para inactivar esta bacteria en leche destinada al consumo humano. En el primer estudio se comparó el ELISA y la PCR de sangre en muestras de bovino y ovino. El conjunto de muestras bovinas (94 de animales menores de dos años y 184 de animales de entre 2 y 5 años) procedía de una explotación afectada, y se componía de 80 positivas y 198 negativas a ELISA. La PCR detectó DNA de Map (IS900) en 66 de estas muestras. El análisis general de los resultados mostró una clara asociación pero una baja correlación negativa entre las dos técnicas (Fisher exact test [FET] p = 0,0049; 45,3%, kappa = -0,1665 ± 0.0994). Se observó una ligera concordancia entre las novillas (87,7%, kappa = 0,4471 ± 0,2435), que resultó negativa entre vacas adultas (62,7%, kappa = -0,3670 ± 0,1057). En el caso de la especie ovina, se utilizaron 496 muestras de sangre procedentes de 53 explotaciones, muestras entre las que había 180 de parejas madre/cría. Se confirmó la presencia de DNA de Map en 61 muestras ovinas. La asociación entre los resultados de ELISA y PCR en estas muestras era fuerte, pero con una baja concordancia (FET, p < 0,0005; kappa = 0,1622 ± 0,1188) ligeramente mejor entre ovejas adultas (kappa = 0,2135 ± 0,1992) que entre corderos (kappa = 0,1193 ± 0,1301). También se detectó una alta proporción de parejas madre/cría positivas (FET p < 0,0001, kappa = 0.6269 ± 0.1854). Los resultados de la PCR IS900, además de demostrar la circulación del DNA de Map en la sangre, indican una potencial utilidad diagnóstica de esta técnica, especialmente en animales jóvenes. Estas apreciaciones deberán ser confirmadas en estudios más extensos con animales cuyo estatus de paratuberculosis sea determinado con métodos de referencia. El segundo, tercero y cuarto estudios se centran en la verificación de métodos de identificación y caracterización molecular de Map. En el segundo, se estudió la validez de la PCR IS900 y del análisis de restricción con endonucleasas de amplificados de la secuencia IS1311 (IS1311 PCR-REA) como estrategia de identificación y genotipado de 185 RESUMEN; LABURPENA; SUMMARY cepas de Map, aplicándola a 38 aislamientos procedentes de vacas, ovejas, cabras y bisontes de distintas regiones de España, India y EEUU, y a una colección de otras micobacterias distintas de Map. Todos los aislados de Map eran positivos a IS900 e IS1311, a diferencia de las otras micobacterias que eran negativas, excepto un aislado de M. intracellulare con el que se obtuvo un amplificado de IS1311 perfectamente distinguible del específico. De los aislamientos obtenidos en España, todos los que procedían de bovino, tres de seis de los caprinos y uno de los diez ovinos, pertenecían al tipo C (cattle type). Mientras, los nueve ovinos y tres caprinos restantes pertenecían al tipo S (sheep type). Todos los aislados de India eran del tipo B (bison type), tipo que sólo se había detectado en bisontes de EEUU, al que igualmente pertenecían los tres analizados en este estudio. Los resultados de este estudio preliminar muestran diferencias genotípicas entre aislamientos de Map relacionados con factores geográficos y de hospedador que pueden ser explotados para el trazado epidemiológico de aislamientos de Map con el método IS1311 PCR-REA. En el tercer estudio se empleó la IS1311 PCR-REA para analizar 520 aislamientos de Map cultivados de varias especies hospedadoras (bovino, ovino, caprino, bisonte, ciervo y jabalí) procedentes de diversas localizaciones geográficas, con el fin de conocer mejor la epidemiología de Map. Cuatro de los cultivos ovinos eran pigmentados. Todos los aislamientos bovinos, un 4% de los ovinos y un 26% de los caprinos eran del tipo C, así como los de ciervo y jabalí. En cambio, el 96% de las ovejas y el 74% de las cabras procedentes de España se hallaban infectadas con cepas de tipo S, igual que las tres ovejas de Portugal. De esta colección de aislamientos, 269 fueron además tipados con la técnica de electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) utilizando las endonucleasas SnaBI y SpeI. El empleo de este método reveló 37 perfiles SnaBI-SpeI diferentes, de los cuales 32 no habían sido descritos antes. El 85% de los cultivos bovinos eran de los tipos llamados 2-1 y 1-1, previamente descritos en la bibliografía. Sin contar con los aislamientos de pequeños rumiantes de India (todos ellos con perfil 29-1), entre los cultivos ovinos se detectaron 10 genotipos distintos, y su prevalencia no superó en ningún caso el 25%. El 43% de los aislamientos caprinos eran del tipo 16-11 previamente descrito, aislamientos entre los que se detectaron otros tres tipos más. Gracias a esta técnica de tipado, se pusieron de manifiesto algunas diferencias interesantes entre las distintas razas estudiadas. El dendrograma que se construyó a partir de las similitudes entre los patrones de PFGE de todas las cepas, dividió los aislamientos en dos grandes grupos compatibles con los descritos en gran parte de la bibliografía. En uno (cepas de tipo bovino o C) se incluían todas las cepas procedentes de bovino, de ciervo, de jabalí, y algunas de pequeños rumiantes, mientras que el otro (cepas de tipo ovino o S) lo componían exclusivamente cepas ovinas y caprinas, que representaban 11 perfiles SnaBI-SpeI diferentes. Entre las cepas pigmentadas ovinas se detectaron 2 tipos diferentes, y aunque ambos fueron incluidos en el grupo de cepas ovinas, no formaban un subgrupo común. En cultivos sucesivos de 186 RESUMEN; LABURPENA; SUMMARY varias muestras de un toro semental se descubrió la presencia de tres cepas diferentes de Map, sugiriendo una infección mixta. Los tipos de las cepas de bisonte de EEUU y los de pequeños rumiantes de India eran diferentes, lo que indica que no se trata de la misma cepa. Se observaron diferencias en los requerimientos de cultivo asociadas con el genotipo de los aislamientos. A pesar de que las distintas modalidades del medio de cultivo 7H9 parecen cumplir con los requerimientos de todos los tipos de cepa, resulta interesante utilizar otros medios para minimizar cualquier tipo de sesgo en el cultivo de Map, así como subcultivar en medio sólido los cultivos líquidos para obtener colonias puras. En España, la especie bovina se encuentra parasitada por cepas de tipo bovino, mientras que las ovejas y cabras se ven principalmente afectadas por cepas de tipo ovino. Se ha detectado una gran homogeneidad genotípica entre los aislados bovinos, a diferencia de la heterogeneidad detectada entre los de origen ovino y caprino. En el cuarto estudio se contó con varios aislamientos de M. avium procedentes de pacientes de SIDA colombianos que habían sido exhaustivamente caracterizados por métodos moleculares (Accuprobe, hsp65-PRA, ITS-1, mig, IS1245 PCR y RFLP, IS1311 PCR y RFLP, e PCR IS900). Según la PCR, cinco de ellos procedentes de tres pacientes poseían la secuencia específica de Map IS900 (17,4% de los pacientes). Como resultado de la secuenciación de los amplificados se comprobó que ésta era idéntica a la de la cepa K10 recientemente propuesta como de referencia. Esos cinco aislados y otros dos IS900 negativos de uno de los pacientes fueron analizados con la IS1311 PCRREA, y el patrón obtenido correspondía en todos los casos al de M. avium. Para descartar la presencia de DNA de Map, también se les aplicó la PCR para detectar la secuencia exclusiva de Map Locus 251, siempre con resultado negativo. La presencia de IS900 en aislados de M. avium de pacientes infectados con el HIV ya se había observado, pero no se le ha atribuido la suficiente importancia. Los resultados de estudios de detección de Map en pacientes de Crohn basados en la IS900, pueden verse afectados, pues parece que su detección no implica necesariamente la presencia de Map al menos en estos grupos de personas, aunque sigue estando asociada a enfermedad clínica. El empleo de otras dianas genéticas puede confirmar la identidad de estas bacterias portadoras de IS900. En el quinto y último trabajo, en vista de la posibilidad de que células viables de Map se encuentren en leche destinada al consumo humano, se planteó la posibilidad de usar un método alternativo a los tratamientos térmicos para conseguir la inactivación de Map en este potencial vehículo de transmisión para el ser humano, las altas presiones hidrostáticas (HHP). Para ello, se inocularon de manera artificial varias muestras de leche con distintas concentraciones de dos cepas diferentes de Map, que fueron sometidas a tratamientos de 300, 400 y 500 MPa en temperaturas de 5 y 20ºC. Las reducciones en las células viables de ambas cepas se incrementaron con el aumento de la presión. Se pudieron observar diferencias significativas entre las cepas, y entre los medios de cultivo. En cambio, el resultado de los tratamientos fue muy similar a ambas 187 RESUMEN; LABURPENA; SUMMARY temperaturas. Con el tratamiento de 500 MPa se consiguieron reducciones medias de 4 log CFU/ml que son similares a las obtenidas con la pasterización, con la ventaja de que el HHP se puede aplicar en condiciones de refrigeración que mantienen las cualidades y características organolépticas de la leche. LABURPENA Paratuberkulosia Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map) bakterioak heste mehean eraginiko gaixotasun kronikoa da, eta batez ere animalia hausnarkarien artean ematen da. Mundu osoan zehar hedatuta dago eta galera ekonomiko garrantzitsuak eragiten ditu abere-industrian. Nahiz eta oraindik inork ez duen froga definitiborik aurkitu, badirudi Mapek Crohn gaixotasunaren eragilea dela. Bakterioa gizakiaren elika katean topatu denez, osasun publikoaren inguruko ardura nabarmenki areagotu egin da. Lan hau bost estudio ezberdinez osatuta dago, eta bere helburuak Mapen alderdi bakteriologikoekin erlazionatuta daude: Map (edo bere DNA) odolean zehar ibiltzen dela baieztatzea eta horrek diagnostikoan erabiltzeko daukan ahalmena ikertzea, karakterizazio molekularreko teknikak Neikerren erabiltzeko egokitzea eta hoiekin Mapen isolamendu bilduma bat karakterizatzea, eta azkenik, gizakiaren kontsumorako zuzendutako esnean tratamendu termikoen metodo alternatiboak saiatzea Map inaktibatzeko. Lehenengo estudioan ELISA eta odol PCRa konparatu ziren behi eta ardi laginekin. Behien odol laginak esplotazio erasatu batetik hartu ziren (94 behi bi urte baino gazteagoak eta 184 bi eta bost urte bitartekoak), hauetatik 80 ELISA positibo eta 198 ELISA negatibo izanik. PCRak Mapen DNAa (IS900) lagin hauetako 66tan detektatu zuen. Emaitzen analisi orokorraren arabera teknika bien arteko asoziazioa argia zen baina korrelazio negatiboa zen (Fisher exact test [FET] p = 0,0049; 45,3%, kappa = 0,1665 ± 0.0994). Nahiz eta ahula izan, gazteen artean tekniken konkordantzia ikusi zen (87,7%, kappa = 0,4471 ± 0,2435), behi helduen artekoa negatiboa izanik (62,7%, kappa = -0,3670 ± 0,1057). Ardien kasuan, 53 esplotazio ezberdinetan hartutako 496 odol lagin bildu ziren, hauen artean 180 ama/kume bikoteak izanik. Mapen DNAa ardi laginen 61 laginetan aurkitu zen. Konkordantzia baxua izan arren, ELISA eta PCRaren emaitzen arteko asoziazioa handia izan zen (FET, p < 0,0005; kappa = 0,1622 ± 0,1188). Ardi helduen artean lortutako konkordantzia altuagoa zen (kappa = 0,2135 ± 0,1992) gazteetan baino (kappa = 0,1193 ± 0,1301). Ama/kume bikote positiboen proportzio altua detektatu zen (FET p < 0,0001, kappa = 0.6269 ± 0.1854). IS900 PCRaren emaitzek erakusten duten bezala, Mapen DNAa odolean zehar ibiltzen da, eta teknika honek diagnostikorako erabilera potentziala duela, batez ere animalia gazteen artean. Etorkizunean, balorazio hauek paratuberkulosi estatus ezaguna (erreferentziazko 188 RESUMEN; LABURPENA; SUMMARY teknikek jarritakoa) duten animaliekin egindako estudio handiagoetan egiaztatu behar izango dira. Hurrengo hiru estudioak (bigarrena, hirugarrena eta laugarrena) Mapen identifikazio eta karakterizazio molekularrerako metodoetan oinarrituta daude. Bigarrenean, Mapen identifikazio eta anduien genotipo azterketa orokorrerako, IS900 PCRaren eta IS1311aren amplifikatuen endonukleasen bidezko errestrikzioaren (IS1311 PCR-REA) baliotasuna aztertu zen. Horretarako, Espainia, India eta EEBBetako eskualde ezberdinetako behi, ardi, ahuntz eta bisontetatik eratorritako 38 isolamendu erabili ziren. Kontrol modura Mapen ezberdinak ziren beste mikobakterio bilduma bat erabili zen. Mapen isolamendu guztiek IS900 eta IS1311 PCReetan positiboak ziren, eta kontrol guztiak negatiboak, M. intracellulareren kontrolan emandako banda inespezifikoa izan ezik (dena den tamaina ezberdina zuelaz aparte, REAren bidez IS1311ren ezberdina zela froga zitekeen). Espainiar estatuko behi isolamendu guztiak, ahuntzen 6 isolamenduetatik hiru, eta ardien 10etatik beste bat C (cattle type) motakoak ziren. Aldiz, ardien beste 10ak eta ahuntzen beste hirurak S (sheep type) motakoak ziren. Lehenago EEBBetako bisonte batzuetan besterik aurkitu ez zen B (bison type) motakoak ziren Indiako isolamendu guztiak, gure estudioko bisonte amerikarrak bezala. Atariko estudio honen emaitzek Mapen isolamenduen artean ostalari eta geografia faktorekin erlazionatutako ezberdintasunak daudela eta IS1311 PCR-REAa Mapen epidemiologia molekularra aztertzeko erabilgarria dela erakusten dute. Hirugarren estudioan, Mapen epidemiologia hobeto ulertzeko asmoz puntu geografiko ezberdinetako ostalari ezberdinetatik (behia, ardia, ahuntza, bisontea, oreina eta basurdea) hazitako 520 isolamendu IS1311 PCR-REArekin aztertu ziren. Ardien isolamenduetatik lau pigmentatuak ziren. Behien isolamendu guztiak, ardien isolamenduen %4a, eta ahuntzen isolamenduen %26a, C motakoak ziren, orein eta basurde isolamenduak bezala. Aldiz, Espainiako ardien %96a eta ahuntzen %74a S motako anduiekin zeuden infektatuta, Portugaleko hiru ardiak bezala. Isolamendu bilduma honetatik, 269 hartu ziren eremu pultsatupeko gel elektroforesiaren (PFGE) bidez genotipatzeko, SnaBI eta SpeI entzimak erabiliz. Teknika honen bidez 37 SnaBISpeI profil ezberdin aurkitu ziren, hauetatik 32 berriak izanik. Behien isolamenduen %85a bibliografian lehenagotik deskribatuta zeuden 2-1 edo 1-1 genotipoa erakutsi zuten. Indiako hausnarkari txikien isolamenduak kontutan hartu gabe (guztiak 29-1 izanik), ardien kultiboen artean 10 genotipo ezberdin aurkitu ziren, nahiz eta horietako batek ere ez zeukan %25eko prebalentzia baino handiagoa. Ahuntzen isolamenduen %43a bibliografian deskribatuta zegoen 16-11 genotipoa erakutsi zuten, eta espezie honen gainerako isolamenduen artean beste hiru genotipo ezberdin aurkitu ziren espezie ostalari hau infektatzen. Teknika honi ezker aztertutako arraza ezberdinen arteko diferentzia interesgarriak somatu ziren. PFGE patroien antzekotasunetan oinarritutako dendrogramak isolamenduak bi talde ezberdinetan banandu zituen, bibliografiaren parte batean bezala. Talde batean (behi motako anduiak edo C anduiak) behi, orein eta 189 RESUMEN; LABURPENA; SUMMARY basurdetik isolatutako kultibo guztiak, eta hausnarkari txikietatik isolatutako gutxi batzuk biltzen ziren bitartean, bestean (ardi motako anduiak edo S anduiak), ardi edo ahuntzen isolamenduen artean bakarrik aurkitu ziren 11 SnaBI-SpeI profil biltzen ziren. Andui pigmentatuen artean bi genotipo aurkitu ziren, eta biak S motakoen artean sailkatu ziren arren, hauek ez zuten azpitalde bakarra eratu elkarrekin. Hazitarako zezen baten lagin ezberdinetako kultibo ezberdinetan (ezberdinak denboran zehar ere bai) Mapen andui ezberdinak azaldu ziren, infekzio mixtoaren indikatzaile izanik. Indiako hausnarkari txikien anduien eta EEBBetako bisonteen anduien genotipoak ezberdinak ziren, beraz ez ziren andui berbera. Isolamenduaren genotipoarekin erlazionatuta agertzen ziren hazkuntza ezberdintasunak somatu ziren. Nahiz eta 7H9 medioaren modalitate ezberdinek Mapen andui guztien hazkuntzarako errekerimendu guztiak barnean hartzen dituztela dirudien, zehartasun posibleak murrizteko, beste medio solido batzuk erabiltzea interesgarria da, baita kultibo likidoak solido batean azpikultibatzea ere, horrela kolonia puruak hazteko. Espainian behiak C motako anduiek infektazen dituzte, ardiak eta ahuntzak batez ere S motako anduiek infektatzen dituzten bitartean. Behi isolamenduen artean homogeneotasun genetiko oso handia ikusi izan da, ardi eta ahuntz isolamenduen artean aldiz, heterogeneotasun handia da ikusi izan dena. Laugarren estudioan, sakonki karakterizatuta (Accuprobe, hsp65-PRA, ITS-1, mig, IS1245 PCR y RFLP, IS1311 PCR y RFLP, e PCR IS900) zeuden Kolonbiako HIES gaixo batzuetatik isolatutako kultibo batzuk erabili dira. PCRaren arabera, hiru gaixo ezberdinetatik (aztertutako gaixoen %17,4) hazitako bost isolamenduk Mapen IS900 sekuentzia espezifikoa zeukaten. Sekuentziazioaren arabera, anplifikatu hoien sekuentzia erreferentzia gisa proposatu berri duten K10 Mapen anduiaren berdinak ziren. Bost isolamendu horiek eta gaixo baten beste bi (isolamendu IS900 positibo bi zituen eta beste bi negatibo) IS1311 PCR-REAren bidez aztertu ziren, eta emaitza M. aviumen patroi berdina izan zen kasu guztietan. Mapen DNArik ez zegoela baieztatzeko Locus 251 Mapen sekuentzia espezifikoa bilatu zen PCRaren bidez, eta isolamendu guztietan negatiboa izan zen. Aurretiko beste lan batzuk IS900a HIESdun gaixotatik hazitako M. aviumen isolamendu batzutan topatu zutela diote, baina aurkikuntza hauei orain arte ez zaie merezi duten garrantzia eman. Gure emaitzak eta aurrekoak (bibliografia), IS900an oinarritutako Mapen detekzioa erabiltzen duten Crohni buruzko estudioen emaitzetan eragina eduki dezakete. Hau da, IS900a aurkitzeak ez du Mapen beharrezko presentzia inplikatzen, pertsona talde mota honetan behintzat. Hala ere, IS900a gaixotasun klinikoarekin erlazionatuta jarraitzen du. Beste itu genetikoen erabilerari esker bakterio IS900-eramaileen identitatea konfirmatu daiteke. Mapen zelula bideragarriak giza-kontsumorako zuzendutako esnean topa daitezkela kontutan hartuz, azkeneko estudioan (bostgarrena) Map inaktibatzeko tratamendu termikoen metodo alternatiboak aztertzea zen helburua, presio hidrostatiko altuak (HHP) erabiltzea alegia. Horretarako esne lagin ezberdinak Mapen andui biren kontzentrazio ezberdinez inokulatu ondoren, 300, 400 eta 500 MPaeko presioz tratatu 190 RESUMEN; LABURPENA; SUMMARY ziren 5 edota 20ºCtan. Zelula bideragarrien kontaketetan lortutako murrizketak presioa igotzearekin batera handitzen ziren. Erabilitako kultibo medioen artean eta anduien artean ezberdintasun signifikatiboak aurkitu ziren. Ez zen temperaturaren (5 edo 20ºC) eraginik nabaritu. 500 MPaeko tratamenduari esker zelula bideragarrien 4 log CFU/mlko batazbesteko murrizketak lortu ziren, pasterizazioaren bidez lortzen direnen antzekoak izanik. Hala ere, HHP tratamenduak duen abantaila hozte-temperaturatan aplika daitezkela da, esnearen kualitate eta ezaugarri organoleptikoak mantenduz. SUMMARY Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map) causes a chronic inflammation (paratuberculosis) of the intestines mainly in ruminant species. Its prevalence in food-producing animals is increasing globally, causing significant financial losses. Although there are no conclusive studies, it is suspected to be responsible for Crohn’s disease. The detection of Map in potential transmission vehicles for humans has increased public health concerns on Map. The present work consists of five studies focused on some bacteriological aspects of Map: to confirm the presence of Map (or its DNA) on cattle and sheep blood and to study its potential use in diagnosis, to adjust molecular typing methods of Map in Neiker and to use them for a big Map collection characterization, and finally, to evaluate alternatives for the use of thermal inactivation treatments of micro-organisms on milk destined for human consumption. The first study was carried out to compare the performance of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and blood polymerase chain reaction (PCR) for diagnosis of paratuberculosis in cattle and sheep. For cattle, a set of 278 samples from one paratuberculosis affected Friesian farm was used; it included 80 ELISA-positive samples and 198 ELISA-negative samples from an age-matched group. Ninety-four samples were from heifers and 184 were from 2-5-year-old cows. The IS900 PCR detected 66 positive samples. The overall analysis showed a clear association (Fisher exact test [FET] p = 0.0049) but a weak negative agreement (45.3%, kappa = -0.1665 ± 0.0994) between the two tests. It reflected a moderate agreement among heifers (87.7%, kappa = 0.4471 ± 0.2435) and a moderate disagreement among cows (62.7%, kappa = 0.3670 ± 0.1057). For sheep, 496 single blood samples from 53 Latxa dairy flocks; 180 of the blood samples were from dam/offspring pairs. In 61 ovine blood samples the PCR detected the presence of Map’s DNA. The overall association between the 2 tests on ovine samples was strong (FET, p < 0.0005), whereas the agreement was low (kappa = 0.1622 ± 0.1188). There was slightly better agreement for ewes (kappa = 0.2135 ± 0.1992) than for lambs (kappa = 0.1193 ± 0.1301). There was also a highly unlikely proportion of dam/offspring positive results (FET p < 0.0001, kappa = 0.6269 ± 0.1854). These results confirm the presence of Map’s DNA in cattle and sheep blood, 191 RESUMEN; LABURPENA; SUMMARY and suggest that blood PCR testing might be a potentially useful new approach in paratuberculosis diagnosis, especially in young animals. Further intensive studies on animals with known paratuberculosis status (with reference techniques) are needed for confirmation of these considerations. The second, third and fourth studies are focused on identification and molecular characterization methods of Map isolates. In the second one, the validity of IS900 PCR and IS1311 restriction-endonuclease-analysis (IS1311 PCR-REA) as identification and preliminary characterization methods are studied. These were applied to 38 Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map) isolates from cattle, sheep, goats and bison from distinct regions of Spain, India and the United States of America (USA). A control non-Map mycobacterial collection was used. All Map isolates were positive in both IS900 and IS1311 PCR methods. None of the other isolates was positive in any of the PCR assays performed, except M. intracellulare, which yielded a band easily distinguishable from the specific one in the IS1311 PCR. In Spain, all eight bovine isolates, three out of six caprine isolates and one of ten ovine isolates were of the C type (cattle type), while the other nine ovine isolates and three caprine isolates were of the S type (sheep type). In India, all five ovine isolates and six caprine isolates were of the B type, and so were all three isolates from bison (Bison bison) from the USA. These results show that there are genetic differences between Map isolates related to geographic and host factors that have a potential use in the epidemiological tracing of new paratuberculosis isolates by using the IS1311 PCR-REA. In order to better understand the epidemiology of paratuberculosis, 520 isolates from different hosts (cattle, sheep, goats, bison, deer and wild boar) and origins were cultured and typed by IS1311 PCR-REA, in the third study. Four of the ovine isolates were pigmented. All bovine isolates, 4 and 26% of Spanish ovine and caprine cultures, respectively, and the deer and wild boar isolates, were IS1311-cattle type strains. IS1311-sheep type encompassed 96% and 74% of isolates from Spanish sheep and goats, and all three Portuguese sheep cultures. Two-hundred and sixty-nine of these isolates were further characterized by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) using SnaBI and SpeI endonucleases. Thirty-seven distinct multiplex PFGE profiles were found, giving 32 novel profiles. Previously defined profiles 2-1 and 1-1 accounted for the 85% of cattle isolates. All Indian isolates belonged to the novel 29-1 profile. Ten distinct profiles were detected in Spanish sheep, none of them with an incidence higher than 25%. 16-11 (43%) and another three profiles were identified in Spanish caprine cultures. The use of PFGE showed some interesting differences between different breeds. The hierarchical analysis, clustered all profiles found in cattle, “wild” hosts and some small ruminants within the same group (C type strains). The other group included 11 profiles only found in Spanish sheep and goats, including Spanish pigmented profiles (S type strains). Although the two profiles found in these pigmented isolates belonged to the same S type group, they were not included in a separate subgroup. Consecutive 192 RESUMEN; LABURPENA; SUMMARY cultures from different samples of one bull yielded three isolates with a different PFGE genotype, suggesting mixed infection of the animal. The differences found between profiles of Indian small ruminant isolates and those from American bisons indicate they are not the same strain. Differences in growth requirements associated with isolate genotype were observed. Although 7H9 broth based culture media seem to broadly cover the growth requirements of most Map strains, the use of various solid media is recommended to reduce any recovery biases, and subculture on solid media to obtain pure colonies. Cattle in Spain are infected with C type strains, while small ruminants are mainly infected with S type strains. High genetic homogeneity of isolates from cattle, and heterogeneity of those from sheep and goats have been detected. In the fourth study, various thoroughly characterized (Accuprobe, hsp65-PRA, ITS1, mig, IS1245 PCR y RFLP, IS1311 PCR y RFLP, e PCR IS900) M. avium isolates from Colombian HIV positive human patients were further characterized. Up to five of the isolates cultured from three patients were positive to IS900 by PCR (17.4% of patients studied). These amplified products showed a nucleotide sequence identical to that found in the genome of Map K10 bovine strain. That sequence has been recently proposed as the reference sequence of IS900. The IS900 positive isolates, as well as two other isolates obtained from a same patient were further studied with IS1311 PCR-REA to confirm those results. All isolates gave the same M. avium pattern. To rule out the presence of Map DNA, the isolates were tested for the presence of the Map specific locus 251, and all isolates were negative. This is not the first report on the presence of the IS900 element in M. avium isolates from HIV positive patients. This finding has not been suitably considered in further IS900 based studies on Crohn’s Disease, since detection of IS900 does not necessarily implicate presence of Map, in this group of patients at least. However, positive IS900 amplification still appears to be associated to clinical disease. Analysis of additional specific targets could help to clarify the identity of the IS900-carrying micro-organisms detected. Finally, in the fifth study, the objective was to evaluate the ability of high hydrostatic pressures (HHP) to be used as an alternative to thermal treatments for inactivation of Map in milk destined for human consumption. Several milk samples were artificially inoculated with different dilutions of two Map strains for this purpose. Samples were then treated with 300, 400 y 500 MPa pressures at 5 and 20ºC. Reductions of M. avium subsp. paratuberculosis increased with pressure level. Significant differences were also found between M. avium subsp. paratuberculosis strains and between the media used, but the assayed temperature levels had no significant effects on the counts. Average reductions of 4 log CFU/ml after treatment with 500 MPa are comparable to those caused by thermal treatments. Since mild HHP treatments could be applied to milk at refrigeration temperatures, minimizing organoleptic and nutritional alteration, HHP treatment seem to be advantageous. 193 BIBLIOGRAFÍA CITADA BIBLIOGRAFÍA CITADA Ablordey A, Swings J, Hubans C, Chemlal K, Locht C, Portaels F y Supply P. 2005. Multilocus variable-number tandem repeat typing of Mycobacterium ulcerans. J.Clin.Microbiol., 43(4):1546-51. Adaska JM y Anderson RJ. 2003. Seroprevalence of Johne's-disease infection in dairy cattle in California, USA. Prev.Vet.Med., 60(3):255-61. Aduriz G, Juste RA, Garrido JM y Geijo MV. 2000. Epidemiología y control de la paratuberculosis bovina. En: Juste editor. Paratuberculosis. Bovis, Aula Veterinaria, vol.nº93, pp. 63-93. Luzan 5, Madrid, España. Aduriz JJ. 1993. Epidemiología, diagnóstico y control de la paratuberculosis ovina en la Comunidad Autónoma del País Vasco. 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Identificación, origen y factores fisicoquímicos que condicionan la contaminación por elementos metálicos de sedimentos de ríos. ESTILITA RUIZ ROMERA Nº 8. Análisis financiero de proyectos de inversión en repoblaciones forestales. ÁLAVARO AUNOS GÓMEZ Nº 9. Desarrollo y evaluación del sistema integrado de diagnóstico y recomendación (DRIS) para la fertilización de las praderas permanentes. Marta Rodríguez Julia Nº 10. Estudio de las mieles producidas en la Comunidad Autónoma del País Vasco. MARÍA TERESA SANCHO ORTIZ Nº 11. La biomasa microbiana como agente de las transformaciones de nitrógeno en el suelo tras el enterrado de la paja de cereal. JESÚS ÁNGEL OCIO ARMENTIA Nº 12. Análisis jurídico y económico de la implementación de la política agraria comunitaria en la Comunidad Autónoma del País Vasco. BEATRIZ PÉREZ DE LAS HERAS Nº 13. Nemátodos formadores de quistes (Globodera spp.) en patata (Solanum tuberosum L.): caracterización taxonómica, reproducción y actividad de las formas juveniles. AZUCENA SALAZAR BAYONA Nº 14. Ensayo comparativo de tres métodos de tratamiento antihelmítico estratégico en rebaños de ovejas latxas. ANA LUISA GRACIA PÉREZ Nº 15. Estudio sobre una encefalitis vírica similar al Louping-ill en el ganado ovino de la Comunidad Autónoma Vasca. DANIEL FERNÁNDEZ DE LUCO MARTINÉZ Nº 16. Análisis de caracteres involucrados en la selección y mejora de Lupinus hispanicus Boiss. et Reuter. VERÓNICA ARRIETA PICO Nº 17. Contribución al estudio de fermentaciones artesanales e industriales de Rioja Alavesa. MILAGROS VIÑEGRA GARCÍA Nº 18. Estudio del manejo de la alimentación en los rebaños ovinos de raza Latxa y su influencia sobre los resultados reproductivos y de producción de leche. LUIS Mª. OREGUI LIZARRALDE Nº 19. El sector pesquero vizcaíno, 1800-1960. Análisis de la interacción de los elementos ambiental, extractivo y comercial en la pesquería. JOSÉ AGUSTÍN MAIZ ALCORTA Nº 20. Epidemiología, diagnóstico y control de la paratuberculosis ovina en la Comunidad Autónoma del País Vasco. J. J. ADURIZ RECALDE Nº 21. Agrupación de poblaciones locales de maíz (Zea mays L.) mediante caracteres morfológicos y parámetros ambientales. JOSÉ IGNACIO RUIZ DE GALARRETA GÓMEZ Nº 22. Estudio del potencial melífero de Bizkaia. AMELIA CERVELLO MARTÍNEZ Nº 23. Influencia de los procesos de salado y ahumado sobre las características fisicoquímicas del queso Idiazabal (compuestos nitrogenados). FRANCISCO C. IBAÑEZ MOYA Nº 24. El Euskal Artzain Txakurra (el perro pastor vasco) descripción y tipificación racial. MARIANO GÓMEZ FERNÁNDEZ Nº 25. Evaluación de diferentes ciclos de selección recurrente en dos poblaciones sintéticas de maíz. GOTZONE GARAY SOLACHI Nº 26. Valoración agronómica de la gallinaza: Compostaje. ADOLFO MENOYO PUELLES Nº 27. Relación clima-vegetación en la Comunidad Autónoma del País Vasco. AMELIA ORTUBAY FUENTES Nº 28. Influencia de los procesos de salado y ahumado tradicional sobre las características microbiológicas y organolépticas del queso Idiazabal. FRANCISCO J. PÉREZ ELORTONDO Nº 29. Mastitis en la oveja Latxa: epidemiología, diagnóstico y control. JUAN C. MARCO MELERO Nº 30. Contribución al conocimiento anatomopatológico y diagnóstico de la tuberculosis caprina y ovina por Mycobacterium bovis. M.ª MONTSERRAT GUTIÉRREZ CANCELA Nº 31. Estudio de factores que pueden influir en la calidad de la pluma de gallos Eusko-oiloa (Variedad Marradune) para la fabricación de moscas artificiales utilizadas en la pesca de la trucha. ROSA M.ª ECHARRI TOMÉ Nº 32. Estudio de la fracción lipídica durante la maduración del queso Idiazabal. Influencia de los procesos tecnológicos del tiempo de permanencia en salmuera y ahumado. ANA ISABEL NÁJERA ORTIGOSA Nº 33.- Influencia del tipo de cuajo y adición de cultivo iniciador sobre los compuestos nitrogenados durante la maduración del queso Idiazabal. M.ª SOLEDAD VICENTE MARTÍN Nº 34. Estudio de la infección por Borrelia burgdorferi, grupo Ehrlichia phagocytophila y virus de la encefalitis ovina en las poblaciones de ixódidos de la Comunidad Autónoma Vasca. MARTA BARRAL LAHIDALGA Nº 35. Lipolisis en el queso Idiazabal: efecto de la época de elaboración, del cultivo iniciador, de la pasteurización y del tipo de cuajo. FELISA CHAVARRI DÍAZ DE CERIO Nº 36. Aspectos inmunopalógicos de la paratuberculosis de los pequeños rumiantes. Respuesta inmune asociada a la vacunación. JUAN MANUEL CORPA ARENAS Nº 37. Desarrollo y evaluación de nuevas técnicas de diagnóstico del Maedi-Visna. ANA BELÉN EXTRAMIANA ALONSO Nº 38. Estudios sobre Patogenia y Diagnóstico de la Adenomatosis Pulmonar Ovina. MARÍA MERCEDES GARCÍA GOTI Nº 39. Análisis de los factores de explotación que afectan a la producción lechera en los rebaños de raza Latxa de la CAPV. ROBERTO J. RUIZ SANTOS Nº 40. Crecimiento y producción de repoblaciones de Pinus radiata D. Don en el Territorio Histórico de Gipuzkoa (País Vasco). LUIS MARIO CHAUCHARD BADANO Nº 41. Puesta a punto de técnicas PCR en heces y de Elisa para el diagnóstico de la Paratuberculosis. Estudio de prevalencia en ganado bovino. JOSEBA M. GARRIDO URKULLU Nº 42. Epidemiología y diagnóstico de la leptospirosis y la neosporosis en explotaciones de bovino lechero de la CAPV. RAQUEL ACHAERANDIO GALDOS Nº 43. Relaciones aire-agua en sustratos de cultivo como base para el control del riego. Metodología de laboratorio y modelización. VALENTÍN TERÉS TERÉS Nº 44. Zonas endémicas de enfermedad de Lyme en la CAPV: estudio del papel de los micromamíferos en el mantenimiento de Borrelia burgdorferi sensu lato en el medio natural. HORACIO GIL GIL Nº 45. Optimización del esquema de mejora de la raza Latxa: análisis del modelo de valoración e introducción de nuevos caractéres en el objetivo de selección. ANDRÉS LEGARZA ALBIZU Nº 46. Influencia de las condiciones de almacenamiento, reimplantación y lluvia ácida en la viabilidad de Pinus radiata D. Don. MIREN AMAIA MENA PETITE Nº 47. Estudio sobre encefalopatías en peces: patogenicidad del nodavirus causante de la enfermedad y retinopatía vírica (ERV) y transmisión experimental del prión scrapie a peces. RAQUEL ARANGUREN RUIZ Nº 48. Enfermedades transmitidas por semilla en judía-grano (Phaseolus vulgaris L.): detección, control sanitario y mejora genética. ANA MARÍA DÍEZ NAVAJAS Nº 49. Pastoreo del ganado vacuno en zonas de montaña y su integración en los sistemas de producción de la CAPV. NEREA MANDALUNIZ ASTIGARRAGA Nº 50. Aspectos básicos de la mejora genética de patata (Solanum tuberosum L.) a nivel diploide. LEIRE BARANDALLA URTIAGA Nº 51. El cuajo de cordero en pasta: preparación y efecto en los procesos proteolíticos y lipolíticos de la maduración del queso de Idiazabal. Mª. ÁNGELES BUSTAMANTE GALLEGO Nº 52. Dinámica de la población de atún blanco (Thunnus alalunga Bonnaterre 1788) del Atlántico Norte. JOSU SANTIAGO BURRUTXAGA Nº 53. El pino radiata (Pinus radiata D.Don) en la historia forestal de la Comunidad Autónoma de euskadi. Análisis de un proceso de forestalismo intensivo. MARIO MICHEL RODRÍGUEZ Nº 54. Balance hídrico y mineral del pimiento de Gernika (Capsicum annuum L., cv Derio) en cultivo hidropónico. Relaciones con la producción. HUGO MACÍA OLIVER Nº 55. Desarrollo de métodos moleculares y su aplicación al estudio de la resistencia genética y patogenia molecular del Scrapie. DAVID GARCÍA CRESPO Nº 56. Estudio epidemiológico y experimental de la transmisión y control del virus Maedi-Visna en ovino lechero de raza Latxa del País Vasco. VEGA ÁLVAREZ MAIZTEGUI Nº 57. Desarrollo y aplicación de técnicas de diagnóstico serológico para el estudio de la transmisión calostral y horizontal del virus Maedi-Visna (VMV) en ovino. MARA ELISA DALTABUIT TEST Nº 58. Integral Study of Calving Ease in Spanish Holstein Population. EVANGELINA LÓPEZ DE MATURANA LÓPEZ DE LACALLE
