espectrofotometría

ESPECTROFOTOMETRÍA
Lic. José Manuel Arriaga Romero
PRINCIPIOS
ESPECTROFOTOMÉTRICOS
• Características de la luz
• Longitud de onda
• Es igual a la distancia entre dos puntos idénticos
sobre ondas de luz consecutivas
• Mientras más cerca estén una onda de otra
• La longitud de onda es más pequeña
• La luz contiene mayor cantidad de energía
• Hay mayor número de fotones en una distancia
dada
• Mientras menor es la longitud de onda, hay mayor
número de fotones en una distancia dada
• Mayor cantidad de fotones representa mayor
energía
• Las longitudes de onda más pequeñas representan
mayor cantidad de energía que las longitudes de
onda más grandes
• Espectro electromagnético
• La unidad de la longitud de onda es el nanómetro
• 1 nm = 10-9 m
• Se expresa por la letra griega lambda (λ)
• En base a las longitudes de onda el espectro
electromagnético se divide en tres rangos
• Luz ultravioleta
• Luz visible
• Luz infrarroja
(UV)
(VIS)
(IR)
190 nm a 390 nm
390 nm a ± 750 nm
mayor de 750 nm
• La luz en el rango ultravioleta es invisible
• La luz en el rango visible excita las células
retinianas
• Percepción de colores
• La luz en el rango infrarrojo se percibe como calor
y sus longitudes de onda se expresan en μm
• 1 μm = 10-6 m
• Las longitudes de onda menores a las del rango
ultravioleta incluyen los rayos X y la radiación
gamma
• Tienen tanta energía que penetran los tejidos
• Las longitudes de onda mayores a las del rango
infrarrojo (medidas en cm) incluyen a las ondas
de radio
• Curvas de espectro de absorción
• Cada color visible corresponde a un rango de
longitudes de onda
• Cada soluto coloreado absorbe un patrón único
de longitudes de onda cuyas energías
corresponden a los niveles de energía de los
electrones en los enlaces químicos
• El color percibido de una solución será dominado
por las longitudes de onda que son transmitidas (y
no por las absorbidas) por el soluto
• Las longitudes de onda absorbidas y transmitidas
son complementarias una de otra
• El color visible de una solución será el
complemento de las longitudes de onda que son
absorbidas
• Una solución de hemoglobina absorbe luz verde a
540 nm y se ve de color rojo
• Una solución de bilirrubina absorbe luz azul a 450
nm y se ve de color amarillo
• El patrón de absorbancias a diferentes longitudes
de onda es tan distintivo que un soluto puede un
soluto puede ser identificado por su espectro de
absorción
• Una curva de espectro de absorción es una
gráfica que muestra los patrones de
absorbancias de un soluto a diferentes
longitudes de onda
• Otro uso del espectro de absorción es para
decidir la longitud de onda a la que se hará un
análisis cuantitativo
• Debe elegirse la longitud de onda a la que la
absorbancia es mayor, debido a que aún una
pequeña cantidad de soluto puede producir na
cantidad medible de absorbancia
• En los ejemplos anteriores la hemoglobina es
medida a una longitud de onda de 540 nm y la
bilirrubina a 450 nm
• Debe elegirse el pico de absorción que presente
el mayor ancho, aún si hay otro con mayor pico
de absorción pero más estrecho
• Transmisión y absorción de luz
• Un espectrofotómetro utiliza una lámpara de
alta intensidad y mide la cantidad de luz que
penetra la solución coloreada
• La proporción de luz que penetra la solución se
llama transmitancia (T)
• Se expresa como porcentaje (%T) de la luz que
atraviesa la solución (I) en relación a la
cantidad de luz que entra a la solución (lo)
• lo es la luz incidente y l es la luz transmitida
• La absorbancia se define como el logaritmo
negativo de la transmitancia
A = - log T = - log l/lo
• La fórmula simplificada para su cálculo,
habiendo aplicado una transmitancia de 100 %
para lo y transformando l en %T, es:
A = 2- log %T
• Tiene la ventaja que hay proporcionalidad
directa con la concentración de soluto
• A mayor concentración de soluto mayor
absorbancia, y viceversa
• Esto permite obtener una gráfica lineal cuando
se grafican las absorbancias de luz obtenidas
con diferentes concentraciones de soluto
• Llamada curva de calibración
• Ley de Beer
• Es la expresión formal de la relación entre la
absorbancia y la concentración de soluto
• Se basa en tres supuestos
• La luz que incide sobre el soluto es
monocromática (una sola longitud de onda)
• El soluto que está siendo analizado es el único
coloreado presente en la solución
• La única luz que está siendo medida proviene
de la fuente de luz analítica
• La adherencia a estas tres condiciones es difícil
• Hay limitaciones inherentes a la precisión en la
medición de la cantidad de luz transmitida
• El %T es una función logarítmica, por lo que deben
evitarse las lecturas entre 95 y 100 %T y entre 0 y 10 %T
• Calibración
• Si todas las condiciones son óptimas
• La absorbancia de una solución debiera ser
proporcional a la concentración de su soluto coloreado
• Una solución calibradora debiera ser suficiente
• Si se han cumplido con las condiciones sólo se necesita
• Poner el espectrofotómetro en 0 %T (oscuridad completa
= absorbancia infinita)
• Poner el espectrofotómetro en 100 %T (falta completa de
color = absorbancia 0)
• La calibración se simplifica con la fórmula siguiente:
𝐴𝐴 𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑 𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑
𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶 𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑 𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑
=
𝐴𝐴 𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐
𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶𝐶 𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐
• Reordenando se obtiene la fórmula de Beer-Lambert:
Concentración del desconocido =
• Que se resume como:
CM
=
𝐴𝐴 𝑀𝑀
𝐴𝐴𝑆𝑆𝑆𝑆
X CSt
𝐴𝐴 𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑 𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑
𝐴𝐴 𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑𝑑 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐
X Concentración del calibrador
CM = concentración del soluto en la muestra
AM = absorbancia del soluto coloreado en la solución
de la muestra
CSt = concentración del soluto en el calibrador
ASt = Absorbancia del soluto coloreado en la solución
del calibrador
La espectrofotometría es un método
analítico que usa las propiedades de la luz
para mediciones cualitativa y
cuantitativas.
La medición depende tanto de la longitud
de onda como de las propiedades de la
partícula de luz.