Tema 4 - OCW Usal
Anuncio
2 Métodos luminiscentes Tema 4 METODOS LUMINISCENTES Cuando una especie química absorbe radiación electromagnética ultravioleta o visible pasa a un estado electrónico excitado. Muchas sustancias en dicho estado disipan el exceso de energía en forma de calor, mediante colisiones con átomos o moléculas vecinas, como ocurre en la espectrofotometría de absorción. Sin embargo, un cierto número de especies pierde solo una parte de este exceso de energía en forma de calor, y emite la energía remanente en forma de radiación electromagnética, de distinta frecuencia que la absorbida, y que puede utilizarse con fines analíticos. X + CALOR X + hν X* X + calor + h ν' absorción (espectrofotometría) emisión (fotoluminiscencia) El proceso de emisión de radiación como consecuencia de la desactivación de una molécula se denomina genéricamente luminiscencia, mientras que el término fotoluminiscencia se refiere al caso particular en el que la excitación tenga lugar por absorción de fotones. Cuando la energía de excitación es de otro tipo, se originan otras modalidades de luminiscencia: así, la quimio-luminiscencia es un fenómeno análogo a la fluorescencia, excepto en el hecho de que la energía de excitación proviene de una reacción química. Cuando la quimio-luminiscencia tiene lugar en un ser vivo, como por ejemplo, en la luciérnaga, recibe el nombre de bioluminiscencia. Por otra parte, la tribo-luminiscencia (del Griegro, tribo = frotar) se produce al liberarse la energía almacenada en ciertas sustancias cristalinas, como azúcar, y como consecuencia de su rotura. La fotoluminiscencia puede clasificarse, en principio, en fluorescencia y fosforescencia, según el mecanismo mediante el cual la sustancia vuelve al estado fundamental, si bien, una distinción desde el punto de vista práctico se basa en el tiempo transcurrido entre la absorción y la emisión. Claudio González Pérez 3 El contenido de este capítulo se enfoca fundamentalmente hacia la fluorescencia, pues la fosforescencia se aplica en escala mucho más limitada. Así mismo, al final del capítulo se indican brevemente algunas características y aplicaciones de la quicioluminiscencia. La luminiscencia puede considerarse como una de las técnicas analíticas más antiguas, pues su descubrimiento data del siglo XVI, cuando el físico y botánico español Nicolas Monardes observó, en 1565, un misterioso matiz azulado en el agua almacenada en un recipiente construido con madera de la especie "Lignum nifriticum". Sin embargo, no fue hasta el siglo XIX en que el físico inglés George Stokes estableció las bases de su utilidad analítica al describir los primitivos mecanismos de absorción y emisión. FUNDAMENTO DE LA FOTOLUMINISCENCIA Para que una sustancia origine emisión foto-luminiscente es necesario que previamente tenga lugar la absorción de radiación electromagnética. En la figura 3.6. del tema anterior se han representado las transiciones electrónicas más comunes que pueden tener lugar cuando una molécula orgánica absorbe radiación. De todas ellas, las que tienen lugar entre los orbitales π enlazantes y antienlazantes (π—>π*) son las de mayor interés en los procesos luminiscentes. A continuación se ampliarán algunos conceptos relacionados con los procesos de absorción y emisión de forma general, pero que son aplicables a las mencionadas transiciones π—>π*. La multiplicidad molecular, M, se define como: M = 2S + 1 donde S es el número cuántico de espín de la molécula, y es la suma de los espines de cada uno de sus electrones. Muchas moléculas orgánicas tienen un número par de electrones, por lo que S=0 y M=1. A dicho estado se le denomina singulete. El estado energético más bajo (estado fundamental) deberá ser uno en el cual todos los electrones estén apareados, y a dicho estado se le denomina estado singulete fundamental (figura 4.1.a.) Cuando un electrón pasa a un nivel energético superior, (por ejemplo, pasa de a *) puede ocurrir que conserve su espín, o que se produzca cambio de éste. En el 4 Métodos luminiscentes primer caso se tiene un estado singulete excitado (figura 4.1.b.) y en el segundo, un 1 1 S=+ + = 1. 2 2 estado triplete, ya que, en estas condiciones, M=3, debido a que Las transiciones desde el estado singulete fundamental hasta el estado triplete son muy poco probables; normalmente es necesario pasar a través del estado singulete excitado*. π∗ π∗ π∗ π π π b singulete excitado c triplete excitado a singulete fundamental Figura 4.1. Estados singulete y triplete. En la figura 4.2. se han representado parcialmente diferentes niveles de energía para una molécula fotoluminiscente. Relajación vibracional 2 Conversión interna S1 Cruzamiento entre sistemas .. desactivación no radiante E Absorción Fluorescencia v2 T v1 1 v0 Fosforescencia S v2 v1 v0 So λ2 λ1 λ3 λ4 v2 v1 v0 Figura 4.2. Niveles de energía de un sistema fotoluminiscente. * Las moléculas con electrones desapareados (número impar de electrones) constituyen un estado doblete y es el caso, por ejemplo, de radicales libres orgánicos. Claudio González Pérez 5 El nivel So representa el estado singulete fundamental, mientras que S1 y S2 estados singulete excitados, y T1 el estado triplete. Por otra parte, superpuestos a cada nivel de energía electrónico hay una serie de niveles de energía vibracionales estrechamente espaciados, representados en la figura por vo, v1, v2, etc. Los niveles rotacionales no se han incluido porque no pueden resolverse con los espectrómetros convencionales. Cuando una molécula absorbe radiación se produce el paso desde el estado electrónico y vibracional fundamental a un estado electrónico excitado y cualquiera de los posibles estados vibracionales excitados. Este proceso de excitación tiene lugar en un tiempo del orden de los 10–15 segundos. En sistemas condensados, como cuando se opera en disolución, el exceso de energía vibracional se pierde inmediatamente, como consecuencia de los choques entre las moléculas excitadas y el disolvente. Este proceso recibe el nombre de relajación vibracional. Además, puede ocurrir que se pase a un estado electrónico de más baja energía sin emisión de radiación (S2 a S1). Este proceso, denominado conversión interna, se produce cuando dos niveles de energía electrónicos están suficientemente próximos para que haya un solpamiento de los niveles de energía vibracionales. Los procesos de conversión interna y de relajación vibracional transcurren en un tiempo muy pequeño (del orden de los 10–12 seg.) El proceso de emisión de un fotón desde S1 a So recibe el nombre de fluorescencia, y ocurre inmediatamente después de la excitaciòn (en aproximadamente 10–9 a 10–7 segundos), por lo cual, no es posible percibir visualmente la emisión de fluorescencia una vez eliminada la fuente de excitación. Por otra parte, debido a la conversión interna y a los procesos de relajación vibracional, la emisión de fotones fluorescentes desde estados electrónicos excitados superiores al primero son procesos muy poco probables. Así, en relación con la figura 4.2., la excitación por radiación a la longitud de onda λ2 normalmente provoca fluorescencia de una longitud de onda λ3, con exclusión de la transición que resultaría entre S2 y So. La desactivación de un estado electrónico excitado por pérdida de energía no radiante puede tener lugar mediante unos procesos de conversión interna, si los niveles vibracionales del estado fundamental se solapan con los del primer estado excitado, o por conversión externa, lo cual implica interacción y transferencia de energía entre la molécula excitada y el disolvente u otros solutos. Como se comentó anteriormente, mientras una molécula está en un estado excitado, puede tener lugar un cambio de espín en un electrón, con lo que se adquiere Métodos luminiscentes 6 el estado triplete. Este proceso de transformación de un estado singulete a un estado triplete se denomina cruzamiento entre sistemas, y la probabilidad de que esto suceda aumenta si los niveles vibracionales se solapan. Una vez adquirido el estado triplete, la molécula puede llegar al nivel vibracional inferior mediante procesos de relajación vibracional, y posteriormente emitir un fotón para retornar finalmente al estado fundamental. Esta emisión se denomina fosforescencia. Debido a que las transiciones entre estados de diferentes multiplicidades están "prohibidas", la emisión fosforescente se produce con un cierto retraso respecto a la absorción (entre 10–3 y 10 segundos). Por ello, con frecuencia, puede ser observada a simple vista después de cesar la radiación de excitación. Sin embargo, como consecuencia del mayor tiempo de vida del estado triplete, los procesos de desactivación en forma de energía no radiante pueden competir más eficazmente con la fosforescencia que con la fluorescencia. Por esta razón, la fosforescencia casi nunca se observa a temperatura ambiente, siendo necesario operar en condiciones criogénicas para que se reduzca la probabilidad de desactivación por choques*. A modo de resumen, puede decirse que los procesos de desactivación de una especie en forma de energía no radiante son los más probables, seguidos de la emisión fluorescente, y los menos probables son los correspondientes a la fosforescencia. Esto hace que los métodos absorciométricos sean más numerosos que los fluorimétricos, y éstos, a su vez, más que los basados en el empleo de la fosforescencia. FACTORES QUE AFECTAN A LA FLUORESCENCIA La emisión fluorescente observada en una determinada especie está condicionada por la propia estructura molecular de la sustancia y por otros factores dependientes del medio en que se trabaje. Influencia de la estructura molecular sobre la fluorescencia El primer requisito para que exista florescencia (o fosforescencia) es que la molécula posea una estructura capaz de absorber radiación ultravioleta o visible, esto es, puedan tener lugar transiciones π—>π* y n—>π*. Sin embargo, * En época relativamente reciente, ha sido posible observar fosforescencia a temperatura ambiente cuando la muestra se incorpora a una matriz sólida. 7 Claudio González Pérez experimentalmente se ha observado que el comportamiento fluorescente se presenta con más frecuencia en compuestos en los que la transición es π—>π* y no en aquellos en los que es n—>π*. Esta condición elimina virtualmente los compuestos orgánicos saturados, mientras que los compuestos conteniendo dobles enlaces conjugados, especialmente aquellos con un alto grado de estabilización por resonancia serán muy prometedores. Así, suelen presentar fluorescencia muchos hidrocarburos aromáticos, particularmente si tienen gran rigidez y estructuras multi-cíclicas. Las características de la emisión fluorescente (longitud de onda de máxima emisión y su intensidad) de una molécula orgánica aromática suele estar muy influida por los sustituyentes en el anillo bencénico. Así, por ejemplo, cuando los sustituyentes son halógenos, se observa una disminución de la fluorescencia al aumentar el peso atómico del halógeno, lo cual parece debido al llamado efecto del átomo pesado. Este efecto aumenta la probabilidad de que se produzca el cruzamiento entre sistemas, con el consiguiente aumento de la fosforescencia. Por otra parte, la presencia de un ácido carboxílico en un anillo aromático hace que tengan lugar transiciones n—>π* con menos energía que π—>π*, lo cual generalmente inhibe la fluorescencia. Un factor estructural importante es la rigidez. Experimentalmente se observa que la fluorescencia está particularmente favorecida en moléculas que poseen estructuras rígidas. Así, la intensidad de la fluorescencia del fluoreno es unas cinco veces mayor que la del bifenilo. . . CH 2 bifenilo fluoreno La diferencia parece ser debida a la rigidez que proporciona el grupo metileno del fluoreno. Asimismo, la fluoresceína presenta una intensa fluorescencia en disolución líquida y, sin embargo, la fenolftaleína no, a pesar de su similitud estructural. –O O O COO fluoresceína – O COO fenolftaleína – 8 Métodos luminiscentes En ambos ejemplos, la forma rígida (fluoreno y fluoresceína) presenta mayor fluorescencia. Este efecto se debe a que las estructuras más rígidas limitan las vibraciones, lo cual minimiza la degradación por colisiones y el cruzamiento de sistemas. El aumento de fluorescencia de ciertos agentes orgánicos cuando forman quelatos con iones metálicos parece debido también a producirse un incremento en la rigidez del sistema. Así, por ejemplo, el colorante pontacromo BBR no es fluorescente, pero sí lo es su quelato con Al3+. H 2O H2O Al OH HO N=N Pontacrom o BBR O SO 3 Na 3+ HO N=N SO 3 Na Pontacrom o BBR–Al 3+ La formación del quelato aumenta considerablemente la rigidez molecular, al impedir que la molécula gire alrededor del grupo azo. Otros factores de tipo estructural que influyen sobre el comportamiento luminiscente son: * La presencia de grupos donadores de electrones, como —NH2 y —OH favorecen la fluorescencia, puesto que aumentan la probabilidad de transición entre el estado singulete de menor energía vibracional y el estado fundamental. * La introducción de un átomo de número atómico elevado en un sistema de electrones π suele aumentar la fosforescencia, en detrimento de la fluorescencia. * Los grupos aceptores de electrones, como —COOH, —NO2, —N=N— y X disminuyen y, en ocasiones inhiben la fluorescencia. Influencia de otros factores medioambientales sobre la fluorescencia El "ambiente" en el que se encuentre la especie fluorescente constituye un parámetro importante que puede usarse en análisis para incrementar la sensibilidad y la selectividad de la fluorescencia, ya que existen varios factores medioambientales Claudio González Pérez 9 que pueden influir fuertemente sobre el comportamiento fluorescente de moléculas poliatómicas. Influencia del disolvente. En muchas ocasiones se observa que al aumentar la polaridad del disolvente se produce un desplazamiento en el espectro de fluorescencia hacia mayores longitudes de onda. Este hecho puede explicarse de la forma siguiente: Las transiciones electrónicas entre diferentes niveles energéticos ocurren muy rápidamente, de forma que cuando una molécula en estado fundamental absorbe un fotón, pasa a un estado excitado meta-estable (estado excitado FranckCondon), en el cual la geometría molecular y la configuración del disolvente son todavía las características del estado fundamental (figura 4.3.). La reorientación del disolvente tiene lugar aproximadamente 10–11—10–12 segundos después de la excitación, originando un estado excitado de "equilibrio", en el cual la configuración del disolvente es óptima para la geometría y configuración electrónica de la molécula. La emisión ocurre desde ese estado excitado de "equilibrio", hasta un estado fundamental meta-estable, teniendo lugar posteriormente la relajación del disolvente, para conducir hasta el verdadero estado fundamental. En la mayoría de las moléculas polares el estado excitado es más polar que el estado fundamental; por ello, al aumentar la polaridad del disolvente se tiende hacia una estabilización del estado excitado, en mayor grado que lo hace el estado fundamental (figura 4.3.A, B y C). En consecuencia, al aumentar la polaridad del disolvente tiene lugar un desplazamiento hacia mayores longitudes de onda (menor energía). Figura 4.3. Influencia de la polaridad del disolvente sobre la emisión de fluorescencia. 10 Métodos luminiscentes Respecto a la constitución del disolvente hay que hacer notar lo siguiente: anteriormente se ha mencionado que la introducción de átomos pesados como sustituyentes en moléculas aromáticas produce un incremento en la fosforescencia a expensas de la fluorescencia. Este efecto se observa frecuentemente incluso cuando el elemento en cuestión no forma parte de la molécula luminiscente. Así, disolventes conteniendo átomos pesados, normalmente dan lugar a una disminución de la fluorescencia. Este comportamiento puede justificarse en algunos casos: concretamente cuando se trata de disolventes halogenados, por formación de complejos 1:1 en los que interviene el estado excitado del soluto fluorescente, pues la reactividad de los estados excitados es normalmente diferente a la que presenta la molécula en estado fundamental. Influencia del pH. El espectro de fluorescencia de muchos compuestos aromáticos conteniendo grupos funcionales ácidos o básicos es sensible al pH. Los cambios en la emisión de los compuestos de este tipo proviene del número de especies resonantes diferentes que están asociadas con las formas ácidas o básicas de las moléculas. Así, por ejemplo, la anilina, en medio neutro y alcalino presenta fluorescencia en la región visible, pero dicha fluorescencia desaparece en medio ácido. La razón está en que el ion anilinio (forma ácida) tiene las mismas formas resonantes que el benceno y solo presenta fluorescencia, como él, en la región ultravioleta, mientras que la anilina tiene tres estructuras resonantes adicionales. H H H H H H+ H N(+) H + H N: N N – . . ion anilinio anilina Estas formas resonantes adicionales proporcionan una mayor estabilidad al primer estado excitado, y la consecuencia es una emisión fluorescente a mayor longitud de onda. La fluorescencia de ciertos compuestos en función del pH ha sido utilizada para la detección de puntos finales en volumetrías ácido–base. Sin embargo, es realmente curioso el hecho de que el cambio de comportamiento espectral se produzca a un pH diferente del que puede predecirse de su constante de disociación. Así, el pKa del 2naftol es 9.5, por lo que la fluorescencia de la forma aniónica solo debería observarse a valores de pH superiores a 9.5, mientras que en la práctica, se percibe a pH muy inferiores a ese valor. La explicación de este hecho reside en que la molécula excitada Claudio González Pérez 11 (el primer estado singulete excitado) posee un carácter ácido diferente del estado fundamental. Algo parecido sucede con los estados triplete, si bien, en menor medida. Influencia del oxígeno disuelto. El efecto del oxígeno disuelto es uno de los problemas más molestos de la fluorimetría, ya que a menudo reduce la intensidad de emisión de una disolución fluorescente. Normalmente, el oxígeno presente en concentración 10–3 M reduce la emisión fluorescente del orden del 20%. Por ello, es necesario desairear las disoluciones antes de llevar a cabo la medida. El papel que juega el oxígeno en la atenuación de la fluorescencia se debe fundamentalmente a sus propiedades oxidantes y a sus características paramagnéticas. Así, frente a especies reductoras, el oxígeno puede llevar a cabo la oxidación inducida foto-químicamente de las especies fluorescentes, si bien, con mayor frecuencia, la atenuación de la fluorescencia se produce debido a que el paramagnetismo del oxígeno molecular favorece el cruzamiento entre sistemas, lo cual conduce hasta el estado triplete. Al parecer, el cruce entre sistemas se produce mediante colisiones con especies excitadas y por formación transitoria de complejos de transferencia de carga. Por otra parte, el que la presencia de oxígeno favorezca el cruzamiento entre sistemas en muchas moléculas fluorescentes no significa que aumente la fosforescencia, pues el O2 es también un efectivo atenuador de estados tripletes. Debido a que el estado triplete tiene una vida más larga que el singulete, le hace mucho más susceptible para colisionar con impurezas, tales como el propio oxígeno, u otras producidas por foto-descomposición del soluto. En cualquier caso, la capacidad del oxígeno para inhibir la fotoluminiscencia puede ser utilizada para su determinación en disolución. Otros gases paramagnéticos, como el óxido nítrico, se comportan de forma similar, así como iones paramagnéticos de los metales de transición. Influencia de la temperatura. La temperatura es una variable importante en fluorimetría analítica, observándose una disminución de la fluorescencia al aumentar aquella. El cambio en la fluorescencia es normalmente del 1 % por ºC, si bien, en algunos compuestos, como el triptofano o la rodamina B puede ser hasta del 5 %. La disminución de la emisión fluorescente con la temperatura se debe a que el aumento de la frecuencia de choques a temperatura elevada incrementa la probabilidad de desactivación en forma de energía no radiante. Por otra parte, el aumento de Métodos luminiscentes 12 temperatura hace disminuir la viscosidad del disolvente, lo cual, también aumenta la probabilidad de desactivación mediante colisiones. RELACION ENTRE INTENSIDAD DE FLUORESCENCIA Y CONCENTRACION La intensidad de fluorescencia, If, es directamente proporcional a la concentración, C, de la sustancia absorbente, pero solo a concentraciones relativamente bajas, lo cual puede demostrarse como sigue: la fracción de radiación transmitida, según la Ley de Beer, es: T= P –ε bC = 10 Po donde, Po=potencia del haz incidente P=potencia del haz transmitido ε=absortividad b=espesor de la cubeta (camino óptico) C=concentración La fracción de radiación absorbida es: 1– P –ε bC = 1 – 10 Po y la cantidad de radiación absorbida es: Po – P = Po (1 – 10–εbC) La intensidad de la radiación fluorescente, If, está relacionada con la cantidad de radiación absorbida de la forma siguiente: If = k φf (Po–P) donde k es una constante de proporcionalidad, que depende de parámetros instrumentales (eficacia del sistema detector y geometría) y φf es el rendimiento cuántico de la fluorescencia (relación entre el número de fotones emitidos y los absorbidos por unidad de tiempo). El término 1–10–εbC puede desarrollarse como una serie de McLaren, 1 – 10–εbC = 1 – e–2.3εbC 13 Claudio González Pérez 1 – 10 –ε bC 2.3ε bC = 1 – 1 – 2.3ε bC + 2! 2.3ε bC = 2.3ε bC – 2! 2 2 2.3ε bC – 3! 2.3ε bC + 3! 3 +… = 3 –… de donde, If = k φ f Po 2.3ε bC 2.3ε bC – 2! 2 2.3ε bC + 3! 3 –… [I ] Para bajas concentraciones, cuando el término εbC sea menor que aproximadamente 0.05, todos los términos de la ecuación [I], excepto el primero, son muy pequeños, y la expresión se reduce a If = k φf Po 2.3 ε b C Así, para disoluciones muy diluidas, la intensidad de fluorescencia será directamente proporcional a la concentración: If = K C En la figura 4.4. se muestra una representación gráfica de la variación de la intensidad de fluorescencia con la concentración. K Po If fluorescencia no uniforme fluorescencia uniforme C Figura 4.4. Relación entre la intensidad de fluorescencia y la concentración. A concentraciones relativamente altas, los términos de mayor orden de la ecuación [I] pueden ser lo suficientemente importantes para que se pierda la linealidad, como ya se comentó anteriormente. Sin embargo, existen otras causas para la no linealidad a concentraciones altas. Son las siguientes: Métodos luminiscentes 14 * Autoatenuación. Se produce como consecuencia del choque entre moléculas excitadas, lo cual origina una desactivación en forma de energía no radiante. Lógicamente, al aumentar la concentración, aumentará la probabilidad de que se produzcan esas colisiones. * Autoabsorción. En este caso, la fluorescencia de una molécula es absorbida por otra molécula del mismo soluto en estado fundamental, y la probabilidad de tales eventos crece al aumentar la concentración. La auto-absorción reduce la intensidad de fluorescencia, salvo que φf sea la unidad. Por ello, la representación gráfica de If frente a C puede hacerse incluso descendente para altos valores de C. * Como ya se vio, If es proporcional a la absortividad molar: a mayor absorción, mayor fluorescencia. Sin embargo, cuando la absorción es demasiado grande y la disolución bastante concentrada, la porción de la disolución más próxima a la fuente luminosa absorbe mucha radiación, de forma que queda muy poca disponible para el resto. Si la concentración es tan grande que toda la radiación incidente es absorbida, If = k φf (Po – P) = k φf Po, en cuyo caso, If tiende al valor de k Po (ver figura 4.4.). * Muchas moléculas aromáticas (especialmente aquellas con grupos funcionales capaces de unirse por enlaces de hidrógeno) forman dímeros u otros agregados en disolución. Esta tendencia, lógicamente será mayor a altas concentraciones de soluto. Considerando que, con frecuencia, los dímeros son menos fluorescentes que el correspondiente monómero, se observará un descenso de If como consecuencia de la formación de estas especies dímeras. Por otra parte, ciertos compuestos en estado singulete excitado tienen tendencia a formar asociaciones con moléculas de su misma especie en estado fundamental. El espectro de emisión de estas asociaciones suele estar desplazado hacia mayores longitudes de onda respecto al del correspondiente monómero. INSTRUMENTACION Como la mayor parte de los instrumentos utilizados en los métodos espectroscópicos, los componentes principales de un fluorímetro son: una fuente de radiación, un sistema selector de longitudes de onda (filtro o monocromador), una célula conteniendo la muestra, y un detector. Sin embargo, una diferencia importante entre la fluorimetría (también la fosforimetría) y los demás métodos 15 Claudio González Pérez espectroscópicos es la presencia de dos filtros (o dos monocromadores); uno para seleccionar la longitud de onda de excitación y otro para la de emisión. En la figura 4.4. se han representado los componentes básicos de un fluorímetro. En espectrómetros de luminiscencia se necesitan fuentes de radiación más intensas que las lámparas de volframio o de deuterio que se utilizan en las medidas de absorción. Anteriormente se indicó que la intensidad de fluorescencia es directamente proporcional a la potencia del haz incidente. La lámpara de arco de xenón presenta un espectro esencialmente continuo que se extiende por las regiones ultravioleta y visible, siendo muy utilizada en espectrofluorímetros de red. Por otra parte, en los fluorímetros de filtro, suele utilizarse la lámpara de arco de mercurio, la cual emite un intenso espectro de líneas sobre un fondo continuo. El uso de esta fuente puede implicar una mayor sensibilidad, debido a la alta intensidad de las líneas del mercurio. Muestra Fuente de radiación monocromador (o filtro) de excitación . . Medidor o registro monocromador (o filtro) Detector de emisión . Figura 4.4. Componentes básicos de un fluorímetro. Los sistemas para seleccionar la longitud de onda más empleados en instrumentos de luminiscencia son filtros y redes. De hecho, los instrumentos se clasifican en florímetros de filtro y espectrofluorímetros de red. De los primeros, los más utilizados son los filtros de interferencia, por proporcionar pequeñas anchuras de banda. Por lo que respecta a las redes, ofrecen las ventajas de presentar resolución uniforme y dispersión lineal a todas las longitudes de onda. El mayor inconveniente es que pasan varios órdenes espectrales, lo cual puede evitarse usando filtros en el camino óptico. Métodos luminiscentes 16 Los prismas se usan poco en instrumentos para luminiscencia, porque, aunque proporcionan una gran dispersión en el ultravioleta, es en el visible donde se realizan muchas medidas, y, además, para obtener una sensibilidad adecuada se necesitaría un prisma muy grande, lo cual no es económico. Las cubetas utilizadas para contener la muestra suelen ser de cuarzo, para permitir el paso de la radiación ultravioleta. Las más típicas son de 1 cm de espesor, como las utilizadas para medidas de absorción, excepto que todas las caras son transparentes a la radiación (están pulidas), ya que generalmente las medidas de fluorescencia se realizan en un ángulo de 90º respecto a la radiación incidente; a otros ángulos, la dispersión por la disolución y las propias paredes de la cubeta puede originar mayor ruido de fondo. En cuanto a los detectores, la mayor parte de los fluorímetros y espectrofluorímetros actuales usan tubos fotomultiplicadores como sistemas para detectar la radiación de fluorescencia. Finalmente, mencionar que mientras que los más precisos espectrofotómetros de absorción ultravioleta y visible utilizan un dispositivo de doble haz, esta operación no es práctica en instrumentos de luminiscencia. Por ello, hay que tener en cuenta siempre los problemas inherentes al empleo de haz sencillo. ESPECTROS DE EXCITACION Y EMISION Debido a la presencia de dos monocromadores, pueden registrarse dos tipos de espectros: el espectro de excitación (intensidad de fluorescencia observada en función de la longitud de onda de excitación a una determinada longitud de onda de emisión) y el espectro de emisión (intensidad de la emisión fluorescente en función de la longitud de onda de emisión, a longitud de onda de excitación fija). Esto es, si se fija la λex y se mide la radiación emitida a las diferentes λem se obtiene el espectro de emisión. En cambio, si se mantiene constante la λem y se van variando las λex , se obtiene el espectro de excitación. Este es ligeramente diferente del espectro de absorción, pero muy semejante a él. 17 Claudio González Pérez . Excitación - absorción . . Fluorescencia 300 350 400 λ, nm 450 Figura 4.5. Espectros de excitación y de emisión. El espectro de emisión aparece, evidentemente, a longitudes de onda más largas que el de excitación (absorción) (figura 4.5.). Solamente las bandas de mayor longitud de onda del espectro de absorción suelen estar superpuestas con las bandas de menores longitudes de onda de la emisión*. Además, debido a que los espaciados entre los niveles vibracionales son similares en el estado fundamental y en el primer estado singulete excitado, el espectro de fluorescencia es aproximadamente una imagen especular del espectro de absorción. Para aplicaciones analíticas se usa el espectro de emisión, aunque corrientemente, cuando se trabaja con un espectrofluorímetro, se obtiene primero un espectro de excitación, con objeto de confirmar la identidad de la sustancia y seleccionar la longitud de onda óptima de excitación. * Estas bandas, ordinariamente llamadas "transiciones 0–0" se producen como consecuencia de transiciones entre niveles vibracionales cero de los estados fundamentales y primer estado singulete excitado. Métodos luminiscentes 18 Espectro verdadero y aparente Debido a que los espectrómetros de luminiscencia suelen ser de haz sencillo, todos los problemas inherentes a esta forma de operar (fluctuaciones de la fuente de radiación, inestabilidad del detector, etc.) están potencialmente presentes. Hay dos problemas particularmente molestos y son, que tanto la intensidad de la fuente de radiación como la sensibilidad de cualquier detector pueden variar con la longitud de onda. Cuando se obtienen espectros que dependen de las características del instrumento utilizado se denominan aparentes (tanto de excitación como de emisión, si bien, las distorsiones debidas a parámetros instrumentales se ponen de manifiesto fundamentalmente en el espectro de excitación). Cuando es posible corregir el espectro aparente considerando las características de la fuente y del detector se obtiene el espectro verdadero o corregido. La corrección puede hacerse de forma manual si se conocen las características de la fuente y del detector, si bien, existen instrumentos especialmente diseñados para llevar a cabo la corrección de forma automática. APLICACIONES Antes de describir algunas aplicaciones de los métodos fluorescentes, es interesante comparar la sensibilidad y la selectividad de los métodos luminiscentes en relación con los absorciométricos. Sensibilidad. Los métodos fluorimétricos son más sensibles que los absorciométricos. Esto se debe, sobre todo, a que en estos métodos el detector debe distinguir una pequeña diferencia entre dos señales grandes (Po y P), cada una de las cuales lleva su correspondiente ruido de fondo, mientras que en fluorimetría, el detector solo necesita poner de manifiesto una pequeña señal positiva frente a un ruido de fondo pequeño. De hecho, la sensibilidad en fluorimetría puede mejorarse aumentando Po, mientras que en absorciometría, al aumentar Po aumenta también P, no afectando a la absorbancia. En general, los métodos fluorimétricos suelen ser entre 10 y 100 veces más sensibles que los espectrofotométricos. Claudio González Pérez 19 Selectividad. La selectividad de los métodos luminiscentes suele ser mayor que la de los absorciométricos. De hecho, hay muchas especies capaces de absorber radiación, pero el número de ellas que pueden re-emitir es mucho menor. Además, en los métodos de fluorescencia, tanto la longitud de onda de excitación, como la de emisión, pueden seleccionarse para minimizar interferencias, mientras que en espectrofotometría solo la longitud de onda de absorción es seleccionable. Por tanto, si dos materiales fluorescentes difieren en el espectro de excitación o de emisión, es factible analizar uno selectivamente en presencia del otro. En cuanto a las aplicaciones de los métodos fluorimétricos, y ante la imposibilidad de dar cuenta de todas ellas, se citarán algunos ejemplos específicos, dentro de los grupos que se relacionan seguidamente. Sustancias inorgánicas Las sustancias inorgánicas pueden determinarse por los métodos siguientes: a) Análisis directo. Aunque bastantes especies inorgánicas presentan fluorescencia en estado sólido, pocos son los sistemas de este tipo aplicables analíticamente. En disolución, tampoco son demasiado numerosas las determinaciones directas; prácticamente se circunscriben a compuestos de uranilo (las sales de uranio tetravalente y los uranatos no son fluorescentes), algunos elementos pertenecientes a las tierras raras [Ce(III), Eu(III), Tb(III), Dy(III)] y Tl(I). Este último, en presencia de cloruro (TlCl43–) muestra una intensa emisión fluorescente a 450 nm. Un ensayo cualitativo para Tl(I) se basa en su fluorescencia violeta en presencia de KCl. b) Formación de quelatos fluorescentes. La formación de quelatos fluorescentes por combinación de un ión metálico con un ligando orgánico proporciona uno de los métodos más sensibles y selectivos para la determinación de muchos elementos. En la tabla 4.1. se muestran algunos ejemplos. La mayor parte de las aplicaciones inorgánicas de la fluorimetría se han desarrollado para elementos que no son de transición, pues aunque muchos iones metálicos de transición forman quelatos muy estables y complejos con ligandos aromáticos, un número relativamente pequeño de ellos son fluorescentes. Ello se debe a lo siguiente: en primer lugar, muchos iones de transición son paramagnéticos, lo cual favorece el cruzamiento entre sistemas y, en consecuencia, disminuye la probabilidad de desactivación por fluorescencia. Además, muchos complejos de metales de 20 Métodos luminiscentes transición poseen una gran cantidad de niveles energéticos poco espaciados, lo cual aumenta la probabilidad de desactivación por conversión interna. Tabla 4.1. Determinación fluorimétrica de especies inorgánicas Quelatos fluorescentes Sensibilidad Reactivo ( g/mL) Especie Ag+ Al3+ Al3+ Cu2+ Li+ Sn4+ Butilrodamina S Morina Rojo de alizarina R Luminocupferrón 8-hidroxiquinoleína Flavonol 0.01 0.05 0.007 0.1 0.2 0.1 Determinaciones indirectas Sensibilidad Reactivo ( g/mL) Especie Cl– F– PO43– Nitrato de uranilo Al–morina Al–morina 1.0 0.2 0.05 c) Determinaciones indirectas. Algunos aniones, tales como F– o CN– pueden determinarse indirectamente por medida de la disminución de la intensidad de fluorescencia de un determinado quelato (tabla 4.1.). Así, por ejemplo, el fluoruro puede determinarse indirectamente mediante el descenso de la fluorescencia que su presencia ejerce sobre la fluorescencia del complejo aluminio–morina, con un límite de detección de 0.2 µg/mL. En otros casos tiene lugar la liberación de un ligando y la formación posterior de un quelato fluorescente con otra especie. Así, es posible la determinación de cianuro mediante el proceso siguiente: SO 3K 2 SO – + 4 CN 3K 2 N + Pd(CN) O– O N Pd/2 SO 3K Mg N O Mg/2 fluorescente 2+ 2– 4 21 Claudio González Pérez Sustancias orgánicas Existe una amplia variedad de compuestos orgánicos que pueden determinarse por métodos fluorimétricos a niveles inferiores a 1 p.p.m. (µg/mL), y algunas de las especies más fluorescentes, tales como la fluoeresceína o la quinina a niveles considerablemente inferiores. Hay que recordar que, en principio, presentarán fluorescencia molecular especies altamente absorbentes, como compuestos no aromáticos altamente conjugados, aromáticos y heterocíclicos. Por eso, gran cantidad de hidrocarburos, colorantes, ácidos, aldehídos, alcoholes, compuestos nitrogenados, hidratos de carbono, pesticidas, porfirinas, esteroides, fármacos, etc. son susceptibles de ser detectados o determinados por métodos fluorimétricos. A modo de ejemplo, puede citarse la determinación de vitaminas, interesante desde el punto de vista histórico, por ser uno de los primeros grupos de compuestos biológicamente activos para los que se describieron métodos fluorimétricos. Muchos de estos compuestos tienen estructuras que presentan fluorescencia nativa, mientras que otros pueden convertirse en fluoróforos por procedimientos sencillos (tabla 4.2.) Tabla 4.2. Determinación fluorimétrica de vitaminas Vitamina Reactivo λex λem A B1 B2 B6 fluorescencia nativa + ferricianuro fluorescencia nativa +KMnO4 340 365 370 480 445 440 B12 fluorescencia nativa ac. dehidroascórbico + o-fenilendiamina 350 275 450 305 350 430 C D2 D3 + ac. tricloroacètico 390 480 E K fluorescencia nativa —— 270 — 370 — 22 Métodos luminiscentes La vitamina A puede determinarse aprovechando la fluorescencia nativa que presenta, midiendo la radiación emitida a 480 nm. CH3 CH3 CH3 CH3 . CH3 CH2 OH CH3 Vitamina A Dentro del grupo de vitaminas B, las hay que presentan fluorescencia nativa, como la B2 (riboflavina) y la B12 (cianocobalamina), mientras que otras, como la B1 (tiamina) y la B6 (piridoxina) necesitan una transformación previa, lo cual se consigue por oxidación con ferricianuro y permanganato rspectivamente. La vitamina C requiere la transformación previa en ácido dehidroascórbico y posterior condensación con o-fenilendiamina, para originar un fluoróforo azul. Por su parte, las vitaminas D2 y D3 dan productos altamente fluorescentes cuando se tratan con ácido tricloroacético y otros ácidos. El tocoferol (vitamina E) puede determinarse fluorimétricamente haciendo uso de su fluorescencia nativa, o bien, puede condensarse con o-fenilendiamina, después de oxidación para dar un derivado fluorescente de fenacina. Para la vitamina K no se han descrito métodos fluorescentes debido a que sufre descomposición a la luz ultravioleta. Dentro de este epígrafe general en el que se trata de las aplicaciones de la fluorimetría a la detección y determinación de compuestos orgánicos, se indican seguidamente algunas aplicaciones dentro de campos concretos. Química clínica. La más extensa aplicación de los métodos fluorimétricos, en términos de número de análisis realizados por dia, tiene lugar, probablemente, en química clínica. Muchas determinaciones clínicas importantes se realizan rutinariamente por estos métodos en muchos laboratorios. La alta sensibilidad, simplicidad y bajo coste de la instalación son factores importantes en la adopción de estos métodos. De los centenares de métodos descritos para decenas de compuestos diferentes, se citan, a modo de ejemplo, y como curiosidad algunos de ellos. Claudio González Pérez 23 La determinación de fenilalanina es posible fluorimétricamente usando solamente 25 µL de suero. Es importante esta determinación para la prevención de ciertos tipos de subnormalidad, ya que, la incapacidad para metabolizar este aminoácido hace que tenga lugar su acumulación en los tejidos, originando daños en el cerebro y retraso mental progresivo. Asimismo, pueden determinarse estrógenos en orina, en concentraciones del orden de 0.05 µg/mL, corticosteroides, de gran importancia para evaluar la función de las glándulas suprarrenales, catecolaminas, importantes por su influencia sobre el sistema vascular, porfirinas en orina, que pueden servir para indicar defectos en la médula ósea, trastornos hepáticos e incluso envenenamiento por plomo, así como otras especies de gran importancia práctica en muchos casos de interés clínico. La fluorimetría también se utiliza con éxito en análisis bioquímico. Así, por ejemplo, es posible la determinación de la secuencia de nucleótidos en el ADN con marcas fluorescentes, lo cual es fundamental para la elaboración de los códigos genéticos. La forma de proceder consiste en "marcar" las unidades fundamentales de terminación de cadena con grupos fluorescentes que emitan a longitudes de onda determinadas. Análisis forense. La gran sensibilidad de muchos métodos fluorimétricos hace que sean particularmente adecuados en muchas determinaciones relacionadas con análisis forense. Como ejemplo se muestra seguidamente la forma de detectar huellas digitales latentes por fluorescencia producida por láser* Cuando un dedo presiona sobre una superficie, aproximadamente 0.1 mg de material permanece adherido a ella. De él, el 98-99 % es agua, que se evapora, quedando un residuo del orden de 1 µg. Aproximadamente, la mitad son sustancias inorgánicas (por ejemplo, NaCl) y el resto una mezcla de sustancias orgánicas (aminoácidos, lípidos, vitaminas). La detección de los restos de aminoácidos se lleva a cabo por tratamiento con ninhidrina (I), la cual reacciona con ellos originando un producto púrpura (II), no fluorescente, invisible si la cantidad es muy pequeña. * Anal. Chem. 61, 557 A (1989). 24 Métodos luminiscentes O– O OH OH . O N= O O [I] O . [II] Posteriormente, por tratamiento con cloruro de cinc, se forma un producto fluorescente (III) que se pone de manifiesto mediante su fluorescencia inducida por láser. O O N O Zn H2 O Cl O H2 O [III] Fármacos y drogas. La fluorimetría también encuentra amplia aplicación en el análisis de fármacos y drogas. Su importancia se basa en la gran sensibilidad y selectividad de las técnicas fluorimétricas. Hay que considerar que la farmacología requiere métodos analíticos capaces de distinguir entre varios medicamentos y sus productos metabólicos. Debido a que muchos fármacos se administran en dosis muy pequeñas, con frecuencia inferiores a 100 µg diarios, los métodos analíticos deben ser altamente sensibles, sensibilidad que debe ser suficiente para detectar las pequeñas cantidades expulsadas del organismo. En la tabla 4.3. se muestran algunos ejemplos de determinaciones fluorimétricas para este tipo de sustancias. 25 Claudio González Pérez Tabla 4.3. Determinación fluorimétrica de fármacos y drogas Sustancia Condiciones λex (nm) λem (nm) Sensibilidad (µg/mL) Adrenalina pH 1 295 335 0.1 Ac. salicílico pH 11 310 435 0.1 Ampicilina hidrólisis 346 422 0.05 Aspirina HAc–CHCl3 280 335 0.01 Atropina eosina 365 556 1.0 Codeina pH 1 245,285 350 0.1 Digital HCl-glicerina 350 465 0.1 Estreptomicina pH 13 366 445 0.1 LSD pH 7 325 365 0.002 Morfina pH 1 285 350 0.1 Pentotal pH 13 315 530 0.1 Quinina pH 1 350 450 0.002 En Química Agroalimentaria también se utilizan las técnicas luminiscentes con cierta extensión. Así, por ejemplo, los antioxidantes son sustancias que se añaden a los alimentos que contienen grasas o aceites para evitar su degradación durante el proceso de elaboración. Una de las sustancias empleadas es el hidroxianisol butilado (BHA). Esta sustancia está permitida por la legislación vigente y puede separarse por destilación con arrastre en corriente de vapor y determinarla directamente en el destilado por espectrofluorimetría (λex=293 nm; λem=323 nm). Contaminación ambiental. Muchas aplicaciones de los métodos fluorimétricos en relación con la contaminación atmosférica se refieren a la determinación de hidrocarburos aromáticos polinucleares, muchos de los cuales son cancerígenos. En ocasiones, pueden cuantificarse productos no fluorescentes mediante una reacción 26 Métodos luminiscentes previa que origine un fluoróforo y en combinación con técnicas de separación cromatográfica. Así, por ejemplo, se han encontrado isocianatos alifáticos (muy perjudiciales para la salud) en el aire de lugares de trabajo donde se emplean espumas de poliuretano. El procedimiento consiste en tratar con 1-naftil-metilamina para formar derivados fluorescentes que pueden separarse por cromatografía líquida. . NH 2 NCO NHCNHCH 2 + 2 . NCO diisocianato NHCNHCH 2 derivado fluorescente . Respecto a la contaminación de aguas, se encuentra un interesante ejemplo en el uso del espectro de fluorescencia casi como "huella digital" para la identificación de crudos y otros materiales petrolíferos procedentes de vertidos. La técnica, relativamente moderna, proporciona unos resultados tan dignos de confianza, al menos, como los obtenidos por procedimientos de identificación convencionales, habiendo sido adoptada por los servicios de guarda costas de algunos países. 27 Claudio González Pérez FOSFORESCENCIA Las medidas de fosforescencia se llevan a cabo de forma análoga a las de fluorescencia, excepto en lo siguiente: la muestra normalmente se mide a la temperatura del nitrógeno líquido (77ºK) para minimizar la desactivación por colisiones, y la excitación debe ser interrumpida un cierto tiempo para observar la emisión de fosforescencia en ausencia de la emisión fluorescente. Para ello se utilizan dispositivos como el representado en la figura 4.6. cubeta con la muestra vaso Dewar con N 2 líquido . Figura 4.6. Medida de fosforescencia. En cuanto a las aplicaciones, la fosforimetría no ha tenido una utilización tan amplia como la fluorimetría, debido probablemente a la necesidad de trabajar a bajas temperaturas y a la poca precisión de las medidas. Sin embargo, la gran selectividad que potencialmente presenta esta técnica la hace particularmente adecuada para algunas determinaciones. Así, por ejemplo, de entre las muchas sustancias que normalmente se encuentran en la sangre, solo el triptofano presenta una cierta fosforescencia. Ello hace que la sangre normal muestre muy poca fosforescencia, lo cual hace posible la determinación de un cierto número de fármacos fosforescentes presentes a nivel de trazas. Las medidas de fosforescencia a temperatura ambiente pueden llevarse a cabo en ocasiones sobre compuestos adsorbidos en un soporte rígido, como papel de filtro, lo cual minimiza la desactivación del estado triplete en forma no radiante. 28 Métodos luminiscentes QUIMIOLUMINISCENCIA La quicio-luminiscencia se origina cuando se produce una especie excitada como consecuencia de una reacción química. A + B —> X* X* —> X + hν El número de reacciones químicas que dan lugar a productos luminiscentes es muy escaso, lo cual limita las posibilidades de uso de esta técnica. Sin embargo se observan ciertas ventajas en orden a su alta selectividad, simplicidad y gran sensibilidad. La instrumentación necesaria para llevar a cabo medidas quicio-luminiscentes es muy simple; únicamente es necesario un recipiente donde tenga lugar la reacción y un tubo fotomultiplicador para detectar la radiación emitida. No suele ser necesario dispositivo alguno para seleccionar la longitud de onda, ya que la única fuente de radiación es la reacción química. La mayor parte de las aplicaciones analíticas de la quicio-luminiscencia en fase líquida se basan en la medida de la luminiscencia producida por ciertos reactivos, como luminol [I] y lucigenina [II] en presencia de oxidantes y en medio alcalino. CH N NH 2 3 + O . NH . NH N+ O CH [I] 3 [II] La oxidación del luminol da lugar a una luminiscencia azul con un máximo de emisión a 425 nm, originada en un proceso del tipo siguiente: NH 2 NH 2 O – NH . NH O COO – + OH + O 2 + N 2 + 2 H2 O + hν – COO 29 Claudio González Pérez La intensidad de la luminiscencia producida por el luminol y la lucigenina se modifica frecuentemente por la presencia de ciertos iones metálicos, lo cual proporciona un método muy sensible para su determinación. En muchos casos se observa una exaltación de la intensidad de la radiación emitida, y en algunos se produce una inhibición de la luminiscencia. En la tabla 4.4. se muestran algunos ejemplos de determinaciones de iones metálicos por este procedimiento. Tabla 4.4. Determinación quimioluminiscente de metales Especie Reactivo Sensibilidad Co(II) Cu(II) Fe(II) Hg(II) Hg(II) V(IV) Ti(IV) luminol + H2O2 10–9 M 10–9 M 10–9 M 0.2 µg/mL 0.002* µg/mL 0.002 µg/mL 0.02* µg/mL luminol + H2O2 luminol + H2O2 luminol + H2O2 lumniol+H2O2+Cu2++CN– luminol + O2 + P2O74– luminol + H2O2 + Cu2+ *Atenuación de la quimioluminiscencia En muchos casos, los iones metálicos ejercen un efecto catalítico sobre la oxidación del reactivo. Algunos sistemas de este tipo, basados en la oxidación del luminol catalizada por iones metálicos, se han adaptado para el análisis de oxidantes, tales como H2O2, ClO–, Br2, I2, Fe(CN)63– y MnO4–, obteniéndose límites de detección del orden de 10–9 a 10–10 M. Asimismo, determinadas especies orgánicas presentan también un efecto catalítico o inhibidor sobre la reacción del luminol con el peróxido de hidrógeno o con el oxígeno, haciendo posible su determinación. Así, por ejemplo, el efecto catalítico de la hemoglobina sobre la oxidación del luminol permite detectar la presencia de sangre en diluciones de 1 en 107. La quicio-luminiscencia también se utiliza para el análisis de gases, siendo particularmente importantes los métodos desarrollados para ciertos contaminantes atmosféricos. Así, los analizadores automáticos para el NO se basan en la reacción quicio-luminiscente entre dicha especie y ozono: NO + O3(reactivo) —> NO2* + O2 NO2* —> NO2 + hν 30 Métodos luminiscentes La respuesta es lineal entre 1 ppb y 10000 ppm. Esta reacción se utiliza también para la determinación de NO2 en muestras de interés ambiental. En este caso, es necesaria una reducción previa de NO2 a NO, lo cual se lleva a cabo operando a 800 º en presencia de radiación ultravioleta. NO 2 UV 800º NO +O 3 NO 2 *+ O 2 NO 2 + h ν El propio ozono puede ser determinado midiendo la luminiscencia producida por reacción con rodamina B adsorbida en la superficie de gel de sílice. Otro ejemplo de proceso quimioluminiscente es el basado en la reacción de un oxidante, como el flúor, con especies orgánicas que contengan el grupo tio: R—S—R + fluor —> Productos + hν Esta reacción es la base del detector quicio-luminiscente utilizado en cromatografía, específico para esos compuestos orgánicos.
