Ensayo de toxicidad crónica con microalgas clorofíceas

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Ensayo de toxicidad crónica
con microalgas clorofíceas
Felipe Fernando Martínez-Jerónimo
C lasificación
del ensayo :
AE
Principio de la prueba
Esta prueba se basa en la determinación de los efectos inhibitorios que sobre la
tasa de crecimiento poblacional pueden producir los compuestos tóxicos puros,
así como los contenidos en mezclas de composición conocida, en productos
formulados o los que pueden estar presentes en muestras de agua o en efluentes con o sin tratamiento. Este ensayo se fundamenta en que una población
microalgal, cuando se encuentra en condiciones propicias para su desarrollo,
es capaz de aumentar su tamaño de población, por lo que en esas condiciones
es posible detectar si los productos problema o muestras a analizar producen
inhibición en la tasa de crecimiento poblacional. Las microalgas, como componentes del fitoplancton, constituyen el grupo de productores primarios que
son fundamentales en todos los ecosistemas acuáticos, ya que determinan la
productividad de los mismos y permiten el desarrollo de consumidores de
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Amplia experiencia
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diferente nivel trófico. Es por ello que resulta importante evaluar los efectos
sobre este grupo de organismos. Siendo la tasa de crecimiento una respuesta
sensible y fácil de monitorear, se puede evaluar la disminución de dicha respuesta como un indicador del estrés al cual están sujetas las poblaciones de
microalgas. Este supuesto es válido para especies de microalgas que se reproducen asexualmente, por fragmentación o por la formación de autosporas. La
tasa de crecimiento poblacional se puede medir directa o indirectamente, lo
cual es una gran ventaja de esta prueba. Las mediciones directas se realizan
mediante el conteo (en una cámara Neubauer o hemacitómetro) de los individuos en muestras representativas, mientras que las mediciones indirectas se
obtienen a través de la determinación de la densidad óptica (o absorbancia) a
una longitud de onda adecuada, el peso seco, el contenido de clorofila u otros
pigmentos fotosintéticos, la concentración de proteínas, etc.
Este método consiste en exponer a las microalgas a una serie de concentraciones o diluciones de las muestras problema, espaciadas geométricamente
en base 2. En el bioensayo definitivo, la concentración mayor deberá inhibir
completamente el crecimiento, en tanto que la tasa de crecimiento poblacional
en la concentración menor no deberá diferir significativamente de la determinada para el tratamiento usado como control negativo.
Se sugiere emplear como organismos de prueba a las microalgas clorofíceas
Pseudokirchneriella subcapitata (anteriormente conocida como Selenastrum
capricornutum o Raphidocelis subcapitata) (figura 6.1) o Ankistrodesmus falcatus (figura 6.2), que son especies de reproducción asexual y unicelulares,
por lo que es sencillo realizar con ellas las cuentas para la determinación de
la densidad celular, cuando se escoge a ésta como una medida directa del
tamaño de la población algal.
La respuesta medida es la inhibición en la tasa de crecimiento poblacional
en un período de 96 horas de exposición. La ventaja de esta prueba es que es
de fácil realización y proporciona una medida directa de los efectos sobre la
población experimental expuesta.
Esta prueba es adecuada para la evaluación de los efectos tóxicos crónicos
de efluentes con o sin tratamiento, muestras de agua de cuerpos de agua receptores de descargas, compuestos puros y mezclas de composición conocida
o desconocida, principios activos y productos formulados comerciales. Es útil
además para la clasificación de la toxicidad de compuestos en el monitoreo de
la calidad del agua en ecosistemas acuáticos y en la evaluación de la eficiencia
de los sistemas de tratamiento de las aguas residuales.
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Figura 6.1. Microfotografía de Pseudokirchneriella subcapitata (antes denominada como
Selenastrum capricornutum) (obtenida por microscopía de contraste de fases)
Figura 6.2. Microfotografía de Ankistrodesmus falcatus
(obtenida por microscopía de contraste de fases).
Infraestructura en el laboratorio
Para esta prueba se requiere que el laboratorio cuente con un área para trabajo
en condiciones de esterilidad (cuarto de inoculación o campana de flujo laminar con filtración y esterilización de aire), además de área para esterilización
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de materiales y soluciones (con horno y autoclave). Adicionalmente, se deberá
contar con una área acondicionada para el cultivo, la cual debe tener un sistema
regulado de iluminación artificial con lámparas fluorescentes “luz de día”, con
control de temperatura y con suministro de aire comprimido filtrado y libre
de aceite. El suministro de aire se emplea sólo para la producción de inóculos
y para la propagación de cultivos activos de la cepa, pues los bioensayos se
realizan sin aireación, aunque en este último caso es deseable el contar con
una placa agitadora orbital, a fin de evitar la sedimentación de las microalgas.
También se puede evitar la sedimentación durante los bioensayos mediante
agitación manual periódica.
Material
La cristalería que se requiere es la típica de un laboratorio, aunque debe incluir los materiales indispensables para el trabajo microbiológico, además de
pipetas automáticas, propipetas, etc. De manera específica, se debe considerar
que los ensayos toxicológicos se deben realizar en matraces Erlenmeyer de
vidrio, de 50 o 125 mL de capacidad total, y tubos de ensaye con tapón de
baquelita de 100 X 15.
Equipo
Los equipos requeridos son los básicos de cualquier laboratorio de análisis
biológicos, los cuales incluyen: balanza analítica, microscopio óptico, estereomicroscopio, autoclave (de gas o eléctrica), potenciómetro, oxímetro
salinómetro o conductivímetro y espectrofotómetro.
Reactivos
Es indispensable contar con los compuestos necesarios para la preparación del
medio de cultivo para el crecimiento algal que se detallan más adelante. Este
medio funciona también como agua de dilución para preparar las soluciones
de la muestra problema durante el bioensayo. Para simplificar la preparación
del medio de cultivo se sugiere la preparación de soluciones concentradas,
que deberán conservarse en frascos herméticamente cerrados, protegidos de
la luz y a baja temperatura.
Todos los reactivos deberán ser grado analítico y de la máxima pureza posible, a fin de evitar exponer a los organismos a elementos traza o compuestos
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potencialmente tóxicos, lo que podría afectar la respuesta de las microalgas
durante el bioensayo.
Organismos de prueba
La cepa utilizada debe provenir de un cepario o colección de laboratorio autorizado o certificado. Aunque particularmente A. falcatus es una especie que
puede ser obtenida mediante colectas de muestras de fitoplancton de cuerpos
de agua dulce, los procesos de aislamiento, purificación e identificación son
laboriosos y tardados, por lo que es preferible adquirirla a través de un laboratorio que cuente con ella. Una vez obtenida, la cepa debe ser conservada
de acuerdo a las instrucciones del proveedor, en refrigeración y en medio de
cultivo solidificado con agar bacteriológico al 1.5%. La calidad microbiológica
de la cepa debe ser revisada periódicamente, pues aun cuando no se requieren
cepas axénicas, la carga bacteriana en la cepa unialgal debe ser reducida y la
población algal nunca debe estar contaminada con hongos, protozoarios ni
con otros organismos fotosintéticos, tales como las cianobacterias, que con
relativa facilidad pueden contaminar a una cepa monoespecífica, sobre todo
cuando no se realiza un manejo aséptico o cuando no se trabaja con medios
de cultivo y materiales debidamente esterilizados.
Cultivo y mantenimiento o almacenamiento de los
organismos
Las cepas se conservarán en tubos de ensaye de 150 X 15, con tapón de baquelita,
que contendrán medio de cultivo solidificado mediante la adición de agar bacteriológico al 1.5%. También se recomienda mantener cultivos activos de la cepa
en matraces de 125 o 250 mL. El mantenimiento de las condiciones asépticas en
el medio de cultivo y en los materiales que se emplearán es fundamental para
garantizar la calidad de respuesta de las microalgas; también se debe considerar
que todo el manejo y conservación de las cepas, así como los procesos para realizar los bioensayos, presupone condiciones de esterilidad. El medio de cultivo
sugerido es el recomendado por la Agencia para la Protección Ambiental de los
Estados Unidos (USEPA, 2002), que se muestra en la tabla 6.1, el cual es adecuado
tanto para la conservación de la cepa como para la propagación de los inóculos y
como agua de dilución para los bioensayos. Sin embargo, para realizar cultivos de
crecimiento rápido (preparación de inóculos) se recomienda, de manera adicional,
el medio Basal de Bold que se muestra en la tabla 6.2.
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Tabla 6.1. Composición del medio de cultivo y agua de dilución
para las pruebas de toxicidad con microalgas clorofíceas (USEPA, 2002)
Macronutrientes
Concentración
Elemento
(mg/L)*
NaNO3 25.5
MgCl2•6H2O 12.2
CaCl2•2H2O 4.41
MgSO4•7H2O 14.7
K2HPO4 1.04
NaHCO3 15.0
Micronutrientes
H3BO3 MnCl2•4H2O ZnCl2 CoCl2•6H2O CuCl2•2H2O Na2MoO4•2H2O FeCl3•6H2O Na2EDTA•2H2O Na2SeO4
(µg/L)*
Concentración
(mg/L)*
N
Mg
Ca
S
P
Na
K
C
4.20
2.90
1.20
1.91
0.186
11.0
0.469
2.14
Elemento
(µg/L)*
185.0
B
416.0
Mn 3.27
Zn 1.43
Co 0.012
Cu 7.26
Mo 160.0
Fe 300.0
2.39
Se 32.5
115.0
1.57
0.354
0.004
2.88
33.1
0.91
*Las cantidades indicadas se diluyen en agua destilada o deionizada (con conductividad menor a 5 µS
cm-1).
Los medios de cultivo se preparan a partir de soluciones patrón o concentradas. Tanto para la propagación como para los bioensayos se requiere
proporcionar iluminación continua con intensidad luminosa de 4,500 a 5,000
luxes y el crecimiento e incubación se logra a temperatura de 25 ± 1 °C. La
calidad de respuesta de la cepa debe ser evaluada periódicamente con el
compuesto tóxico de referencia, sulfato de cobre, evaluando la concentración
media de inhibición (CI50). Los bioensayos en su fase de prueba definitiva,
tienen duración de 96 horas.
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Tabla 6.2. Composición del medio de cultivo basal de Bold para el mantenimiento
de cepas y propagación de microalgas clorofíceas
Reactivo
NaNO3
CaCl2•2H2O
MgSO4•7H20
K2HPO4
KH2PO4
NaCl
FeSO4•7H2O
H2SO4
H3BO3
EDTA
KOH
ZnSO4•7H2O
MnCl2•4H2O
MoO3
CuSO4•5H2O
Co(NO3)2•6H2O
Concentración
(mg/L)*
250
25
75
75
175
25
4.98
0.001 (ml/L)
11.42
50
31
8.82
14.4
0.71
1.57
0.49
*En agua destilada o deionizada.
Procedimiento de prueba
Preparación del material antes de la prueba
Todos los materiales empleados deberán ser de vidrio de borosilicato, lavado
de acuerdo al procedimiento complementario descrito en este documento,
para eliminar todo vestigio de compuestos tóxicos que pudiera afectar los
resultados en el bioensayo. Como se ha dicho, todo el manejo debe realizarse en condiciones asépticas, con materiales, medios de cultivo y soluciones
esterilizadas de manera adecuada. Para ello puede usarse calor seco a 200 °C
durante 1 hora, autoclave a 15 libras/pulgada2 por 15 minutos o filtración
Millipore® con membranas estériles de 0.45 µm. En este último caso el equipo
y membranas deben ser previamente esterilizados en autoclave.
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Desarrollo de la prueba
El bioensayo es estático, sin renovación de la solución de prueba, realizándose
siempre con soluciones acuosas de las muestras problema. Cuando se trate de
materiales de baja hidrosolubilidad, se deberán emplear disolventes de baja
toxicidad, como acetona, etanol, metanol o dimetil sulfóxido, teniendo siempre
presente que su concentración no debe ser superior a 1 mL/L, independientemente de que se deberá implementar una segunda serie control que contenga la
máxima cantidad de solvente utilizada. Se deberá evaluar el pH y la conductividad eléctrica de las muestras al inicio y al término de la prueba. Se ensayarán al
menos 5 concentraciones o diluciones de los materiales a evaluar, contando cada
una de ellas con al menos 3 réplicas. Los recipientes de prueba sugeridos son
matraces Erlenmeyer de 50 o 125 mL, aunque también se pueden emplear tubos
de ensaye de 100 X 15, de preferencia con tapón de baquelita o con tapones de
algodón recubiertos de gasa. El volumen total de prueba será de 25, 75 o 7 mL.
La temperatura debe ser de 25 ± 2 °C, la iluminación continua con intensidad
de 4,500 a 5,000 luxes, proporcionada por lámparas fluorescentes “luz de día”.
El inóculo inicial en todos los casos será de 10,000 células/mL. La respuesta
evaluada será la densidad celular determinada a las 24, 48, 72 y 96 horas en
todas las réplicas de todas las concentraciones y de la serie testigo, mediante
conteo en la cámara Neubauer. Adicionalmente se deberán hacer observaciones
al microscopio compuesto de muestras de los cultivos, para registrar posibles
alteraciones en la morfología celular (con respecto a la serie testigo), así como
determinar si ocurren cambios en los patrones de distribución citoplásmica de
las células o en la coloración del cultivo. Para evaluar la densidad poblacional
se empleará la cámara Neubauer o hemacitómetro y el microscopio compuesto
al aumento de 40X. Se debe tener una variación máxima del 20% entre las dos
cuentas de una misma muestra, de lo contrario se deberá repetir o aumentar
el número de conteos por muestra, teniendo cuidado en el llenado de ambos
lados de la cámara de Neubauer. La distribución de los recipientes de cultivo
en el área de incubación deberá ser aleatoria, a fin de evitar sesgos por efectos
diferenciales en la iluminación o en la temperatura. De manera resumida, el
procedimiento de prueba se muestra en la tabla 6.3.
Expresión de los resultados
Se trazarán las curvas individuales de incremento poblacional para todas las concentraciones y el testigo, incluyendo en cada una, para cada tiempo, los datos de
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Tabla 6.3. Condiciones recomendadas para las pruebas de toxicidad crónica
con microalgas clorofíceas
Tipo de prueba
Duración
Iluminación
Fotoperíodo
Temperatura
Aireación
Recipientes de prueba
Volumen de prueba
Edad de cultivo al inóculo
Densidad celular del inóculo
Concentraciones o diluciones ensayadas
Replicas por concentración
Efecto medido
Efectos adicionales medidos
Periodicidad de las observaciones
Criterio de aceptación de la prueba
Estática sin renovación de la solución de prueba
96 horas (prueba definitiva)
Artificial, controlada, con lámparas
fluorescentes “luz de día” de 4,500 a 5,000 luxes
Iluminación continua (24 horas luz:0 horas
oscuridad)
25 ± 1 ºC
No, agitación manual periódica durante toda
la prueba
Matraces Erlenmeyer de 50 o 125 mL o tubos
de ensaye de 100 X 15, con tapón de baquelita
o tapón de algodón
25, 75 o 7 mL
6 días (fase exponencial de crecimiento)
10,000 células/mL
Mínimo 5, más el control negativo (prueba
definitiva)
Mínimo 3
Inhibición del crecimiento poblacional,
medida como densidad celular
Cambios en la morfología y el aspecto celular
Cada 24 horas
La densidad celular en el testigo, al término de
la prueba (96 horas), debe ser superior a 1X106
células/mL y el coeficiente de variación para el control no debe exceder del 20%
todas las réplicas, así como los valores promedio y las barras de error estándar para
la densidad celular, que se expresará como células algales por mL. Adicionalmente,
con los datos de densidad celular para todas las réplicas en cada concentración y en
el control a las 96 horas, se realizará un análisis de varianza (ANOVA) de un factor,
a fin de determinar si existen diferencias significativas entre las concentraciones
y con respecto al control. Si el resultado del ANOVA es significativo, entonces se
deberán realizar pruebas post hoc o comparaciones múltiples para determinar los
tratamientos que difieren significativamente entre si. Se sugiere emplear métodos
como el de Tukey, SNK o LSD; como complemento a estas comparaciones se aplicará
la Prueba de Dunnett para determinar las concentraciones o diluciones que producen
densidades celulares significativamente menores, con respecto al control negativo.
El análisis de comparaciones múltiples también permite determinar los valores de
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Ensayos para agua dulce
LOEC, NOEC y la MATC (máxima concentración permisible del compuesto tóxico)
o la concentración de seguridad para exposiciones crónicas.
También con los datos promedio de densidad celular a las 96 horas se
determinará el porcentaje de inhibición con respecto al control negativo y se
calculará la concentración media de inhibición (CI50) o concentración efectiva
media (CE50) e intervalo de confianza (P = 0.95%) a las 96 horas por el método que resulte más adecuado (Probit, Logit, Binomial o Ángulos Móviles
Promedio). La inhibición se determinará como porcentajes de disminución en
la densidad celular con respecto a la densidad celular promedio alcanzada en
la serie utilizada como control negativo. En caso de que se detectaran efectos
estimulatorios (mayor crecimiento poblacional en alguna concentración de la
muestra problema que la registrada en el control negativo) no se incluirán esos
datos para la determinación de la CE50, a fin de evitar errores en su estimación,
aunque esto deberá quedar reflejado en las gráficas de crecimiento poblacional.
Si este fuera el caso y si además se determinara que el efecto es significativo, se
deberán discutir las posibles causas de la estimulación. Este ensayo es semejante
a los protocolos de prueba propuestos como métodos estandarizados por la
Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos de América (USEPA,
1996), la Sociedad Americana de Evaluación y Materiales (ASTM, 2004) y la
Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OECD, 1984).
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