Tema 11 - OCW Usal

Cromatografía de gases
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Tema 11
CROMATOGRAFIA DE GASES
La cromatografía de gases (CG) incluye todos los sistemas cromatográficos en los
que la fase móvil es un gas. Desde la década de los cincuenta, en la que Martin y
James (1952) descubrieron la cromatografía gas-líquido hasta el desarrollo de la
HPLC, puede considerarse como el método de separación mas importante. En la
actualidad, la CG es una técnica analítica usada rutinariamente en multitud de
laboratorios universitarios, de investigación e industriales, debido a su alta resolución,
sensibilidad y selectividad.
La utilización de columnas capilares, así como el empleo de la CG en conjunción
con otras técnicas, especialmente la espectrometría de masas, han aumentado
espectacularmente sus posibilidades, siendo factible la separación, cuantificación y
subsiguiente caracterización de una gran variedad de productos en distintas mezclas,
desde gases permanentes y mezclas de isótopos, hasta aceites esenciales en
perfumes, ácidos grasos en grasas animales y agentes contaminantes en aguas y
suelos.
Además de las aplicaciones típicamente analíticas, la CG puede utilizarse a escala
preparativa para la obtención de compuestos de elevada pureza, así como también es
posible la obtención de datos físico-químicos relativos a propiedades superficiales,
cinética y termodinámica de procesos de adsorción y separación, desarrollo de
catalizadores, etc.
Existen dos tipos de cromatografía en fase gaseosa: la cromatografía gas-sólido
(CGS) y la cromatografía gas-líquido (CGL), según se utilice una fase estacionaria
sólida o una fase estacionaria líquida (sobre un soporte sólido, o directamente sobre la
pared interna de la columna), respectivamente. De las dos modalidades, la primera
tiene unas aplicaciones bastante limitadas, por lo que en la práctica, casi siempre que
se hace alusión a la cromatografía de gases está implicada la CGL. Por ello, en este
capitulo, se tratará fundamentalmente de la CGL, y solo se hará una breve referencia
al final sobre la CGS.
Claudio González Pérez
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PRINCIPIOS BASICOS
Los principios fundamentales de la cromatografía expuestos en el capítulo
anterior son aplicables a la cromatografía de gases con solo algunas ligeras
modificaciones resultantes de las propiedades diferenciales entre el estado líquido y
el estado gaseoso, principalmente la difusividad.
Las principales diferencias entre gases y líquidos pueden concretarse en:
* Las interacciones entre las moléculas de los gases, a diferencia de los líquidos, suelen
ser pequeñas. Por otra parte, los gases suelen tener poca capacidad para desalojar las
moléculas de soluto no volátiles fijadas a la fase estacionaria (ya sea ésta sólida o
líquida). Por ello, en CG, la fase móvil no interacciona con las moléculas de analito, siendo
su función únicamente el transporte del analito a través de la columna.
* Los gases difunden entre sí mucho mejor que los líquidos, lo cual influye en la
resolución y en la velocidad de separación. Así, a velocidades de fase móvil próxima a su
valor óptimo, la cromatografía líquida proporciona mejor resolución, si bien, en CG la
velocidad óptima de flujo es del orden de 104 a 105 veces superior a la CL, con lo que
pueden obtenerse separaciones en muy poco tiempo. Por otra parte, y como consecuencia
de la mayor difusividad de los gases, el equilibrio de separación se alcanza más
rápidamente.
* Las propiedades superficiales de los líquidos también influyen sobre sus
características cromatográficas. Así, la tensión superficial de los líquidos, y de la que
carecen los gases, se utiliza en cromatografía sobre papel y de capa fina como fuerza
impulsora de la fase móvil, lo que permite realizar separaciones sin columna. Este tipo de
separaciones no son posibles en cromatografía de gases.
* La mayor densidad de los líquidos respecto a los gases permite usar la gravedad o la
fuerza centrífuga como fuerza motriz de la fase móvil, mientras que la pequeña
viscosidad de los gases, hace posible el empleo de columnas más largas.
Debido a la compresibilidad de los gases, en CG es más aconsejable utilizar
volúmenes de retención en lugar de tiempos de retención. Como se indicó
anteriormente, VR = tR F y VM = tM F, siendo F la velocidad media de flujo de fase
móvil a través de la columna*. Estos volúmenes de retención, VR y VM, dependen de la
* Generalmente, suele medirse el caudal a la salida de la columna con un medidor de pompas de jabón. El
caudal medido está relacionado con el caudal medio por la expresión:
T c P – P H 2O
F = Fm
Ta
P
donde Ta y Tc son las temperatura ambiente y de la columna respectivamente, P la presión atmosférica y
PH2O la presión de vapor de agua a Ta.
Cromatografía de gases
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presión media en el interior de la columna, por lo cual se utilizan volúmenes de
retención corregidos, VRo y VMo, obtenidos a partir de,
VRo = j VR ;
VMo = j VM
donde j es el llamado factor de compresibilidad, dado por,
j=
3
.
2
Pi
Pi
2
Po – 1
3
Po – 1
siendo Pi y Po la presión en el interior y en el exterior de la columna respectivamente.
En cromatografía de gases, y para estandarizar los volúmenes de retención, suele
emplearse el volumen neto, obtenido por diferencia entre VRo y el volumen muerto,
VN = VRo – VMo
y también el volumen de retención específico, Vg, definido como el volumen neto de
analito por gramo de fase estacionaria a 0 ºC:
Vg =
VN 273
.
m Tc
donde Tc es la temperatura de la columna y m la masa, en gramos, de la fase
estacionaria.
El volumen de retención específico está relacionado con la constante de
distribución, K, por la expresión:
Vg =
K
ρs
.
273
Tc
donde ρs es la densidad del líquido en la fase estacionaria. El factor 273/Tc corrige
Vg a la temperatura de referencia de 273 ºK.
Es necesario poner de manifiesto que a una determinada temperatura, Vg
depende únicamente de la constante de distribución y de la densidad del líquido que
constituye la fase estacionaria, por lo que, en principio, podría ser un parámetro
característico con fines de identificación.
Asimismo, es necesario indicar que en CG la constante de distribución depende
marcadamente de las presiones de vapor de los componentes, y éstas, a su vez, de la
temperatura. El equilibrio dependerá claramente de la temperatura y, por lo tanto,
este parámetro deberá mantenerse de la forma más precisa posible.
Claudio González Pérez
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LAS MUESTRAS PARA CROMATOGRAFIA DE GASES
La separación de compuestos directamente, esto es, sin transformaciones
previas, requieren que las muestras cumplan las condiciones siguientes:
* Compuestos en estado gaseoso, o bien en estado líquido y sólido, con presiones de
vapor de por lo menos 0.3 mm de mercurio a la temperatura máxima de la fase
estacionaria empleada.
* No descomponibles por el calor a la temperatura de la separación.
* No adsorbibles o descomponibles por el soporte sólido de la columna.
* Detectables a la salida.
Actualmente, se ha ampliado el campo de utilización de la CG a muchos
compuestos que no cumplen los requisitos citados. Así, es posible analizar compuestos,
como azúcares o aminoácidos, totalmente no volátiles, pero que se transforman en
derivados volátiles por reacciones apropiadas. Por otra parte, los métodos de
muestreo de los productos de descomposición pirolítica de muestras no volátiles, no
dan información directa sobre la composición de las sustancias, pero suministran datos
de sus productos de descomposición. Asimismo, compuestos no detectables, se
transforman en otros sensibles al método de detección y por diversos artificios se
reduce el grado de descomposición de muestras inestables.
INSTRUMENTACION
Un cromatógrafo de gases consta básicamente de los siguientes componentes
(figura 11.1.)
* Fuente de gas portador con los correspondientes reguladores y medidores
de presión.
* Sistema para la introducción de las muestras.
* Columna cromatográfica, con un medidor de caudal a la salida.
* Detector.
* Sistema para el tratamiento de datos y registrador.
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Cromatografía de gases
.
medidor de caudal de
pompas de jabón
medidor
de presión
jeringa
termostatos
detector
válvula
reguladora
válvula
reductora
columna
registrador
.
botella
de gas
portador
.
.
Figura 11.1. Componentes básicos de un cromatógrafo de gases.
La columna cromatográfica va introducida en un horno termostatizado por aire,
con posibilidad de regular la temperatura entre 25 y 400 ºC, con precisiones
comprendidas entre ± 0.1 y ± 0.01 ºC, dependiendo de la precisión deseada en la
medida de los tiempos de retención. Por otra parte, el sistema de introducción de las
muestras y el detector se mantienen generalmente a una temperatura superior en un
10% a la de la columna, para asegurar la rápida volatilización de la muestra y prevenir
la condensación.
GASES PORTADORES (FASES MOVILES)
El gas portador, que actúa como fase móvil y transporta los componentes de la
muestra a través de la columna y hasta el detector, deberá ser una especie
químicamente inerte respecto al analito y relativamente barata, ya que es expulsado a
la atmósfera al final del proceso cromatográfico. En la práctica, los gases más
utilizados son: helio, nitrógeno, hidrógeno, argon y dióxido de carbono,
especialmente los tres primeros.
La elección de la fase móvil se hace normalmente en orden al coste,
disponibilidad e inercia química, así como también en función del detector utilizado y,
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Claudio González Pérez
ocasionalmente, en cuanto a la eficacia de la separación. En este sentido, con
nitrógeno suelen obtenerse separaciones más eficaces que con hidrógeno o helio, lo
cual puede ser debido a su menor coeficiente de difusión y, consecuentemente, menor
valor del término B de la ecuación de Van Deemter. Sin embargo, para adquirir esa
eficacia se requieren bajas velocidades de flujo, lo cual va en detrimento del tiempo
necesario para el análisis. Por este motivo, en ocasiones, resulta preferible utilizar
hidrógeno o helio para las velocidades optimas más elevadas, aún a costa de sacrificar
la eficacia. Sin embargo, el empleo de hidrógeno presenta otros problemas, ya que es
altamente inflamable, puede formar mezclas explosivas con el aire y a veces puede
reaccionar con los componentes de la muestra para originar "artefactos"
hidrogenados.
Un factor muy importante en las separaciones por cromatografía de gases es el
ajuste del caudal, ya que este condiciona la velocidad de la separación. Normalmente
los caudales se controlan mediante un regulador de presión de dos niveles, colocado en
la botella del gas, y algún tipo de regulador de presión instalado en el cromatógrafo.
Los caudales pueden determinarse mediante un rotámetro situado a la cabeza de
la columna, si bien, la forma más exacta es utilizar un simple medidor de pompas de
jabón colocado a la salida de la columna.
El caudalímetro de burbuja representado en la figura 11.2. funciona de la forma
siguiente: apretando la pera de goma se eleva el nivel de la disolución jabonosa y se
forma una burbuja; midiendo el tiempo que tarda en pasar entre dos marcas sobre un
tubo graduado, que corresponden a un volumen conocido, se determina el caudal de gas
portador. Para su construcción puede utilizarse una bureta de diferente capacidad,
según el caudal a medir.
burbuja
gas portador
procedente de la columna
solución jabonosa
.
Figura 11.2. Caudalímetro de burbuja.
Cromatografía de gases
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SISTEMAS PARA LA INTRODUCCION DE LA MUESTRA
Las muestras a separar por cromatografía de gases pueden ser de diferente
naturaleza y estado físico, pero necesariamente han de pasarse al estado de vapor. El
procedimiento de vaporizar las muestras y de introducirlas en la columna tiene gran
importancia desde el punto de vista de la eficacia de la separación.
Para que se cumplan las condiciones teóricas del mecanismo de la separación, la
muestra ha de adsorberse totalmente en el primer plato de la columna sin mezclarse
con el gas portador. Sin embargo, como en la práctica, la inyección no es instantánea,
la muestra se mezcla en cierta medida con el gas portador y no se fija totalmente en
el primer plato, el proceso de separación se inicia simultáneamente en varios platos a
la vez, lo que origina un ensanchamiento de las bandas cromatográficas.
Por otra parte, es importante que el tamaño de muestra sea el adecuado a las
características del equipo utilizado. Así, cuando se añade a la columna una cantidad de
soluto superior a su capacidad, no se establece el equilibrio entre la fase gaseosa y la
fase líquida en los primeros platos, reduciéndose su eficacia, a la vez que aparecen
colas. Además, el tamaño de muestra viene condicionado por el detector utilizado, no
pudiendo exceder el margen lineal de respuesta, para evitar la saturación. En resumen,
deberá inyectarse la cantidad adecuada de muestra, en el menor tiempo posible y
conseguir la vaporización total de las muestras no gaseosas (las muestras sólidas y
líquidas se introducen usualmente como disoluciones diluidas en un disolvente volátil).
Para ello se emplean diversos artificios y técnicas de muestreo.
Las muestras gaseosas se introducen generalmente en la columna
cromatográfica usando válvulas rotatorias y bucles de volumen conocido, como el
representado en la figura 10.17. (también pueden usarse estos dispositivos para
muestras líquidas). Los distintos bucles son fácilmente intercambiables y sus
volúmenes suelen oscilar entre 0.1 y 10.0 mL. Además, el sistema se diseña para
minimizar las fluctuaciones de presión que puedan tener lugar cuando la válvula se
cambia desde la posición "llenado" a la de "inyección".
Un método prácticamente universal para la introducción de muestras en CG, pero
que se utiliza fundamentalmente con muestras líquidas implica el uso de una
microjeriga para inyectar a través de un diafragma o "septum" de silicona en una
cámara de vaporización situada en la cabeza de la columna y calentada unos 50 ºC por
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Claudio González Pérez
encima del punto de ebullición del componente menos volátil de la muestra. En la figura
11.3.a. se representa esquemáticamente un dispositivo de este tipo.
gas portador
cámara de vaporización
columna
jeringa
septum
a)
gas
portador
c
g
columna
g
c
atmósfera
a
c
g
a
a
b)
Figura 11.3.a) Inyección con jeringa. b) Repartidores de caudal.
Los diafragmas tienen un tiempo de vida limitado, dependiendo de la destreza del
operador, la temperatura del inyector y la calidad del propio diafragma. Un operador
suficientemente hábil pincha el septum en un nuevo lugar en cada inyección, con lo que
se aumenta el número de veces que puede usarse. Por otra parte, las altas
temperaturas del bloque de inyección conducen a una pérdida de flexibilidad del
septum de silicona como consecuencia de su degradación, sobre todo cuando se opera
a temperaturas superiores a 300 ºC. Esta degradación del septum puede originar
materiales despolimerizados de bajo peso molecular, los cuales darán origen a picos
falsos, a la vez que producen fluctuaciones en la línea base. Otro fenómeno es el
relacionado con los efectos de memoria producidos como consecuencia de la facilidad
para adsorberse de determinados compuestos que posteriormente serán de-sorbidos.
Alternativamente, la inyección puede realizarse directamente en la columna. En
estos casos, la aguja hipodérmica llega hasta el relleno de la propia columna, donde se
deposita directamente la muestra líquida, de manera que la banda cromatográfica se
forma directamente sobre la fase estacionaria. Este tipo de inyección se utiliza en el
caso de muestras que podrían descomponerse si se calientan por encima de su punto
de ebullición. La muestra se inserta directamente al principio de la columna operando a
Cromatografía de gases
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una temperatura inicial relativamente baja, con lo que los solutos quedan en una zona
muy estrecha. La separación ocurre al elevarse la temperatura de la columna.
El tamaño de la muestra, para la columnas analíticas ordinarias, varía entre unas
pocas décimas de micro-litro y 20 µL, para lo cual suelen utilizarse divisores de
muestra, los cuales permiten pasar a la columna solo una parte de la muestra
inyectada, desechándose el resto. En la figura 11.3.b. se muestran diversos modelos de
repartidores de caudal. En estos dispositivos , el caudal total de gas portador que
contiene la muestra vaporizada se divide en dos porciones antes de entrar en la
columna: una de ellas, la menor, se dirige a la columna, y la mayor desemboca a la
atmósfera. En todos estos sistemas se coloca un limitador de caudal en la parte que
desemboca a la atmósfera, para lo cual suelen usarse agujas hipodérmicas calibradas y
tubos de vidrio capilares.
Los repartidores de caudal se colocan en ocasiones también a la salida del
detector, cuando éste tiene una respuesta lineal muy limitada y las cantidades de
soluto separadas son excesivamente grandes, o cuando, al emplear detectores
destructivos se ha de recuperar la muestra para su identificación, o con fines
preparativos.
Recientemente se han desarrollado sistemas de vaporización a temperatura
programada, los cuales resultan ventajosos cuando se opera con determinado tipo de
muestras.
COLUMNAS Y FASES ESTACIONARIAS
La columna constituye la parte esencial del sistema cromatográfico y de la que
depende el éxito o el fracaso de los análisis. En ella está contenida la fase
estacionaria, que determina la selectividad y la eficacia de las separaciones.
Hasta hace poco tiempo, la mayor parte de las cromatografías de gases se
realizaban con columnas empaquetadas o de relleno, mientras que actualmente se
utilizan más extensamente las columnas tubulares abiertas o capilares. Las primeras
suelen tener una longitud comprendida entre 1 y 6 metros, con un diámetro interno
que oscila entre 2 y 6 mm, mientras que las columnas capilares tienen longitudes entre
10 y 100 metros y diámetros comprendidos entre 0.1 y 0.6 mm. En cuanto a los
materiales de que están fabricadas, suelen ser acero inoxidable o vidrio para las
columnas empaquetadas, y sílice para las capilares, si bien se han utilizado también
otros metales como aluminio o cobre, e incluso teflón.
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Claudio González Pérez
La temperatura es una variable importante en cromatografía analítica, siendo
necesario su control preciso en orden a obtener resultados reproducibles. Por ello, las
columnas cromatográficas suelen disponerse en rollos de 10 a 30 cm de diámetro, con
el fin de poder colocarlas en el interior de un horno termostatado que permita operar
entre unos 10 ºC por encima de la temperatura ambiente y unos 450ºC, con una
precisión de 0.1 ºC.
En la práctica, suelen emplearse temperaturas ligeramente superiores al punto
de ebullición medio de la muestra, con lo que se obtienen tiempos de elución
razonables. Sin embargo, para muestras en las que los puntos de ebullición de los
componentes se presenten en un amplio intervalo, los picos correspondientes a los
solutos más volátiles estarán muy próximos y los correspondientes a los menos
volátiles estarán muy espaciados. La resolución no es igual para todos los picos, siendo
deficiente al principio y excesiva al final. Por otra parte, los picos de los componentes
más volátiles son altos y estrechos, mientras que los de los componentes menos
volátiles son bajos y anchos.
Para evitar los inconvenientes anteriormente mencionados suele emplearse una
programación de temperatura, aumentando ésta, linealmente o por etapas, mientras
se realiza la separación*. En la figura 11.4. se muestran los cromatogramas de una
mezcla de hidrocarburos operando en condiciones isotermas (fig. 11.4.a.) y a
temperatura programada (fig. 11.4.b.)
C-8
C-9
C-6
C-14
C-10
C-16
C-18
C-7
C-20
a)
C-8
C-7
C-6
C-18
C-14
C-9
C-16
C-20
C-10
b)
Figura 11.4. Cromatogramas de mezclas de hidrocarburos. a) Isotérmica. b) Temperatura programada.
* También puede modificarse el caudal de gas portador, habiéndose desarrollado técnicas de programación
de esta variable e incluso una programación mixta de temperatura y caudal.
Cromatografía de gases
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Columnas empaquetadas
Las columnas empaquetadas suelen ser tubos de vidrio o de acero inoxidable con
las características de longitud y diámetro interno ya mencionadas, y que se llenan con
un soporte sólido de grano fino (60-100 mallas, 0.25-0.15 mm) recubierto de una capa
delgada (0.05-1 m) de un líquido no volátil que actúa de fase estacionaria. Una buena
columna empaquetadas puede contener entre 1000 y 2000 platos teóricos por metro,
mientras que las columnas capilares pueden llegar hasta los 10000 platos por metro.
El soporte sólido deberá presentar las siguientes características:
* Superficie relativamente grande, para que la película de la fase líquida
depositada sea fina y se mantenga distribuida de forma que ofrezca el máximo
contacto con los solutos de la fase móvil, para facilitar el rápido intercambio
entre ambas fases.
* Material relativamente duro, para que las partículas no se rompan durante el
proceso de impregnación con la fase líquida y de llenado.
* Material estable térmicamente y poroso, para no producir una caída de presión
excesiva. Por otra parte, la uniformidad del tamaño de las partículas reduce el
término A de la ecuación de van Deemter, con lo que se reduce la altura de plato
y se incrementa la resolución.
* La superficie ha de ser químicamente inerte y no absorbente de los solutos, es
decir, no deberá contribuir a la separación cromatográfica.
Aunque se han estudiado muchos materiales, ninguno cumple rigurosamente todas
las condiciones enumeradas previamente. De todos ellos, el más frecuentemente
utilizado se prepara partir de tierra de diatomeas, constituida por esqueletos de
miles de especies de plantas unicelulares que habitaban antiguos mares y lagos. Por
tratamiento térmico de las diversas variedades de estas especies, con o sin adición de
fundentes, se modifican sus características generales y se obtienen los soportes
sólidos conocidos por distintas denominaciones comerciales, de las que, posiblemente,
la más popular sea "Chromosorb". Las variedades más utilizadas de Chromosorb son:
* Chromosorb P. Soporte de color rosa, constituido por granos muy duros, de área
superficial elevada (4.0 m2/g) y que puede soportar gran cantidad de fase estacionaria
(35% w/w). Presenta una marcada interacción con los solutos, particularmente a
temperatura elevada.
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Claudio González Pérez
* Chromosorb W. Soporte siliceo de color blanco, obtenido por tratamiento a 1600 ºC
con un fundente alcalino. Presenta menor área superficial (1.0 m2/g) que el Chromosorb P
y puede impregnarse, como máximo, con un 15 % de fase líquida.
* Chromosorb G. Es el más duro de todos y doblemente denso que el Chromosorb W,
presentando relativamente poca interacción con compuestos polares. Debido a su
pequeña superficie, tiene poca capacidad de retención de fase líquida.
Un problema importante que presentan los soportes sólidos diatomáceos es la
marcada actividad superficial que presentan. Esta se debe, sobre todo, a la presencia
de los grupos silanol (Si–OH) que se forman sobre la superficie de los silicatos, debido
a la humedad, los cuales constituyen puntos activos que provocan adsorción de
compuestos polares, así como la formación de enlaces de hidrógeno con determinados
compuestos, traduciéndose todo ello en la presencia de picos distorsionados y la
aparición de colas (El mismo problema presentan las columnas capilares de sílice).
La reducción de la actividad superficial (desactivación) de los soportes sólidos
puede llevarse a cabo de diversas formas, si bien, la más utilizada es la silanización,
consistente en el tratamiento con dimetilclorosilano*
— Si — OH
soporte
sólido
O
Cl
O
Si
+
— Si — OH
— Si — O
CH 3
Cl
CH 3
Si
+ 2 HCl
— Si — O
CH 3
CH 3
Para que la reacción sea completa, los grupos –OH deben ocupar puntos activos
adyacentes. En presencia de un solo hidroxilo la reacción es:
— Si — OH
soporte
sólido
Cl
CH 3
— Si — O
Si
+
Cl
CH 3
Si
CH 3
Cl
* Tambien puede usarse hexametildisilazano, en cuyo caso la reacción es
–Si–OH
O
–Si–OH
+ (CH3)3Si–NH–Si(CH3)3
CH 3
–Si–O–Si–CH 3
CH 3
+ NH 3
O
CH 3
–Si–O–Si–CH 3
CH 3
+ HCl
CH 3
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Cromatografía de gases
Mediante un lavado con metanol, el segundo cloruro se sustituye por un grupo
metoxi,
— Si — O
soporte
sólido
CH 3
Si
Cl
+ CH 3 OH
CH 3
— Si — O
CH 3
Si
CH 3
+ HCl
CH 3
Los tratamientos silanizadores reducen considerablemente el área de los
soportes e influyen significativamente en los volúmenes de retención de los solutos.
Por otra parte, la presencia de impurezas minerales (en muchas ocasiones, óxidos
metálicos) sobre la superficie de los soportes dan lugar a puntos activos que
interaccionan con determinados tipos de compuestos. En estas ocasiones, un lavado
con ácidos, nítrico o clorhídrico, previo a la silanización, elimina estas impurezas.
Entre los soportes no diatomáceos usados en CG están las micro-bolas de vidrio,
el teflón y las micro-bolas de polímeros orgánicos, cuyas características mas
importantes son:
* Micro-bolas de vidrio. Soporte no poroso, de área superficial baja y muy duro.
Tiene una figura geométrica muy definida y tamaño uniforme, con lo cual se
reduce el término A en la ecuación de van Deemter, disminuyendo la altura de
plato e incrementándose la resolución. Por el contrario, admite cantidades muy
pequeñas de fase estacionaria.
* Teflón. Desde el punto de vista de la actividad superficial, el teflón se acerca
al ideal, ya que presenta muy poca interacción sobre los solutos, pero tiene el
inconveniente de su poca capacidad de retención de líquidos sobre su superficie.
Es útil para la separación de compuestos polares, tales como agua, ácidos
orgánicos, fenoles, aminas y gases ácidos como HF, HCl, SO2 y óxidos de
nitrógeno.
* Micro-bolas de polìmeros orgánicos. Se preparan por polimerización, en
suspensión, del estireno, usando como agente entre-cruzador el divinal-benceno.
Su estructura física es la de una esfera porosa en la que se ha controlado el
tamaño de poro durante el proceso de fabricación, si bien no puede considerarse
estrictamente como soporte sólido, ya que también actúa como fase estacionaria.
Claudio González Pérez
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La fase estacionaria para cromatografía gas-líquido deberá reunir las siguientes
características:
* Baja volatilidad a la temperatura de la columna. Se sugiere que su punto de
ebullición sea, al menos, 100 ºC mayor que la máxima temperatura de trabajo.
* Estabilidad térmica a la temperatura de la columna.
* Inercia química, ya que, salvo casos especiales, no deberá reaccionar
químicamente con los componentes de la muestra.
En cuanto a la selección de la fase estacionaria más adecuada a cada caso, hay
que considerar, además de los factores mencionados, que el líquido deberá tener un
cierto poder disolvente para la muestra. En este sentido, la antigua regla de que "lo
semejante disuelve a lo semejante", donde el término "semejante" se refiere a las
polaridades del soluto y de la fase estacionaria, permite predecir qué solutos serán
retenidos por cada fase líquida. Así, por ejemplo, el hidrocarburo saturado escualano
(C30H62, punto de ebullición 350ºC) de polaridad muy baja, es una buena fase líquida
para la separación de alcanos, mientras que el polietilenglicol, de polaridad mucho más
elevada, se puede utilizar para la separación de alcoholes. Sin embargo, no es
necesario que el líquido estacionario tenga un grupo funcional igual al del soluto y, en
ocasiones, una fase líquida puede servir para la separación de una amplia variedad de
mezclas. Esto ha llevado a considerar algunas "columnas para propósitos generales", si
bien esto no debe interpretarse de forma estricta, ya que ninguna fase líquida puede
tener una eficacia completa para separar todo tipo de solutos.
El número de fases líquidas empleadas en las separaciones por cromatografía de gases
es muy elevado, si bien, puede afirmarse que el 90 % de los análisis pueden llevarse a
cabo utilizando un reducido número de ellas. En la tabla 11.1. se muestran algunas de
más utilizadas, situadas en orden creciente de polaridad.
De todas las fases estacionarias que se indican en la tabla, el escualano —
obtenido por hidrogenación del escualeno, C30H50, — es la fase líquida menos polar,
utilizándose fundamentalmente para la separación de hidrocarburos saturados. Por su
parte, el Apiezon L tiene algo de polaridad debida a impurezas que pueden eliminarse
por tratamiento térmico; es una fase de uso general para compuestos de puntos de
ebullición elevados.
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Cromatografía de gases
Tabla 11.1.
Fases estacionarias para cromatografía de gases
Fase líquida
Estructura
Escualano
2,6,15,19,23,hexametiltetracosano,
C30H62
Apiezon L
—[CH 2 —CH—CH—CH 2 ]n —
ºC
20–120
50–280
Usos
hidrocarburos, haluros
de alquilo,
mercaptanos
comp. poco polares de
punto de ebullición
elevado
CH 3
— Si — O —
Polidimetilsiloxano
SE–30*
CH 3
CH 3
Fenildimetilsilicona
n
C 6 H5
C 6 H5
hidr. aromáticos
polinucleares,
esteroides, PCBs
5% OV 3*
— Si — O — Si — O —
CH 3
50–350
50% OV 17*
n
0–350
0–380
drogas. esteroides,
pesticidas
50% trifluoropropilmetil silicona
OV 210*
Polietilenglicol
Carbowax 1000*
0–280
aromáticos clorados
nitroaromáticos
30–150
alcoholes, ácidos
libres, éteres,
glicoles, aminas
[O–CH2–CH2]nOH
* Denominación comercial
Los polímeros basados en la estructura Si – O – Si constituyen la base de un
grupo muy amplio de fases estacionarias. Se diferencian unas de otras en su peso
molecular medio, su estabilidad térmica y su viscosidad, mientras que sus propiedades
químicas dependen del grado de sustitución en los átomos de silicio.
Las metil fenil siliconas constituyen un conjunto de fases estacionarias en las
que diferentes proporciones de grupos metilo han sido sustituidas por grupos fenilo, y
en ellas, la polaridad aumenta al hacerlo el número de grupos fenilo. Además, es
posible obtener fases líquidas de mayor polaridad mediante la sustitución de grupos
metilo de las dimetil-siliconas por grupos polares como trifluoropropil o ciano.
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Claudio González Pérez
Los compuestos conocidos con el nombre de Carbowax ( y más recientemente,
Superox) son polietilenglicoles, y en ellos, el número después del nombre indica el peso
molecular medio del polímero. Cuanto menor es, mayor es la polaridad.
Además de las fases mencionadas, se han desarrollado fases estacionarias
especiales para determinadas técnicas analíticas, tales como cromatografía de gases–
espectrometría de masas, donde es esencial que el "sangrado"* sea mínimo, o bien para
separaciones de ciertos tipos de solutos. En este sentido, se han desarrollado fases
estacionarias estables a elevadas temperaturas (del orden de 450 ºC) consistentes en
copolímeros silicona–carboranos (figura 11.5.), así como fases quirales, utilizadas para
la separación cromatográfica de enantiómeros.
C
CH3 — Si — CH 3
BH
.
CH 3
CH 3
CH 3
CH 3
CH 3
Si — O — Si — O — Si — O
"Dexil 300"
CH 3
.
Figura 11.5. Estructura de fase estacionaria para operar a temperaturas elevadas.
La cantidad de fase líquida aplicada al soporte sólido es necesario controlarla de
forma adecuada, ya que si hay demasiado líquido, los solutos pasan mucho tiempo
difundiéndose en esa fase, disminuyendo la eficacia de la separación, y si se carga la
columna con una cantidad de fase líquida insuficiente, los solutos pueden interaccionar
con el sólido mediante fenómenos de adsorción, con la consiguiente perturbación de la
separación. La carga de líquido depende del tipo de soporte sólido, el tamaño de la
muestra y otros factores, pero, en general, varía entre el 3 y el 15 % (en volumen).
Columnas capilares
Las columnas tubulares abiertas o columnas capilares son mucho más estrechas y
suelen ser mucho más largas que las columnas empaquetadas. La teoría de las columnas
* El "sangrado" de una columna consiste en la pérdida de fase estacionaria, bien durante el proceso de
elución, o cuando se limpia con un disolvente para eliminar los contaminantes.
Cromatografía de gases
18
sin relleno fue inicialmente expuesta por Golay en 1957 y como consecuencia
inmediata de esta teoría se deduce que el primer término (A) de la ecuación de van
Deemter debe ser cero, si el flujo de la columna es laminar.
Los dos tipos más importantes de columnas capilares son las de pared recubierta
(WCOT) y con soporte recubierto (SCOT) (ver figura 10.4.), existiendo una tercera
modalidad denominada de capa porosa (PLOT), cuyas características se resumen más
adelante.
Las columnas de pared recubierta son sencillamente tubos capilares con la pared
interna recubierta de una fina capa de fase estacionaria, mientras que en las columnas
SCOT la superficie interna del capilar está recubierta de una fina capa de un material
soporte recubierto a su vez de una fase líquida estacionaria. En general, la eficacia de
una columna SCOT es menor que la de una columna WCOT, si bien bastante mayor que
la de una columna empaquetada. Por ello, las columnas SCOT han sido sustituidas casi
en su totalidad por las WCOT.
Inicialmente, las columnas WCOT se construyeron con acero inoxidable, vidrio
tratado químicamente para que la superficie interna fuera rugosa, plástico y algunos
metales como cobre o aluminio. Actualmente, casi todas son de sílice fundida,
fabricadas con sílice prácticamente exenta de óxidos metálicos y con un
recubrimiento externo protector de poliimida.
Las principales
empaquetadas son:
diferencias entre las columnas WCOT y las columnas
* Las columnas capilares proporcionan mayor resolución que las columnas
empaquetadas. Ello se debe a que la longitud de la columna es mayor, con lo que
se aumenta el número de platos teóricos, pudiéndose llegar a los 500000, frente
a 10000 de las columnas empaquetadas.
* El tiempo necesario para realizar un análisis (tiempos de retención) con
columnas WCOT es menor que con columnas empaquetadas, como consecuencia
del menor contenido de fase estacionaria, con lo que los solutos se retienen
menos tiempo.
* La cantidad de muestra utilizada con columnas capilares suele ser del orden de
los nano-gramos, frente a los microgramos que se usan frecuentemente en las
columnas empaquetadas.
* Aunque en las columnas capilares se utiliza una cantidad de muestra
considerablemente menor que en las columnas empaquetadas, el límite de
Claudio González Pérez
19
detección es del mismo orden de magnitud, debido a que con aquellas tiene lugar
un menor ensanchamiento de las bandas, originándose picos estrechos bien
definidos.
Las fases estacionarias usadas en las columnas capilares suelen ser las mismas
que en las columnas con relleno, si bien se denominan comercialmente de forma
distinta. Así, la fase SE–30 (ver tabla 11.1.) corresponde con X–1 en una columna
WCOT, la OV–210 con X–200, la Carbowax 20M con X–WAX, etc. En la práctica, con
solo cuatro o cinco fases estacionarias diferentes, pueden separarse los componentes
de casi todas las muestras a analizar, especialmente cuando se opera a temperatura
programada. Asimismo, se han desarrollado fases estacionarias especiales para
aplicaciones muy concretas, tales como muestras de productos petrolíferos, fases
quirales para la separación de enantiómeros, etc.
Las columnas capilares de capa porosa consisten en columnas de sílice en las que
la fase estacionaria está constituida por partículas de un sólido activo sobre su
superficie interna. Con esta finalidad, desde 1981 viene utilizándose alúmina, en la que
la actividad superficial se debe a la matriz Al–O–Al , si bien, dicha actividad puede
modificarse por la adición de sales, tales como KCl o Na2SO4. Estas columnas se
desarrollaron inicialmente para el análisis de compuestos de bajo peso molecular, tales
como gases atmosféricos e hidrocarburos C1 a C6.
DETECTORES
Los solutos eluidos de una columna cromatográfica se ponen de manifiesto
mediante detectores que deben medir el componente minoritario en mezclas binarias
muy diluidas. En CG se han utilizado numerosos métodos de detección que van desde
los más sencillos, como la valoración volumétrica directa, usado por Martin y James en
sus trabajos iniciales, hasta los más sofisticados, como el espectrómetro de masas.
Clasificación
Debido a la gran diversidad de fenómenos físicos o físico-químicos implicados en
los métodos de detección, no es fácil hacer una clasificación racional de los
detectores. De todas formas, suelen agruparse según algunas características comunes
en:
20
Cromatografía de gases
* Integrales, diferenciales.
* Destructivos, no destructivos.
* Discriminativos, no discriminativos.
Los detectores integrales proporcionan en cualquier instante una medida de la
cantidad total del material eluido desde que comienza la detección. Los
cromatogramas consisten en una serie de escalones cuyas alturas indican las
cantidades de soluto (figura 11.6.a.). La bureta de Martin pertenecía a este tipo de
detectores.
.
3
a)
Respuesta del detector
2
1
.
2
b)
1
3
tiempo
Figura 11.6. Cromatogramas de la misma muestra. a) Detector integral. b) Detector diferencial.
Los detectores diferenciales responden a la primera derivada de la variación de
la concentración del efluente en función del tiempo, y el cromatograma consiste en
una serie de picos, como se muestra en la figura 11.6.b: Estos detectores tienen la
ventaja sobre los integrales de su mayor versatilidad (ver más adelante). Por otra
parte, el área de pico es la variable que normalmente se utiliza desde el punto de vista
cuantitativo.
Los detectores destructivos descomponen las sustancias durante el proceso de
detección y suelen responder a la velocidad a la que la muestra pasa por el sistema de
detección (flujo másico). Por su parte, los detectores no destructivos tienen la
propiedad de no alterar los compuestos medidos y responden generalmente a la
concentración del compuesto medido en el gas portador. En cromatografía de gases
Claudio González Pérez
21
preparativa o en sistemas multi-canales con varios detectores montados en serie, se
han de emplear detectores no destructivos. Sin embargo, los muy sensibles, aunque
sean destructivos, pueden aplicarse a la preparación de compuestos puros. En estos
casos, el efluente de la columna se divide en dos partes con un repartidor de caudal,
pasando al detector una fracción muy pequeña del compuesto, y la mayor parte, a otro
detector o al sistema colector de fracciones.
Los detectores no discriminativos dan información de la cantidad de muestra
eluida, pero no la identifican. Como los datos de retención por sí solos no suelen ser
suficientes para caracterizar de forma inequívoca las sustancias, tiende a utilizarse
detectores discriminativos. Los más empleados son el espectrómetro de masas y el
espectrómetro de infrarrojo. Por otra parte, existen detectores que pueden
considerarse como intermedios entre unos y otros, pues solamente responden a un
determinado número de compuestos y presentan cierto grado de discriminación.
Características
Aunque ninguno de los métodos de detección utilizados en CG puede considerarse
como el detector universal, y tampoco parece probable que pueda llegar a diseñarse,
el detector ideal debe reunir las características siguientes:
* Sensibilidad adecuada. Puede considerarse que la sensibilidad es una medida
de la magnitud de la señal originada por el detector para una cantidad o
concentración de analito determinada. Podría expresarse, por ejemplo, en
mV/concentración (mV.g–1.s). En principio, la sensibilidad debería ser
independiente de la concentración de analito, por lo que la representación gráfica
de la señal del detector frente a la concentración sería lineal. Sin embargo, en la
práctica, esta linealidad únicamente se observa en un margen de concentración
determinado. Por ello, el margen dinámico lineal de un detector se define como
el intervalo de concentración en el cual la respuesta es constante en un 5%.
Generalmente se expresa por un número que representa la relación entre la
máxima y la mínima concentración entre las que la respuesta del detector es
lineal.
La creciente demanda de análisis de trazas en distintos campos ha estimulado el
desarrollo de detectores cada vez más sensibles. Así, el conocimiento que
actualmente se tiene sobre el impacto de trazas de contaminantes en los
ecosistemas biológicos ha creado un mercado de detectores muy sensibles para
22
Cromatografía de gases
estudios de contaminación de aguas, así como residuos de pesticidas en
productos alimenticios*.
Respuesta del detector
* Buena estabilidad y reproducibilidad. La línea base de un cromatograma está
sometida a fluctuaciones fortuitas, conocidas como "ruido de fondo" (figura
11.7.a.), el cual se puede originar en los distintos componentes del instrumento,
como los amplificadores, registradores, etc., así como en fluctuaciones del gas
portador.
b)
RN
a)
tiempo
Figura 11.7. Líneas base de cromatogramas. a) Ruido de fondo. b) Deriva.
Muchos de estos ruidos pueden eliminarse utilizando componentes de alta calidad
y operando adecuadamente con el cromatógrafo, si bien, siempre existirá un
ruido inherente al detector, el cual, junto con la sensibilidad, establece el límite
de detección de un determinado soluto (ver en el Tema 1, "Sensibilidad y límite
de detección de los métodos instrumentales").
En cromatografía, el límite de detección suele considerarse como la mínima
cantidad de muestra para la cual el detector proporciona una señal, S, de, al
menos, el doble del nivel de ruido. En la práctica, esto corresponde a un pico cuya
altura sea, al menos, el doble del nivel de ruido,
S ≥ 2 RN
y
hmin≥ 2 RN
Por otra parte, la línea base puede desviarse, tal como se muestra en la figura
11.7.b., lo que se conoce con el nombre de "deriva". En ocasiones, la deriva se
observa cuando en una operación a temperatura programada la columna alcanza
una temperatura a la que se volatiliza la fase estacionaria.
* Tiempo de respuesta. El detector debe responder con rapidez a los cambios
de concentración del analito, si bien en el tiempo total de respuesta del
cromatógrafo influyen también la inercia de otros componentes, como el
registrador.
* Respecto a los niveles de contaminantes detectados en relación con cuestiones medioambientales, es
preciso señalar que un nivel "cero" para un político significa cero, mientras que para un químico analítico
significa una cantidad inferior a la que puede detectarse con la metodología disponible.
23
Claudio González Pérez
* Versatilidad. El detector deberá responder a una gran variedad de analitos y, a
ser posible, proporcionar una respuesta semejante para todos ellos.
Los detectores más utilizados en cromatografía de gases, y de los que se
indicarán seguidamente sus principales características, son el de conductividad
térmica (TDC), el de ionización de llama (FID) y el de captura electrónica (ECD), si
bien, también se usan otros, como el de nitrógeno-fósforo (NPD), el fotométrico de
llama (FPD), el de ionización (PID) etc.
Detector de conductividad térmica (TCD)
Se basa en los cambios de conductividad térmica de la corriente de gas
ocasionados por la presencia del analito. Consiste en un filamento metálico o un
“termistor* que al calentarlo, en condiciones de estado estacionario, adquiere una
temperatura por la conductividad térmica del gas que se encuentra en sus
proximidades. Cuando cambia la composición del gas, cambia la temperatura del
elemento (filamento o termistor) y esto se refleja mediante un cambio en su
resistencia eléctrica.
Las medidas absolutas de conductividad térmica son muy difíciles de realizar, por
lo que se emplea un método de medida diferencial. Para ello, se utilizan dos células,
conteniendo cada una de ellas un sensor. Por una pasa gas portador puro, y por la otra,
el gas portador que sale de la columna cromatográfica (figura 11.8.).
filamentos
efluente de
la columna
bloque metálico
conexiones al
puente de Wheatstone
gas portador
puro
Figura 11.8. Esquema de un detector de conductividad térmica.
* Los termistores son glóbulos pequeños fabricados con mezclas de óxidos metálicos, con una capa
protectora de vidrio y con un coeficiente de temperatura/resistencia eléctrica extraordinariamente grande.
Cromatografía de gases
24
Los elementos sensibles se hallan incorporados a un puente de Wheastone, de
forma que cuando pasa solamente gas portador a través de ambas células, el puente se
equilibra a cero. Cuando se eluye de la columna algún componente, la conductividad
térmica de la mezcla de gases varía, por lo que cambia la temperatura del elemento
sensible, y como consecuencia de ello también la resistencia, desequilibrándose el
puente.
Con este tipo de detector deberá usarse helio o hidrógeno como gas portador, ya
que su conductividad térmica es mucho mayor que la de casi todos los compuestos
orgánicos, de modo que, incluso en presencia de pequeñas cantidades de materia
orgánica, tiene lugar una disminución relativamente grande de la conductividad
térmica del efluente de la columna y, en consecuencia, el detector experimenta un
marcado aumento de temperatura*.
El detector de conductividad térmica es uno de los primeros detectores que se
usaron en CG; es relativamente sencillo y no es muy caro. Responde adecuadamente a
una gran cantidad de compuestos orgánicos e inorgánicos, con límites de detección del
orden de 10–9 g/mL. Por su parte, es un detector no destructivo y el margen lineal es
de 104.
Detector de ionización de llama (FID)
Se basa en la conductividad eléctrica de los gases. A temperatura y presión
normales, los gases se comportan como aislantes, pero si en su interior existen átomos
o moléculas cargadas eléctricamente, o electrones libres, se produce un incremento en
la conductividad.
El detector de ionización de llama, representado esquemáticamente en la figura
11.9., consiste en un quemador en el que se produce una llama de hidrógeno, la cual
origina muy pocos iones. Sin embargo, la energía térmica de la llama es suficiente para
ionizar muchas moléculas, con lo que aumenta la conductividad eléctrica a través de
los compuestos de la llama. Entre el extremo del mechero y un segundo electrodo
colector de iones se aplica un potencial de unos cientos de voltios, midiéndose la
intensidad de la corriente originada por la ionización en la llama, la cual difiere de la
presentada por el gas portador y la originada por una gran variedad de sustancias.
* Si se toma como referencia el helio, al que se le asigna un valor de 100 para su conductividad térmica, la
correspondiente para el hidrógeno es 128, mientras que para una gran cantidad de analitos orgánicos, los
valores oscilan entre 6 y 17.
25
Claudio González Pérez
Como las corrientes originadas son muy pequeñas ( 10–12 A) es necesaria la
correspondiente amplificación.
llama
amplificador
.
registrador
aire
H2
efluente de
la columna
Figura 11.9. Detector de ionización de llama.
El detector de ionización de llama es uno de los más utilizados actualmente.
Responde a casi todos los compuestos orgánicos, mientras que es insensible a gases no
combustibles como CO2, SO2, óxidos de nitrógeno y el propio vapor de agua. Esto hace
que el detector sea particularmente adecuado para el análisis de compuestos
orgánicos contaminados con agua, azufre u óxidos de nitrógeno. Su sensibilidad es más
elevada que la del TCD (≅10–12 g/mL) y presenta un gran intervalo lineal (107), si bien,
se trata de un detector destructivo.
Detector de captura electrónica (ECD)
En el detector de captura electrónica se mide una pérdida de señal cuando el
analito se eluye de la columna cromatográfica. En la figura 11.10. se representa un
esquema del ECD, que opera de la forma siguiente: el gas portador, N2 ó Ar, se hace
pasar a través de una cámara que contiene un emisor de partículas β (Ni-63 o tritio
adsorbido sobre una lámina de platino) de alta energía, las cuales, al interactuar con
dicho gas portador producen grandes cantidades de electrones térmicos que se
dirigen hacia un electrodo colector (por aplicación de un voltaje entre 1 y 100 V),
originándose una corriente uniforme o corriente-base.
N2 + β– <—> N2+ + e–
Ar + β– <—> Ar* + Ar+ + e–
26
Cromatografía de gases
.
columna
63 Ni
electrodo colector
Figura 11.10. Detector de captura electrónica.
Cuando moléculas del analito con alta afinidad electrónica entran al detector,
capturan algunos electrones según el proceso,
AB + e– —> AB– y A. + B–
con lo que se produce una disminución de la corriente. Esta señal se procesa
electrónicamente para formar el cromatograma.
El detector de captura electrónica tiene un límite de detección pequeño (10–16
mol/mL) y no altera la muestra significativamente, si bien la respuesta no es lineal,
aunque, pulsando el voltaje, puede alcanzarse un margen lineal de 0.5 a 103.
La mayor ventaja de este detector es su selectividad, no respondiendo a
hidrocarburos (excepto algunos aromáticos), alcoholes y cetonas, mientras que es
especialmente sensible a moléculas que contienen halógenos, grupos carbonilo
conjugados, grupos metilo, compuestos nitro y compuestos organometálicos. Por ello,
muchas de sus aplicaciones inciden en análisis de trazas de muestras
medioambientales para disolventes clorados, gases clorofluorocarbonos, pesticidas y
herbicidas (DDT, γBHC/lindano, aldrín), organometálicos (plomo tetraetilo),
hidrocarburos aromáticos polinucleares cancerígenos, etc.
APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFIA GAS-LIQUIDO
Las aplicaciones más numerosas de la CGL se encuentran en el campo del análisis
cualitativo y cuantitativo de mezclas complejas de compuestos orgánicos. Aunque la
cromatografía es básicamente un método de separación, de cada cromatograma se
Claudio González Pérez
27
obtiene información cualitativa a partir de la posición de los picos, y cuantitativa, a
partir de la medida de su altura o de su área.
Análisis Cualitativo
Teóricamente, el tiempo de retención o el volumen de retención de un
determinado soluto, obtenido en una columna particular a una temperatura y velocidad
de flujo controlados cuidadosamente, es una propiedad característica suya, como lo es
el punto de ebullición o el índice de refracción, y podría servir para identificarlo. Sin
embargo, cuando se parte de una muestra totalmente desconocida, es prácticamente
imposible identificar sus componentes por este procedimiento, ya que los miles de
compuestos conocidos hace que existan demasiadas posibilidades entre las que elegir.
En este sentido, la CG no puede competir con técnicas como la espectrometría de
masas, la espectrometría de infrarrojo o la resonancia magnética nuclear.
Afortunadamente, el analista no siempre se enfrenta con muestras totalmente
desconocidas, por lo que, en muchos casos, el problema puede resolverse
cromatográficamente. Para ello pueden seguirse varios caminos.
El procedimiento más simple de análisis cualitativo se realiza con ayuda de
patrones: los tiempos de retención de los picos desconocidos se comparan con los
tiempos de retención de compuestos conocidos, separados en la misma columna y
en las mismas condiciones experimentales. Como alternativa, si se sospecha la
existencia de un determinado compuesto en una mezcla, se añade éste, con lo que el
área de ese pico aumentará respecto a los otros picos del cromatograma. Esta
identificación no es definitiva cuando se realiza con un mismo tipo de columna, pero es
casi concluyente cuando se hace con dos o más tipos de columnas. Es muy poco
probable que dos compuestos con el mismo tiempo de retención en una fase
estacionaria tengan el mismo tiempo de retención en dos fases estacionarias distintas.
El tiempo de retención no es el parámetro ideal para la identificación de un
compuesto, ya que, como se ha mencionado, depende de la temperatura, velocidad de
flujo y volumen de fase líquida. Por ello, es más adecuado utilizar un parámetro que
sea independiente de dichos factores. En este sentido. se han propuesto los índices
de retención de Kóvats, los cuales relacionan el volumen de retención, VR (o el tiempo
de retención, tR) del compuesto desconocido con el de dos alcanos lineales que se
eluyan inmediatamente antes y después del compuesto problema. Para ello, a cada uno
de los dos alcanos lineales se adscribe un índice I, dado por,
I = 100 n
28
Cromatografía de gases
siendo n el número de átomos de carbono del alcano.
El índice de retención del compuesto desconocido se obtiene de la expresión:
x–1
I = 100
log VR problema – log VR
x+1
x–1
+ 100 x
log VR – log VR
donde,
VR(problema) = volumen de retención del compuesto desconocido.
VRx–1 = volumen de retención del alcano eluido antes del compuesto desconocido.
VRx+1 = volumen de retención del alcano eluido despues del compuesto
desconocido.
x = número de átomos de carbono del alcano eluido antes del compuesto
desconocido.
La escala logarítmica de la ecuación anterior se debe a que el logaritmo de los
volúmenes de retención en las series homólogas varía linealmente con el número de
átomos de carbono (figura 11.11.)
.
nonano
log V R
octano
.
heptano
hexano
6
7
8
9
n
Figura 11.11. Relación entre VR y n para la serie homóloga de los alcanos.
La identificación de componentes a partir de datos de retención no es un
método general aplicable a todo tipo de muestras. Otra forma de identificación
consiste en recoger los efluentes de las columnas en trampas y analizarlos mediante
técnicas químicas o fisicoquímicas, si bien, esta forma de operar está condicionada por
las pequeñas cantidades de muestra colectadas. En los procedimientos de
29
Claudio González Pérez
identificación más sofisticados, los efluentes de la columna se pasan directamente a
un detector discriminativo, como el espectrómetro de masas o de infrarrojo.
La asociación cromatografía de gases/espectrometría de masas (CG/EM)
proporciona una herramienta muy potente para la identificación de los componentes
de una mezcla compleja. La figura 11.12. muestra un diagrama de bloques donde se
indican los componentes principales de un sistema CG/EM controlado por un
computador.
Espectrómetro de masas
.
Cromatógrafo
de gases
Analizador
Cámara
de
Interfase
ionización
de
masas
Detector
.
Sistema de vacío
Computador
Registrador
.
Figura 11.12. Sistema cromatografía de gases/espectrometría de masas.
La interfase o conexión entre el cromatógrafo y el espectrómetro deberá tener
un volumen muerto que sea mínimo, con objeto de no provocar ensanchamiento de
bandas cromatográficas. Por otra parte, deberá reducir convenientemente la presión,
ya que la columna cromatográfica opera normalmente a una presión ligeramente
superior a la atmosférica, mientras que en el interior del espectrómetro la presión es
inferior a 10–3 torr. Asimismo, y sobre todo cuando se opera con columnas de relleno,
deberá reducirse el caudal a introducir en el espectrómetro, lo cual se consigue
mediante dispositivos separadores.
La formación de iones se produce en la cámara de ionización, donde los
electrones emitidos por un filamento caliente son acelerados y dirigidos hacia un
ánodo colector. En su trayectoria chocan con las moléculas orgánicas del analito,
originándose iones moleculares y, en muchos casos, iones secundarios como
consecuencia de procesos de fragmentación,
M + e —> M+ + 2 e —> A+ + B+ + C+ etc. (M+: ión molecular) ⎯
30
Cromatografía de gases
El papel que desempeña el analizador de masas es separar los iones emergentes
de la cámara de ionización según su relación masa/carga. Con esta finalidad se utilizan
dispositivos de dos tipos: espectrómetros de sector magnético y de cuadrupolo.
Los detectores pueden presentar los datos de dos formas: a tiempo real y
reconstruidos por ordenador. Hay que considerar que cada especie que emerge de la
columna cromatográfica origina, además del ión molecular, todo un conjunto de picos
correspondientes a los distintos tipos de fragmentaciones, por lo que el número de
especies detectadas por el espectrómetro puede ser considerable. La identificación
de compuestos se hace por comparación con colecciones de espectros de masas de
sustancias conocidas. Una vez completada la separación, los cromatogramas pueden
reconstruirse por ordenador y presentarse en una pantalla o imprimirse. En la figura
11.13.a. se muestra el cromatograma de una mezcla constituida por acetaldehido,
etanol, acetona y benceno, y en la figura 11.13.b. el espectro de masas del pico
correspondiente al benceno.
1. acetaldehido
2. etanol
3. acetona
4. benceno
4
1
3
2
.
tiempo
a)
20
40
60
b)
80
100
120
m/z
Figura 11.13. a) Cromatograma reconstruido por ordenador. b) Señales del pico número 4 (benceno).
El espectro infrarrojo de un compuesto puede considerarse como su huella
digital, y puede utilizarse para su identificación, por comparación con espectros
estándar. Los primeros acoplamientos cromatografía de gases/espectrometría
infrarroja datan de 1967, si bien su aplicación práctica no tuvo lugar de forma
inmediata debido a las dificultades derivadas de la baja sensibilidad y del tiempo
necesario para obtener cada espectro con un instrumento convencional. Actualmente,
con espectrómetros de infrarrojo de Transformada de Fourier, se requieren
tiempos del orden de 0.2 segundos, que son perfectamente compatibles con las
anchuras de pico obtenidas con columnas capilares. Igual que en el caso de la CG/EM,
se dispone de colecciones de espectros digitalizados y sistemas de búsqueda para
manipular la enorme cantidad de datos que producen los instrumentos mencionados.
Claudio González Pérez
31
Análisis Cuantitativo
La cromatografía de gases es una poderosa herramienta de la que dispone el
análisis cuantitativo para mezclas complejas. Como ya se indicó en el Tema 10 (en la
sección "La Cromatografía y el Análisis Químico") el parámetro cuantitativo es el área
de pico (con detectores diferenciales, que son los que se utilizan casi siempre), y no
las alturas de pico, por depender éstas de un gran número de variables. Las áreas de
pico se obtienen por métodos convencionales, tales como triangulación, planimetría o
mediante el uso de integradores, mecánicos o electrónicos. La obtención del calibrado
se basa en la utilización de patrones y se obtiene operando como se indica en la
sección ya mencionada del Capítulo anterior.
Determinaciones indirectas por cromatografía de gases
Existe una gran cantidad de compuestos químicos que no pueden ser analizados
directamente por cromatografía de gases, bien porque no sean suficientemente
volátiles o por otros motivos. En muchos casos, puede llevarse a cabo la determinación
indirecta aplicando alguno de los métodos que seguidamente se mencionan.
Derivatización. Puede estimarse que entre el 80 y 90 % de los compuestos
orgánicos no son adecuados para su determinación directa por CG debido a su baja
volatilidad. Tal es el caso de una gran cantidad de muestras biológicas, como
proteínas, hidratos de carbono, aminoácidos, etc. Una solución a esta aplicabilidad
limitada está en la preparación de derivados adecuados, para lo que se utilizan
normalmente los métodos de sililación, acilación y esterificación.
La sililación es la técnica de derivatización más empleada, y consiste en la
sustitución de algún átomo de hidrógeno activo del analito por un grupo
trialquilsilil, tal como –Si(CH3)3. Así, por ejemplo, la reacción entre un alcohol y
trimetilclorosilano transcurre según,
R-OH + Cl-Si(CH3)3 —> R-O-Si(CH3)3 + HCl
Estos procesos se llevan a cabo normalmente usando piridina como disolvente y
suelen ocurrir muy rápidamente.
La esterificación consiste generalmente en la formación de ésteres metílicos,
para lo cual se pueden emplear distintos reactivos, utilizándose con frecuencia
trifluoruro de boro en metanol,
32
Cromatografía de gases
R-COOH + CH3OH/BF3 —> R-COOCH3
La acilación con anhidrido de ácido o con acil-imidazoles se usa para transformar
alcoholes y aminas primarias y secundarias en derivados estables
R-OH +
R1 –CO
R1 –CO
R-OH + R1 -CO-N
R1 -COOR + R1 -COOH
O
N
R1 COOR + HN
N
.
En muchas ocasiones se utilizan derivados fluorados para aumentar la
sensibilidad cuando se usa un detector de captura electrónica.
El mayor inconveniente de los métodos de derivatización reside en la necesidad
de utilizar una cantidad de muestra relativamente grande y la posibilidad de que se
pierda algo del componente de interés. Además, el exceso del reactivo utilizado puede
reducir el tiempo de vida de la columna si no se elimina antes de la inyección.
Cromatografía de espacio de cabeza. Es una técnica que hace posible la
determinación de los constituyentes volátiles de muestras sólidas o líquidas por
análisis de la fase de vapor que está en equilibrio termodinámico con la fase sólida o
líquida. Dichos volátiles pueden determinarse en casi todo tipo de matrices sin
necesidad de recurrir a procesos de extracción, disolución o incluso dilución. Para ello,
las muestras se colocan en dispositivos adecuados que se mantienen a temperatura
constante el tiempo suficiente para que se establezcan los equilibrios sólido o
líquido/vapor correspondientes y seguidamente se transfiere un determinado volumen
de la fase gaseosa a la columna cromatográfica. La temperatura debe ser controlada
de forma precisa debido a la dependencia entre esta variable y la presión de vapor y,
por supuesto, la calibración tiene que hecerse en idénticas condiciones a las de la
muestra.
La determinación de especies volátiles en alimentos se lleva a cabo en muchas
ocasiones utilizando la técnica cromatográfica de espacio de cabeza. Los compuestos
volátiles presentes en muchos alimentos pueden ser aceites esenciales, compuestos
aromatizantes o bien, distintos disolventes. Estos pueden proceder de la elaboración
de los propios alimentos (acetona en la purificación de ciertas grasas, diclorometano
en el café descafeinado, etc.) o del material utilizado para el envasado (disolventes
empleados en la fabricación de las tintas usadas). En cualquier caso, en los alimentos,
la proporción entre las materias no volátiles y las sustancias volátiles es muy elevada,
Claudio González Pérez
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por lo que si se introdujera la totalidad de la muestra en la columna, probablemente
ésta se inutilizaría rápidamente. Sin embargo, mediante la técnica de espacio de
cabeza, se resuelve fácilmente el inconveniente mencionado.
Pirólisis en cromatografía de gases. Una gran cantidad de materiales sólidos
pueden analizarse indirectamente por cromatografía de gases sometiéndolos a
pirólisis. Para ello, la muestra se calienta en la cámara de inyección de un
cromatógrafo de gases a una temperatura a la que tenga lugar su descomposición.
Cromatografiando los productos originados en el proceso de pirólisis, es posible, al
menos teóricamente, elucidar la estructura del material original. El método más común
para pirolizar muestras consiste en la utilización de un filamento metálico, con
frecuencia de platino, que se calienta eléctricamente. A veces, los productos de
pirólisis pueden identificarse, pero a menudo, se obtiene un patrón complejo con
muchas bandas de elución no identificadas. En cualquier caso, con esta técnica se
obtiene algo así como una "huella digital" de la muestra.
Aplicabilidad de la cromatografía gas-líquido
Las aplicaciones concretas de la CGL son extraordinariamente numerosas, pues
cada año se publican miles de artículos en relación con el tema y la técnica se ha
extendido a muchos otros campos aparte de la química. Por ello, a continuación solo se
mencionan algunas aplicaciones puntuales de interés.
En análisis de alimentos, ya se ha mencionado que la técnica de espacio de cabeza
se usa frecuentemente para determinar especies volátiles, las cuales son, en muchas
ocasiones, responsables de olores y sabores característicos. A veces se recurre a
procesos de derivatización, tales como la formación de ésteres metílicos para la
determinación de lípidos y ácidos grasos, hidrólisis ácida seguida de esterificación
para las proteínas, o procesos de sililación para hidratos de carbono.
El análisis de drogas por cromatografía de gases suele complementarse por
HPLC, si bien, en análisis forénsico se utiliza extensamente la CG para la
caracterización de ciertas sustancias. El material de partida suele ser muy diverso;
desde preparaciones comerciales a fluidos biológicos (sangre, orina). lo que hace
necesaria la correspondiente extracción previa. Además, en ocasiones, después de la
extracción o disolución se requiere un proceso de derivatización.
La pirólisis en CG se utiliza para la caracterización de alquitranes, pinturas,
películas y fibras sintéticas, e incluso material biológico. Así, por ejemplo, se ha
34
Cromatografía de gases
descrito la caracterización de hasta cuarenta y siete especies de Salmonella de forma
correcta en muestras de la bacteria sometidas a pirólisis.
La CGL se aplica extensamente para el seguimiento y control de la distribución de
contaminantes en el medio ambiente. En este sentido, y por ejemplo, la Agencia de
Protección del Medio Ambiente en Estados Unidos y la Union Europea ha publicado un
conjunto de métodos para el análisis de polutantes en aguas*, donde se incluyen hasta
40 derivados clorados, 40 organofosforados y varios carbamatos.
En relación con la contaminación atmosférica, unos compuestos particularmente
importantes por su elevada peligrosidad son las dibenzo-p-dioxinas policloradas
(PCDD)**
O
O
Cl
O
Cl
O
Cl
Cl
Cl y
Cl x
PCDD
TCDD
Se conocen unos 75 isómeros de PCDD, muchos de los cuales se han identificado
en las emisiones de los incineradores de basura municipales, tanto en las cenizas
arrastradas por el aire, como en las emisiones de las chimeneas. El procedimiento de
análisis utilizado consiste en la toma de muestras atmosféricas con dispositivos
especiales, someter a las cenizas a un tratamiento ácido, seguido de extracción con
tolueno y metoxietanol y, finalmente, separar los compuestos por cromatografía gaslíquido (o por HPLC) e identificarlos por CG-EM.
Por otra parte, hidrocarburos aromáticos (benceno, tolueno) en gases de escape
de automóviles pueden determinarse fácilmente por CGL con detector de ionización
de llama y polietilenglicol como fase estacionaria.
Aunque muchos compuestos inorgánicos no son volátiles, pueden ser analizados
por CG transformando las especies metálicas en derivados volátiles. Con esta finalidad
y para la determinación de ciertos elementos metálicos (Be, Al, Cu, Fe, Cr) se recurre
a la formación de quelatos bastante volátiles con acetilacetona y sus derivados
fluorados.
* USEPA, Determination of Organic Compounds in Drinking Water, Method Series 500; GC Methods of Analysis
for Solid Waste, Method Series 8000. US Environmental Protection Agency, Cincinnati OH.
** La variedad tetraclorada, TCDD, alcanzó una lamentable notoriedad a nivel internacional como
consecuencia del vertido a la atmósfera, a causa de una explosión, de unos 600 Kg del compuesto, en el
verano de 1976 en la localidad de Seveso.
Claudio González Pérez
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CROMATOGRAFIA GAS-SOLIDO
La cromatografía gas-sólido se basa en la adsorción de especies gaseosas sobre
fases estacionarias sólidas. Puede considerarse que es una técnica complementaria de
la CGL, si bien se utiliza de forma mucho más limitada que ésta. Ello se debe, entre
otras cuasas, a que las isotermas de adsorción son frecuentemente no lineales,
excepto para concentraciones muy bajas de soluto, lo cual se traduce en la formación
de picos asimétricos y tiempos de retención que dependen del tamaño de la muestra.
Además, los tiempos de retención suelen ser excesivamente grandes, debido a la gran
área superficial de los adsorbentes, y, por otra parte, muchos adsorbentes son
difíciles de preparar y estandarizar de forma reproducible. Por otra parte, muchos
adsorbentes son activos catalizadores.
La instrumentación en CGS es la misma que en CGL, excepto en la naturaleza de
la fase estacionaria. Esta puede estar contenida en columnas empaquetadas y también
en columnas tubulares abiertas (ver figura 10.4.a.).
Los principales adsorbentes utilizados como fase estacionaria son sílice, alúmina,
tamices moleculares y polímeros porosos.
La sílice porosa se encuentra disponible comercialmente en una gran variedad de
áreas superficiales y diámetros de poro. Aquellas comprenden desde 185 (tipo B) a
100 (tipo C) m2/g y los diámetros varían entre 15 y 30 nm respectivamente. Estas
fases estacionarias se aplican fundamentalmente para la determinación de
hidrocarburos saturados y no saturados de bajo peso molecular.
La alúmina es una sustancia de polaridad elevada que interactúa fuertemente con
moléculas polares, tales como el agua. La activación por calefacción a temperaturas
superiores a 500 ºC produce un incremento en la polaridad por pérdida de agua, y la
absorción de ésta la reduce, alcanzándose un mínimo cuando se absorbe una cantidad
suficiente para formar una mono-capa. El área superficial típica es del orden de 250
m2/g y la superficie puede modificarse por adición de sales inorgánicas.
Los tamices moleculares constituyen unas fases estacionarias ampliamente
usadas en cromatografía. Suelen ser zeolitas preparadas artificialmente con sodio,
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Cromatografía de gases
potasio y alumino-silicatos. Su estructura se muestra esquemáticamente en la figura
11.14., donde se representa la interconexión de ocho cubos-octaedros de Si, Al y O
para originar una cavidad dentro de la cual pueden penetrar moléculas pequeñas que
son parcialmente retenidas, siendo posible la separación de mezclas conteniendo O2,
N2, CO2, H2, CH4, etc.
Los tamices moleculares son excelentes agentes deshidratantes para el gas
portador por su gran afinidad por el agua, la cual es retenida con prioridad antes que
cualquier otra molécula. Cuando se utilizan con esta finalidad pueden regenerarse
calentando a 300 ºC en el vacío o en atmósfera de nitrógeno.
La separación de hidrocarburos ligeros (C1–C3) y gases permanentes puede
llevarse a cabo con tamices moleculares de carbono, constituidos por un esqueleto
carbonoso formado por pirólisis de materiales poliméricos, si bien, los carbonos
activos son sólidos difíciles de preparar de forma reproducible.
.
.
.
cavidad abierta
Figura 11.14. Estructura de tamices moleculares
Los polímeros microporosos se obtienen normalmente por co-polimerización de
divinilbenceno con estireno u otros monómeros. La naturaleza precisa del mecanismo
de las separaciones con estos materiales no se conoce con exactitud, pues, junto con
un proceso de adsorción, parece que tiene lugar algo de reparto, si bien predomina
aquel, especialmente a bajas temperaturas. Estas sustancias se aplican en
cromatografía para la separación de especies gaseosas polares, tales como óxidos de
nitrógeno, sulfuro de hidrógeno, dióxido de carbono, metanol y otras.