region reguladora de preferencia los tejidos macho y su

19
OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
11 Número de publicación: 2 236 915
51 Int. Cl. : C12N 15/82, C12N 15/29
7
C12N 9/24, C12N 9/22
C12N 9/10, C12N 9/00
C07K 14/34, C12Q 1/68
A01H 5/00
ESPAÑA
12
TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA
T3
86 Número de solicitud europea: 98931443 .0
86 Fecha de presentación: 19.06.1998
87 Número de publicación de la solicitud: 0994956
87 Fecha de publicación de la solicitud: 26.04.2000
54 Título: Región reguladora de preferencia los tejidos macho y su procedimiento de utilización.
30 Prioridad: 23.06.1997 US 880499
73 Titular/es:
PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL, Inc.
800 Capital Square
400 Locust Street
Des Moines, Iowa 50309, US
45 Fecha de publicación de la mención BOPI:
16.07.2005
72 Inventor/es: Albertsen, Marc, C.;
Fox, Timothy, W.;
Garnaat, Carl, W.;
Huffman, Gary, A. y
Kendall, Timmy, L.
45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:
74 Agente: Ungría López, Javier
ES 2 236 915 T3
16.07.2005
Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de
la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea
de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se
considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del
Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 236 915 T3
DESCRIPCIÓN
Región reguladora de preferencia los tejidos macho y su procedimiento de utilización.
5
10
Campo de la invención
La presente invención está relacionada con secuencias de ADN aisladas, las cuales actúan como regiones reguladoras en células eucariótidas. Más específicamente, la presente invención está relacionada con secuencias de ADN
aisladas de maíz, las cuales actúan como regiones reguladoras preferidas de tejido andrógeno, y que juegan un papel
en la expresión de los genes en tejidos andrógenos. La presente invención está relacionada también con un método
para conferir a un gen -el cual puede ser expresado normalmente o no en tejidos andrógenos- la habilidad para ser
expresado de una forma preferente en tejido andrógeno.
Antecedentes de la invención
15
20
25
30
La expresión y regulación génica específica temporal y de tejido se encuentran, inter alia, durante la reproducción
sexual en las eucariótidas. En la gametogénesis de las plantas tienen lugar importantes cambios citológicos y bioquímicos durante el desarrollo del polen, cuando la división mitótica asimétrica de la micróspora haploide da como
resultado la formación de dos células; cada una de ellas con diferentes destinos en su desarrollo. La célula vegetativa
ayuda al crecimiento del polen, mientras que la célula generativa experimenta mitosis y se convierte en células de
esperma. Han sido identificados ARNs mensajeros específicos de ambas rutas dentro del polen en plantas como el
maíz, tomate, tabaco, arroz y pensamiento; y han sido identificados también mensajes específicos para el polen, o para
uno o más tipos de otras células dentro de la antera, tales como tapete, epidermis y estomio.
La expresión génica del polen durante la diferenciación implica a unos 24.000 genes estimados (Willing, et al.,
“An Analysis of the Quantity and Diversity of mRNA’s From Pollen and Shoots of Zea mays”; Theor. Appl. Genet.;
Vol. 75; pp. 751-753; (1988)), sin embargo sólo un 10% de los clones de una librería de ADNc son androespecíficos
(Stinson, et al., “Genes Expressed in the Male Gametophyte and Their Isolation”; Plant Physiol.; Vol. 83; pp. 442447; (1987)) y el porcentaje de genes expresados en el polen que son específicos del polen es de entre el 5% y el
80% (Willing, et al., “An Analysis of the Quantity and Diversity of mRNA’s From Pollen and Shoots of Zea mays”;
Theor. Appl. Genet.; Vol. 75; pp. 751-753; (1988)). Este complejo proceso de microsporogénesis implica la producción
secuencial de muchos productos génicos.
35
Hasta la fecha han sido clonados genes específicos andrógenos de plantas: dos de éstos, el gen del maíz Ms45
(Patente Americana Nº 5.478.369) y el gen de Arabidopsis Ms2 (Mark, G.M., et al., Nature; Vol. 363; pp. 715-717;
(1993)), han demostrado que son necesarios para el desarrollo del polen. Otros ejemplos de promotores específicos
andrógenos en plantas incluyen el ZM13, el PG, y el SGB6.
40
El promotor Zm13 es revelado en la Patente Americana Nº 5.086.169. Consiste en 1315 pares de bases y procede
de un gen específico del polen descrito por Hanson, et al., Plant Cell; Vol. 1; pp. 173-179; (1989). Este gen hibridiza
con el ARNm encontrado únicamente en el polen.
45
Otro promotor específico del polen ha sido aislado y caracterizado upstream (aguas arriba) del gen de poligalacturonasa específico del polen (PG) Patente Americana Nº 5.412.085. Esta región promotora comprende 2687 pares de
bases y es expresada predominantemente en el polen y en la inflorescencia emergente, pero no en la inflorescencia preemergente. La Patente Americana Nº 5.545.546, también de Allen, describe otro promotor específico del polen procedente del gen de poligalacturonasa del maíz. Es expresado únicamente en el polen y en la inflorescencia emergente.
50
La Patente Americana Nº 5.470.359 describe una región reguladora perteneciente al gen SGB6 del maíz, la cual
confiere especificidad tapetal. El tejido de expresión, el tapete, consiste en una capa de células que rodean a las células
microsporogénicas en la antera y proporciona nutrientes a las mismas.
55
Son descritos nueve clones genómicos y de ADNc específicos de la antera procedentes del tabaco en la Patente
Americana Nº 5.477.002. Los clones de ADNc eran específicos de la antera, según análisis de Northern, aunque
diferían en los perfiles de desarrollo. El clon Ant32 es específico del tapete.
La Patente Europea Nº 0 420 819 A1 describe el método para la producción de plantas androestériles con el gen
wun1.
60
La PCT WO 90/08825 describe los ADNcs específicos de la antera TA13, TA26 y TA29, y su uso en un sistema
de androesterilidad.
La PCT WO 90/08825 explica los genes de androesterilidad pMS10, pMS14 y pMS18, y su utilización con el gen
reportero GUS.
65
La Patente Americana Nº 5.589.610 detalla un promotor correspondiente al ADNc específico de la antera y al
ADNc preferido de la antera AC444.
2
ES 2 236 915 T3
5
10
Es conocida en este campo la utilización de un promotor vegetal y de un gen exógeno para producir un cambio
en la composición genética de las plantas (Patentes Americanas Nums. 5.432.068, 5.412.085, 5.545.546, 5.470.359 y
5.478.369). Estas patentes tratan de casetes de expresión vegetal con un promotor específico del tejido ligado a un gen
para producir androesterilidad, androfertilidad o, expresar de otra forma un gen en un tejido específico. Sin embargo,
estas patentes no enseñan la utilización de esta región reguladora preferida de tejido andrógeno, o el uso de esta región
reguladora preferida de tejido andrógeno con un gen exógeno como un método de control de la androesterilidad.
La presente invención está relacionada con una región reguladora específica de tejido andrógeno y con los métodos
de utilización de la misma. La expresión de un gen exógeno de forma preferida en tejido andrógeno puede mediar la
androfertilidad y es útil en muchos sistemas, tales como en la producción de semillas híbridas.
Resumen de la invención
15
La invención proporciona una molécula de ácido nucléico aislada, comprendiendo una región reguladora preferida
de tejido andrógeno Ms45, que dirige un nivel mayor de transcripción en los tejidos andrógenos que en algunos tejidos,
o que en todos los demás tejidos de la planta, y comprende:
(a) una secuencia de nucleótido de SEC. ID. Nº: 1 o 2;
20
25
30
(b) una secuencia de nucleótido con, al menos, un 70% de identidad con una secuencia SEC. ID. Nº: 1 o 2, que
dirige un mayor nivel de transcripción en los tejidos andrógenos que en algunos tejidos, o que en todos los demás
tejidos de la planta;
(c) una secuencia de nucleótido, la cual hibridiza con una secuencia de SEC. ID. Nº: 1 o 2 bajo condiciones
altamente astringentes, representadas por un lavado de astringencia de Formamida 50% con solución de Denhardt 5X,
SDS 0,5% y SSPE 1X, a 42ºC, y que dirige un mayor nivel de transcripción en tejidos vegetales andrógenos que en
algunos tejidos, o que en todos los demás tejidos de la planta;
(d) un fragmento de una secuencia de SEC. ID. Nº: 1 o 2, que dirige un mayor nivel de transcripción en tejidos
vegetales andrógenos que en algunos tejidos, o que en todos los demás tejidos de la planta o;
(e) una región reguladora preferida de tejido andrógeno de la secuencia de SEC. ID. Nº:1 o 2 que dirige un mayor
nivel de transcripción en tejidos andrógenos que en algunos tejidos, o que en todos los demás tejidos de una planta;
ligada a un promotor principal.
35
40
45
50
55
Es un objetivo de la presente invención el proporcionar un método para la expresión de genes exógenos de forma
preferida en tejidos andrógenos, utilizando un vector de expresión que confiera expresión preferida de tejidos andrógenos a un gen exógeno. Este proceso puede ser utilizado como restaurador (como en un sistema de androesterilidad)
o, de otra forma, para impactar en la fertilidad, como en la producción de semillas híbridas. Es un objetivo adicional
de esta invención el proporcionar una región reguladora de ADN que confiera expresión génica preferida de tejido
andrógeno. Es también un objetivo de esta invención el proporcionar una región reguladora preferida de tejido andrógeno, o aquéllas con identidad de secuencia con la misma, preferiblemente de alrededor del 70%, 75%, u 80%, más
preferiblemente de alrededor del 85%, o del 90%, y más preferiblemente de alrededor del 95% o del 99%.
Es un objetivo de esta invención el proporcionar una secuencia de ácido nucléico aislada codificadora de las regiones reguladoras preferidas de tejido andrógeno Ms45.
Es un objetivo de esta invención el proporcionar una secuencia de ácido nucléico aislada codificadora de una
región reguladora preferida de tejido andrógeno Ms45 procedente de Zea mays, comprendiendo una secuencia de ácido
nucléico mostrada en la SEC. ID. Nº: 1, o aquéllas con identidad de secuencia con la misma. Es también un objetivo de
esta invención el proporcionar una secuencia de ácido nucléico aislada codificadora de una región reguladora preferida
de tejido andrógeno Ms45 procedente del Zea mays, comprendiendo una secuencia de ácido nucléico mostrada en la
SEC. ID. Nº: 2, o aquéllas con identidad de secuencia con la misma.
Es un objetivo de esta invención el proporcionar un vector de expresión recombinante, comprendiendo la secuencia
de ácido nucléico aislada mostrada en la SEC. ID. Nº: 1, o aquéllas con identidad de secuencia con la misma, ligado de
manera operativa con una secuencia de nucleótido codificadora de un gen exógeno, de tal forma que dicha secuencia
de nucleótido es expresada de forma preferida en tejido andrógeno, de tal manera que promueve la expresión del gen
exógeno.
60
Es un objetivo de esta invención el proporcionar un gen exógeno, en donde dicho gen exógeno es el Ms45.
65
Es un objetivo de esta invención el proporcionar un método de producción de una planta transformada que exprese
una secuencia de nucleótido exógena de forma preferida en tejido andrógeno, comprendiendo las fases de introducción
en una planta de dicha secuencia de nucleótido exógena ligada operativamente con una región reguladora preferida
de tejido andrógeno comprendiendo una secuencia de nucleótido que es mostrada en la SEC. ID. Nº: 1, o aquéllas
con identidad de secuencia con la misma. El método en donde dicha fase de introducción puede ser llevada a cabo
por medio de bombardeo con microproyectiles, puede utilizar Agrobacterium o un vector de transferencia compren3
ES 2 236 915 T3
diendo un plásmido Ti. Asimismo, puede existir más de una copia de dicha secuencia de nucleótido exógena ligada
operativamente a una región reguladora preferida de tejido andrógeno.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Es un objetivo de esta invención el proporcionar un método en donde dicha región reguladora se exprese de forma preferente en tejido andrógeno, en tejidos seleccionados de entre el grupo consistente en polen, tapete, antera,
inflorescencia, células madre del polen y micrósporas.
Es un objetivo de esta invención el proporcionar una planta transformada expresora de una secuencia de nucleótido
exógena de manera preferida en tejido andrógeno, poseyendo una secuencia de nucleótido exógena ligada operativamente a una región reguladora preferida de tejido andrógeno mostrada en la SEC. ID. Nº: 1, o aquéllas con identidad
de secuencia con la misma. Dicha planta es una monocotiledónea o una dicotiledónea. Puede ser utilizada cualquier
planta capaz de ser transformada, incluyendo, por ejemplo, el maíz, el girasol, la soja, el trigo, la cánola, el arroz y el
sorgo. Esta invención proporciona también el tejido transformado de la planta transformada. Como ejemplo, el tejido
puede ser polen, espigas, óvulos, anteras, inflorescencias, estambres, pistilos y células vegetales. La planta transformada puede contener más de una copia de dicha secuencia de nucleótido exógena ligada operativamente a una región
reguladora preferida de tejido andrógeno.
Es un objetivo de esta invención el proporcionar un método para mediar la fertilidad en una planta, en donde la
región reguladora preferida de tejido andrógeno expresa dicha secuencia de nucleótido exógena de tal forma que la
fertilidad se ve afectada. Esta secuencia de nucleótido exógena puede ser cualquier secuencia que afecte la androfertilidad, y puede ser, como ejemplo, una unidad nucleótida complementaria codificadora de tales moléculas antisentido,
como el ARN antisentido calasa, el ARN antisentido barnasa y el ARN antisentido chalcona sintasa, el ARN antisentido Ms45, o ribozimas y secuencias guía externas, o aptámeros o nucleótidos de hebra sencilla. La secuencia
de nucleótido exógena puede codificar también auxinas, rolB, citotoxinas, la toxina de la difteria, metilasa DAM,
avidina, o puede ser seleccionada de entre un sistema regulador procariótico. Además, esta secuencia de nucleótido exógena es un gen de androesterilidad o el gen estructural Ms45, y esta planta es una monocotiledónea o una
dicotiledónea.
Es un objetivo de esta invención el proporcionar un método para producir la semilla híbrida, comprendiendo la
plantación en yuxtaposición de polinización cruzada, una planta androfértil y una planta androinfértil producidas conforme al método anterior, permitiendo que dicha polinización cruzada tenga lugar y recolectando la semilla resultante.
Las plantas pueden ser plantas de maíz.
Estos y otros objetivos son conseguidos, conforme a una realización de la presente invención, por medio del
suministro de una molécula de ADN asilada, en donde la molécula de ADN comprende una secuencia de nucleótido
mostrada en la SEC. ID. Nº: 1.
Conforme a una realización adicional de la presente invención, ha sido proporcionado un vector de expresión
comprendiendo un gen exógeno, en donde la expresión del gen exógeno se encuentra bajo el control de una región reguladora preferida de tejido andrógeno, y donde el producto del gen exógeno tiene efecto sobre la androfertilidad.
Conforme a una realización adicional de la presente invención, ha sido proporcionado un método de utilización de
tal vector de expresión para producir una planta androestéril, comprendiendo la fase de introducción de un vector de
expresión en las células vegetales, en donde el gen exógeno del vector de expresión puede ser una unidad nucleotídica
complementaria, como las moléculas antisentido (ARN antisentido calasa, ARN antisentido barnasa y ARN antisentido chalcona sintasa, ARN antisentido Ms45), ribozimas y secuencias guía externas, un aptámero o nucleótidos de
hebra sencilla. La secuencia de nucleótido exógena puede codificar también auxinas, rolB, citotoxinas, la toxina de la
difteria, metilasa DAM, avidina, o puede ser seleccionada de entre un sistema regulador procariótico.
50
Conforme con una realización adicional de la presente invención, ha sido proporcionado un método de utilización
de una región reguladora preferida de tejido andrógeno para producir una planta híbrida androfértil, comprendiendo
las fases de:
55
a) producción de una primera planta androestéril progenitora, comprendiendo un vector de expresión que
comprende una región reguladora preferida de tejido andrógeno y un primer gen exógeno, en donde la
región reguladora preferida de tejido andrógeno controla la expresión del primer gen exógeno, y en donde
el producto del primer gen exógeno interrumpe la androfertilidad,
60
b) producción de una segunda planta progenitora, comprendiendo un vector de expresión que comprende un
segundo gen exógeno, en donde la región reguladora controla la expresión del segundo gen exógeno de tal
forma que puede ser expresado en tejidos andrógenos;
65
c) fertilización cruzada de la primera progenitora con la segunda progenitora para producir una planta híbrida,
en donde los tejidos andrógenos de la planta híbrida expresan el segundo gen exógeno, y en donde el
producto del segundo gen exógeno evita la interrupción de la función de inflorescencia por medio del
producto del primer gen exógeno, produciendo de este modo una planta híbrida androfértil.
4
ES 2 236 915 T3
Conforme a una realización adicional de la presente invención, ha sido proporcionado un método de utilización de
una región reguladora preferida de tejido andrógeno para producir una planta híbrida androfértil, comprendiendo las
fases de:
5
10
15
a) producción de una primera planta androestéril progenitora, en donde es interrumpico un primer gen involucrado en la expresión de la androfertilidad;
b) producción de una segunda planta progenitora, comprendiendo un vector de expresión que comprende una
región reguladora preferida de tejido andrógeno y un gen exógeno, en donde la región reguladora preferida
de tejido andrógeno controla la expresión del gen exógeno de tal forma que puede ser expresado en tejidos
andrógenos y podría complementar funcionalmente la función del gen interrumpido en a);
c) fertilización cruzada de la primera progenitora con la segunda progenitora con el fin de producir una planta
híbrida, en donde los tejidos andrógenos de la planta híbrida expresan el gen exógeno, y en donde el
producto del gen exógeno evita la interrupción de la función de inflorescencia, produciendo de este modo
una planta híbrida androfértil.
Breve descripción de los dibujos
20
La Figura 1 es un diagrama del clon genómico Ms45 Ac 4.1 y de los sitios de restricción.
La Figura 2 es un mapa plásmido de PHP6045.
25
30
La Figura 3 es un autoradiograma de los productos de extensión del iniciador, indicando el comienzo de la transcripción de Ms45. Las bandas marcadas G, A, T, C, corresponden a las reacciones de secuencia con los dideoxinucleótidos ddGTP, ddATP, ddTTP, y ddCTP, respectivamente. Las bandas 1-4 corresponden a las reacciones de extensión
del iniciador con ARNm procedente de (1) inflorescencias, (2) hojas, (3) anteras, y (4) hojas.
La Figura 4 es un gráfico de barras ilustrando la especificidad de fase de la Región Reguladora Preferida de Tejido
Andrógeno Ms45.
La Figura 5 ilustra la especificidad de tejido, ilustrada por la falta de actividad en el tejido que no es andrógeno.
35
La Figura 6 muestra un gel de análisis Northern de ARNm procedente de antera hibridizado con el gen de androfertilidad Ms45.
La Figura 7 muestra los resultados de un análisis mutacional de caja TATA.
Explicación de la invención
40
45
A no ser que se definan de otra forma, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo
significado por el que son normalmente entendidos por cualquiera con unos conocimientos ordinarios en el campo
al que corresponde esta invención. Si no son mencionadas de otra forma, las técnicas empleadas o contempladas
aquí son metodologías estándar, de sobra conocidas para cualquiera con conocimientos ordinarios en este campo. Los
materiales, métodos y ejemplos son meramente ilustrativos y no limitadores.
En la descripción que sigue a continuación son utilizados extensivamente un número de términos. Las siguientes
definiciones son proporcionadas para facilitar el entendimiento de la invención.
50
55
60
65
1. Definiciones
Identidad o similaridad de secuencia, conforme es conocido en este campo, son las relaciones entre dos secuencias de polipéptidos o dos secuencias de polinucleótidos, conforme se determinan al comparar las secuencias. En este
campo, identidad significa también el grado de relación de secuencias entre dos secuencias de polipéptidos o de polinucleótidos, conforme es determinado por la correspondencia entre dos hebras de tales secuencias. Tanto la identidad
como la similaridad pueden ser fácilmente calculadas (Computational Molecular Biology; Lesk, A.M. ed.; Oxford
University Press, New York; (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects; Smith, D.W. ed.; Academic
Press, New York; (1993); Computer Analysis of Sequence Data (Part I); Griffin, A.M. y H.G. Griffin eds.; Humana
Press, New Jersey; (1994); von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology; Academic Press; (1987); y Sequence Analysis Primer; Gribskov, M. y J. Devereux eds.; M Stockton Press, New York; (1991)). Aunque existe un
número de métodos para medir la identidad y similaridad entre dos secuencias de polinucleótidos o de polipéptidos,
ambos términos son de sobra conocidos para los expertos en este campo (von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology; Academic Press; (1987); Sequence Analysis Primer; Gribskov, M. y J. Deveraux eds.; M Stockton
Press, New York; (1991); y Carillo, H., y D. Lipman, SIAM, J. Applied Math.; Vol. 48; pp. 1073; (1988)). Métodos
usualmente empleados para determinar la identidad o similaridad entre dos secuencias incluyen, aunque sin estar limitados a los mismos, aquéllos revelados en Carillo, H., y D. Lipman, SIAM J. Applied Math.; Vol. 48; pp. 1073; (1988).
Los métodos preferidos para determinar la identidad son diseñados para proporcionar la mayor correspondencia entre
las dos secuencias testadas. Los métodos para determinar la identidad y similaridad son codificados en programas
5
ES 2 236 915 T3
de ordenador. Los métodos de programas de ordenador preferidos para determinar la identidad y similaridad entre
dos secuencias incluyen, aunque sin estar limitados a los mismos, el paquete de programa GCG (Devereux, J., et al.,
Nucleic Acids Research; Vol. 12(1); pp. 387; (1984)), BLASTP, BLASTN, y FASTA (Atschul, S.F., et al., J. Molec.
Biol.; Vol. 215; pp. 403; (1990)).
5
10
El Tejido andrógeno consiste en tejidos preparados de colecciones de células que se encuentran implicadas directamente, o que ayudan, en la reproducción de los gametos andrógenos, tales como polen, tapete, antera, inflorescencia,
células madre del polen, y micrósporas. El tapete es el tejido en la antera en contacto más íntimo con las células
madre del polen y las micrósporas, y se encuentra probablemente implicado en la nutrición de los granos de polen
en crecimiento. Las células madre del polen experimentan dos divisiones meióticas que producen una tétrada de micrósporas haploides. Las micrósporas experimentan la maduración convirtiéndose en un grano de polen. El polen o
los granos de polen son gametofitos andrógenos maduros que pueden poseer la habilidad de fertilizar las plantas que
sean compatibles. La antera es esa porción del estambre en la cual es producido el polen, lo que queda del estambre
consistente en el filamento, del cual la antera depende. El estambre es el órgano andrógeno de la flor.
15
20
25
La región reguladora preferida de tejido andrógeno es una secuencia de nucleótido que dirige un mayor nivel de
transcripción de un gen asociado en los tejidos andrógenos que en otros tejidos, o que en todos los demás tejidos de la
planta. Por ejemplo, el gen Ms45, aquí descrito, es detectado en las anteras durante las fases de tétrada, liberación de la
tétrada y los estadios uninucleados tempranos de desarrollo. Para detalles relacionados con los estadios del desarrollo
de la antera ver Chang, M.T. y M.G. Neuffer, “Maize Microsporogenesis”; Genome; Vol. 32; pp. 232-244; (1989). La
región reguladora preferida de tejido andrógeno del gen Ms45 dirige la expresión de un gen ligado operativamente
en los tejidos andrógenos. Los tejidos preferidos de expresión son andrógenos, no por ejemplo el tejido de la raíz o
del coleóptilo. La expresión predomina en los tejidos andrógenos como por ejemplo, aunque sin estar limitada a los
mismos, el polen, el tapete, la antera, la inflorescencia, las células madre del polen y las micrósporas. Esta expresión
preferida de tejido andrógeno se refiere a niveles mayores de expresión en tejidos andrógenos, pero no necesariamente
a la exclusión de otros tejidos.
Mediar es influir de una forma positiva o negativa, o influir en el resultado, como por ejemplo con la fertilidad o
con cualquier otro rasgo.
30
La androfertilidad se ve afectada cuando se experimenta una fertilidad que no es la normal; esta puede ser una
fertilidad reducida o incrementada, o una fertilidad que sea diferente en términos de tiempo o de otras características.
35
40
45
Aislado significa alterado “por mano del hombre” de su estado natural; es decir, que, si tiene lugar en la naturaleza,
ha sido cambiado o separado de su medio original, o ambas cosas. Por ejemplo, un polinucleótido que se forma de
manera natural o un polipéptido presente de manera natural en un organismo vivo en su estado natural no se encuentra
“aislado”, pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural
se encuentra “aislado”, conforme el término es empleado aquí. Por ejemplo, con respecto a los polinucleótidos, el
término aislado significa que se encuentra separado del cromosoma y de la célula en la cual se forma. Como parte
del aislamiento o siguiendo el mismo, tales polinucleótidos pueden ser unidos a otros polinucleótidos, tales como
ADNs, para mutagénesis, con el fin de formar proteínas fusionadas, y para la propagación o expresión en un huésped,
por ejemplo. Los polinucleótidos aislados, sólos o unidos a otros polinucleótidos tales como vectores, pueden ser
introducidos en células huésped, en cultivo o en organismos completos. Introducidos en células huésped en cultivo
o en organismos completos, tales ADNs aún pueden ser aislados, conforme el término es utilizado aquí, porque no
se encontrarían en su forma natural o en su ambiente. De forma similar, los polinucleótidos y polipéptidos pueden
formarse en una composición, como las formulaciones en medio, soluciones para la introducción de polinucleótidos
o polipéptidos, por ejemplo, en células, composiciones o soluciones para reacciones químicas o enzimáticas, por
ejemplo, las cuales no son composiciones que se originen de manera natural y, en esto consisten los polinucleótidos o
polipéptidos aislados dentro del significado de ese término, conforme es empleado aquí.
50
Un gen exógeno se refiere en la presente descripción a una secuencia de ADN que es introducida o reintroducida
en un organismo. Por ejemplo, cualquier gen, incluso el gen estructural Ms45, es considerado como un gen exógeno
si el gen es introducido o reintroducido en el organismo.
55
60
2. Aislamiento de una Región Reguladora Preferida de Tejido Andrógeno
Aunque los promotores y genes específicos de la antera, activos en tejidos andrógenos son conocidos en este campo,
(McCormick, et al., “Anther-Specific Genes: Molecular Characterization and Promoter Analysis in Transgenic Plants”,
in Plant Reproduction: From Floral Induction to Pollination; Lord, et al., eds.; pp. 128-135; (1989); Scott, et al.,
International Application Publication No. WO 92/11379 (1992); van der Meer, et al., The Plant Cell; Vol. 4; pp. 253;
(1992)), no existen principios ni criterios estructurales generalmente aceptados para el reconocimiento de secuencias
de ADN que confieran expresión de tejidos andrógenos a la expresión génica en el maíz. Consecuentemente, no es
posible el aislar una región reguladora preferida de tejido andrógeno directamente de una librería genómica de maíz
por medio de escrutinio para lograr una secuencia de consenso que confiera expresión preferida de tejido andrógeno.
65
Por ejemplo, la hibridización de tales secuencias puede ser llevada a cabo bajo condiciones de astringencia reducida, media o incluso condiciones altamente astringentes (por ejemplo, condiciones representadas por un lavado
de astringencia de Formamida 35-40% con solución de Denhardt 5X, SDS 0,5%, y SSPE 1X a 37ºC; condiciones
6
ES 2 236 915 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
representadas por un lavado de astringencia de Formamida 40-45% con solución de Denhardt 5X, SDS 0,5%, y SSPE
1X a 42ºC; y condiciones representadas por un lavado de astringencia de Formamida 50% con solución de Denhardt
5X, SDS 0,5%, y SSPE 1X a 42ºC, respectivamente). Una astringencia media en una hibridización estándar de ácidos nucléicos sería útil a la hora de identificar las regiones reguladoras preferidas de tejido andrógeno aquí descritas,
así como otros genes (ver, por ejemplo, Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual; Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; (1982)). Por lo general, las secuencias que codifican una región
reguladora preferida de tejido andrógeno poseerán identidad de secuencia con ella de preferiblemente el 70%, 75%, u
80%, más preferiblemente del 85%, o del 90%, y más preferiblemente del 95% o del 99%.
Los métodos se encuentran fácilmente disponibles en este campo para la hibridización de secuencias de ácido
nucléico. El escrutinio de la hibridización de librerías de ADN en placas (ver, por ejemplo, Sambrook, J., et al.,
Molecular Cloning: a Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; (1982)) o
la amplificación de secuencias codificadoras utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (ver, por ejemplo, Innis,
et al., PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications; Academic Press; (1990)) son técnicas muy conocidas
para el aislamiento del ADN genómico.
Las regiones reguladoras pueden ser identificadas en los subclones genómicos utilizando análisis funcional, usualmente verificado por medio de la observación de la expresión del gen reportero en tejido de antera, y la reducción o
ausencia de la expresión del gen reportero en los tejidos que no son de antera. Este enfoque general se ve ilustrado en el
Ejemplo 3, más abajo. La posibilidad de que las regiones reguladoras se encuentren “upstream” (aguas arriba) o hacia
la posición 5’ del sitio de comienzo de la transcripción puede ser testada por medio del subclonaje de un fragmento
de ADN que contenga la región “upstream” y subclonando pequeños fragmentos en vectores de expresión para experimentos de expresión transitoria. Se espera que fragmentos más pequeños puedan contener regiones esenciales para
la expresión preferida de tejido andrógeno. Por ejemplo, las regiones esenciales de los promotores CaMV 19S y 35S
han sido identificadas en fragmentos relativamente pequeños derivados de piezas genómicas más grandes, conforme
es descrito en la Patente Americana Nº 5.352.605.
Por lo general, las secuencias que codifican una región reguladora preferida de tejido andrógeno poseerán identidad
de secuencia con la misma preferiblemente del 70%, 75%, u 80%, más preferiblemente del 85%, o del 90%, y más
preferiblemente del 95% o del 99%.
El análisis de deleción pueden tener lugar desde ambos extremos 5’ y 3’ de la región reguladora: los fragmentos
pueden ser obtenidos por medio de mutagénesis por búsqueda de ligando, mutagénesis utilizando la reacción en cadena
de la polimerasa, y similares (Directed Mutagenesis: A Practical Approach; IRL Press; (1991)). Las deleciones 3’
pueden delinear la región reguladora preferida de tejido andrógeno e identificar el extremo 3’ de tal forma que esta
región esencial puede ser entonces ligada operativamente a un promotor principal de elección. Una vez que la región
esencial es identificada, la transcripción de un gen exógeno puede ser controlada por medio de la región preferida de
tejido andrógeno del Ms45 más un promotor principal. El promotor principal puede ser cualquiera de los promotores
principales conocidos, como un promotor del Virus de Mosaico de la Coliflor 35S o 19S (Patente Americana Nº
5.352.605), Ubiquitin (Patente Americana Nº 5.510.474), el promotor principal IN2 (Patente Americana Nº 5.364.
780), o un promotor del Virus de Mosaico Figwort (Gruber, et al., “Vectors for Plant Transformation” in Methods in
Plant Molecular Biology and Biotechnology; Glick, et al. eds.; CRC Press; pp. 89-119; (1993)). Preferiblemente, el
promotor es el promotor principal de un gen preferido de tejido andrógeno o el promotor principal CaMV 35S. Más
preferiblemente, el promotor es un promotor de un gen preferido de tejido andrógeno y, en particular, el promotor
principal del Ms45.
Un análisis mutacional adicional puede introducir modificaciones de funcionalidad, como por ejemplo en los niveles de expresión, en el momento de la expresión o en el tejido de expresión. Las mutaciones pueden ser silenciosas
y no tener un efecto observable.
50
3. Inserción de la región en un vector de expresión
55
60
La selección de un vector de expresión adecuado, con el cual se teste la expresión funcional, dependerá del huésped
y del método de introducción del vector de expresión en el huésped, y tales métodos son de sobra conocidos para un
experto en este campo. Para las eucariotas, las regiones en el vector incluyen las regiones que controlan la iniciación
de la transcripción y que controlan el proceso. Estas regiones se encuentran ligadas operativamente a un gen reportero
como el gen β-glucuronidasa (GUS) o la luciferasa. Descripciones generales y ejemplos de vectores de expresión en
plantas y de genes reporteros pueden ser encontrados en Gruber, et al., “Vectors for Plant Transformation” en “Methods
in Plant Molecular Biology and Biotechnology”; Glick, et al. eds; CRC Press; pp. 89-119; (1993). Los vectores de
expresión Gus y los casetes génicos Gus se encuentran disponibles comercialmente en Clonetech, Palo Alto, CA,
mientras que los vectores de expresión de luciferasa y los casetes génicos de luciferasa se encuentran disponibles en
Promega Corporation, Madison, WI. Los plásmidos Ti y otros vectores de Agrobacterium son descritos en Ishida,
Y., et al., Nature Biotechnology; Vol. 14; pp. 745-750; (1996) y en la Patente Americana Nº 5.591.616 Method for
Transforming Monocotyledons, registrada el 3 de mayo de 1994.
65
Los vectores de expresión conteniendo regiones reguladoras putativas localizadas en fragmentos genómicos pueden
ser introducidos en tejidos intactos tales como las anteras en sus distintas fases, embriones o en el callo. Los métodos
para la introducción del ADN incluyen el bombardeo con microproyectiles, inyección de ADN, electroporación y
7
ES 2 236 915 T3
5
transferencia génica mediada por Agrobacterium (ver Gruber, et al., “Vectors for Plant Transformation”, en Methods in
Plant Molecular Biology and Biotechnology; Glick, et al. eds.; CRC Press; (1993), la Patente Americana Nº 5.591.616
Method for Transforming Monocotyledons, registrada el 3 de mayo de 1994, e Ishida, Y., et al., Nature Biotechnology;
Vol. 14; pp. 745-750; (1996)). Métodos generales de cultivo de tejidos vegetales se encuentran en Gruber, et al.,
“Vectors for Plant Transformation”, en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology; Glick, et al. eds.;
CRC Press; (1993).
15
Para el sistema de ensayo transitorio, anteras en las distintas fases aisladas son colocadas de forma inmediata
en medio de cultivo de inflorescencia (Pareddy, D.R. y J.F. Petelino, Crop Sci. J.; Vol. 29; pp. 1564-1566; (1989))
solidificadas con Phytagel 0,5% (Sigma, St. Louis) u otros medios solidificantes. El vector de expresión de ADN es
introducido a las 5 horas, preferiblemente por medio de liberación mediada por microproyectil con 1,2 µ de partículas
a 1000-1100 Psi. Después de la introducción del ADN, las anteras son incubadas a 26ºC sobre el mismo medio de
cultivo de inflorescencia durante 17 horas y fueron analizadas por medio de la preparación de un tejido completo
homogéneo y ensayando para testar la actividad de GUS o de la luciferasa (ver Gruber, et al., “Vectors for Plant
Transformation”, en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology; Glick, et al. eds.; CRC Press; (1993)).
20
Los métodos anteriormente descritos han sido utilizados para identificar secuencias de ADN que regulan la expresión génica de forma preferida en tejidos andrógenos. Tal región ha sido identificada como la región reguladora
preferida de tejido andrógeno Ms45 completa (SEC. ID. Nº: 1). Es identificada en la SEC. ID. Nº: 2 una mutación de
caja TATA con identidad de secuencia con la región reguladora preferida de tejido andrógeno Ms45 completa.
10
De esta forma, la presente invención comprende una molécula de ADN poseyendo una secuencia de nucleótido de
SEC. ID. Nº: 1 (o aquéllas con identidad de secuencia), y teniendo la función de una región reguladora preferida de
tejido andrógeno.
25
Una caja TATA putativa puede ser identificada por medio de análisis de extensión de iniciador, conforme es descrito
en el Ejemplo 2, más abajo, o en Current Protocols in Molecular Biology; Ausubel, F.M., et al., eds.; John Wiley and
Sons, New York; pp. 4.8.1-4.8.5; (1987).
30
35
40
45
50
55
4. Utilización de una región reguladora preferida de tejido andrógeno para el Control de la Fertilidad
Un objetivo de la presente invención es el proporcionar un medio para controlar la fertilidad utilizando una región
reguladora preferida de tejido andrógeno. De manera importante, esta región reguladora preferida de tejido andrógeno
puede controlar la expresión de un gen exógeno en las anteras desde la fase de desarrollo de tétrada a través de
la uninucleada temprana. El significado práctico de esta sincronización es que la expresión de un gen inductor de
esterilidad durante este estadio de desarrollo interrumpirá la maduración de la antera lo suficientemente pronto como
para permitir la verificación visual de la función del sistema inductor de esterilidad en el campo. Puede reducir también
la posibilidad de que tengan lugar “breakers” (anteras que desprenden polen). De esta forma, los efectos del gen
inductor de esterilidad serían evidentes en el campo de la producción en un estadio de desarrollo lo suficientemente
temprano como para permitir, bien manualmente o mecánicamente, el despendonar cualquier “escapado fértil” que
resulte de una rotura parcial o total del sistema inductor de esterilidad.
Un enfoque para controlar la androfertilidad es el manipular la expresión génica en el tapete. El tapete es una capa
de células que rodea a las células microsporogénicas en la antera y que probablemente proporciona nutrientes, tales
como azúcares reductores, aminoácidos y lípidos a las micrósporas en desarrollo (Reznickova, C.R., Acad. Bulg. Sci.;
Vol. 31; pp. 1067; (1978); Nave, et al., J. Plant Physiol.; Vol. 125; pp. 451; (1986); Sawhney, et al., J. Plant Physiol;
Vol. 125; pp. 467; (1986)). Se ha descubierto que el Ms45 es altamente expresado en la capa tapetal. Las células
tapetales producen también β(1,3)-glucanasa (“calasa”), la cual promueve la liberación de la micróspora (Mepham,
et al., Protoplasma; Vol. 70; pp. 1; (1970)). Por lo tanto, existe una relación delicada entre el tapete y las células
microsporogénicas, y cualquier interrupción de la función tapetal es probable que dé como resultado granos de polen
disfuncionales. De hecho, se sabe que lesiones en la biogénesis tapetal dan como resultado mutantes androestériles
(Kaul, “Male Sterility in Higher Plants” en Monographs on Theoretical and Applied Genetics; Frankel et al. eds.;
Springer Verlag; Vol. 10; pp. 15-95; (1988)). Una aparición prematura o tardía de la calasa durante el desarrollo
tapetal se asocia también con ciertos tipos de androesterilidad (Warmke, et al., J. Hered.; Vol. 63; pp. 103; (1972)).
Por lo tanto, el gen de la calasa puede ser utilizado para interrumpir la función de tejido andrógeno. Scott, et al., PCT
WO 93/02197 (1993), revela la secuencia de nucleótido de una calasa específica tapetal. De esta forma, puede ser
inducido un fallo de las micrósporas para convertirse en granos de polen maduros utilizando una molécula de ADN
recombinante que comprenda un gen capaz de interrumpir la función tapetal bajo el control de secuencias reguladoras
específicas tapetales.
60
65
Un enfoque general para impactar en la androfertilidad es el construir un vector de expresión, en el cual la región
reguladora preferida de tejido andrógeno se encuentre ligada operativamente a una secuencia de nucleótido que codifique una proteína capaz de interrumpir la función del tejido andrógeno, dando como resultado la infertilidad. Proteínas
capaces de interrumpir la función del tejido andrógeno incluyen a las proteínas que inhiben la síntesis de macromoléculas que son esenciales para la función celular, enzimas que degradan las macromoléculas que son esenciales para la
función celular, proteínas que alteran la biosíntesis o el metabolismo de las hormonas vegetales, proteínas estructurales, proteínas expresadas inapropiadamente y proteínas que inhiben una función específica de los tejidos andrógenos.
8
ES 2 236 915 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Por ejemplo, puede ser construido un vector de expresión en el cual la región reguladora preferida de tejido andrógeno se encuentre ligada operativamente a una secuencia de nucleótido que codifique un inhibidor de síntesis
proteínica, la cual podría ser, aunque sin estar limitada a la misma, una citotoxina. Por ejemplo, la toxina de la difteria
es un inhibidor de la síntesis proteínica en las eucariotas de sobra conocido. Pueden ser obtenidas moléculas de ADN
codificadoras del gen de la toxina de la difteria de American Type Culture Collection (Rockville, MD), ATCC Nº
39359 o ATCC Nº 67011 y ver Fabijanski, et al., E.P. Appl. Nº 90902754.2, “Molecular Methods of Hybrid Seed
Production” para ejemplos y métodos de utilización. La metilasa DAM, por ejemplo, es una enzima de sobra conocida
del Escherichia coli, la cual modifica el residuo de adenina en la secuencia 5’ GATC 3’ de N6 -metil-adenina. Cigan y
Albertsen describen cómo la metilasa DAM podría ser utilizada para impactar en la fertilidad en plantas transgénicas
(PCT/US95/15229 Cigan, A.M. y Albertsen, M.C., “Reversible Nuclear Genetic System for Male Sterility in Transgenic Plants”). Otro ejemplo de una proteína, la cual interrumpe la fertilidad es la avidina, conforme es ilustrado en la
Solicitud de Patente Americana Nº 08/475.582 “Induction of Male Sterility in Plants by Expression of High Levels of
Avidin” por Howard, J. y Albertsen, M.C..
De forma alternativa, puede ser conseguida la interrupción de la función tapetal utilizando secuencias de ADN que
codifiquen enzimas capaces de degradar una macromolécula biológicamente importante. Por ejemplo, Mariani, et al.,
Nature; Vol. 347; pp. 737; (1990), han demostrado que la expresión en el tapete tanto de la RNasa-T1 del Aspergillus
oryzae como de la RNasa del Bacilluis amyloliquefaciens, llamada “barnasa”, indujo la destrucción de las células
tapetales, dando como resultado androinfertilidad. Quaas, et al., Eur. J. Biochem.; Vol. 173; pp. 617; (1988), describen
la síntesis química de la RNasa-T1, mientras que la secuencia de nucleótido del gen de la barnasa es revelada en
Hartley, J. Molec. Biol.; Vol. 202; pp. 913; (1988).
Los genes de la RNasa-T1 y de la barnasa pueden ser obtenidos, por ejemplo, sintetizando los genes con oligonucleótidos largos mutuamente iniciadores. Ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology; Ausubel, F.M., et
al., eds.; John Wiley and Sons, New York; pp. 8.2.8 a 8.2.13; (1987). Ver también Wosnick, et al., Gene; Vol. 60; pp.
115; (1987). Además, técnicas actuales utilizando la reacción en cadena de la polimerasa proporcionan la habilidad de
sintetizar genes muy largos (Adang, et al., Plant Molec. Biol.; Vol. 21; pp. 1131; (1993); Bambot, et al., PCR Methods
and Applications; Vol. 2; pp. 266; (1993)).
En un enfoque alternativo, la producción de polen se ve inhibida al alterar el metabolismo de las hormonas vegetales, tales como las auxinas. Por ejemplo, el gen rolB del Agrobacterium rhizogenes codifica una enzima que interfiere
con el metabolismo de la auxina al catalizar la liberación de indoles libres de los indoxil-β-glucósidos. Estruch, et al.,
EMBO J.; Vol. 11; pp. 3125; (1991) y Spena, et al., Theor. Appl. Genet.; Vol. 84; pp. 520; (1992), han mostrado que
la expresión específica de la antera del gen rolB en el tabaco dio como resultado plantas con anteras encogidas, en las
cuales disminuyó de forma importante la producción del polen. Por lo tanto, el gen rolB es un ejemplo de un gen que
es útil para el control de la producción de polen. Slightom, et al., J. Biol. Chem.; Vol. 261; pp. 108; (1985), revelan la
secuencia de nucleótido del gen rolB.
Con el fin de expresar una proteína que interrumpa la función del tejido andrógeno, es construido un vector de
expresión, en el cual una secuencia de ADN codificadora de la proteína se encuentra ligada operativamente a secuencias de ADN que regulan la transcripción génica de manera preferente en tejido andrógeno. Son descritos más arriba
los requisitos generales de un vector de expresión, en el contexto de un sistema de expresión transitorio. Aquí, sin
embargo, el método preferido es introducir el vector de expresión en el tejido vegetal embrionario, de tal forma que
una proteína exógena será expresada en un estadio posterior de desarrollo de los tejidos andrógenos de la planta adulta. La estabilidad mitótica puede ser conseguida utilizando vectores virales vegetales que proporcionan replicación
epicromosomal.
Un método alternativo y preferido de obtención de estabilidad mitótica es proporcionado por la integración de
secuencias del vector de expresión en el cromosoma huésped. Tal estabilidad mitótica puede ser proporcionada por
medio de la administración por microproyectil de un vector de expresión en el tejido embriónico (Gruber, et al.,
“Vectors for Plant Transformation”, en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology; Glick, et al. eds.;
CRC Press; (1993)).
La metodología de transformación puede ser encontrada para muchas plantas, incluyendo, aunque sin estar limitadas a las mismas, el girasol, la soja, el trigo, la cánola, el arroz y el sorgo (Knittel, N., et al., J. Plant Cell Rep.;
Springer International, Berlin, W. Germany; Vol. 14(2/3); pp. 81-86; (1994); Chee, P.P. et al., Plant Physiol.; American Society of Plant Physiologists, Rockville, MD; Vol. 91(3); pp. 1212-1218; (1989); Hadi, M.Z., et al., J. Plant
Cell Rep.; Springer International, Berlin, W. Germany; Vol. 15(7); pp. 500-505; (1996); Perl, A., et al., Molecular and
General Genetics; Vol. 235(2-3); pp. 279-284; Zaghmout, O.M.F. y N.L. Trolinder, Nucleic Acids Res.; IRL Press,
Oxford; Vol. 21(4); pp. 1048; (1993); Chen, J.L. y W.D. Beversdorf, Theor. Appl. Genet.; Springer International, Berlin, W. Germany; Vol. 88(2); pp. 187-192; (1994); Sivamani, E., et al., Plant Cell Rep.; Springer International, Berlin,
W. Germany; Vol. 15(5); pp. 322-327; (1996); Hagio, T., et al., Plant Cell Rep.; Vol. 10(5); pp. 260-264; (1991)) y son
también conocidas por aquéllos expertos en este campo.
Con el fin de seleccionar células transformadas, el vector de expresión contiene un gen marcador seleccionable,
como un gen de resistencia a herbicida. Por ejemplo, tales genes pueden conferir resistencia a la fosfinotricina, glifosata, sulfonilureas, atrazina, imidazolinona o kanamicina. Aunque el vector de expresión puede contener secuencias
de ADNc codificando una proteína exógena bajo el control de una región reguladora preferida de tejido andrógeno,
9
ES 2 236 915 T3
así como el gen marcador seleccionable bajo control del promotor constitutivo, el gen marcador seleccionable puede
ser administrado también a células huésped en un vector de expresión de selección distinto. Tal “co-transformación”
de tejido embriónico con un vector de expresión test conteniendo una región reguladora preferida de tejido andrógeno
y un vector de expresión de selección es ilustrada más abajo.
5
5. Inducción de Esterilidad
10
15
20
En un enfoque alternativo, la androesterilidad puede ser inducida por medio de la utilización de un vector de expresión, en el cual la región reguladora preferida de tejido andrógeno se encuentra ligada operativamente a una secuencia
de nucleótido que codifica una unidad nucleotídica complementaria. La unión de moléculas de ácido nucléico complementarias con una molécula diana puede ser seleccionada para que la misma sea inhibidora. Por ejemplo, si la diana es
una molécula de ARNm, entonces la unión de una unidad nucleótida complementaria -en este caso un ARN- da como
resultado la hibridización y detención de la traducción (Paterson, et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci.; Vol. 74; pp. 4370;
(1987)). De esta forma, una molécula de ARN antisentido adecuada, como una complementaria del Ms45 (Patente
Americana Nº 5.478.369), tendría una secuencia que es complementaria a la de una especie de ARNm codificando
una proteína necesaria para la androesterilidad (Fabijanski en “Antisense Gene Systems of Pollination Control For
Hybrid Seed Production”, Solicitud de Patente Americana Nº 08/288.734).
Por ejemplo, la producción del ARN antisentido calasa inhibiría la producción de la enzima calasa, la cual es
esencial para la liberación de la micróspora. Además, la androesterilidad puede ser inducida por medio de la inhibición
de la biosíntesis del flavonoide, utilizando un vector de expresión que produzca ARN antisentido para la región 3’ no
traducida del gen A de la chalcona sintasa (Van der Meer, et al., The Plant Cell; Vol. 4; pp. 253; (1992)). El clonado
y caracterización del gen A de la chalcona sintasa es revelado por Koes, et al., Gene; Vol. 81; pp. 245; (1989), y por
Koes, et al., Plant Molec. Biol.; Vol. 12; pp. 213; (1989).
25
30
35
40
45
De forma alternativa, puede ser construido un vector de expresión en el cual la región reguladora preferida de
tejido andrógeno se encuentre ligada operativamente a una secuencia de nucleótido que codifique una ribozima. Las
ribozimas pueden ser diseñadas de tal forma que expresen actividad endonucleasa, que es dirigida a una cierta secuencia diana en una molécula de ARNm. Por ejemplo, Steinecke, et al., EMBO J.; Vol. 11; pp. 1525; (1992), consiguió
hasta un 100% de inhibición de la expresión génica de la neomicina fosfotransferasa por medio de ribozimas en los
protoplastos de tabaco. Más recientemente, Perriman, et al., Antisense Research and Development; Vol. 3; pp. 253;
(1993), inhibió la actividad de la cloramfenicol acetil transferasa en protoplastos de tabaco, utilizando un vector que
expresaba una ribozima “cabeza de martillo” modificada. En el contexto de la presente invención, las moléculas de
ARN diana adecuadas para las ribozimas incluyen a las especies de ARNm que codifican proteínas esenciales para la
androfertilidad, tales como la ARNm calasa y la ARNm Ms45.
En un enfoque alternativo adicional pueden ser construidos vectores de expresión, en los cuales una región reguladora preferida de tejido andrógeno dirija la producción de transcritos de ARN capaces de promover el clivaje
mediado por la RNasa P de moléculas diana de ARNm. Conforme a este enfoque, puede ser construida una secuencia
guía externa para dirigir la ribozima endógena, RNasa P, a una especie en particular de ARNm intracelular, el cual es
clivado a continuación por la ribozima celular (Patente Americana Nº 5.168.053; Yuan, et al., Science; Vol. 263; pp.
1269; (1994)). Preferiblemente, la secuencia guía externa comprende una secuencia de diez a quince nucleótidos complementaria de una especie de ARNm que codifica una proteína esencial para la androfertilidad, y una secuencia de
nucleótido 3’-RCCA, en donde R es preferiblemente una purina. Los transcritos de la secuencia guía externa se unen a
la especie diana de ARNm por medio de la formación de pares de bases entre el ARNm y las secuencias guía externas
complementarias, promoviendo de esta forma el clivado del ARNm por la RNasa P en el nucleótido localizado en el
lado 5’ de la región de bases pareadas.
55
Otro enfoque alternativo es el utilizar tecnología de aptámeros, donde la unidad nucleotídica complementaria es
un nucleótido que sirve como un ligando a una molécula diana especificada (Patente Americana Nº 5.472.841). Esta
diana podría ser un producto esencial para la androfertilidad o un producto interruptor de la androfertilidad. Utilizando
este método, podría ser seleccionado un aptámero para la molécula diana, Ms45 o avidina, por ejemplo, que se uniría
e inhibiría la expresión de la diana. La secuencia de nucleótido codificadora del aptámero sería parte de vectores de
expresión construidos de tal forma que una región reguladora preferida de tejido andrógeno dirigiera la producción del
aptámero.
60
La esterilidad puede ser inducida también por medio de la interrupción de un gen importante para la androfertilidad, como el gen Ms45 o el Ms2 (Mark, G.M., et al., Nature; Vol. 363; pp. 715-717; (1993)). Los métodos para la
interrupción génica son de sobra conocidos en este campo, e incluyen, aunque sin estar limitados a los mismos, la
inserción de elemento transponible y la inducción a la mutación.
50
6. Restauración de la Androfertilidad en el Híbrido F1
65
Los métodos anteriormente descritos pueden ser utilizados para producir plantas de maíz androestériles transgénicas, para la producción de híbridos F1 en cruces dirigidos a gran escala entre líneas endogámicas. Si las células huevo
de las plantas androestériles transgénicas no contienen todas ellas el gen exógeno que interrumpe la función tapetal,
entonces una proporción de híbridos F1 tendrá un fenotipo androfértil. Por otra parte, los híbridos F1 poseerán un
fenotipo androestéril si el gen exógeno se encuentra presente en todas las células huevo de las plantas androestériles
10
ES 2 236 915 T3
transgénicas, porque la esterilidad inducida por el gen exógeno sería dominante. De esta forma, es deseable el utilizar
un sistema de restauración de androfertilidad con el fin de proporcionar la producción de híbridos F1 androfértiles. Tal
sistema de restauración de fertilidad posee un valor particular cuando el producto recolectado es la semilla o cuando
las cosechas son autopolinizadoras.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
También tal sistema de restauración de fertilidad posee un valor particular cuando la región reguladora preferida de
tejido andrógeno se encuentra ligada operativamente a un promotor inducible, como en WO 89/10396 (Marianai, et al.,
Plants with Modified Stamen Cells) y el promotor inducible responde ante controles externos. Esta región reguladora
preferida de tejido andrógeno ligada consiste en una región reguladora preferida de tejido andrógeno, un promotor
inducible y un gen exógeno.
Un enfoque a la restauración de la androfertilidad sería el cruzar plantas androestériles transgénicas con plantas
androfértiles transgénicas que contengan un gen de restauración de fertilidad bajo el control de una región reguladora
preferida de tejido andrógeno. Por ejemplo, Fabijanski en “Antisense Gene Systems of Pollination Control For Hybrid
Seed Production”, Solicitud de Patente Americana Nº 08/288.734, cruzó plantas androfértiles que expresaban un
inhibidor de la barnasa, llamado “barstar”, con plantas androestériles que expresaban barnasa. Hartley, J. Mol. Biol.;
Vol. 202; pp. 913; (1988), revela la secuencia nucleótida del barstar.
Otro enfoque sería el cruzar plantas androestériles conteniendo una disrupción en un gen esencial de androfertilidad con plantas androfértiles transgénicas conteniendo la región reguladora preferida de tejido andrógeno ligada
operativamente a una copia no interrumpida del gen de la fertilidad, como el gen Ms45 o el Ms2. La secuencia completa del gen Ms45 está contenida en la Patente Americana Nº 5.478.369, y la del Ms2 en Mark, G.M., et al., Nature;
Vol. 363; pp. 715-717; (1993).
De forma alternativa, la restauración de la androfertilidad puede ser conseguida por medio de la expresión de
unidades nucleotídicas complementarias, tales como toxinas, ribozimas o aptámeros en plantas androfértiles, con el fin
de neutralizar los efectos de la toxina en plantas androestériles. De esta forma, la androfertilidad puede ser restaurada
en los híbridos F1 al producir una planta transgénica androfértil que sintetice una especie particular de molécula de
ARN o polipéptido para contrarrestar los efectos del gen exógeno particular expresado en las plantas transgénicas
androestériles.
En un método alternativo de restauración de androfertilidad, plantas androestériles transgénicas contienen un vector de expresión que posee una región reguladora preferida de tejido andrógeno, una región reguladora procariótica (de
un sistema regulador procariótico), y un gen exógeno que es capaz de interrumpir la función tapetal. Son producidas
plantas androfértiles transgénicas que expresan un péptido procariótico bajo el control de una región reguladora preferida de tejido andrógeno. En los híbridos F1 resultantes del cruce androestéril y androfértil, el péptido procariótico
se une a la secuencia reguladora procariótica y reprime la expresión del gen exógeno, el cual es capaz de interrumpir
la androfertilidad. Una ventaja de este método de restauración de la fertilidad es que puede ser utilizada una forma de
planta androfértil transgénica para proporcionar fertilidad a los F1, sin tener en cuenta la identidad del gen exógeno
que fue utilizado para interrumpir la función tapetal en la planta androestéril transgénica.
Por ejemplo, el sistema de gen LexA/operador LexA puede ser utilizado para regular la expresión génica de conformidad con la presente invención. Ver Patente Americana Nº 4.833.080 y Wang, et al., Mol. Cell. Biol.; Vol. 13; pp.
1805, (1993). Más específicamente, el vector de expresión de la planta androestéril contendría la secuencia operadora
LexA, mientras que el vector de expresión de la planta androfértil contendría las secuencias codificadoras del represor
LexA. En el híbrido F1, el represor LexA se uniría a la secuencia operadora LexA e inhibiría la transcripción del gen
exógeno que codifica un producto capaz de interrumpir la androfertilidad. Estos incluirían, aunque sin estar limitados
a los mismos, la avidina, la metilasa DAM, la toxina de la difteria, la RNasa T, la barnasa, el rolB y la chalcona sintasa
A.
50
55
Las moléculas de ADN del operador LexA pueden ser obtenidas, por ejemplo, sintetizando fragmentos de ADN
que contengan la muy conocida secuencia operadora LexA. Ver, por ejemplo, la Patente Americana Nº 4.833.080 y
Garriga, et al., Mol. Gen. Genet.; Vol. 236; pp. 125; (1992). El gen LexA puede ser obtenido al sintetizar una molécula
de ADN codificando el represor LexA. Son expuestas más arriba las técnicas de síntesis génica y las secuencias del gen
LexA son descritas, por ejemplo, por Garriga, et al., Mol. Gen. Genet.; Vol. 236; pp. 125; (1992). De forma alternativa,
las moléculas de ADN codificando el represor LexA pueden ser obtenidas del plásmido pRB500, American Type
Culture Collection, accesión nº 67758. Aquéllos expertos en este campo pueden idear fácilmente otras estrategias
de restauración de la androfertilidad, utilizando sistemas reguladores procarióticos, tales como el sistema represor
lac/operon lac, o el sistema represor trp/operon trp.
60
7. Identificación de Partes Esenciales de la Región Reguladora
65
La identificación de las partes esenciales de una región reguladora puede ser llevada a cabo a través de la deleción,
inserción y/o substitución de nucleótidos en una región reguladora por medio de métodos de sobra conocidos para
alguien experto en este campo. Tales variantes pueden ser obtenidas, por ejemplo, por medio de mutagénesis dirigida
por oligonucleótido, de mutagénesis por búsqueda de ligando, y de mutagénesis utilizando la reacción en cadena de la
polimerasa (Directed Mutagenesis: A Practical Approach; IRL Press; (1991)).
11
ES 2 236 915 T3
5
10
Pueden ser construidas una serie de deleciones 5’ de una región reguladora utilizando sitios de restricción existentes. Los fragmentos de promotor resultantes pueden ser testados para determinar su actividad utilizando un vector de
expresión, conforme a lo expuesto previamente. Su refinamiento y delineación posteriores pueden ser obtenidos realizando cambios más pequeños - preferiblemente de alrededor de 50 o 30 nucleótidos, más preferiblemente de alrededor
de 20 o 10 nucleótidos y más preferiblemente de alrededor de 5 a 1 nucleótidos- hata el fragmento más pequeño de restricción que aún confiera expresión propia sobre el constructo reportero (Directed Mutagenesis: A Practical Approach;
IRL Press; (1991)). Estos pueden ser introducidos en el vector de expresión utilizando sitios de restricción introducidos o naturales. Una serie de deleciones 3’ pueden ser generadas también conforme es expuesto más arriba, o por
medio de PCR, o por medio de métodos de sobra conocidos por alguien experto en este campo (Directed Mutagenesis:
A Practical Approach; IRL Press; (1991)). Su refinamiento y delineación posteriores pueden ser obtenidos realizando
cambios más pequeños -preferiblemente de alrededor de 50 o 30 nucleótidos, más preferiblemente de alrededor de 20
o 10 nucleótidos y más preferiblemente de alrededor de 5 a 1 nucleótidos- hasta el fragmento más pequeño de restricción que aún confiera expresión propia sobre el constructo reportero (Directed Mutagenesis: A Practical Approach;
IRL Press; (1991)).
15
20
Por lo tanto, estas deleciones 5’ y 3’ delinearán la región mínima esencial para imitar el tejido y la expresión
temporal adecuados de la región reguladora más larga. Por lo general, las secuencias que codifican esta región mínima
de una región reguladora preferida de tejido andrógeno poseerán identidad de secuencia con la misma, preferiblemente
de alrededor del 70%, 75%, u 80%, más preferiblemente de alrededor del 85% o 90%, y más preferiblemente de
alrededor del 95% o 99%.
Lo que sigue es presentado como ilustración y no se pretende que limite el rango de la invención.
Ejemplo 1
25
Clonado y secuenciación genómicos del promotor Ms45
El marcaje Ac e identificación del ADNc del Ms45 y el análisis Northern son descritos en la Patente Americana
Nº 5.478.369.
30
35
40
45
50
Fue utilizado un ADNc parcial del Ms45 para el escrutinio de una librería genómica de maíz B73. Esta librería
fue preparada por medio del clonado de SAU3A1 parciales en un vector de clonaje genómico digerido por BAMHI
(Lambda Dash II, Stratagene, La Jolla, CA). Fueron escrutadas aproximadamente 1 x 106 placas utilizando como
huésped una cepa de E. coli adecuada para ADN genómico (ER1647, New England Biolabs, MA). El clon AC4.1 fue
purificado a homogeneidad después de tres rondas de escrutinio. El mapa de restricción del AC4.1 mostró que el clon
era de alrededor de 13 kb de longitud y que contenía dos sitios BAMHI internos (Figura 1). Uno de estos sitios fue
encontrado también en el ADNc parcial del Ms45. Los dos fragmentos BAMHI fueron subclonados en un vector de
clonaje (Bluescript SK+, Stratagene, La Jolla, CA). El clon de extremo 5’ era de alrededor de 3,5 kb de longitud y
correspondía a la secuencia “upstream” (aguas arriba) (5’) del sitio BAMHI interno. El clon de extremo 3’ era de 2,5
kb y contenía la secuencia Ms45 “downstream” (aguas abajo) del sitio BAMHI interno. Al mismo tiempo, fue aislado
y secuenciado un ADNc putativo del Ms45 completo. Fue identificado el sitio de inicio de la traducción putativo por
medio de la comparación de secuencias entre el clon de extremo 5’ y el ADNc del Ms45.
La secuenciación de la región promotora del Ms45 fue conseguida utilizando el método de terminación de cadena
o dideoxi, de Sanger, F. et al., “DNA Sequencing with Chain Termianting Inhibitors”; Proc. Nat’l. Acad. Sci.; Vol. 74;
pp. 5463-5467; (1977). Fue secuenciado el clon genómico pac4.1-5’ (Figura 1) utilizando el oligo universal u otros
que eran específicos de la secuencia, utilizando técnicas de sobra conocidas en este campo.
La región reguladora preferida de tejido andrógeno tenía un sitio NCOI introducido en el codón de iniciación,
y fue clonada como un fragmento NCOI en un vector de expresión sin promotor Luci. Este nuevo vector reportero
fue llamado plásmido PHP6045 (figura 2) ATCC Nº: 97828 (Depositada el 12 de diciembre de 1996; American Type
Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852).
Ejemplo 2
55
Ensayo de Extensión del Iniciador
60
Fue aislado el ARN completo procedente de inflorescencias de maíz conteniendo anteras desde la fase de tétrada
hasta la uninucleada temprana. El ARN completo fue precipitado con etanol y MgCl2 . Fue aislado un miligramo
del ARN completo y fue purificado el ARNm poli A+ utilizando celulosa oligo-dT. Fue aislado también ARN poli
A+ directamente procedente de brotes de hojas de maíz de 6 días de edad y de anteras de maíz, utilizando protocolos
conocidos por aquéllos expertos en este campo.
65
Fue preparada una escalera secuenciadora utilizando un oligonucleótido Ms45 de cadena sencilla e incorporando el
35S-dATP en un procedimiento secuenciador estándar, utilizando protocolos de sobra conocidos para alguien experto
en este campo.
La extensión del Iniciador fue realizada conforme al método mostrado más abajo:
12
ES 2 236 915 T3
I. El iniciador de oligonucleótido sintético marcador del extremo 5’
Combinado:
5
5 pmol iniciador N11916 (PHL11916) en 1,0 µl
5 µl (50 µCi) gamma 32P-ATP (>5000 Ci/mmol)
0,7 µl tampón de quinasa 10X
0,7 µl T4 polinucleótido quinasa
incubado a 37ºC, 45 min.
10
Diluido con 20 µl de TE y calentado hasta los 65ºC para inactivar la enzima.
15
20
Tampón de quinasa 10X
0,5M de Tris-HCl, pH 7,6-8,0
5mM de espermidina
100mM de MgCl2
100 mM de DTT
0,1 mg/ml de gelatina o BSA
Para preparar 1 ml
0,5 ml de 1M
0,05 ml de 0,1 M
0,1 ml de 1M
0,5 ml de 0,5M
50 µl de 2 mg/ml
0,1 ml de agua
II. Iniciador y ARN anillados
25
Los iniciadores de quinasa fueron anillados a ARNm procedente de inflorescencias de maíz, brotas de hojas de
maíz de 6 días de edad, anteras de maíz y hojas de maíz de 6 días de edad. Fueron mezclados juntos en hielo 2 µl de
ARNm, 1 µl de oligo quinasa, 2 µl de tampón de anillación 5X (1,25M de KCl, 10 mM de Tris, pH 7,9-8,15), y 1 µl
30 mM de vanadil. Se aumentó el volumen total hasta las 10 µl con 10mM de Tris, pH 8,15. Esta mezcla fue calentada
hasta los 65ºC y enfriada hasta los 55ºC en un período de 4 horas en un bloque térmico termociclador.
30
III. Extensión del iniciador
35
40
45
50
Fueron añadidas 23 µl de la mezcla de extensión del iniciador (ver receta más abajo) y 0,4 µl de transcriptasa
reversa (SuperScript, BRL, MD) a cada tubo. Esta fue mezclada por medio de pipeteado suave hacia arriba y hacia
abajo, y fue colocada inmediatamente a 48ºC e incubada durante 45 minutos. La Mezcla de Extensión del Iniciador
consiste en 10 mM de MgCl2 , 5 mM de DTT, 0,33 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP, dTTP y agua DEPC.
Fueron añadidas 300 µl de etanol y precipitadas en congelador a -20C durante toda la noche, a continuación fueron
nodulizadas durante 30 minutos en un microfuge. Los nódulos fueron secados en un Speed Vac y disueltos en 6 µl de
0,1 NaOH/1mM de EDTA. Los contenidos de los tubos fueron mezclados pipeteándolos y por vortex para asegurar
que los nódulos se disolvieran. Éstos fueron mantenidos a temperatura ambiente durante 2,5 horas, y fueron añadidas
6 µl de tinte secuenciador (solución de parada del kit secuenciador USB), y la solución fue desnaturalizada a aproximadamente 95ºC. La mitad de la muestra fue vertida en gel secuenciador de poliacrilamida desnaturalizado 6% con
tampón apilador y se tuvo a 55 vatios durante 2 horas. El gel fue secado en un secador de gel y fue expuesto a película
X-AR de Kodak. Después de una exposición de tres días, fue observado un producto de transcripción en la reacción de
extensión del iniciador de ARNm de inflorescencia de maíz, el cual correspondía a una deoxitimidina situada 42 nucleótidos aguas arriba del codón iniciador (Figura 3). Esta posición fue designada como +1. Fue identificado también
en -3 un comienzo de transcripción menor.
Ejemplo 3
Determinación del Estadio y Especificidad de Tejido de la Región Reguladora Preferida de Tejido Andrógeno Ms45
55
60
65
La región reguladora preferida de tejido andrógeno completa (SEC. ID. Nº: 1) fue fusionada al gen reportero de
luciferasa de la luciérnaga Photinus pyralis, (DeWit, T.R., et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA; Vol. 82; pp. 7870- 7873;
(1985)) con la región no traducida Pinll-3’ de la patata (An, G., et al., “Functional Analysis of the 3’ Control Region of
the Potato Wound-Inducible Proteinase Inhibitor II Gene”; Plant Cell; Vol. 1; pp. 115-122; (1989)). Anteras del maíz
en distintos estadios de desarrollo fueron colocadas en placas en medio de cultivo de inflorescencia (Pareddy, et al.,
Theoret. Appl. Genet.; Vol. 77; pp. 521-526; (1989)), fueron solidificadas con agar (Phytagar®, Sigma, St. Louis). Se
permitió que una de las tres anteras de cada flósculo pasara por las distintas fases, y las restantes anteras fueron unidas
por estadio y colocadas para bombardeo con microproyectiles, usualmente ocho anteras por placa. Las anteras fueron
disparadas a 1100 p.s.i. con 1,8 µ de partículas de tungsteno en las cuales fue precipitado ADN del constructo de región
reguladora preferida de tejido andrógeno Ms45/reportero de luciferasa. Todas las anteras de una placa determinada
se encontraban en la misma fase: premeiótica, meiosis I, meiosis II, tétrada, liberación de micróspora, micróspora
uninucleada temprana, o micróspora uninucleada media. Fueron disparadas tres repeticiones en cada fase. Las anteras
fueron incubadas durante la noche a 26ºC durante 18 horas. Fue preparado un extracto crudo con las anteras de cada
placa y fue examinado para determinar la actividad de la luciferasa y el contenido proteínico. La actividad de la
luciferasa, normalizada a concentración proteínica, es indicada en grafico en la Figura 4 como una función de fase
13
ES 2 236 915 T3
de desarrollo. La actividad mayor tuvo lugar en las fases de desarrollo de tétrada y de liberación de micróspora, con
una menor actividad en la meiosis I y II, y escasa actividad detectable en la fase uninucleada temprana. No se detectó
actividad significativa por encima del fondo en las anteras premeióticas o en la fase uninucleada media.
5
10
15
20
25
30
35
Además, el callo embriogénico, cultivado en medio MS conteniendo 2,0 µg/ml de 2,4-D fue bombardeado de
la misma manera, a excepción de que lo fue a 650 p.s.i. con partículas recubiertas con un reportero de luciferasa
fusionado bien con la región reguladora preferida de tejido andrógeno Ms45 o con un promotor ubiquitin de maíz
(Patente Americana Nº 5.510.474), y un reportero uidA (GUS) fusionado con un promotor ubiquitin de maíz. La
luciferasa fue normalizada a β-glucuronidasa. Conforme es mostrado en la Figura 5, la región reguladora preferida
de tejido andrógeno Ms45 fue incapaz de conferir expresión transitoria en el callo embriogénico y en los vástagos,
aún cuando el promotor ubiquitin fue expresado. De forma similar, las semillas de maíz, embebidas y germinadas
en agua destilada durante dos días y colocadas en filtros húmedos, fueron sometidas a bombardeo con microproyectiles y fueron examinados sus hipocotilos para determinar la luciferasa y la β-glucuronidasa. La región reguladora
del ubiquitin (promotor) se encontraba activa, pero la región reguladora preferida de tejido andrógeno Ms45 no lo
estaba.
Este resultado corre parejo con los resultados del análisis de hibridización de ARN. Fueron recolectadas anteras
de maíz en diferentes estadios de desarrollo y fueron tratadas como sigue. Una de las tres anteras de cada flósculo fue fijada en (3:1 etanol:ácido acético glacial) en un pocillo de una placa microtiter, y dos fueron congeladas en
nitrógeno líquido en un pocillo en la posición correspondiente de otra placa microtiter. Las anteras fijadas pasaron
por las diferentes fases; a continuación, las correspondientes anteras congeladas fueron unidas según fase, y fue aislado ARN poliA+ de 20 anteras (kit de ARN Micro-Quick Prep, Pharmacia Uppsila Sweden).Volúmenes idénticos
de ARN de anteras en cada grupo de unión según fase fueron sometidos a electrofóresis en 1,2% agarosa en tampón MOPS + formaldehído. Muestras de ARN fueron transferidas por mancha de tinta a una membrana de nylon,
fijadas por medio de degradado por UV (Stratalinker, Stratagene Inc., La Jolla), e hibridizadas con un fragmento sonda marcado con 32P, consistente en toda la región codificadora de ADNc y la región 3’ del Ms45. Los resultados
mostrados en la Figura 4 confirman el estado estable del trascripto Ms45 detectable en las fases de tétrada a uninucleada temprana, y posiblemente tan temprano como, pero no con anterioridad, a la telofase II en la meiosis. O los
niveles del transcripto resultantes de la actividad de la región reguladora preferida de tejido andrógeno Ms45 durante
la meiosis no se acumulan lo suficiente como para ser detectados por hibridización de ARN, o no tiene lugar en las
plantas la actividad de la región reguladora preferida de tejido andrógeno en la fase meiótica observada en ensayos
transitorios.
De esta forma, la región reguladora preferida de tejido andrógeno Ms45 (SEC. ID. Nº: 1) fue caracterizada como
poseedora de expresión preferida en tejidos andrógenos, al menos desde la fase de tétrada en el desarrollo de la antera
hasta la de liberación de la tétrada, con un menor nivel de expresión posiblemente en las fases meiótica y uninucleada
temprana.
Ejemplo 4
40
Análisis de caja TATA
45
50
55
60
Dentro del fragmento de 1388bp del ADN codificando la región reguladora preferida de tejido andrógeno Ms45, el
mayor comienzo de transcripción ha sido identificado en +1, un menor comienzo de transcripción ha sido identificado
en - 3 en relación con el mayor comienzo de transcripción, y una caja TATA putativa ha sido identificada en -33
(CATTAAA). Se observó que la secuencia TAAAGAT en - 30 podía ser también una candidata para la caja TATA real.
Este fragmento de 1388bp fue ligado operativamente a un caset génico reportero comprendiendo la región codificadora
de luciferasa de la luciérnaga (Pareddy, et al., Theoret. Appl. Genet.; Vol. 77; pp. 521-526; (1989)) seguido de la
región no traducida 3’ del gen II inhibidor de la proteinasa de la patata. (An, G., et al., “Functional Analysis of the
3’ Control Region of the Potato Wound-Inducible Proteinase Inhibitor II Gene”; Plant Cell; Vol. 1; pp. 115-122;
(1989)).
Una manera, que es de sobra conocida en este campo, para analizar las cajas TATA es mediante la mutación. En otro
derivado, fueron cambiados de uno a seis nucleótidos de la caja TATA putativa en un derivado dado. Fue introducido
un sitio BGLII en la posición -38, alteró la caja TATA putativa de CATTAAA a TATTAAA, la cual es una equivalencia
más cercana a la secuencia canónica de caja TATA, TATATAA.
Será apreciado por alguien experto en este campo que ciertas substituciones dentro de la caja TATA pueden afectar
al nivel de expresión del promotor sin influir en la especificidad de tejido. Conforme es mostrado en la Figura 7, el
cambio en la caja TATA asociado con el sitio BGLII introducido en la posición -38, incrementó de manera espectacular
los niveles de expresión transitorios en las anteras, y sugiere además que la secuencia en la posición -33 es la auténtica
caja TATA. La introducción de un sitio BGLII en las posiciones -40, -43, -51 o -53 no incrementó la actividad del
promotor (información no mostrada), demostrando que el incremento observado en la introducción del sitio BGLII en
la posición -38 no tenía relación con el sitio BGLII per se.
65
Fueron introducidas otras modificaciones de la caja TATA putativa con el fin de probar adicionalmente su funcionalidad. La alternación de la secuencia de la caja TATA putativa desde CATTAAA a GATTAAA, CATGGAA o
GGGCCCA, todas redujeron el nivel de expresión transitorio en las anteras, sugiriendo adicionalmente la importancia
14
ES 2 236 915 T3
5
de esta secuencia como una caja TATA. Sorprendentemente ninguna de estas mutaciones abolieron la actividad transitoria; sin embargo, se ha informado sobre actividad transitoria en otros sistemas en ausencia de una secuencia similar a
la TATA, e incluso de promotores sin TATA (Guan, L., y J.G. Scandalios, Plant J.; Vol. 3; pp. 527-536; (1993); Close,
P. S., “Cloning and Molecular Characterization of Two Nuclear Genes for Zea mays Mitochondrial Chaperonin 60”;
(Dissertation); Iowa State University, Ames, Iowa; pp. 92, 128; (1993)).
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
15
ES 2 236 915 T3
REIVINDICACIONES
5
1. Una molécula de ácido nucléico aislada, comprendiendo una región reguladora preferida de tejido andrógeno
Ms45 que dirige un mayor nivel de transcripción en tejidos andrógenos que en algunos tejidos, o que en el resto de
tejidos de la planta, y comprende:
(a) una secuencia de nucleótido de SEC. ID. Nº: 1 o 2;
10
15
20
(b) una secuencia de nucleótido con, al menos, un 70% de identidad con una secuencia de SEC. ID. Nº: 1 o 2,
que dirige un mayor nivel de transcripción en tejidos andrógenos que en algunos tejidos, o que en el resto
de tejidos de la planta;
(c) una secuencia de nucleótido, la cual hibridiza con una secuencia de SEC. ID. Nº: 1 o 2 bajo condiciones
altamente astringentes, representadas por un lavado de astringencia de Formamida 50% con solución de
Denhardt 5X, SDS 0,5% y SSPE 1X, a 42ºC, y dirige un mayor nivel de transcripción en tejidos vegetales
andrógenos que en algunos tejidos, o que en todos los demás tejidos de la planta;
(d) un fragmento de una secuencia de SEC. ID. Nº: 1 o 2 que dirige un mayor nivel de transcripción en tejidos
vegetales andrógenos que en algunos tejidos, o que en todos los demás tejidos de la planta o;
(e) una región reguladora preferida de tejido andrógeno de la secuencia de SEC. ID. Nº: 1 o 2 que dirige un
mayor nivel de transcripción en tejidos andrógenos que en algunos tejidos, o que en todos los demás tejidos
de una planta; ligada a un promotor principal.
25
30
2. Un ácido nucléico aislado de la reivindicación 1, apartado (e), en donde el promotor principal es el promotor
CAMV 35S o el 19S, el promotor principal IN2, el promotor ubiquitin o un promotor del virus del Mosaico Figwort.
3. Un vector de expresión recombinante comprendiendo el ácido nucléico aislado de las reivindicaciones 1 o 2,
ligado operativamente a una secuencia de nucleótido codificando un gen exógeno, de tal forma que dicho gen exógeno
es expresado a un nivel mayor en los tejidos andrógenos de una planta que en algunos tejidos, o que en todos los demás
tejidos.
4. El vector de la reivindicación 3, en donde dicho gen exógeno es el Ms45.
35
40
5. Un método de producción de una planta transformada que expresa una secuencia de nucleótido exógena a
un mayor nivel en tejidos andrógenos de dicha planta que en algunos tejidos, o que en todos los demás tejidos,
comprendiendo la introducción en la planta de dicha secuencia de nucleótido exógena ligada operativamente a una
región reguladora preferida de tejido andrógeno de las reivindicaciones 1 o 2.
6. El método conforme a la reivindicación 5, en donde dicha fase de introducción es llevada a cabo por medio de
bombardeo con microproyectiles.
7. El método conforme a la reivindicación 5, en donde dicha fase de introducción utiliza Agrobacterium.
45
50
8. El método conforme a la reivindicación 7, en donde dicho Agrobacterium comprende un plásmido Ti.
9. El método conforme a la reivindicación 5, en donde dicha región reguladora se expresa a un mayor nivel que
en algunos tejidos, o que en todos los demás tejidos, en los tejidos seleccionados de entre polen, tapete, antera,
inflorescencia, células madre del polen y micrósporas.
10. El método conforme a la reivindicación 5, en donde dicha región reguladora preferida de tejido andrógeno de
las reivindicaciones 1 o 2 se encuentra presente en más de una copia.
55
60
11. Un método de mediación de la fertilidad en una planta, comprendiendo la producción de una planta transformada, en donde la región reguladora preferida de tejido andrógeno de las reivindicaciones 1 o 2, ligada operativamente
a un gen exógeno, expresa dicha secuencia de nucleótido exógena de tal forma que produce impacto en la fertilidad.
12. El método conforme a la reivindicación 5, en donde dicha secuencia de nucleótido exógena comprende una
secuencia de ADN codificando un sistema regulador procariótico.
13. El método conforme a la reivindicación 5, en donde dicha secuencia de nucleótido exógena codifica un gen
citotóxico.
65
14. El método conforme a la reivindicación 5, en donde dicha secuencia de nucleótido exógena codifica avidina.
15. El método conforme a la reivindicación 5, en donde dicha secuencia de nucleótido exógena codifica metilasa
DAM.
16
ES 2 236 915 T3
16. El método conforme a la reivindicación 5, en donde dicha secuencia de nucleótido exógena codifica dicha
región reguladora preferida de tejido andrógeno ligada operativamente a una unidad nucleotídica complementaria.
5
17. El método conforme a la reivindicación 16, en donde dicha unidad nucleotídica complementaria es seleccionada
de entre el ARN antisentido calasa, el ARN antisentido barnasa, el ARN antisentido chalcona sintasa, y el ARN
antisentido Ms45.
18. El método conforme a la reivindicación 16, en donde dicha unidad nucleotídica complementaria es seleccionada
de entre ribozimas y secuencias guía externas.
10
19. El método conforme a la reivindicación 11, en donde dicha secuencia de nucleótido exógena codifica un
producto seleccionado de entre auxinas, rolB y toxina de la difteria.
15
20. El método conforme a la reivindicación 11, en donde dicha secuencia de nucleótido exógena es un gen de
androesterilidad.
21. El método conforme a la reivindicación 20, en donde dicho gen de la androesterilidad es el Ms45.
22. El método conforme a la reivindicación 20, en donde la planta es una monocotiledónea.
20
23. El método conforme a la reivindicación 20, en donde la planta es una dicotiledónea.
25
24. Un método de la reivindicación 5, comprendiendo adicionalmente la plantación en polinización cruzada yuxtapuesta, de una primera planta androfértil y una segunda planta androestéril, permitiendo que tenga lugar dicha
polinización cruzada y recolectando la semilla resultante.
25. El método conforme a la reivindicación 24, en donde dicha planta es el maíz.
30
35
26. Una planta transformada expresando una secuencia de nucleótido exógena a un mayor nivel en tejidos andrógenos que en algunos tejidos, o que en todos los demás tejidos, comprendiendo una secuencia de nucleótido exógena
ligada operativamente a una región reguladora preferida de tejido andrógeno de la reivindicación 1.
27. Una planta transformada de la reivindicación 20, en donde dicha región reguladora preferida de tejido andrógeno de las reivindicaciones 1 o 2, y dicha secuencia de nucleótido exógena ligada operativamente, se encuentran
presentes en más de una copia.
28. Una planta transformada de la reivindicación 26, la cual es una monocotiledónea o una dicotiledónea.
40
29. Una planta transformada de las reivindicaciones 26 o 28, la cual es seleccionada de entre el maíz, el girasol, la
soja, el trigo, la cánola, el arroz y el sorgo.
30. Tejido transformado de la planta transformada de la reivindicación 29.
45
31. Tejido transformado de la reivindicación 30, el cual es seleccionado de entre polen, espigas, óvulos, anteras,
inflorescencias, estámenes, pistilos y células vegetales.
32. Células vegetales transformadas de la planta transformada de la reivindicación 26.
50
55
60
65
17
ES 2 236 915 T3
18
ES 2 236 915 T3
19
ES 2 236 915 T3
20
ES 2 236 915 T3
21
ES 2 236 915 T3
22
ES 2 236 915 T3
23
ES 2 236 915 T3
24
ES 2 236 915 T3
LISTA DE SECUENCIAS
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
5
(i) SOLICITANTE: Pioneer Hi-Bred International, Inc.
(ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: REGIÓN REGULADORA PREFERIDA DE TEJIDO ANDRÓGENO Y
MÉTODO DE UTILIZACIÓN DE LA MISMA.
10
(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
(iv) DOMICILIO PARA CORRESPONDENCIA:
(A) DIRIGIDO A: PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL, INC.
(B) CALLE: 800 Capital Square, 400 Locust Street
15
(C) CIUDAD: Des Moines
(D) ESTADO: Iowa
(E) PAÍS: U.S.A.
20
(F) CÓDIGO POSTAL: 50309
(v) REQUERIMIENTOS DE ORDENADOR PARA SU LECTURA:
(A) TIPO MEDIO: Disquete
25
(B) ORDENADOR: IBM PC compatible
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.30
30
(vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
(A) NÚMERO DE SOLICITUD: PCT NO ASIGNADO
(B) FECHA SOLICITUD: AL MISMO TIEMPO QUE ESTA
35
(C) CLASIFICACIÓN:
(viii) INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:
(A) NOMBRE: Sweeney, Patricia A.
(B) NÚMERO DE REGISTRO: 32.733
40
(C) Nº REFERENCIA/SUMARIO: 0578-PCT
(ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
(A) TELÉFONO: (515) 248-4800
45
(B) FAX: (515) 334-6883
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE ID. Nº: 1:
50
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 1394 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucléico
(C) CADENA: sencilla
55
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 1:
60
65
1
ES 2 236 915 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
2
ES 2 236 915 T3
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE ID. Nº: 2:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
5
(A) LONGITUD: 1394 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucléico
(C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
10
(iii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 2:
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
3
ES 2 236 915 T3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
4