terapia gnica - Recursos Javeriana

TERAPIA GÉNICA
Erika Simanca, Adolberto Torres, Otto Castro, Carol Deaza, Samuel Ibarra,
Liliana Otero.
La terapia génica es un nuevo procedimiento para tratar, curar y prevenir la
enfermedad cambiando los genes de un individuo. En principio existen tres
formas de tratar enfermedades mediante la terapia génica:
*Sustituir genes alterados: Se pueden corregir mutaciones mediante cirugía
génica, sustituyendo el gen defectuoso o reparando la secuencia mutada.
*Inhibir o contrarrestar efectos dañinos: Se lleva a cabo mediante la inhibición
dirigida de la expresión génica. Este proceso se desarrolla bloqueando
promotores, interfiriendo con los mecanismos de expresión génica mediante
RNA anti-sentido que son complementarios de mRNA y se unen a ellos
bloqueándolos, o, más recientemente, mediante siRNA ("small interferents
RNA"), que bloquean secuencias específicas de RNA, por lo que pueden inhibir
cualquier gen bloqueando sus mRNA.
*Insertar genes nuevos: Se realiza por supresión dirigida de células específicas.
Se insertan genes suicidas que destruyen a la propia célula que los aloja, o genes
estimuladores de la respuesta inmune. También se puede introducir una copia
de un gen normal para sustituir la función de un gen mutante que no fabrica
una proteína correcta.
Las modificaciones pueden ser realizadas fuera de las células cultivadas y
luego administradas al paciente mediante un vector (procedimientos “ex vivo”)
o pueden ser involucradas como modificaciones en las células del individuo
directamente (procedimientos “in vivo”) 1 .
EVOLUCIÓN Y DESARROLLO DE LA TERAPIA GÉNICA.
Los primeros experimentos en este campo, surgieron a partir de la introducción
de genes en la levadura y de células de mamífero en el cultivo tisular, después
se fueron incorporando genes a animales superiores in vivo. El mayor reto en
estas investigaciones ha sido encontrar el mejor vector para transferir los genes
de un individuo a otro. Diferentes hallazgos han hecho posible el desarrollo de
este tipo de terapias. Algunos de los hallazgos más relevantes para el desarrollo
de la terapia génica fueron:
1. Genes ajenos integrados en el cromosoma del animal receptor :
Los primeros animales superiores en que se utilizaron estas técnicas fueron
ratones. Estos experimentos se basaban en las técnicas del ADN recombinante.
El ADN ajeno o extraño era inyectado en embriones tempranos y era
incorporado a los cromosomas de algunas células embrionarias y mantenidos
en ellos, con su consiguiente proliferación y diferenciación en células tisulares
adultas. También se hicieron experimentos en los que el ADN ajeno podía
integrarse en la línea germinal. Una vez que la clonación de genes fue posible se
podía microinyectar en embriones tempranos de ratón el ADN deseado. A estos
ratones se les llamó ratones transgénicos, y al ADN inoculado se le llamó
transgen.
2. Los transgenes pueden ser regulados por patrones de tejido específico:
Aunque un transgén sea integrado en una localización cromosómica distinta a
la de su duplicado endógeno, generalmente se expresa de manera tal, que
mimetiza la expresión del gen endógeno.
3. La expresión transgénica puede ser dirigida a tejidos específicos:
El ARN codificado para la insulina humana puede ser diferenciado fácilmente
del ARN trascrito por los genes de la insulina del ratón. Cuando eran
analizados los ratones transgénicos del gen de la insulina humana, el ARN de la
insulina humana sólo se encontraba en el páncreas, y no en otros tejidos. Esto
significa que la transcripción de los transgenes de la insulina humana es
inducida por las mismas señales que inducen a los genes endógenos de la
insulina del ratón, es decir, que responde a las mismas señales reguladoras que
los genes endógenos.
4. Los Transgenes son utilizados para eliminar tipos celulares específicos:
La introducción de genes en tipos celulares específicos es una poderosa
herramienta para estudiar el desarrollo del ratón. En estas investigaciones se
elimina únicamente el tipo celular específico, con el propósito de evaluar los
efectos de la ausencia de estas células en el desarrollo del ratón.
5. Los Retrovirus pueden ser utilizados para esbozar linajes celulares:
Los estudios de linajes celulares han sido realizados por introducción de
marcadores génicos en ratones recién nacidos. Los retrovirus son vectores
eficientes en transportar genes a las células.
TIPOS DE TERAPIA GÉNICA:
Según los propósitos y tipos de células blanco se distinguen 4 categorías de
terapia génica:
Tipo I es la terapia génica de células somáticas; ésta terapia involucra la
corrección de defectos genéticos en cualquiera de las células somáticas del
organismo.
Tipo II es la corrección de una deficiencia genética a través de la transferencia
de genes funcionales dentro de las células germinales o gametos, reemplazando
un gen defectuoso. A diferencia de la anterior, no se recomienda la adición de
genes en la línea germinal, debido a los efectos biológicos que producirían la
mezcla del gen normal y mutado sobre las señales reguladoras necesarias para
el crecimiento y desarrollo celular normales.
Tipos III y IV de terapia génica involucran el uso de células somáticas y de
células germinales, seleccionando una o varias características fenotípicas
particulares, con el propósito de hacer mejoramiento genético. Estas terapias
están dirigidas a personas normales en quienes no hay evidencia de alteración
genética alguna. El tipo IV pretende asegurar que las modificaciones genéticas
pasen a las futuras generaciones.
SISTEMAS DE TRANSFERENCIA GENÉTICA.
La inserción del gen terapéutico en las células blanco se puede hacer mediante
el uso de métodos químicos, físicos y biológicos.
Sistema de Transferencia
VIRAL
QUIMICO
FISICO
FUSION
Instrumentos
Adenovirus
Retrovirus
Virus adenoasociados (AAV)
Herpes Virus
Fosfato Calcico
Medios Cationicos
Polietilenglicol
Electroporación
Disparo de micropartículas de oro.
Lisosomas cargados con ADN
policatiónicos.
Los métodos químicos comprenden el uso sales como el fosfato de calcio, DEAE
dextrano, o el uso de liposomas dentro del cual se introduce el gen o segmento
de ADN que se quiere transportar al interior de las células.
En cuanto a los métodos físicos, se puede usar la electroporación,
procedimiento por el cual se usa la corriente eléctrica para formar poros en la
membrana celular que permite el paso del ADN hacia el interior de las células,
la microinyección de material genético directamente en la célula o la micro
balística.
VECTORES VIRALES
De manera clara, los virus pueden ser utilizados como vectores en la terapia
génica, al menos bajo circunstancias ideales.
Retrovirus
Los retrovirus comprenden una gran clase de virus desarrollados que contienen
ARN de cadena sencilla como genoma viral. Durante el ciclo de vida vírico
normal, el ARN vírico se transcribe a la inversa para producir ADN de cadena
doble (gracias a la acción de la enzima transcriptasa reversa) que se integra en
el genoma de la célula huésped y se expresa en períodos prolongados. Como
resultado, las células infectadas vierten virus de forma constante sin daño
aparente en la célula hospedadora.
Adenovirus
Los vectores de adenovirus son capaces de transferir el gen de forma eficiente
en una amplia cantidad de células y tejidos, y son fáciles de producir en
grandes cantidades. La principal desventaja de este vector es que la respuesta
del huésped al virus parece limitar la duración de la expresión y la capacidad
de repetir la dosis.
Virus Adeno-asociados
El AAV es un virus muy pequeño, muy simple, no autónomo, que contiene
ADN lineal de cadena sencilla. El virus requiere la co-infección con otros virus
como el adenovirus para replicarse.
Herpes virus
El potencial de estos virus como vectores génicos recae en la habilidad de llevar
grandes secuencias de ADN extraño insertadas y su habilidad para establecer
infecciones latentes de larga duración en las cuales el genoma del virus existe
aparentemente sin efectos en la célula hospedera.
VECTORES NO VIRALES
Bombardeo de partículas
Este se ha mostrado como un método efectivo de transferir genes tanto in vitro
como in vivo. En este método físico el plásmido de ADN es primero revestido
sobre su superficie, con gotas de 1 a 3 micras de diámetro de oro o tungsteno.
Estas partículas son aceleradas por una descarga eléctrica de un aparato o por
un pulso de gas y son " disparadas" hacia el tejido.
Inyección directa de ADN
Por este método el ADN o ARN puro circular y cerrado covalentemente es
directamente inyectado dentro del tejido deseado. El mecanismo de captura del
ácido nucleico a través de la membrana celular muscular, es el resultado de una
serie de características estructurales favorables de las células multinucleadas: el
retículo sarcoplasmático y un extenso sistema tubular transverso. Gracias a éste
el contenido extracelular es penetrado profundamente en la célula facilitando la
transferencia del ADN. Así el método de inyección de ADN directamente es
simple, económico, y no es tóxico, comparado con la entrega mediante virus.
Liposomas catiónicos
La técnica recae en las propiedades de carga eléctrica del ADN (negativo
debido a la cadena de fostatos en la doble hélice), lípidos catiónicos (carga
positiva) y la superficie celular (una red de cargas negativas debido a los
residuos del ácido siálico).
Así, lo mismo que hacen las histonas (proteínas ricas en aminoácidos cargados
positivamente que compactan el ADN), los lípidos catiónicos interaccionan con
las cargas negativas del ADN condensándolo. El exceso de cargas positivas
permite a los transportadores catiónicos interaccionar, mediante enlaces
electrostáticos con las cargas negativas que presenta la membrana celular.
Transferencia de genes mediante receptores
Las células absorben los elementos del medio exterior por endocitosis: su
membrana se repliega hasta formar una vesícula, el endosoma. Los complejos
de transfección aprovechan este mecanismo para penetrar en sus objetivos
celulares. El Receptor de Asialoglicoproteínas (ASGPr) es específico para
hepatocitos. El hígado es de gran importancia en el metabolismo del cuerpo,
por tanto es obvio que sea diana para las terapia génica, también muchas
enfermedades son debidas a deficiencias en enzimas hepáticas 2 .
CONTROL DE LA EXPRESIÓN DE LOS GENES TRANSFERIDOS
Uno de los puntos centrales de la terapia génica es lograr la expresión del gen
corrector específicamente en el tejido alterado. Este objetivo debe incluir como
requisito la existencia de promotores de tejido especifico regulables.
Recientemente se ha reportado la construcción de los cromosomas artificiales
que contiene elementos de la expresión y estabilización mitótica en humanos.
Un cromosoma artificial es un elemento genético complejo compuesto, por lo
menos, de las siguientes partes: un elemento de inicio de replicación (ori); un
elemento de replicación mitótica (regiones centroméricas) que permita su
estabilización como elemento genético durante la división celular; secuencias
teloméricas; un promotor de tejido especifico, que es una parte muy importante
de este complejo y que sirve para asegurar la expresión del gen corrector en ,
ciertas células. Normalmente, estos cromosomas artificiales son muy útiles
para transportar genes de gran tamaño, como los mega-genes, que tienen más
de 200Kb.
Los genes celulares se pueden clasificar en dos grupos principales: aquellos
que se expresan en todas las células, que corresponden a los denominados
genes domésticos (Housekeeping genes), y los que se expresan en un tejido o en
un conjunto de ellos, denominados genes histo-especificos. Algunos ejemplos
de estos últimos son las globina, que se expresan solo en las células
eritroblásticas.
Un factor adicional importante en la expresión de un gen en una célula es el
estado de la cromatina. La porción relajada de la cromatina es
transcripcionalmente activa, por lo que se debe entregar el gen corrector en
esta zona de la cromatina.
ESTRATEGIAS PARA TERAPIA GÉNICA SOMÁTICA
La terapia génica somática se puede hacer de dos formas in situ y ex vivo.
La terapia ex vivo consiste en extraer células, por ejemplo los linfocitos, de la
persona enferma, introducirles el gen corrector en el laboratorio mediante
alguno de los sistemas e inducir su proliferación hasta lograr en ellos, la
integración estable de gen. Luego los linfocitos corregidos son transfundidos
de nuevo a la persona y, debido a su capacidad para infiltrar otras células, la
proteína normal se distribuye en los diferentes tejidos.
En contraste, en la terapia in vivo, el gen corrector es suministrado
directamente al tejido (músculo, mucosa, piel, etc.), mediante un vector que
permite la integración del gen y la síntesis de de la proteína normal. Este
último enfoque genera una serie de problemas tecnológicos y éticos.
La terapia génica, en general no ha demostrado efectos adversos debidos a la
activación de oncogenes o supresión de otros genes. La expresión lograda
hasta ahora ha sido transitoria. En el momento más 3500 individuos que están
participando en protocolos de terapia génica portan genes “no propios” en su
organismo. Se están llevando a cabo más de 530 protocolos, de los cuales 62%
son para curar el cáncer, 14% para enfermedades monogénicas, 7% para
enfermedades infecciosas y 7% para enfermedades cardiovasculares.
La identificación de nuevos genes involucrados en las enfermedades del
hombre, el desarrollo de nuevos vectores y la regulación transgénica han
acelerado el progreso de la terapia génica. Sin embargo, una de las mayores
dificultades que presenta la aplicación clínica de esta terapia radica en las
características que debe tener el vector utilizado. Los requisitos más
importantes que debe cumplir este vector son: la facilidad para producirlo a
gran escala, la seguridad para manejarlo con cada tipo de célula y la capacidad
para producir una expresión transgénica regulada 3 . Aunque la terapia génica
está todavía en etapa experimental, las investigaciones indican que en los
próximos 25 años será posible utilizarla con éxito para el tratamiento de
diferentes enfermedades 4 .
Uno de los campos de la odontología que puede beneficiarse directamente de
este tipo de terapias lo constituye las alteraciones craneofaciales y dentales. De
las cerca de 5.500 patologías heredadas que presentan malformaciones, cerca de
700 involucran la región craneofacial y alrededor de 300 se manifiestan con
labio y/o paladar fisurado 5 .
Algunas cráneosinostosis como los síndromes de Appert, Pfeiffer y Crouzon,
que afectan el crecimiento craneofacial normal, debido al cierre prematuro de
las suturas, son producidas por una mutación en el gen FGFRII (receptor tipo
II del factor de crecimiento fibroblástico) 6 . La investigación actual en biología
de las suturas, está dirigida a conocer las funciones de los genes que se expresan
en este tejido, los mecanismos de señalización celular, las actividades de los
factores de transcripción específicos y las interacciones celulares. Cuando se
conozcan estos procesos, será posible prevenir o intervenir tempranamente
mediante terapia génica perinatal las patologías relacionadas con
cráneosinostosis o con otros síndromes que afectan el crecimiento craneofacial.
La literatura reporta que en defectos defectos craneofaciales y periodontales se
puede utilizar sistemas de osteoinducción mediante la terapia génica,
combinada con trepáis de células madre y bioingeniería.
Las proteínas morfogenéticas BMP2 y BMP7 han sido empleadas en la terapia
génica de células mesenquimales de roedores y humanos, para inducir la
formación de hueso nuevo in vivo e in vitro. Métodos como la electroporación o
sonoporación han sido usados para transferir el gen Gdf11 (que codifica para la
proteína BMP11) para amputar pulpa dental, estimular la formación y
reparación de dentina. El plásmido Gdf11 cDNA transferido dentro del tejido
pulpar por sonoporación in Vitro, indujo la producción de sialoproteína
dentinal (un marcador de diferenciación odontoblástica) y la producción de
dentina reparativa en las pulpas amputadas de dientes in vivo. Estos resultados
sugieren el potencial terapéutico de este tipo de terapias en endodoncia 7 .
En odontología, el uso de implantes metálicos se pueden usar en combinación
con las BMP 8 . Estas podrían estimular el crecimiento óseo alrededor de los
implantes, para lograr una integración optima del implante, sin embargo el uso
de las BMP en odontología aún no ha podido ser implementado clínicamente
porque aún se desconocen muchos factores que afectan su respuesta in vivo.
Los resultados ambiguos que reportan los estudios con la utilización de las
BMP paraecen estar relacionados con las dosis efectivas de BMP y con los
vectores utilizados para su liberación in vivo 9
Recientemente Chao y col (2005), propusieron el uso de las BMP2, 4 y /
recombinadas mediante terapia génica y demostraron un aumento significativo
de la osteogénesis cuando las BMP eran recombinadas, en comparación con la
utilización individual de cada una de ellas 10 .
Otra área de la odontología que podría beneficiarse con la terapia génica está
relacionada con las enfermedades que afectan las glándulas salivares. Al
respecto Ambudkar considera que la mayor limitación para el uso de la terapia
génica en este campo, radica en la elección del vector utilizado para transferir
los genes, ya que actualmente los vectores disponibles inducen reacciones
inmunes y otros efectos indeseables que impiden establecer con seguridad este
tipo de terapias 11 .
La terapia génica puede ser utilizada también para el tratamiento del dolor
crónico severo. Numerosos estudios han demostrado que los genes pueden ser
transferidos a células del sistema nervioso central de los modelos animales. Por
ejemplo la transferencia del gen b-endorfina produce analgesia efectiva en ratas.
Este procedimiento podría ser de gran utilidad en un futuro para el tratamiento
de la “neuralgia del trigémino”.
Sin embargo uno de los mayores campos de acción de la terapia génica en
odontología lo constituyen las técnicas usadas para transferencia de genes en el
tratamiento primario o adjunto de los pacientes que presentan cáncer de cabeza
y cuello. Wang y col (2001), sugieren que la terapia génica con IL-12
combinada con la inmunización de la mucosa oral puede inducir inmunidad
sistémica antitumoral 12 . Por otra parte Fukui y col (2001) proponen que la
sensibilización de las células tumorales con “ganciclovir”, utilizando como
vector el virus asociado al adenovirus, podría ser utilizado con éxito en la
terapia génica para el carcinoma oral escamo-celular 13 .
La utilización de terapia génica en la bioingeniería de tejidos orales que utilizan
células madres, es también uno de las áreas más investigadas hoy en día para
el tratamiento del cáncer, la pérdida de tejidos ocasionada por traumas y otras
patologías, las anomalías dentomaxilofaciales.
BIBLIOGRAFÍA
1
Kaji E, Leiden J. Gene and stem cell therapies. JAMA. 2.001;285: 545-550.
Sangiuolo F, Novelli G. Sequence-specific modification of mouse genomic DNA mediated by
gene targeting techniques. Cytogenet Genome Res. 2004;105(2-4):435-41.
3
Monahan Pe, Samulski Rj. AAV Vectors : is clinical success on the horizon? Gene Ther.
2.000; 7:24-30.
4
Vile Rg, Russell Sj, Lemoine Nr. Cancer gene therapy: hard lessons and new courses. Gene
Ther. 2.000; 7: 2-8.
5
wang E. Family: Craniofacial research. Anew day has arrived in genetic research.
www.Forsyth Institute.com. 2000.
6
Thesleff I. The genetic basis of normal and abnormal craniofacial development. Acta Odontol
Scand. 1.998; 56: 321-325.
7
Nakashima M, Tachibana K, Iohara K, Ito M, Ishikawa M, Akamine A. Induction of
reparative dentin formation by ultrasound-mediated gene delivery of growth/differentiation
factor 11. Hum Gene Ther. 2003 Apr 10;14(6):591-7.
8
Carinci F. et al. Analysis of MG6 3 osteoblastic-cell response to new manoporus implant
surface by means of a microarray technology. Clin.Otal. Impl. Res. 15, 2004/ 180-186.
9
Schilephake H. Bone growth factors in maxillofacial skeletal reconstruction. Int J Oral
Maxillofac Surg. 2002 Oct;31(5):469-84.
10
Zhao M, Zhao Z, Koh JT, Jin T, Franceschi RT. Combinatorial gene therapy for bone
regeneration: cooperative interactions between adenovirus vectors expressing bone
morphogenetic proteins 2, 4, and 7. J Cell Biochem. 2005 May 1;95(1):1-16.
11
Areus-Jones C. Teeth We´re going to grow them back! www.healtnewsdigest.com. 2.001.
2
12
Wang J, Murakami T, Hakamata Y et al. Gene gun-mediated oral mucosal transfer of
interleukin 12 cDNA coupled with an irradiated melanoma vaccine in a hamster model:
successful treatment of oral melanoma and distant skin lesion. Cancer Gene Ther
2001.8(10):705-12.
13
Fukui T, Hayashi Y, Kagami H, Yamamoto et al. Suicide gene therapy for human oral
squamous cell carcinoma cell lines with adeno-associated virus vector. Oral Oncol 2001.
37(3):211-5.