PARTICIPACIÓN DE LOS RECEPTORES DOPAMINERGICOS EN

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO
E INVESTIGACIÓN
EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE
LOS RECEPTORES D2-like DOPAMINERGICOS EN LAS
RESPUESTAS A ESTÍMULO MOTIVACIONALES DE
RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
TES I S
PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRO EN CIENCIAS EN FARMACOLOGÍA
P
R
E
S
E N T
A
BIOL. EXP. MARIA INOCENCIA FLORENCIA
MATA ESQUIVIAZ
DIRECTORES DE TESIS
DRA. NAYELI PÁEZ MARTÍNEZ
DR. ANGEL MILIAR GARCÍA
MEXICO D.F.
ENERO 2010
EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
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RECONOCIMIENTO
Esta Tesis se realizó con el asesoramiento de los doctores; Dra. Nayeli Páez Martínez y el
Dr. Ángel Miliar García.
Durante su realización conto con el apoyo del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología
(CONACYT) a través de la beca de Maestría No. 219154 y del Programa institucional de
formación de investigadores (PIFI) mediante la beca otorgada durante la estancia en la
Escuela Superior de Medicina.
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AGRADECIMIENTOS
En primer lugar, quisiera expresar mi más grande agradecimiento a Dios, por darme la
oportunidad de dejarme terminar este proyecto que hoy se ve reflejado con esta tesis. Pero
también quiero dar mis más sinceros agradecimientos a mis asesores la Dra. Nayeli Páez
Martínez y el Dr. Ángel Miliar García, por brindarme la oportunidad de trabajar con ellos,
por proporcionarme su confianza y por el constante apoyo entregado durante la realización
de esta tesis, además, por sus oportunos y muy buenos consejos que muchas veces fueron
claves para ayudarme con mis problemas intelectuales, de ánimo y personales. Gracias por
ayudarme a crecer y a orientarme en mi formación profesional.
A la Dra. Esperanza García Mendoza del instituto nacional de neurología y neurocirugía
Manuel Velazco Suarez; al Dr. Pedro López Sánchez del laboratorio de farmacología
molecular de la Escuela Superior de Medicina del IPN; a la Dra. Erika Estrada Camarena
del instituto nacional de psiquiatría Ramón de la Fuente y la Dra. Carolina López
Rubalcaba del departamento de fármacobiología del Cinvestav Sur,
por todo su apoyo
desinteresado, por brindarnos los medios para que se llevara acabo este proyecto y por la
paciencia de enseñarme las diversas técnicas del laboratorio que fueron vitales para la
realización de esta tesis, así como también por dejarme trabajar en su laboratorio y darme la
oportunidad de aprender y sentirme parte de su laboratorio, también gracias por los
excelentes ratos de charlas que me ayudaron a crecer moralmente e intelectualmente.
A todos los sinodales el Dr. Ofir Picazo Picazo, el Dr. Joel Lomelí González, la Dra. Judith
Espinosa Raya y al Dr. Edgar Abarca Rojano, quienes han enriquecido esta tesis con sus
muy acertados comentarios en cada seminario.
Un agradecimiento especial para los médicos neurocirujanos Dr. Acosta, Dr. Martínez, y
Dr. González, que estuvieron conmigo en los momentos más difíciles de mi vida, no tengo
con que agradecerles que me hayan ayudado a salir de esta.
También le quiero agradecer a mis padres Carmen y Marcelino por todo el amor que me
han otorgado, por la confianza, por su apoyo incondicional tanto moral y económico y por
enseñarme que las cosas se consiguen trabajando. A mis hermanos Enrique, Francisco,
Lourdes, Raúl, Elizabeth, Jorge y Fabián por estar siempre conmigo, por ser mi guía, mi
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ejemplo y mi fortaleza. A mis cuñadas y cuñados y a todos mis sobrinos por ser siempre
la alegría de mi casa, porque por muy malos que fueran los momentos siempre en ellos
encontraba una sonrisa.También quiero agradecer a mis compañeros de laboratorio de
neuropsicofarmacología y a los del laboratorio de farmacología molecular por la paciencia,
compañía y la disposición para responder a mis preguntas, a todos ustedes “muchas gracias
por todo”.
Por último, pero no menos importante, quisiera agradecer también a mis amigas y Juliopor
su paciencia y el apoyo brindado durante una etapa muy importante de mi vida y por el
hecho de siempre estar conmigo en las buenas y en las malas.
Dedicado a Dios por ser el pilar más fuerte que
tengo y a toda mi familia por brindarme el
apoyo y el amor que me motivo a salir adelante
y por que este logro es de cada uno de ustedes.
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EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
CONTENIDO
Lista de abreviaturas------------------------------------------------------------------------------------i
Índice de figuras----------------------------------------------------------------------------------------ii
Índice de tablas-----------------------------------------------------------------------------------------iii
Resumen ------------------------------------------------------------------------------------------------iv
Abstract--------------------------------------------------------------------------------------------------v
1. Introducción -------------------------------------------------------------------------------12
1.1. Dopamina-------------------------------------------------------------------------------12
1.2. Síntesis y Metabolismo-----------------------------------------------------------------12
1.3. Vías dopaminérgicas--------------------------------------------------------------------14
1.4. Receptores dopaminérgicos------------------------------------------------------------16
1.5. Estructura de los receptores dopaminérgicos----------------------------------------18
1.6. Localización y composición de los receptores dopaminérgicos------------------20
1.7. Funciones de la dopamina en el sistema mesolimbico-----------------------------22
2. Estímulos motivacionales--------------------------------------------------------------------23
2.1. Generalidades de motivación--------------------------------------------------------23
2.2. Estímulos motivacionales naturales-------------------------------------------------24
2.3. Estimulos naturales de recompensa-------------------------------------------------24
2.4. Estímulos naturales de castigo-------------------------------------------------------25
2.5. Estimulos motivacionales no naturales ---------------------------------------------26
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3.Modualción del sistema dopaminérgico ante estímulos
motivacionales--------------------------------------------------------------------27
3.1. Proceso de habituación (liberación de dopamina) ---------------------------------27
3.2.Cambios en los receptores dopaminérgicos-----------------------------------------28
3.2.Regulación de los receptores D2-like------------------------------------------------28
I.
Justificación-----------------------------------------------------------------------------32
II.
Hipótesis---------------------------------------------------------------------------------32
III.
Objetivo general------------------------------------------------------------------------33
IV.
Objetivos particulares-----------------------------------------------------------------33
V.
Material y métodos---------------------------------------------------------------------34
1. Protocolo experimental------------------------------------------------------------ 34
1.1.Animales--------------------------------------------------------------------34
1.2.Ovariectomía--------------------------------------------------------------34
2. Estímulos motivacionales y Grupos experimentales--------------------------35
2.1.Recompensa ---------------------------------------------------------------35
2.2.Castigo----------------------------------------------------------------------35
3. Cuantificación de la liberación de Dopamina----------------------------------36
4. Evaluación de RNAm de los receptores dopaminérgicos del subtipo D2-------------------------------------------------------------------------------------------37
5. Determinación de los cambios en la expresión de los receptores
dopaminérgicos del subtipo -------------------------------------------------------38
6. Evaluación del efecto anhedonico (preferencia espacial) --------------------38
VI.
Análisis Estadístico---------------------------------------------------------------------38
VII.
Resultados--------------------------------------------------------------------------------39
1. Cuantificación de la liberación de Dopamina----------------------------------- 39
2. Evaluación de RNAm de los receptores dopaminérgicos del subtipo D2-----------------------------------------------------------------------------------------------------40
3. Determinación de los cambios en la expresión de los receptores
dopaminérgicos del subtipo D2--------------------------------------------------------41
5.Evaluación del efecto anhedonico (preferencia por la sacarosa)-----------41
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VIII.
Discusión-----------------------------------------------------------------------------49
1. Cuantificación de la liberación de Dopamina-----------------------------------49
2. Evaluación de RNAm de los receptores dopaminérgicos del subtipo D2---49
3. Determinación de los cambios en la expresión de los receptores
dopaminérgcios del subtipo D2---------------------------------------------------50
4. Evaluación del efecto anhedonico (preferencia espacial)----------------------50
IX.
Conclusiones----------------------------------------------------------------------------60
X.
Bibliografía------------------------------------------------------------------------------61
XI.
Anexo----------------------------------------------------------------------------------- 62
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Lista de abreviatura
AADC
L-aminoácido aromático descarboxilasa
AC
Adenilato ciclasa
AMPc
Monofosfato de Adenosina cíclico
ANOVA
Análisis de varianza
ATP
Trifosfato de Adenosina
ATV
Área tegmental ventral
COF
Corteza orbitofrontal
COMTCatecol-O-metiltransferasa
CXP
Corteza Prefrontal
DA
Dopamina
DAT
Transportador de dopamina
DGA
Diacilglicerol
D1
Receptor de dopamina subtipo1
D2
Receptor de dopamina subtipo-2
D3
Receptor de dopaminasubtipo 3
D4
Receptor de dopaminasubtipo 4
D5
Receptor de dopamina subtipo-5
HIP
Hipocampo
L-DOPA
L-3,4 dihidroxifenilalanina
NAc
Núcleo Acumbens
MAO
Monoamino Oxidasa
PKA
Proteína cinasa A
PKC
Proteína cinasa C
RNAm
Ácido ribonucleico mensajero
TH
Tiroxina hidroxilasa
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Índice de figuras
Figura 1. Sinapsis dopaminérgica----------------------------------------------------------------13
Figura 2.Vías dopaminérgicas--------------------------------------------------------------------15
Figura 3. Mecanismo de transducción de señales acoplados a la familia de los receptores
dopaminérgicos D1 y D2-like----------------------------------------------------------------------17
Figura 4. Estructura de los receptores dopaminérgicos-----------------------------------------19
Figura 4.Esquema de aplicación de choques eléctricos 0.1 y 0.3mA-----------------------20
Figura 5.Componentes del sándwich de transferencia----------------------------------------- 42
Figura 6. Preferencia por la sacarosa-------------------------------------------------------------Figura 7. Efecto de la administración repetida de sacarosa a diferentes concentraciones
sobre los niveles de dopamina en hipocampo----------------------------------------------------Figura 8. .Cambios de los niveles de dopamina en corteza prefrontal en animales tratados
con sacarosa a diferentes concentraciones---------------------------------------------------------------Figura 9. Respuesta de la concentración de dopamina en el caudado con la administración
repetida de sacarosa a diferentes concentraciones ------------------------------------------------Figura 10. Diferencias en los niveles de dopamina en el núcleo acumbens generados por la
repetida administración de sacarosa a diferentes concentraciones-------------------------------Figura 11. Efecto de la exposición repetida (4 días)de quinina a 0.3 y 1 mM sobre las
concentraciones de dopamina en el hipocampo---------------------------------------------------Figura 12. Niveles de dopamina en la corteza prefrontal en respuesta a la exposición
repetida de quinina a 0.3 y 1 mM--------------------------------------------------------------------Figura 13. Resultado de la ingesta de quinina a diferentes concentraciones, durante cuatro
sesiones, sobre los niveles de dopamina en el caudado ----------------------------------------
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Figura 14. Efecto de la exposición repetida de quinina a diferentes concentraciones
sobre la concentración de dopamina en el núcleo acumbens---------------------------------Figura 15. Niveles de dopamina en hipocampo, corteza prefrontal, caudado y núcleo
acumbens después de la aplicación repetida de choques eléctricos.--------------------------Figura 16. Disminución de la expresión del RNAm del receptor D2 en la corteza
prefrontal, el caudado y el núcleo acumbens después de la administración repetida de
sacarosa y quinina a 0.3 y 1mM comparada con los animales que fueron tratados con una
sola exposición de sacarosa a 1 mM, 18S, selectina y V-CAM.------------------------------Figura 17. Cambios en la expresión relativa del receptor del subtipo D2 en el núcleo
acumbens, corteza prefrontal y del caudado de animales tratados con una sola exposición de
sacarosa 1 mM.-----------------------------------------------------------------------------------------Figura 18. Cambios en la expresión del receptor del subtipo D2 en la corteza prefrontal en
animales pretratados con sacarosa a concentraciones de 0.3 y 1 mM.---------------------------Figura 19. Expresión del receptor del subtipo D2 en respuesta a la administración repetida
de sacarosa a concentraciones diferentes.---------------------------------------------------------------------Figura 20. Efecto de la administración repetida de sacarosa a 0.3 y 1 mM sobre la
expresión del receptor del subtipo D2.---------------------------------------------------------------Figura 21. Niveles de expresión del receptor D2 en el caudado en relación a la
administración repetida de quinina a diferentes concentraciones -------------------------------Figura 22. Menor expresión del receptor D2 en el caudado con la ingesta repetidade
quinina a 0.3 y 1 mM. ---------------------------------------------------------------------------------Figura 23. El efecto de la administración repetida de quinina a distintas concentraciones
sobre la expresión del receptor D2 en el núcleo acumbens. ------------------------------------Figura 24. Cambios en los niveles de expresión del receptor D2 en la corteza prefrontal, el
caudado y el núcleo acumbens en respuesta a la aplicación repetida de choques eléctricos a
0.1 y 0.3 mA.
Figura 25. Efecto anhedónico de la sacarosa de ratas que fueron pretratadas, cuatro días
antes, con agua (vehiculo), sacarosa a 0.3 y 1 mM y quinina 0.3 y 1mM.--------------------Figura 26. Ingesta de sacarosa en ratas pretradas con choques eléctricos a 0.1 y 0.3 mA.-Figura 27. Preferencia por la sacarosa de ratas pretratadas con distintos tratamientos----
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Índice de tablas
1.-Tabla 1. Receptores de dopamina--------------------------------------------------------------18
2- Tabla 2.Drogas de abuso----------------------------------------------------------------------28
3.-Tabla 3.Curva estándar patrón de 0.5μg de proteínas con ASB
(albúmina sérica bovina) ---------------------------------------------------------------------------40
2.-Tabla 4. Soluciones para preparar Tris-Glicina-SDS-PAGE en geles de 1.5mm de
espesor. Las cantidades se referidas se refieren para preparar el gel de corrida (10ml) y un
gel concentrador (2ml).------------------------------------------------------------------------------
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Resumen
La Dopamina (3,4 dihidroxifeniletilamina) es un neurotransmisor catecolaminérgico que
ejerce sus efectos mediante la interacción a dos familias de receptores dopaminergicos, los
D1-like y los D2-like. Estos receptores, con base a sus características moleculares han sido
clasificados en 5 subtipos. Los receptores D1-like (subtipos D1 y D5) están acoplados a
proteínas Gα
s
y estimulan la formación de AMPc como principal mecanismo de
transducción de señales. Por otro lado, los receptores D2-like, a través de la proteína G
(Gαi y Gαo) inhiben la formación de AMPc. Dichos receptores se encuentran ampliamente
distribuidos en cuatro sistemas anatómicos: el sistema límbico, mesocortical, nigroestrial y
tuberoinfundibular. En el sistema mesolimbico, las neuronas se originan en el área
tegmental ventral y proyectan hacia zonas del cerebro anterior como el núcleo accumbens
y la corteza prefrontal. A nivel de este sistema, la dopamina se libera ante diversos
estímulos motivacionales, los cuales se clasificarlos en naturales y no naturales. Dentro de
los naturales podemos agruparlos en naturales de recompensa y naturales de castigo
(estímulos amenazantes). Dichas respuestas naturales, presentan propiedades hedónica y
pueden actuar como reforzadores positivos, mediante la generación de un comportamiento
de aprendizaje y de repetición. También se ha descrito que la pre-exposición de estímulos
motivacionales de recompensa genera un fenómeno de habituación, disminuyendo la
liberación de dopamina en diversas áreas cerebrales.De manera adicional, se ha observado
que los estímulos motivacionales no naturales como lo es la administración repetida de las
drogas de abuso producen, la estimulación repetida del sistema mesolimbico, lo que genera
cambios neuroadaptativos, que se observan como una disminución de receptores
dopaminérgicos (especialmente los de la familia D2-like). De igual forma, se ha reportado
que una densidad baja de receptores D2-like predispone a los estímulos motivacionales no
naturales. Con estos hallazgos se ha sugerido que la dopamina no solo es un
neurotransmisor del placer sino que se encarga de señalar aquellas conductas que son
importantes para la sobrevivencia del individuo, ya sea que se trate de estímulos
motivacionales positivos o negativos. Sin embargo, a la fecha no ha quedado claro cuál es
el papel de los cambios producidos en los niveles de los receptores dopaminérgicos, ante
los diversos estímulos motivacionale, ya sea de recompensa o de castigo.
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ABSTRACT
Dopamine (3,4 dihidroxiphenylethylamine) is a catecholamine neurotransmitter that exerts
its effects by interacting with two families of dopamine receptors, the D1-like and D2-like.
These receptors, based on their molecular characteristics have been classified into 5
subtype. D1-like receptors (D1 and D5 subtypes) are coupled to Gαs protein and stimulate
cAMP formation as the main mechanism of signal transduction. On the other hand, the D2like receptors, through protein (Gαs y Gαo) inhibit the formation of cAMP. These receptors
are widely distributed in four anatomical systems: the limbic system, mesocortical,
nigrostriatal and tuberoinfundibular. In the mesolimbic system, the neurons arise in the
ventral tegmental area and projecting to forebrain area such as the nucleus accumbens and
prefrontal cortex. At the level of this system, dopamine is released to various motivational
stimuli, which are classified intro natural and unnatural. Among the natives we can group
them intro reward and punishment (stimuli threatening). These answers, present hedonic
properties (which produce a pleasurable effect)
and can act as positive reinforcers, by
generating a learning behavior and repetition. It has also been reported to pre-exposition of
motivational reward stimuli generated a phenomenon of habituation, decreasing the release
of dopamine in various brain areas. Additionally, it was observed that unnatural
motivational stimuli such as repeated administration of drugs of abuse occurs,too, repeates
stimulation of the mesolimbic system, which generates neuroadaptive changes, seen as a
decrease in dopamine receptors (specially the D2-like family). Similarly, it is reported that
a low density of D2-like receptors predispose. Motivational unnatural. These finding have
suggested that dopamine is a neurotransmitter not only pleasure but is responsible for
identifying those behaviors that are important to the survival of the individual, whether in
the case of positive or negative motivational stimuli. However, to date not clear what the
role of changes in the levels of dopamine receptors, to the various motivational stimuli,
either reward or punishment.
.
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1. Introducción
1.1.
1.2.
Dopamina
Síntesis y Metabolismo
La Dopamina(3,4-dihidroxifeniletilamina) es un neurotransmisor catecolaminergico que
se sintetiza a partir del aminoácido L-tirosina. La síntesis consiste en dos pasos, primero
se presenta una hidroxilación, a través de la enzima tirosina hidroxilasa (TH), la cual
hidroxila tal aminoácido a L-3,4 dihidroxifenilalanina (L-DOPA). A continuación se
produce una descarboxilación de L-DOPA, reacción catalizada por la enzima Laminoácido aromático descarboxilasa (AADC), para dar como producto final a la
dopamina (DA). Una vez sintetizado, el neurotransmisor es almacenado en el interior de
las vesículas sinápticas para después ser liberado por exocitosis al espacio sináptico, en
respuesta de un potencial de acción presináptico, y así unirse a sus receptores tanto pre
como post-sinápticos que permiten la acción del neurotransmisor(Ver figura 1) (Felman et
al., 1997).
La dopamina liberada en el espacio sináptico puede también ser transportada de regreso
por el trasportador de dopamina (DAT) a la neurona presináptica, este proceso se llama
recaptura, y es el mecanismo más importante por el cual la dopamina es removida de la
hendidura sináptica. Una parte de la dopamina que entra a la terminal neuronal (alrededor
del 50%) es transportada hacia el interior de las vesículas sinápticas, y posteriormente ser
liberada. La dopamina remanente que entra a la terminal neuronal es destruida por una
enzima oxidativa mitocondrial, la monoamino oxidasa (MAO). La dopamina remanente
en la hendidura sináptica difunde a la circulación y es destruida en el hígado por la
catecol-O-metiltransferasa (COMT) y la MAO(Ver figura 1) (Siegel y Sapru., 2006).La
acción de ambas enzimas da lugar a dos metabolitos: el ácido 3,4-dihidroxifenilacético
(ADFA) y el ácido homovalinico (AHV)(Felman et al., 1997).
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Fig. 1. SINAPSIS DOPAMINERGICA. En esta figura se muestra el proceso de
síntesis de la Dopamina (DA), la recaptura presináptica y vesicular de la misma, así
como su liberación vesicular, y los receptores dopaminérgicos posinápticos y
presinápticos. (Siegel y Sapru., 2006).
1.3. Vías dopaminérgicas
Las neuronas dopaminérgicas se encuentran distribuidas en cuatro vías que incluyen
diferentes áreas cerebrales. El Sistema Mesolimbico, cuyos cuerpos celularesse originan
en el núcleo localizado en la porción ventral (o tagmento) del cerebro medio y cuyos
axones proyectan a la amígdala, área septal y principalmente en el núcleo acumbens
(NAc). Esta vía hace elevo en este núcleo y envía proyecciones que se dirigen hacia la
corteza prefrontal (CXP). (Adinoff et al., 2004; Shirayama y Chaki.,2006; Spanagel y
Weiss., 1999; Schultz., 2002).El Sistema Mesocortical, donde las neuronas, al igual que el
anterior sistema, se originan en el área tegmenta ventral (ATV) pero proyectan
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directamente hacia la corteza prefrontal medial, que incluye la corteza orbitofrontal
(COF) y la corteza del cíngulo (Shirayama y Chaki., 2006; Carrion y Poppel., 2007). El
Sistema Tuberoinfundibular, el cual se origina en el hipotálamo (núcleo arcuato
principalmente) y se comunica con el lóbulo intermedio de la hipófisis y la eminencia
media. (Feldman et al., 1997;Koob et al., 1998) y por último el Sistema Nigroestrial,
cuyos cuerpos neuronales se localizan en la sustancia nigra y proyecta hacia el estriado
dorsal (Ver figura 2) (Adinoff et al., 2004; Schultz., 2002; Rang et al., 2008).
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Prefrontal
Cortex
Striatu
m
Nucleus
accumbens
Mesocortic patway
VTA
Tuberoinfudibular patway
Mesolimbic patway
Nigrostriatal patway
SN
Fig. 2. VÍAS DOPAMINERGICAS. En esta figura se muestran las diferentes vías
dopaminergicas: sistema mesolimbico, masocortical (en color café), tuberoinfundibular
(en color azul) y nigroestrial (en color negro). SN; sustancia nigra, VTA; área tegmental
ventral, estriado dorsal (núcleo caudado-putamen), núcleo acumbens, y corteza prefrontal
(Carrion y Poppel., 2007; Rang et al., 2008).
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1.4. Receptores dopaminérgicos
Con base en sus características moleculares, estructurales, funcionales, su respuesta
farmacológica y su distribución anatómica, los receptores de la dopamina se agrupan en dos
familias, la D1-like y D2-like. Estos receptores a su vez han sido clasificados en 5 subtipos
(Kababian y Calne., 1979). Los receptores D1-like (subtipos D1 y D5) son receptores
metabotrópicos que están acoplados a proteína Gα s,por lo que estimulan a la enzima adenil
ciclasa (AC), que a partir del ATP genera AMPc. Este segundo mensajero regula la
activación de la proteína cinasa A (PKA), la cual fosforila un subgrupo de proteínas
nucleares y factores de transcripción, que a su vez regulan y modifican la expresión
funcional de múltiples genes. Por otro lado, los receptores D2 (subtipos D2, D3, D4), son
receptores metabotrópicos que interactúan con la proteína G del tipo Gαi y Gαo, por lo cual
inhiben a la adenil ciclasa, y por lo tanto la formación de AMPc. Otros sistemas de
transducción de señales están asociados con la activación de este receptor, tales como la
apertura de los canales de K+, la activación de la cascada de fosfoinositol, y la reducción de
corrientes de Ca2+ que fluyen a través de canales dependientes de voltaje (Ver Figura 3)
(Felman et al., 1997; Missale et al., 1998).En la tabla 1 se resumen los diferentes subtipos
de receptores dopaminérgicos, la proteína G a la que se acoplan, las vías clásicas de
transducción y las moléculas efectoras que lo modulan.
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Fig. 3. Mecanismo de transducción de señales acoplados a la familia de los receptores
dopaminergicos D1 y D2-like. AC, adenilil ciclasa; AMPc, monofosfato cíclico de adenosina;
ATP, trifosfato de adenosina; ADP, difosfato de adenosina;DAG, diacilglicerol; IP3, 1,4,5trifosfato de inositol; PIP2, 4,5-difosfato de fosfatidilinositol; PKA, cinasa deproteína activada por
AMPc; P, fosforilación; PKC, cinasa C de proteína. PLC, fosfolipasa C (Bahena et al., 2000).
Tabla 1. Receptores de dopamina
D1-like
Familia
D2-like
D1
D5
D2
D3
D4
Proteína G
Gs/olf
Gs/olf
Gi/o
Gi/o
Gi/o
Mecanismo
+AC
+AC
-AC
AC
-AC
de
+PLC
+PLC
Subtipo
transducción
de señales
↑AMPc
+PLC
+PLC
-Canales de
-Canales de
Ca²+
Ca²+
+Canales de
+Canales de
K
K
↓AMPc
↓AMPc
↓AMPc
↑Ác. Araquid.
Moléculas
↑AMPc
efectoras
↑PKA
↑IP3
↑IP3
↑IP3
↓ Ca²
↓ Ca²
↑K
+
+
+
↑ K+
1.5. Estructura de los receptores dopaminérgicos
Los receptores dopaminérgicos de ambas familias (Ver figura 4) poseen 7 dominios
intramembranales, los cuales están conectados de forma alterna por asas intracelulares
(i1,i2,i3) y extracelulares (e1,e2,e3), además de que poseen una región amino terminal
glicosilada. El tercer y séptimo dominio intracelular de las dos familias de receptores
presentan diferencias moleculares que resultan en señales intracelulares diferentes. La
familia de los receptores D1-like se caracterizan por tener, en el tercer dominio, un asa i3
corta y un carboxilo terminal grande en el séptimo dominio (Missale et al., 1998), el cual es
rico en residuos de serina, treonina y cisteína por lo que es susceptibles a la fosforilación
por cinasas como la PKA y la PKC (Rankin et al., 2006), y que a su vez permiten la
interacción con la proteína Gαs. En contraste, en los receptores D2-likepresentan una
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región carboxilo terminal corta, además de una asa i3 larga, rica en residuos de serina y
treonina, mismos que pueden ser forforilados por diversas cinasa, regulando así el acople a
la proteína Gαi y Gαo y (Namkung y Sibley., 2004).
Fig. 4. ESTRUCTURA DE LOS REPTORES DOPAMINERGICOS.
Representación esquemática de la estructura de las dos familias, D1-like y D2-like,
con sus siete dominios intramembranales (I-VII), asas citoplasmáticas (i1, i2, i3), asas
extracelulares (e1, e2, e3), extremo amino terminal (NH2) y extremo carboxilo
terminal (COOOH). (Levant., 1997)
Existe una alta homología de secuencia entre los dos miembros de receptores D1-like, del
orden del 80%. Entre los miembros de la familia D2-like la homología es de un 75% entre
los receptores D2 y D3 y un 53% entre los D2 y D4. Por el contrario la homología entre los
receptores D1-like y D2-like es solo del 42-46%. La homología es mayor en los dominios
transmembranales y en aquellos residuos que son clave para la unión de la dopamina, como
por ejemplo, las dos serinas en el dominio cinco transmembranal que está implicado en el
reconocimiento de los dos grupos de hidroxilo presentes en las catecolaminas y el residuo
aspártico del dominio tres transmembranal que se cree actúacomo contraiondel grupo
amino de las aminas biogénicas(Missale et al., 1998).
El extremo carboxilo terminal, en ambas familias, contiene lugares de fosforilación que se
sabe juegan un papel importante en la desensibilización del receptor (Missale et al., 1998;
Namkung y Sibley., 2004; Rankin., et al.,2006).
1.6. Localización y composición de los receptores dopaminérgicos
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D1-like (subtipos D1 y D5)
Receptor D1
Este subtipo D1 es el receptor dopaminérgico más abundante en el sistema nervioso central.
Se encuentran distribuido en mayor densidad en el tubérculo olfatorio, caudadoputamen,núcleo accumbens, las islas de calleja, la amígdala, la sustancia nigra, y el
cerebelo, mientras que en niveles moderados los encontramos en corteza cerebral
(frontal, entorrinal y del cíngulo), el tálamo y el globo pálido, y son muy escasos en
hipocampo, la región septal y el área tegmental ventral (Fremeau et al., 1991). Se
encuentran localizados en las neuronas postsinápticas, y están conformados por cadenas de
446 residuos de aminoácidos, tanto en el humano como en la rata (Gingrich et al., 1992).
Receptor D5
El subtipo de receptor D5 se expresa en menor intensidad que el subtipo D1 y su
localización parece restringirse al hipocampo y a los núcleos lateral mamilar y
parafascicular del tálamo (Tiberi et al., 1991; Meador-Woodruff et al., 1992). Están
localizados en las neuronas postsinápticas y son proteínas de 475 aminoacidos en la rata,
mientras que en el humano son de 477 aminoácidos (Feldman et al., 1997).
D2-like (Subtipos D2, D3 y D4)
Receptor D2
Estos receptores dopaminérgicos se expresan en alta densidad en el caudado-putamen, el
tubérculo olfatorio, el núcleo accumbens, las islas de calleja y el área tegmental ventral.
En moderadas cantidades en la sustancia nigra reticulada y compactada, la corteza
cerebral (regiones prefrontal, entorrinal y cíngulo), el globo pálido, la amígdala el tálamo
e hipotálamo e hipocampo (Meador-Woodruff et al., 1991). La distribución del RNAm es
paralela a la descrita para la proteína. Así se ha descrito un elevado nivel de RNAm para
este receptor en el núcleo accumbens, la corteza prefrontal y el área tegmental ventral.
Estos se encuentran localizados en neuronas postsinápticas y presinápticas donde puede
actúa como un autoreceptor en las terminales dopaminergicas que regula la síntesis y
liberación de dopamina (Missale et al., 1998).
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Los subtipos D2 son una población heterogenia, donde se presentan dos isoformas
molecularmente diferentes, llamadas D2S (corto) y D2L (largo) generados por un splicing
alternativo del mismo gen. El gen del receptor D2 está compuesto por 8 exones, 7 de los
cuales se transcriben. En el sexto exón tiene lugar un splicing alternativo, el cual codifica
para 29 aminoacidos adicionales en la tercera asa intracelular, generando las dos isoformas
que se encuentran tanto en la rata como en el humano (Missale et al. 1998).
La traducción de señales por estas dos isoformas (D2S y D2L) afectan de manera diferente
las respuestas presinápticas y postsinápticas (De Mei et al., 2008). La isoforma D2L tiene
443 áminoácidos en los humanos y 444 en la rata, y es el responsable de la señalización
mediada de los receptores D2 postsinápticos. La isoforma D2S presenta 414 aminoácido en
el humano y 415 en la rata (Giros et al., 1989), y tiene mayor efecto presináptico, debido a
que cuando se activan estos receptores se reduce la fosforilación en la Ser40 de la tirosina
hidroxilasa (TH). La desregulación de la función de los autoreceptores D2, mediado por
D2S juega un papel importante en la patología del abuso de las drogas, así como en la
vulnerabilidad de las mismas, además de regular la síntesis de la DA, también participa en
el control de su liberación modulando el transportador de dopamina (DAT) (Lee et al.,
2007)
Receptor D3
Niveles altos del subtipo D3 se encuentran en la isla de calleja, núcleo accumbens, la
región septal, los núcleos geniculados medial y lateral del tálamo, el núcleo mamilar medial
del hipotálamo y en las células de pulkinje del cerebelo. Las densidades intermedias se han
observado en la corteza parietal y temporal, el hipocampo, el bulbo olfatorio, el
neoestriado, el núcleo accumbens, la amígdala, el núcleo subtalámico y los
lóbulosanteriores e intermedios de la hipófisis. En niveles mínimos se detectan en la
sustancia nigra compacta, el área tegmental ventral, la corteza frontal, el cíngulo y el globo
pálido (Lévesque et al., 1992).Este subtipo está presente en su mayoría en neuronas
presinápticas y que en postsinápticas. En el humano el receptor consta de 400 aminoácidos,
mientras que en la rata la cadena peptídica es de 446 residuos de aminoácidos (Sokoloff et
al., 1990; Levant B., 1997; Le Foll et al., 2009).
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Receptor D4
El subtipo D4 se encuentra en alta densidad en la corteza frontal, el bulbo olfatorio, la
amígdala y la retina (Cohen et al., 1992; Defagot et al.,1997). En densidades intermedias se
observa en caudado-putamen, mientras que en densidades bajas o apenas detectables se
han reportado en el hipotálamo y el hipocampo (Defagot et al.,1997). Este subtipo está
presente en neuronas presinápticas y postsinápticas. Se encuentra formado por una cadena
peptídica de 385-387 aminoácidos en la rata y en el humano respectivamente (Felman et al.,
1997).
1.7. Funciones de la dopamina en el sistema mesolímbico
La dopamina en el sistema mesolimbicoregula una variedad de funciones entre las cuales se
encuentran; el aprendizaje (Beninger y Miller, 1998),la actividad motriz (Hassler., 1978) la
emotividad y la motivación (Schultz, 2002; 2007; Salamone y Correa., 2002, Salamone et
al., 2003, Bassareo et al., 2002).Dicho sistema dopaminergico que regula estas funciones,
hoy en día es un objeto de estudio de mayor interes, debido a que sus disfunciones estas
involucradas en la etiología o tratamiento de varias patologías tales como la adicción a
drogas, esquizofrenia, parkinson, déficit de atención e hipeactividad entre otras.
2. Estímulos motivacionales
2.1 Generalidades de la motivación
La motivación es un proceso mediante el cual el organismo emite respuestas a estímulos
(motivacionales) en relación con sus consecuencias predictivas en términos de
sobrevivencia de él mismo y de la especie (Di Chiara y Bassareo.,2007).
La motivación tiene dos aspectos importantes: la direccionalidad y la activacionalidad. El
aspecto de direccionalidad se refiere a la observación de que el comportamiento es dirigido
hacia un objetivo o por un estimulo particular. El aspecto activacional de la motivación se
refiere al gasto energético que conllevala búsqueda del objeto, ya que el organismo puede
tener obstáculos o costos relacionados al trabajo para conseguir estímulos gratificantes,
como la comida (Salamone y Correa.,2009; Cofer y Appley., 2007).De manera
interesante,Young (1949) propusoque la motivación contiene además un factor hedonico:
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la de lo placentero y lo desagradable. De esta forma, la conducta de un sujetopuede
estar influenciada por el efecto gratificante(o de recompensa) que consiga al procurarse el
estímulo. Así por ejemplo a una rata ala que se exponga comida se dirigirá hacia el
alimento no solo por la necesidad bioquímica del organismo (comer para sobrevivir) sino
también por el factor hedónico o disfrute que implica el consumir el alimento (Cofer y
Appley., 2007).
Por otra parte, Murray H.A propone que la motivación implica una fuerte asociación
afectiva, caracterizada por una reacción de meta anticipada y basada en asociaciones
pasadas de ciertas clavesrelacionadas con el placer y el dolor. De esta forma, si una persona
está pasando por una emoción o efectos muy placenteros, al mismo tiempo estará
recibiendo varios estímulos o claves de su ambiente, su cuerpo, sus pensamientos y su
propio estado emocional; es decir, en ocasiones ulteriores estos estimulos pueden reactivar
una parte de él. Al parecer, esta reactivación fraccional del estado emocional es motivante;
es decir, el hombre se dedicara a actividades instrumentales que le harán acercarse a las
circunstancias en las que él experimento el efecto placentero o la emoción placentera. De
haber sido desagradable la emoción, igualmente podrían reintegrar una parte de este
estadoque lo hiciera apartarse de todo contacto con la situación (evitación) (Cofer y
Appley., 2007).
2.2. Estimulos motivacionales naturales
A los estímulos motivacionales podemos clasificarlos en naturales y no naturales. Dentro
de los naturales podemos agruparlos en naturales de recompensa y naturales de castigo. De
manera interesante se ha descrito que elcerebro evolucionóde tal forma que pudiera
responder a estimulos de recompensa naturales, tales como la comida y el sexo. Así las
respuestas adecuadas a recompensas naturales fueron evolutivamente importantes para
garantizar la sobrevienvencia, la reproducción y el estado de salud. En algún momento de la
evolución los seres humanos descubrieron la manera de estimular, de manera no
naturaleste sistema de recompensa, situación que se presentó con el uso de drogas (Kelley
y Berridge., 2002).
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Muchas características moleculares de los sistemas naturales que conllevan a la
recompensa y aquellos sistemas que son afectados por las drogas de abuso son conservados
a traves de las especies, desde la Drosophilae a las ratas y a los humanos e incluyen a la
dopamina, las proteínas G, las protein cinasas, los transportadores a catecolaminas y los
factores de trasncripción, tales como la proteína de unión al elemento de respuesta a AMPc
(CREB) (Kelley y Berridge., 2002).
2.3. Estìmulos naturales de recompensa
Las respuestas de recompensason una clase de estímulos motivacionales que presentan
propiedades hedónica (que generan placer) y que pueden actuar como reforzadores
positivos (Di Chiara y Bassareo., 2007; Young et al., 2005), para generar un
comportamiento de aprendizaje y repetición (Schultz., 2010). Estos estímulos son
esenciales para la sobrevivencia del individuo, tales como la ingesta de alimento y el beber
agua (Wilson et al., 1995; Bassareo and Di Chiara., 1997; Bassareo et al., 2002; Bello et al.,
2002), así como también hacia aquellos que son fundamentalespara la sobrevivencia de la
especie, como la conducta sexual (Fiorino et al., 1997; Fiorino y Phillips, 1999;) y la
conducta materna (Lavi-avnon et al.,2008).
Existe amplia evidencia de todas estas respuestas naturales de recompensa activan al
sistema mesolimbico dopaminérgico, generando un aumento en la cantidad extracelular de
dopamina (Schultz, 2002; Young et al, 2005), la cual se ha propuesto quepromueve el
placer asociado con el reforzante positivo. (Salamone., et al; 2009).Asi por ejemplo, en
estudios de microdialisisse encontró que un estímulo apetitoso de valencia motivacional
positiva y novedosa, como lo es la administración de la sacarosa, el chocolate y los
Fonzies®(fritura hecha a base de harina de maíz, grasa vegetal y queso)incrementan los
niveles de dopaminaen la corteza prefrontal y en el core del núcleo acumbens, pero no en el
shell del núcleo accumbens, a los 20 minutos de ser administrados(Bassareo y Di
Chiara.,1997;Bassareo et al., 2002). De igual forma,otro estudio encontró que las ratas a las
que se les dio acceso a una dieta liquida, con sabor a chocolate,presentaban aumento en las
concentraciones de dopamina en el núcleo acumbens, tanto en animales deprivados de
alimento como aquellos que tuvieron alimento ad libitum (Wilson et al., 1995).
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Por otra parte, estudios con microdialisis han demostrado que la liberación de dopamina
en el núcleo acumbens esta asociado conlos componentes de iniciación, mantenimiento y
consumación de la conducta sexual en las ratas macho.Por ejemplo un estudio se encontro
que con la presentación de la rata hembra al macho y con el inicio de la copulaexisteun
incremento significativo en los niveles de dopamina en el núcleo acumbens; estos valores
disminuyen a sus niveles basales una vez que los animales están saciados sexualmente y
vuelven a incrementarse cuando se presenta una nueva hembra receptiva (Fiorino et al.,
1997).
En estudios relacionados a la conducta materna, se ha demostrado que dicha conducta
contiene cuatro actividades esenciales que dependen de la especie o el hábitat: la
construcción del nido, la conducta durante el parto, la recuperación de las crías y la acción
de amamantarlas (Cofer y Appley., 2007), todas estasestán asociadas a diferentes niveles
de dopamina en el sistema mesolimbicos. Un estudio de microdialisis y preferencia espacial
condicionada, en donde utilizaron un modelo de ratas deprimidas y ratas sanas,demostró
que los niveles de dopamina en al núcleo acumbens aumentaba en las ratas sanas, cuando se
ponían en contacto con sus crías en comparación con las ratas deprimidas. Tambien este
estudio mostró que las ratas deprimidas no presentaban preferencia por el lugar asociados a
sus crías como las ratassanas (Lavi-Avnon., 2008). Por otro lado, se ha observado que la
administración de antagonistas del receptor D2 (haloperidol), interfiere con la motivación
maternal,al disminuir comportamientos que promueven la crianza, tales como: la
recuperación y agrupamiento de las crías en el nido, y el lamer a las crías(Stern y keer.,
1999).
2.4. Estímulos naturales de castigo
Las respuestas de castigo son estímulos motivacionales aversivos, que pueden ser
amenazantes, desagradables y dolorosos, y tienen propiedades reforzantes negativas, que
aumentan y mantienen la conducta aprendida para escapar del estímulo o tratar de evitarlo.
Estas pueden ser las descargas eléctricas, la administración de sustancias con sabores
desagradables, el olor de depredadores, entre otros(Plaza et al, 1996; Becerra et al., 2001).
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Inicialmente en estudios realizados con monos se propuso que las respuestas
motivacionales de castigo NO liberaban dopamina en la vía mesolímbica (Schultz
etal.,1993, 1997; Mirenowiczand y Schultz.,1996),sin embargo estudios posteriores
realizados en ratas y ratones demostraron que diferentes estímulos aversivos, tales como la
administración de sustancias desagradables, olores desagradables, choques eléctrico,
golpes,y pellizcosen la cola y patas de estos animales, producen liberación dopamina en la
vía mesolimbica. Así por ejemplo, en estudios de microdialisis se ha determinado que la
administración intraoral de la quinina, el cloruro de sodio concentrado, y estímulos
olfatorios, como el olor a orina de un depredador, incrementan los niveles de dopamina, a
los 20 minutos después de ser administrado. El aumento de dopamina se observan a nivel
de la corteza prefrontal y el core del núcleo acumbens,pero no así en el shell, cuando se
administra de manera aguda(Bassareo et al., 2002). Tambien se ha encontrado, por estudios
en microdialisis, que una sola exposición de los choques eléctricos de 1mA en la cola de la
ratas aumentan los niveles de dopamina en un 25% en el estriado, 39% en el núcleo
acumbens y 95%en la corteza prefrontal medial en relación a la basal, a los 15 minutos
después de ser administrados (Abercrombie et al., 1989). De la misma forma, la aplicación
de choques eléctricos en ratas que fueron alojadas de manera individual aumento la
liberación de dopamina en el shell del núcleo acumbensen relación con aquellas ratas que
fueron criadas en grupos (Allison y Marsden.,1998). Ademas estudios con electrofisiología
encontraronun aumento de dopamina en las neuronas dopaminergicas en el área tegmental
ventral, después de la aplicación de pellizcos en las patas de las ratas. Este aumento regreso
a su estado basal inmediatamente después de terminar con el estímulo aversivo,
repitiéndose lo mismo después de un segundo pellizco, el cual fue administrado a los 3
minutos (Ungless et al.,2004). En línea con esta observación, se ha encontrado que después
de pellizcar la cola de las ratas se produce una liberación de dopamina que se presenta a los
10 segundos en la corteza prefrontal, 5 minutos en el estriadoy 8 minutos en el núcleo
acumbens (Mantz et al., 1989). En contraste con lo anterior, Cabib y colaboradores (1988)
reportaron que en ratones sometidos a 60 o 120 minutos de restrinción presentaron una
disminución en los niveles de dopamina en el núcleo acumbens, por lo que proponen que la
exposición a estímulos aversivos produce una alteración bifásica de la liberación de
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dopamina en el sistema mesolimbico: es decir se produce un incremento inicial seguido
por una disminución por debajo de los niveles del control (Cabib y Allegra.g, 1996).
2.5. Estímulos motivacionalesno naturales
Como se describió anteriormente, se ha propuestoque los seres humanos descubrieron la
manera de estimular artificialmente el sistema mesolimbico dopaminergicocon el uso
dedrogas adictivas. Las drogas pueden impactar el sistema de recompensa para producir
adicción en tres formas: (1) las drogas de abuso pueden activar el mismo sistema cerebral
como los estimulos motivacionales naturales. De hecho, la teoría de la adicción basada en
la hedonia, por el placer que produce el consumo de drogas (reforzamiento positivo),
supone que las drogas actúan como reforzantes naturales. (2) las drogas también pueden
cambiar la escala cuantitativa de algunos componentes de recompensa, fragmentando y
distorsionando el proceso de recompensa anormal para producir una conducta compulsiva.
(3) las drogas adicitivas pueden inducir nuevos procesos cerebrales, tales como estados
aversivos de abstinencia, el cual puede jugar el papel mas importante para la adicción
(Kelley y Berridge., 2002).
Las diferentes sustancias adictivas no actúan de manera directa sobre los mismos sistemas
de neurotransmisión (ver tabla 2), sin embargo existe amplia evidencia que demuestra que
las drogas de abuso activan el circuito mesolimbico dopaminergico (del placer), el cual está
básicamente modulado por la dopamina. De esta forma, las drogas alteran a la dopamina
bloqueando la función cerebral normal o perturbando sus procesos de almacenamiento,
liberación y eliminación(Di Chiara e Imperato., 1988; Volkow et al., 1999).
Drogas de abuso
Sistemas de
Sitio
Neurotransmisión
Estimulantes (cocaína,
Receptores de dopamina
VTA, Nucleo
anfetaminas, metanfetaminas,
accumbens , corteza
nicotina)
prefrontal
Cannabinoides (mariguana)
Receptores canabinoides
VTA
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Depresivos (barbituricos,
Receptores GABA
VTA
Receptores opiodes
VTA, Nucleo
benzodiacepinas)
Opioides (codeína, morfina,
heroina)
accumbens,
Tabla 2. Drogas de abuso, sistema de nerurotransmisión y área donde actúan (Koob
et al., 1998)
Los estimulantes como la cocaína aumentan la concentración de dopamina extracelular en
las terminaciones de las neuronas del área tegmental ventral hacia el núcleo acumbens
debido a que inhiben la recaptura de la misma, mediante el bloqueo del transportador de
dopamina (DAT) (Koob., 1992; Carboni et al., 2001), también las anfetaminas promueven
la liberación de dopamina en el sistema mesolimbico, mediante la unión con el
transportador de dopamina, el cúal las intoduce hacia el interior de la neurona y una vez
dentro de la célula, las enfetaminas penetran a las vesículas para inducir la liberación de
dopamina hacia el citosol. De esta manera el transportador de dopamina trabaja de forma
inversa capturando anfetaminas y liberando dopamina, la cual a su vez, activa a los
receptores dopaminergicos (Koob et al., 1998;Cruz., 2007).En cuanto a los canabinoides,
estos se unen a los receptores canabinoides-1 (CB1) que se encuentran en el botón de la
neurona GABAérgicas que inhiben la liberación de dopamina del área tegmental ventral
hacia el núcleo acumbens, y la hiperpolariza, evitando así que se descarge el
neurotrasnmisor (GABA) y permitiendo que la dopamina continue liberandose. De esta
manera el efecto de los canabinoides es neuromodulador por que modifica la acción de
otros neurotransmisores (Di Chiara y Imperato., 1988; Tanda et al., 1997).Asimismolos
depresores del sistema nervioso centralal interactuar con los receptores GABAAdesactivan
a la neurora GABAérgica que se encuentran inhibiendo a la neurona dopaminergica del
área tegmental ventral, por lo que se aumenta la concentración de dopamina en el núcleo
acumbens (Diana et al., 1993). En relación a los opiodes se sabe que, activan a los
receptores opiodesµ que se encuentran en el area tegmental ventral, desde aquí deshiniben a
las células dopaminergicas e incrementan indirectamente los niveles extracelulares de la
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dopamina en el núcleo acumbens (Di Chiara y Imperato., 1988; Di Chiara y North.,
1992; Tanda et al., 1997).
De tal manera que al estar en el interior del cuerpo humano, las sustancias adictivas
producen los mismos efectos placenteros que los estímulos biológicamente necesarios para
su sobrevivencia (comida y agua) pero de manera más aguda, lo que dificulta la rápida y
oportuna diferenciación por parte del cerebro. Mientras más expuesto se esté a la droga
mayores son las asociaciones entre esta y las fuentes de respuestas conductuales y
neuroquímicas(Kelley y Berridge., 2002).
3.0. Modulación del sistema dopaminérgico ante estímulos motivacionales
3.1. Proceso de habituación (liberación de dopamina)
De manera interesante algunos estudios en los que se ha evaluado el efecto de una sola
preexposición de los estímulos motivacionalde es sobre la liberación de dopamina se ha
encontrado un fenómeno al que se le ha denominado habituación. De manera experimental
la habituación se observa como una disminución en la liberación de dopamina en respuesta
a un estímulomotivacionales después de unapre-exposicion a éste (Thompson y Spencer.,
1979; Di Chiara y Bassareo., 2007). Así por ejemplo, un estudios con microdialisisen ratas
demostró que una sola preexposición de alimento novedosos como el chocolate y los
fonzies, disminuyen los niveles de dopamina en el shell del núcleo acumbens pero no en el
core y la corteza prefrontal (Bassareo et al., 2002).En el mismo sentido, se encontró que la
exposición continua de choques eléctricos presentó una disminución en la liberación de
dopamina, es decir un proceso de habituación (Chrapusta et al., 1997). De igual forma, la
administración se sustancias con sabor aversivo, como la quinina, suele presentar
habituación en el shell del núcleo acumbens pero no en el core y la corteza prefrontal
después de una simple exposición al mismo sabor (Bassareo and Di Chiara., 1997;
Bassareo et al 2002). En contraste a lo anterior, se ha demostrado que la administración
repetida de drogas de abuso como los psicoestimulantes (cocaína y amfetaminas)no
presentahabituación en el shell del núcleo acumbens.Asimismo, se ha propuesto que la falta
de atenuación en la liberación de dopamina permite fortalecer el valor del reforzamiento de
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las drogas y mantener un aprendizaje anormal (Di Chiara and Imperato.,1998), y que
como consecuencia conllevana un proceso adictivo.
Hipótesis las adicciones
Existen tres hipótesis de las adicciones que muestran que la dopamina y los receptores
dopaminergicos tiene una participación crucial en el proceso adictivo, demostrado así que
dichas sustancias adictivas, también generan altos niveles extracelulares de dopamina, los
cuales activan al sistema mesolimbico, al igual que las respuestas de recompensa, aunque
algunas drogas,como ya se analizo antes, actúan de manera indirecta actuando por
diferentes sistemas de neurotransmisión.
Hipótesis del agotamiento de la dopamina en la adicción o “Modelo de ahnedonia
general”
Esta hipótesis sugiere que la activación mesolimbica se debe a la acción de la dopamina, la
cual es responsable del placer asociado con las respuestas de recompensa. De esta forma,
esta teoría propone que el uso continuo de las drogas (que es el comportamiento adictivo)
es una consecuencia de la necesidad continua de producir una alta concentración de
dopaminaen las vías mesolimbicas y regiones cerebrales relacionadascon el resultante
placer asociado. Esta hipótesis sugiereque la administración de drogas de abuso produce
una serie de cambios neuroadaptativos en respuesta a la alta estimulación del sistema
mesolímbico. Así, el uso compulsivo de psicoestimulantes puede resultar en un estado de
déficit de DAen el núcleo acumbens, resultante en un choque de anhedonia (disminución
del placer), que es un síntoma de depresión mayor (Shirayama y Chaki., 2006) y una
demanda biológica (es decir, el deseo) de más droga para reponer el agotamiento de los
depósitos de la DA (
).
Además de los cambios en las concentraciones de dopamina, existen evidencias que
muestran que ante el consumo continuo de algunas drogas existen también un incremento
en los niveles de los receptores DAT estriales (por ejemplo, en respuesta a la ocupación de
estos por por la cocaína), además de una disminución de los receptores D2 dopaminergicos
(en respuesta a las elevadas concentraciones de dopamina en el sitio postsinaptico). Se
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propone que la atenuación de los niveles de los receptores D2 estriales disminuye el
reforzamiento saliente (importante) de las recompensas naturales y a su vez aumenta la
necesidad del flujo dopaminergico en relación con el uso de sustancias psicoactivas.
Hipótesis de sensibilización
La hipótesis de la sensibilización parte de un punto de vista diferente de la relevancia de la
dopamina a los procesos adictivos. Esta hipótesis predice que la administración repetida de
las drogas “sensibiliza” al sistema de DA a las drogas y. Este fenómeno se basaba en las
observaciones de que la aplicación intermitentey periódica de un estímulo eléctrico en
regiones límbicas del cerebro inducen una excitabilidad neuronal progresiva,que se observa
como un aumento en la sensibilidad en la aplicación posterior del estímulo original. La
sensibilidad inducida por la cocaína, fue observada primero por Grode en 1912, estos
hallazgos fueron seguidos por otros estudios pre-clínicos que muestran un desarrollo
progresivo en la probabilidad de convulsiones generalizadas después de la administración
diaria de cocaína y la sensibilidad aumentada de los receptores dopaminérgicos ante la
administración de psicoestimulantes. La sensibilización limbica inducida por la cocaína fue
sugerida como una relación de la causalidad entre el consumo crónico de cocaína y las
crisis convulsivas inducidos por cocaína, los ataques de pánico, la psicosis y el deseo.
Hipotesis motivacional del aprendizaje
Esta hipótesis sugiere que la adicción de drogas de abusoes el resultado de un aprendizaje
anormal de motivación, que se deriva en un aumento de las propiedades apetitivas de las
drogas. Esto se propone que esta relacionado con la falta de habituación para que la
dopamina se libere en el shell del núcleo acumbens ante administraciones repetidas del
estímulo, lo que se traduce como un fortalecimiento anormal de tal estimulo y por lo tanto
de la recompensa (aprendizaje de incentivos) y las asociaciones estimulo-respuesta (habito
de aprendizaje), lo que se propone constituyen la base para el uso de drogas y el consumo
compulsivo (Di Chiara and Imperato., 1998).
3.2. Regulación de los receptores D2-like
3.2.1. Estímulos motivacionales no naturales
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Existe amplia evidencia que demuestra la importancia de la regulación de los receptores
D2 en el consumo de las drogas de abuso, sin embargo hasta la fecha existe escasa
información sobre la participación de este receptor en la exposición repetida de los
estimulos motivacionales naturales.
Enestudios de tomografías de emisión de positrones se ha encontrado que existe una
regulación a la baja de los receptores dopaminérgicos en el estriado de aquellos
pacientesadictos a los psicoestimulantes, como la anfetamina (Volkow et al., 2001) y la
cocaína (Volkow et al., 1990, 1999; Martinez et al.,2004), los opiáceos como la morfina
(Wang et al., 1997) y el alcohol (Heinz et al., 2004) en comparación con individuos sanos.
Algunos autores han propuesto que la disminución de la expresión de los receptores D2 en
pacientes adictos podría preceder a la adicción y estar presente antes del primer contacto
con la droga.Por ejemplo, un estudio demostró que en sujetos sanos la disminución de los
receptores D2 fue predictiva de una experiencia placentera después de la administracióndel
metilfenidato, una droga estimulante, en comparación con aquellos individuos que lo
detectaron como no placentero (Volkow et al., 1999; 2002).En pacientes dependientes, la
disminución de la densidad de D2 persiste después de varios meses de abstinencia, esta
reducción de los receptores D2 esta asociada con la disminuciónde la glucosa utilizada en la
corteza orbitofrontal y con la disforia(Volkow et al.,1990; 1993). Por lo que esta claro, que
la disponibilidad del receptor D2 esta relacionado a los efectos subyacentes negativos
durante la abstinencia. En línea con esta teoría, en estudios con primates no humanosse ha
descrito una asociación entre la reducción delos niveles del receptor D2 y la predisposición
al consumo de cocaína. Así por ejemplo, los monos subordinados que presentabanmenor
proporción de los receptores D2 con respecto a los monos dominantes, se
autoadministraron mayor dosis de cocaína que aquellos monos dominantes. Con esto se
demuetra que los monos subordinados son mas sensibles a los reforzantes de la cocaína y
menos sencibles a los efectos adversos de la cocaína que los monos dominantes (Morgan et
al., 2002).
Un estudio con ratas que fueron entrenadas para autoadministrarse alcohol, se les inyectó
estereotaxicamente dentro del núcleo acumbens un adenovirus que introdujo un gen del
receptor D2 de dopamina, este adenovirus incrementó los receptores de D2 en el cerebro de
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ratas y al mismo tiempo redujo de manera importante la ingesta del alcohol(Thanos et
al., 2001).
También, los estudios genéticos han encontrado un polimorfismo en el alelo Taq1A del gen
DRD2ANKK1, el cual se traduce en la disminución de la expresión de los receptores D2
(Noble et al., 2000). Este polimorfismo se ha asociado con la adiccion a sustancias, así
como la adicción a juegos patológicos (Cohen et al., 2005) y la obesidad (Comings D. et
al., 1996; Johnson y Kenny., 2010).Con estos hallazgos se ha propuesto que la disminución
en la expresión de los receptores D2 predispone a las personas a tener un alto riego de
comportamiento impulsivo y compulsivo y abuso de drogas, como un intento de compensar
la anhedonia (ausencia del placer).Por lo que la búsqueda de sustancias como el alcohol,
opioides, estimulantes, nicotina y glucosa, ante la disfunción de los receptores D2, podría
representar la base de lo que se ha denominado “síndrome de déficit de recompensa”
(Coming y Blum., 2002; Blum et al., 2000).
3.2.2. Estímulos motivacionales naturales
Los cambios en los niveles de los receptores D2-like se han estudiado principalmente en la
ingesta de alimento y tales cambios se han asociado con el proceso de obesidad. Así por
ejemplo, estudios de tomografía de emisión de positrones (PET)mostraron que los
individuos obesos presentan menores niveles de los receptores D2 en comparación de los
individuos normales. Esta disminución de los receptores D2 se propone que está
correlacionada negativamente con el índice de masa corporal, de tal manera que la
deficiencia de la dopamina en individuos obesos conlleva a comer compulsivamente como
una forma de compensar la activación disminuida de este circuito (Wang et al., 2001). En
línea con estos hallazgos, estudios de tomografía en humanos, han proporcionado pruebas
de la participación de la dopamina en el estriado dorsal (donde se localiza el núcleo
acumbens) en ralción a la motivación de la ingesta del alimento(Volkow et al., 2002). Por
otro lado, estudios de autoradiografía ha demostrado que existe un aumento en la densidad
del receptor D2 en el estriado de ratas que tuvieron acceso restringido al alimento durante 7
días, en tanto que en los grupos de ratas que consumienro sacarosa 0.3M, presentaron una
reducción en la densidad del receptor D2 en el shell del núcleo acumbens y en el estriado
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dorsolateral (Bello et al., 2002). Johnson y Kenny (2010) evaluaron los niveles de
receptores D2 y su relación con el consumo compulsivo de alimento. En este trabajo, a un
grupo de ratas se les dio acceso (durante una hora) a la comida rica en energía, estilo
cafetería (salchicha, tocino y pastel), encontrando que estássubieron de peso el doble de la
que solo consumían comida del laboratorio. Estos resultados fueron correlacionadoscon
inmunoblot para determinar los niveles del receptor D2, encontrándose que las ratas con
sobre peso presentaban bajos niveles del receptor D2. Ademas empleando la técnica
knockdown, para desctivar al receptor D2, se encontró que estos animales presentaban una
búsqueda compulsiva del alimento altamente apetecible y rico en grasa.
Con todo esto Wang y colaboradores (2001) proponen que el déficit en el procesamiento de
la recompensa puede ser un factor de riesgo importante para el desarrollo de la obesidad, de
tal manera que aquellos individuos obesos consumen alimentos apetecibles de manera
compulsiva para compensar la hiposensibilidad de la recompensa.En particular no está
claro si el déficit en el procesamiento de la recompensa es genéticamente constitutivo y
preceden a la obesidad, o si el consumo excesivo de los alimentos sabrosos puede manejar
la disfunción de la recompensa y contribuir así a la obesidad inducida por la dieta (Johnson
y Kenny., 2010).
Contrario al déficit progresivo en las respuestas de recompensa, que algunos autores han
reportado como una regulación a la baja de los receptores D2 de la dopamina tanto en
humanos como en ratas obesas,en personas con anorexia nerviosa se ha observado una
elevada densidad del receptor D2 y D3 en el estriado (Frank et al., 2005).Estas evidencias
han llevado a proponer que el consumo excesivo de los alimentos sabrosos desencadena
respuestas neuroadaptativas iguales a las que ocurren en la adicción, lo que conduce al
desarrollo de una conducta de alimentación compulsiva (Johnson y Kenny., 2010).
Cabe resaltar quetodo lo que hoy en día se sabe de las adiciones es gracias a todos los
estudios de las respuestas motivacionales naturales. Por lo tanto una mayor comprensión de
la participación de la dopamina en las recompensas naturales aclara los mecanismos de la
adicción de las drogas (Kelley y Berridge., 2002).
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I.
Justificación
Se ha reportado que la adicción a drogas representa un problema de salud pública que de
acuerdo a la última encuesta nacional de adicciones representa el 36.1 % de la población
nacional. A pesar de la prevalencia con la que se presenta este problema aún no se tiene
claro cualesson los mecanismos que acompañan el desencadenamiento y desarrollo del
proceso adictivo.
Diversas investigaciones han encontrado que las drogas de abuso, de todos los tipos,
producen la activación del sistema mesolímbico dopaminérgico, al igual que lo hacen los
estímulos motivacionales naturales. Algunos estudios han encontrado, que a diferencia de
los estímulos motivacionales naturales, la exposición repetida con drogas de abuso no
presenta el fenómeno de habituación en la liberación de dopamina.Por otro lado, se ha
descrito que lasdrogas de abuso disminuyen la expresión de receptores dopaminérgicos de
tipo D2-like, sin embargo se sabe muy poco lo que sucede con estos receptores tras la
administración repetida de estímulos motivacionales naturales. Con estos antecedentes
resulta interesante conocer si los estímulos motivacionales naturales presentan similitudes o
diferencias con los estímulos motivacionales no naturales, tanto en los niveles de dopamina
como en la expresión de los receptores dopaminérgicos D2. De esta manera el entender las
diferencias que existen entre ambos estímulos motivacionales contribuira a ampliar nuestro
conocimiento sobre la fisiopatología del proceso adicitivo.
II.
Hipótesis
1. La administración repetida de los estímulos motivacionales naturales, tanto de
recompensa como de castigo, producirá habituación en la liberación de dopamina en
el núcleo acumbens, pero no en corteza prefrontal, caudado-putamen e hipocampo.
2. La exposicón repetida a los estímulos motivacionales naturales de recompensa al
igual que los estímulos de castigo producirá una disminución en la expresión de
receptores dopaminergicos del subtipo D2 en todas las áreas cerebrales analizadas.
III.
Objetivo general
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Evaluar los niveles de dopamina y la expresión de los receptores dopaminergicos D2like ante estímulos motivacionales de recompensa (ingesta de sacarosa) y de castigo
(ingesta de quinina y choques eléctricos) en ratas.
IV.
Objetivos particulares
1. Evaluar la liberación de dopamina en hipocampo, caudado, corteza prefrontal y núcleo
accumbens después de la
administración repetida de estímulos motivacionales de
recompensa y de castigo.
2. Analizar los cambios en la expresión del RNAm de los receptores dopaminergicos del
subtipo D2 después de la administración repetida de estímulos motivacionales de
recompensa y castigo.
3. Determinar los cambios en los niveles de los receptores dopaminergicos del subtipo D2,
después de la administración repetida de estímulos motivacionales de recompensa y
castigo.
4. Analizar cambios en el efecto hedónico producidos por un estímulo motivacionales de
recompensa y de castigo.
V.
1.
1.1.
Material y métodos
Protocolo experimental
Animales
Se utilizaron ratas Wistar hembra ovariectomizadas, de 200-220g de peso, las cuales fueron
alojadas en grupos de 5 animales por caja, con libre acceso a agua y alimento, y
mantenidasen ciclo invertido de luz y obscuridad (de 10 am a 22 pm horas).
1.2.
Ovariectomía (OVX)
Las ratas fueron anestesiadas con Tribromoetanol 0.2% (10mg/kg), vía intraperitoneal. La
cirugía consistió en realizar una incisión longitudinal a nivel abdominal. Una vez realizada
la incisión, se localizaron los oviductos y los ovarios, a continuación se ligan los oviductos,
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se extirpan los ovarios y se suturó el músculo y la piel del animal. Posterior a la cirugía
los animales se colocaron en una caja limpia para su recuperación, y se alojaron en el
bioterio de estancia durante dos semanas (15 días) antes de iniciar el experimento
correspondiente.
1.3. Sesiones de Ambientación
Para evitar que el estrés pudiera influir en nuestras pruebas, los animales fueron
manipulados durante 10minutos, una vez al día durante 2días, una vez concluida la
habituación los animales fueron asignados aleatoriamente a los grupos experimentales que
se señalan a continuación.
2. Aplicación del estímulo motivacional de recompensa
A un grupo de ratas ovariectomizadas, se les administró 1ml de sacarosa por vía intraoral a
diferentes concentraciones, de 0.3mM (n = 9) y 1mM (n = 9), una vez al día durante 5 días.
Los grupos control correspondieron a animales a los que se les administró 1 ml agua y aire
(que solo consitio en colocarle la jeringa en el hosico al animal), una vez al día durante 5
días (n = 9).
3. Aplicación del estímulo motivacional de castigo
Se emplearon dos grupos experimentales, a uno se le administró 1ml de quinina por vía
intraoral, a diferentes concentraciones, de 0.3mM (n = 9) y 1mM (n = 9), una vez al día
durante 5 días; mientras que otro grupo de ratas fueron tratados con un total de36choques
eléctricos, de 0.1mA y 0.3mA. Los choques eléctricos duraron 1s y se aplicaroncada 10s
durante un minuto, este proceso fue repetido cada 5 minutos durante 30minutos, una vez al
día durante 5 días (Ver figura5). Para estos estímulos motivacionales los grupos controles
correspondieron a animales a los cuales se les administró agua (control para quinina), y que
fue el mismo grupo control que para el tratamiento con sacarosa, otro al que se le
administro aire, y otro grupo al cual se les introdujo en la cámara de choques durante 30
minutos, sin que recibieran el estímulo de los choques (control para el grupo de choques
eléctricos).
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Figura 5. Esquema de la aplicación de choques eléctrico de 0.1mA y 0.3mA
4. Extracción del cerebro
Veinte minutos después de haber administrado la última sesión del estímulo, las ratas se
decapitaron, se les extrajo el cerebro y se disectaron las áreas cerebrales a estudiar
(hipocampo, el núcleo accumbens, caudado-putamen y la corteza prefrontal).Estas áreas se
colocaron en tubos ependorff y se almacenaron a -80°C hasta que estas fueran utilizadas.
EXPERIMENTO 1
Determinación en la liberación de dopamina por cromatografía liquida de alta
resolución (HPLC)
1. Preparación de la muestra
Las muestras de tejido obtenidas a partir del hipocampo, la corteza prefrontal, el núcleo
accumbens y el caudado-putamen,se colocaron en hielo, e inmediatamente después se les
añadió 300-500μl de ácido perclórico 0.4N(la cantidad de ácido perclórico dependió del
peso de la muestra(por cada 10mg de tejido se le administraron ml de ácidoperclórico)y
0.1% (p/v) de metabisulfito de sodio. El tejido se homogenizo y se centrifugo a 8,000 rpm
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por 15 min, a una temperatura de 4°C. Posteriormente, la muestra se filtro y se obtuvo
el sobrenadante el cual fue almacenado a -70°C hasta su uso para el análisis
cromatográfico.
2. HPLC
Se construyó una curva de calibración a distintas concentraciones de dopamina (40, 80, 160
y 320 μg/ml) Dopamina (Sigma, USA). Una vez preparadas, tanto las soluciones para la
curva de calibración como las muestras se inyectaronen el equipo HPLC-1020 (PerkinElmer LC-4C). El cromatógrafo está equipado con un detector electroquímico BASCC-5 y
una columna Alltech (100 X 4.6mm) de acero inoxidable de gel de sílice de 3μm de tamaño
de partícula. Las condiciones cromatogràficas consistieron en el empleo de un volumen de
inyección de 25μl y una fase móvil que consistió de una solución amortiguadora de fosfatos
(0.1M a pH 3.1) que contiene 0.9mM de octil sulfato de sodio, 0.1mM de EDTA y
15%(v/v) de metanol. Las muestras se corrieron a un flujo de 1.0ml/min y el tiempo de
corrida fue de 30minutos.Los picos fueron integrados con un equipo Navegador
Turbochrom 4.1 de Perkin-Elmer. La concentración de dopamina fue obtenida por la
interpolación de su respectiva curva estándar. Todas las muestras fueron analizadas por
duplicado.
EXPERIMENTO 2
Análisis de los cambios en la expresión del RNAm de los receptores dopaminérgicos
del subtipo D2-like por PCR-TR
1. Extracción de RNAm total.
La muestra de tejido se homogenizaron (con ayuda de un homogenizador tissue tearor;
biospec products, INC. U.S.A) en 500μl de trizol, la homogenización se llevo acavo a una
velocidad de entre 15,000 y 20,0000 rpm durante 4 minutos y se centrifugo a 11,000rpm
por 10minutos a una temperatura de 4°C. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se
dejo almacenar a temperatura ambiente por 5 minutos, posteriormente se le adiciono 100μl
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de cloroformo, y se agito vigorosamente por 15 segundos. La muestra se dejo a
temperatura ambiente por 10minutos, posteriormente la muestra se centrifugo a 11,000rpm
durante 15minutos a una temperatura de 4°C. En este paso se obtuvo la fase acuosa
transparente que contenía el RNA, la cual se transfirió a un tubo nuevo para adicionarle
250μl de isopropanol y dejar almacenar a temperatura ambiente durante 10minutos para
después centrifugar a 11,000rpm, durante 10minutos a una temperatura de 4°C. Se retiró
el isopropanol y el pellet, que contenía el RNA, se lavócon 500μl de etanol al 75%. La
mezcla se centrifugó a 8,000rpm por 5 minutos a una temperatura de 4°C. Por último se
dejo secar el pellet en una bomba de vacio por 10 minutos y se le adiciona un volumen
adecuado de agua DEPC de acuerdo a la cantidad del pellet.
2. Integridad del RNAm en gel de agarosa al 1%
El tubo que contenía el pellet de RNA se colocó en un baño de agua a una temperatura de
55-60°C por 5 minutos, posteriormente se tomaron 3μl de la muestra de RNA y 2μl de
colorante de RNA, los cuales se vertieron en un tubo nuevo, el resto de la muestra se incuba
a -80°C. Los 5μl de la mezcla se depositaron en un pozo de gel de agarosa al 1%, el cual se
encuentra en una cámara de electroforesis con buffer de RNA, dicha mezcla se dejo correr
por 20 minutos a 60 Volts.
3. Cuantificación del RNAm
Después el gel de agarosa al 1% se transfiere a una placa de fluorescencia para cuantificar
el RNAm mediante un software llamado “Launch Doclt”.
4. Síntesis de cDNA (RT-PCR)
En un tubo ependorff de 500μl se colocaron 10.5 μl de agua miliQ, 5μl de dNTPs [10mM],
1μl de primer random y 4μl de RNAm obtenidos de la muestra.Hecha la mezcla se agito
vigorosamente con ayuda del vortex y posteriormente se incubo a 65°C por 2 minutos.
Inmediatamente después la mezcla se coloco en hielo por aproximadamente un minuto y se
le adiciono 2.5μl de buffer para PCR 10X, 2.5μl de buffer DTT [100mM], 1μl de la enzima
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transcriptasa inversa (Epicentce) y se realizó una agitación vigoroza. Finalmente se
colocó el tubo con la muestra en un termociclador (eppendorf) en donde se llevaron a cabo
cinco ciclos consecutivos: el primer ciclo fue a una temperatura de 25°C por 10 minutos, el
segundo fue de 42°C por 60 minutos, el tercero fue de 85°C por 5 minutos, el cuarto y
quinto fueron de 4°C por 9 y 6 minutos respectivamente.
PCR-Tiempo real
En una campana para PCR y en condiciones estériles se preparó la mezcla siguiente: en un
tubo ependorff de 500μl se colocaron 5.9μl de agua miliQ, 2μl de TaqMan Master, 0.5μl
del oligo Forward, 0.5μl del oligo Reverse y 0.1μl de la sonda específica para los receptores
dopaminérgicos del subtipo D2. Después se tomaron 9μl de dicha mezcla y se colocaron en
un capilar, para posteriormente adicionarle 1μl del cDNA obtenido en el paso descrito
anteriormente y se agito vigorosamente. El capilar se colocó en un termociclador apto para
PCR-TR durante 50 minutos para cuantificar mediante la computadora la fluorescencia
producida en cada ciclo con la cantidad de DNA multiplicada.
EXPERIMENTO 3
Determinación de los cambios en los niveles de receptores dopaminergicos del subtipo
D2 mediante inmuno blot.
1. Preparaciónde la muestra
Los tubos ependorff con las muestras de tejido se colocaron en hielo y a estos se les agregó
1ml de solución RIPA (0.1M, pH7.4) y 10μl de cada uno de los inhibidores de proteasas
(IAA
[0.001M],
TLCK
[0.09M]
y
PMSF
[1,74mg/ml
de
DMSO]
SIGMA
CHEMICAL),posteriormente se homogenizo el tejido empleando un homogenizador
manual de vidrio y se centrifugo a 10,000rpm por 15 minutos a una temperatura de 4°C,
después se obtuvo el sobrenadante y se formaron alícuotas de 200
μl en tubos nuevos
de
1ml,desechando el material precipitado. Las muestras se almacenaron a -80°C hasta su
uso.Una alícuota fue utilizada para la determinación de la proteína, con esta muestra se
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realizo una dilución de 1:100, colocando en un tubo nuevo 5μl de la muestra y 495μl de
agua miliQ para formar una solución con un volumen total de 500μl.
2. Determinación de la concentración de proteínas
La concentración de proteína se determino por el método de Lowry (Lowry et al., 1951),
empleando las muestras por duplicado. Para la curva de calibración se agregaron los
volúmenes indicados en la tabla 1, para cada uno de los tubos:
1
2
Proteína
(μg)
0
5
Albúmina
(0.5μg/μl)(μl)
0
10
Agua miliQ
(μl)
200
190
Volumen
total (μl)
200
200
3
10
20
180
200
4
15
30
170
200
5
20
40
160
200
6
25
50
150
200
7
30
60
140
200
8
35
70
130
200
9
40
80
120
200
10
45
90
110
200
11
50
100
100
200
muestra
?
200μl de
muestra
0
200
Tubo
Tabla 3. Curva estándar patrón de 0.5μg de proteínas con ASB
(albúmina sérica bovina)
Posteriormente a cada tubo se le adiciono 1ml de solución C (preparada con Carbonato de
sodio 2.00%, Hidróxido de sodio 0.40% y Tartrato de sodio y potasio 0.02%), recién
preparada y se agito vigorosamente para después dejar a temperatura ambiente por 10
minutos. Hecho esto se les añadió a cada tubo 100μl de solución D (reactivo de Foulin 1N),
recién preparada, se agitó y se dejo incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Después de este tiempo las muestras se leyeron en un espectrofotómetro a 750nm (luz
visible). Finalmente se construyó la curva estándar y por extrapolación se estimó la
concentración de proteína de las muestras, empleando regresión lineal.
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3. Electroforesis
Se tomaron alícuotas de 200 μl de las muestras y se mezclaron con 22μl de buffer de carga
el cual fue previamente preparado con β-mercapto etanol. Posteriormente se hirvieron
durante 10 minutos para desnaturalizar las proteínas y se colocaron inmediatamente en
hielo.
En diferentes pozos de un gel de poliacramida al 10% (gel de corrida) y al 6% (gel
concentrador)(ver tabla 2) se cargó la muestra, considerando una cantidad de proteína entre
10-20μl. De igual forma en un carril independiente se cargaron 3μl de marcador de peso
molecular. Las muestras se dejaron correr por electroforesis durante 2ha 88V, con lo cual se
separaron las proteínas en función de su peso molecular a favor de un gradiente eléctrico.
4. Transferencia
Una vez terminada la electroforesis, las proteínas separadas presentes en el gel se
transfirieron a membranas de PVDF, empleando un sistema semiseco Trans-blot SD
Electrophoretic Transfer Cell de Bio-Rad durante 50 minutos a 18V. Para este paso la
membrana de PVDF se humedeció previamente en metanol absoluto por 5 minutos y
después se sumergió en un buffer de transferencia junto con los papeles filtro. La
membrana de PVDF, el gel y los papeles filtros se colocaron de la manera que a
continuación se ilustra en la unidad de transferencia, procurando eliminar el exceso de
buffer (ver figura 5).
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Pape
l
G
filtro
el
Figura 5. Componentes del sándwich de transferencia
Me
mbr
Pape
ana
l
filtro
5. Bloqueo e incubación de los anticuerpos
Una vez realizada la transferencia, las membranas fueron bloqueadas con TBST-leche al
5%, durante 2 horas a temperatura ambiente, en agitación constante. Con esto se consigue
bloquear con caseína el resto de la membrana donde no hay proteína transferida. A
continuación las membranas se incubaron con el anticuerpo policlonal de conejo contra los
receptores dopaminergicos D2 (Santa Cruz, Biotechnology) cuyo peso molecular es de 50
KDa o con β-actina (Santa Cruz, Biotechnology; control de carga) con un peso molecular
de 43 KDa; diluidos 1:200 y 1:1000 respectivamente, en TBST-leche 5% a 4°C durante
toda la noche en agitación constante.
Al siguiente día las membranas se lavaron con TBST por 10 minutos y se incubaron con el
anticuerpo secundario anti-cabra (Santa Cruz Biotechnology) diluido 1:1000 en TBSTleche 5% durante 2 horas a temperatura ambiente en agitación constante y se lavaron 3
veces con TBST durante 10 minutos.
6. Detección
Página 47
EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
La membrana se colocó sobre un vidrio, en el cual se vertieron 1200µl del sustrato
quimiluminiscentes (Western Blotting Luminol Reagent; Santa Cruz Biotechnology, CA.
U.S.A.), posteriormente la membrana se expuso a una película (Hiperfylm Amersham
Biosciences) dentro de un cassette (Spectroline). El tiempo de exposición fue de 30
minutos. A continuación se revelaron y fijaron con la solución reveladora (Kodak
ProfessionalDektol, Rochester, NY. U.S.A) y fijadora (Kodak Professional Rapad Fixer,
Rochester, NY U.S.A) para finalmente hacer un lavado de agua y ponerlas a secar.
Por ultimo se escanearon las películas y se guardaron las imagenes en una computadora,
para medir la intensidad de las bandas empleando un software de análisis densitometrico
llamado Quantity One 1-D (Bio-Rad Hércules, CA, E.U.A). La cantidad relativa de cada
proteína del receptor D2 se determino mediante el cociente de proteína /β-actina (proteína
control).
EXPERIMENTO 4
Análisis de los cambios en el efecto hedónico
1. PREFERENCIA POR LA SACAROSA
Para evaluar este efecto se empleoel modelo de preferencia por la sacarosa. Este
experimento se realizaró en una cámara, la cual está dividida en dos compartimentos
diferentes, de manera que se distinguen visible y táctilmente, los cuales están separados por
una compuerta. La preferencia por la sacarosa se realizo en cuatro fases: habituación, precondicionamiento, condicionamiento y prueba. La habituación duro una sesión y consistio
en manipular y alojar a los animales, durante 60 minutos, en el cuarto donde se realizo la
prueba. El pre-condicionamiento se realizo en un día y consistio en colocar a la rata en uno
de los compartimentos, elegido al azar, con la compuerta abierta, permitiendo que la rata
explorara libremente por ambos compartimentos, durante 30 minutos. En este paso se
registrò el tiempo en cada compartimento. El condicionamiento se llevo a cabo en 4 días,
con sesiones por la mañana y por la tarde, estas sesiones se separaron por 6horas. Durante
estas sesiones los compartimentos permanecieroncerradospor una compuerta y la rata sólo
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
estuvoen uno de ellos por 30 minutos. En la sesiones de la mañana se les coloco un
bebedero con sacarosa al 15% y se metieron a las ratas en el compartimento derecho,
permitiendo que los animales lo bebieran libremente, y por la tarde se les administro agua
en el compartimento izquierdo realizando la misma operación. Este procedimiento se
balancea con todos los animales, de forma que la mitad de los animales reciban la sacarosa
por la mañana y la otra mitad por la tarde. En todos los casos, el volumen consumido tanto
de sacarosa como agua se determinó al final de la sesión. La sesión de prueba se realizóel
día 6 y fuesimilar al pre-condicionamiento. En este caso, la rata se coloco en uno de los
compartimentos, elegido al azar, con la compuerta abierta, permitiendo que la rata
explorara libremente ambos compartimentos, durante 30 minutos y se registró el tiempo en
que
la
rata
HABITU
ACIÓN
60
mi
n
permanecióen
cada
PRECONDICIONAMI
ENTO
Dí
a
1
30
mi
n
6).
uno
de
los
compartimentos
CONDICION
AMIENTO Saca
rosa
H
6
2
hr
O
s
30
30
min Día mi
mañ
n
2-5
Se repitió
ana
por 4 días tar
de
(Ver
figura
PRU
EBA
30
Dí
mi
na
6
Figura 6. Preferencia por la sacarosa. Esquema que muestra las cuatro fases; habituación,
pre-condicionamiento, condicionamiento y prueba (Weitermier y Murphy., 2009; Rawas .
et al., 2009) .
VI.
RESULTADOS
EXPERIMENTO 1
Determinación en la liberación de dopamina por HPLC
Sacarosa
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
En los siguientes resultados presentados en las figura 7-14, se comparo la concentración
de DA en cada una de las áreas del cerebro, como el hipocampo (HIP) (figura 7), la corteza
prefrontal (CXP) (figura 8), el caudado (CAU) (figura 9), y el núcleo acumbens (NAc)
(figura 10) de los diferentes grupos de tratamiento. Los datos mostraron que en todos
losestímulos, la concentración de dopamina fue mayor en el núcleo accumbens y el
caudado, mientras que hubo menor concentración en el hipocampo y la corteza prefrontal.
Por otra parte en la figura 7, la administración repetida de sacarosa a diferentes
concentraciones (0.3 y 1mM), mostró una tendencia a disminuir los niveles de dopamina,
sin alcanzar significancia estadística, en hipocampo, comparada con el control de agua
(figura 7A), mientras que en el control de aire (figura 7B) hubo una tendencia a aumentar
la concentración de dopamina con la administración de sacarosa 0.3mM, sin embargo no se
observo cambios estadísticamente significativos con sacarosa de 1mM.
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
B
HIPOCAMPO
HIPOCAMPO
A
400
400
de DA/g
tejido
de de
tejido
µgDA/g
µg de
n=9
n=9
300
300
200
200
Figura 7. Efecto de la administración repetida (4 días) de sacarosa a diferentes concentraciones sobre los
niveles de dopamina en hipocampo. La gráfica A muestra los cambios en la concentración de dopamina
que se observaron al tener como control al grupo de animales tratados con agua. La gráfica B muestra las
diferencias en las concentraciones de dopamina al comparar los diferentes tratamientos de sacarosa con un
grupo control de aire. Las barras representan el promedio de nueve animales ± SEM.
100
100
0
AIRE
0.3
1
Sacarosa (mM)
0
H2O
0.3
1
Sacarosa (mM)
Página 51
EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
En la corteza prefrontal (figura 8)hubo una tendencia a disminuir la concentración de
dopamina con la sacarosa 0.3mM y una tendencia a aumentar la liberación de dopamina
con la concentración de sacarosa 1mM, no siendo está estadísticamente significativa,
comparada con el control de agua (figura 8A). Con respecto al control de aire (figura 8B) se
presentro una tendencia a aumentarla liberación de dopamina con la concentración de
sacarosa 0.3 mM y un hubo un aumento en la liberación de dopamina estadisitcamente
significativa con la concentración de sacarosa 1mM.
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
CORTEZA PREFRONTAL
n=9
600
400
200
0
H2O
0.3
1
Sacarosa (mM)
CORTEZA PREFRONTAL
B
*
800
e tejido
µg de DA/g de tejido
800
600
Página 53
EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
La figura 9 muestra que en el caudado no hubo un cambio estadísticamente significativo en
la libración de dopamina comparada con el control de agua (figura 9A), mientras que
comparada con el control de aire (figura 9B) hubo un aumento estadísticamente
significativo de la concentración de dopamina en las dos concentraciones de sacarosa
administradas.
Página 54
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EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
CAUDADO
n=9
15000
10000
5000
0
H2O
0.3
1
Sacarosa (mM)
CAUDADO
B
n
20000
/ g de tejido
µg de DA/ g de tejido
20000
15000
*
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10000
entración de dopamina en el caudado con la administración repetida de
*
EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
Mientras que en la figura 10 en el núcleo acumbes no hubo cambio estadísticamente
significativo en en la concentración de dopamina en las dos concentraciones de sacarosa
administradas comparada con el agua (figura 10A), mientras que en la comparación con el
control de aire (figura 10B) se presento una tendencia a aumentar la liberación de dopamina
en ambas concentraciones de sacarosa.
A
B
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
NÚCLEO ACUMBENS
n=9
15000
10000
5000
0
AIRE
0.3
1
Sacarosa (mM)
NÚCLEO ACUMBENS
20000
n
*
*
e tejido
µg de DA/ g de tejido
20000
15000
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
Figura 10. Diferenciasen los niveles de dopamina en el núcleo acumbens generados por la repetida
administración de sacarosa (4 días) a diferentes concentraciones. La grafica A muestra los niveles de
dopamina comparados con un grupo control de agua y la grafica B muestra los niveles de dopamina
comparados con un grupo control de aire.
Quinina
En la figura 1l el análisis del grupo de ratas (n=9) tratadas con quinina 0.3mM y 1mM,
administradas continuamente mostró una disminución de la concentración de dopamina,
estadísticamente significativa, en hipocampo, comparada con el control de agua (figura
11A), mientras que en la figura 11B no hubo cambio en la concentración de dopamina en
ambas concentraciones de quinina con el control de aire.
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
HIPOCAMPO
HIPOCAMPO
n
=
9
400
µg de DA/ g de tejido
*
*
µg de DA/g de tejido
400
300
200
n=9
100
300
0
AIRE
0.3
1
Quinina (mM)
200
Figura 11. Efecto de la exposición repetida (4 días)de quinina a 0.3 y 1 mM sobre las
concentraciones de dopamina en el hipocampo. En la grafica A se observa las diferencias en los
niveles de dopamina comparadas con un grupo control que fue tratado con agua (Dunnett, *P<0.05),
mientras que en la grafica B se observa los niveles de dopamina comparada con un grupo tratado con
aire.
**
*
100
0
H2O
0.3
1
Quinina (mM)
Sin embargo, en la corteza prefrontal (figura 12) hubo una tendencia a disminuir la
liberación de dopamina en ambas concentraciones de quinina cuando se comparo con el
contro de agua (figura 12 A), mientras que con el control de aire (figura 12B)hubo una
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
tendencia a aumentar la concentración de dopamina en ambas concetraciones de
quinina, sin ser estadísticamente significativa.
B
CORTEZAPREFRONTAL
PREFRONTAL
CORTEZA
de tejido
tejido
µg de
de DA/
DA/gg de
800
400
n=9
n=9
600
300
mina en la corteza prefrontal en respuesta a la exposición repetida de quinina a
200
400 de dopamina con respecto a las diferentes concentraciones de
uestra los niveles
grupo control tratado con agua, en tanto que en la grafica B se muestra los
rado con el grupo tratado con aire. Las barras representan el promedio de 9
100
200
0
0
AIRE
H2O
0.3
0.3
1 1
Quinina
Quinina(mM)
(mM)
Página 60
EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
Con respecto a la figura 13, el caudado presento una tendencia a disminuir la concentración
de dopamina en ambas concentraciones de quinina comparada con el control de agua
(figura 13A); mientras que en el control de aire (figura 13B) hubo un aumento en la
concentración de dopamina que fue estadísticamente significativo en las dos
B
CAUDADO
n=9
µg de DA/g de tejido
20000
15000
**
10000
*
5000
0
AIRE
0.3
1
Quinina (mM)
concentraciones de quinina.
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EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
CAUDADO
n=9
µg de DA/g de tejido
20000
15000
10000
5000
0
H2O
0.3
1
Quinina (mM)
*
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
Figura 13. Resultado de la ingesta de quinina a diferentes concentraciones, durante cuatro sesiones, sobre
los niveles de dopamina en el caudado. En la grafica A se observa los cambios en los niveles de dopamina
comparada con animales que fueron tratados con agua, por el contrario en la grafica B se muestran los
cambios en los niveles de dopamina comparados con los animales tratados con aire (Dunnett *P<0.05).
En la figura 14, el núcleo acumbens mostro unatendencia de disminuir la concentración de
dopamina en ambos tratamientos comparado con el control de agua (figura 14A), mientras
que en la comparación del control de aire (figura 14B) hubo una tendencia a aumentar la
concentración de dopamina en los dos tratamientos de quinina.
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EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
NÚCLEO
ACUMBENS
NÚCLEO
ACUMBENS
n=9
n=9
µg
de DA/g
DA/g de
de tejido
tejido
µg de
20000
20000
15000
15000
10000
10000
5000
5000
00
H2O
AIRE
0.3
0.3
1
1
Quinina
(mM)
Quinina
(mM)
*
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EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
nes sobre la concentración
dministración continua de
e fue tratado con agua. En
oncentración de dopamina
medio de nueve animales ±
En el caso de la aplicación repetida de choques eléctricos que se mostro en la figura 15, se
muestra que en todas las áreas analizadas (figura B, C y D) no se observaron cambios en las
concentraciones de dopamina, únicamente en el hipocampo (figura 15A) hubo una
tendencia a aumentar la concentración de dopamina a la intensidad de 0.3mA, sin que
alcanzara significancia estadística.
A
C
B
D
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EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
HIPOCAMPO
CORTEZA
PREFRONTAL
n=9
n=9
µµggde
de DA/g
DA/g de
de tejido
tejido
400
2000
300
1500
200
1000
Figura 15. Niveles de dopamina en hipocampo (grafica A), corteza prefrontal (grafica B), caudado
(grafica C) y núcleo acumbens (grafica D) después de la aplicación repetida (4 días) de choques eléctricos
a 0.1 y 0.3 mA. Las barras representan el promedio de nueve animales ± SEM.
100
500
00
0
0
0.1
0.1
0.3
0.3
Choques
eléctricos (mA)
(mA)
Choques eléctricos
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EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
CAUDADO
NÚCLEO
ACUMBENS
n=9
n=9
deDA/
DA/ggde
detejido
tejido
µµggde
20000
15000
15000
10000
10000
5000
5000
0
0
0
0
0.1
0.1
0.3
0.3
Choques eléctricos (mA)
Choques eléctricos (mA)
EXPERIMENTO 2
Análisis en los cambios de la expresión del RNAm de los receptores dopaminergicos
del subtipo D2.
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
En este experimento se analizaron los cambios en la expresión del RNAm en la corteza
prefrontal, el caudado y el núcleo acumbens de aquellos animales que fueron tratados con
la administración repetida de sacarosa y quinina a 0.3 y 1 mM y la exposición repetida a
choques eléctricos a 0.3 y 1 mA.En la figura 16A se muestra una gráfica tipo, en la que se
observa que con ninguno de los tratamientos se observaron aumentos en la expresión del
RNAm del receptor D2, en comparación con los grupo al que sólo se le adminsitro sacarosa
1 mM una sola vez (figura 16A), y también en comparación con algunos controles
positivos, tales como la subunidad ribosomal 18S (figura 16B), y de las proteínas
constitutivas selectina y V-CAM (figura 18C).
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
A
B
C
D2-una sola exposición
de sacarosa 1 mM
Figura 16.D2
Disminución
de la expresión del RNAm del receptor D2 en la corteza prefrontal, el
con exposiciones
caudado y el núcleo acumbens después de la administración repetida (4 días) de sacarosa y quinina a
repetidas
0.3 y 1mM comparada con los animales que fueron tratados con una sola exposición de sacarosa a 1
mM (Figura 16A), 18S (figura 16B), selectina y V-CAM (figura 16C).
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
18S
D2
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EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
Selectina
V-CAM
D2
Por otro lado, en la figura 17 se muestra en un grupo de animales tratados con una sola
exposición de la sacarosa 1 mM no se presenta expresión del RNAm del recepor del
subtipo D2 en la corteza prefrontal, en tando que en caudado y núcleo acumbens se
presenta un aumento de la expresión del D2.
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
Receptor dopaminergico 2 en diferentes rgiones del cerebro
2.0
Expresión relativa
1.5
1.0
0.5
0.0
NAC
CXP
CAU
Figura 17. Cambios en la expresión relativa del receptor del subtipo D2 en el núcleo acumbens,
corteza prefrontal y del caudado de animales tratados con una sola exposición de sacarosa 1
mM.
EXPERIMENTO 3
Determinación de los cambios en la expresión del receptor dopaminergico del subtipo
D2.
En este experimento se evaluaron los cambios en la expresión del receptor del subtipo D2
en la corteza prefrontal (CXP), el caudado (CAU) y el núcleo acumbens (NAc), de ratas
que fueron previamente tratadascon sacarosa a diferentes concentraciones (0.3 y 1mM).
Como se observa en la figura 18,en la corteza prefrontal se presento una mayor expresión
del receptor D2 en comparación con el caudado (figura 19) y el núcleo acumbens (figura
20). En esta primera área, aunque se observo una tendencia a aumentar los niveles del
receptor, la administración de sacarosa a las dos concentraciones evaluadas (0.3 y 1 mM)
no modifico de manera estadísticamente significativa los niveles de expresión de este
receptor al comparalos con el grupo control de agua (figura 18A) y el grupo control de aire
(figura 18B).
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
A
B
Expresión del
receptor D2 en Corteza p
1.0
D2/Β-Actina (UA)
0.8
0.6
Figura 18. Cambios en la expresión del receptor del subtipo D2 en la corteza prefrontal en animales
pretratados con sacarosa a concentraciones de 0.3 y 1 mM. figura18A muestra la expresión del receptor
D2 comparado con un grupo control de animales tradados con agua, en tanto que en la figura 18B se
muestra la expresión del receptor D2 comparado con un grupo control de nimales tratados con aire. Las
0.4
barras representan el promedio de cuatro ratas ± SEM.
0.2
0.0
H20
0.3
1
Sacarosa (mM)
Página 73
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EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
Expresión del receptor D2 en Corteza pr
n
1.0
D2/Β-Actina (UA)
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
AIRE
0.3
1
Sacarosa (mM)
Como se puede observar en la figura 19A, a nivel del caudado, la administración repetida
de sacarosa 1 mM disminuyo de manera estadisticamente significativa los niveles de
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
expresión del receptor D2, al compararlos con el grupo control de agua, en tanto que
con la concetración de 0.3 mM se presento solo una tendencia a disminuir la expresión de
este receptor. Por otro lado, al comparar los tratamientos con el grupo control de aire se
observo una tendencia a disminuir los niveles del receptor en ambas concentraciones de
sacarosa, las cuales no alcanzaron significancia estadística (figura 19B).
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
A
B
Expresión del receptor D2 en Cauda
1.0
n
D2/B-Actina (UA)
0.8
0.6
*
0.4
0.2
0.0
H20
0.3
1
Sacarosa (mM)
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
Expresión del receptor D2 en Cauda
1.0
n
D2/Β-Actina (UA)
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
AIRE
0.3
1
Sacarosa (mM)
Figura 19. Expresión del receptor del subtipo D2 en respuesta a la administración repetida de sacarosa a
concentraciones diferentes. En la figura 19A se observan los cambios en la expresión del receptor D2
comparado con el grupo control tratado con agua (Dunnets, *P>0.05), mientras que en la figura 19B se
observan los cambios en la expresión del receptor D2 comparado el grupo control tratado con aire.
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
Finalmente, los niveles de expresión de receptor D2 a nivel del núcleo acumbens no
mostraron cambios significativos con ninguna de las concentraciones de sacarosa
administradas, en relación con el grupo control de agua (figura20A) y el grupo control de
aire (figura 20B).
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EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
A
Expresión delB receptor D2 en Núcleo acu
1.0
n
D2/Β-Actina (UA)
0.8
0.6
Figura 20. Efecto de la administración repetida de sacarosa a 0.3 y 1 mM sobre la expresión del receptor
del subtipo D2. La figura A, muestra la expresión del receptor D2 comparado con el grupo control tratado
con agua, en tanto que la figura B muestra la expresión del receptor D2 comparado el grupo control tratado
con aire.0.4
Las barras muestran el promedio de cuatro animales ± SEM.
0.2
0.0
H20
0.3
1
Sacarosa (mM)
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
Expresión de receptor D2 en Núcleo acu
1.0
n
D2/Β-actina (UA)
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
AIRE
0.3
1
Sacarosa (mM)
Quinina
Página 80
EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
En la corteza prefrontal la administración repetida de quinina dio como resultado una
tendencia a disminuir la expresión del receptor D2 en las dos concentraciones evaluadas
(0.3 y 1 mM)con respecto al control tratados con agua (figura 21A). Sin embargo, la
expresión del receptor D2 no mostro cambios estadísticamente significativos en ambas
concetraciones de quinina comparadas con el grupo control tratado con aire (figura 21B).
A Expresión del receptor D2 en Corteza prefrontal
B Expresión del receptor D2 en Corteza prefrontal
1.0
1.0
D2/Β-Actina (UA)
0.6
0.4
0.2
n
=
4
0.8
D2/Β-Actina (UA)
n
=
4
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
H20
0.3
1
Quinina (mM)
0.0
AIRE
0.3
1
Quinina (mM)
Figura 21.Niveles de expresión del receptor D2 en el caudado en relación a la administración repetida de
quinina a diferentes concentraciones. En la figura A se observa la expresión del receptor D2 comparado
con el grupo control de agua, mientras que en la figura B se muestra la expresión del receptor D2
comparado el grupo control de aire.
En la figura 22 se puede observar que en el caudado se presento una disminución,
estadísticamente significativa, en la expresión del receptor D2,tanto a la concentración
de0.3 como a la de 1 mM de quininacon respecto al control de agua (figura 22A) y al grupo
control de aire (figura 22B).
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
Expresión del receptor D2 en Caudado
1.0
n
=
4
D2/Β-Actina (UA)
0.8
0.6
*
0.4
*
0.2
B
Expresión del receptor D2 en Caudado
1.0
n
=
4
0.8
D2/Β-Actina (UA)
A
0.6
*
0.4
*
0.2
0.0
0.0
H20
0.3
1
Quinina (mM)
AIRE
0.3
1
Quinina (mM)
Figura 22.Menor expresión del receptor D2 en el caudado con la ingesta repetidade quinina a 0.3 y 1 mM.
La figura A muestra la expresión de dicho receptor comparado con el control tratado con agua, entretanto
la figura B muestra la expresión de receptor D2 comparado con el grupo control tratado con aire. (Dunnett,
*P>0.05).
Mientras que en la figura 23 se observa que la expresión del receptor D2 en el núcleo
acumbens no presento cambios estadísticamente significativos con las dos concentraciones
de quinina en comparación con el grupo control tratado con agua (figura 23A) y el grupo
control tratado con aire (figura 23B).
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
1.0
n
=
4
D2/Β-Actina (UA)
0.8
0.6
0.4
B Expresión del receptor D2 en Núcleo acumbens
1.0
0.6
0.4
0.2
0.2
0.0
0.0
H20
0.3
n
=
4
0.8
D2/Β-Actina (UA)
A Expresión del receptor D2 en Núcleo acumbens
1
Quinina (mM)
AIRE
0.3
1
Quinina (mM)
Figura 23.El efecto de la administración repetida de quinina a distintas concentraciones sobre la expresión
del receptor D2 en el núcleo acumbens. En A se observa los cambios en la expresión del receptor
comparado con el control de agua, mientras que B se muestra la expresión de dicho receptor comparado
con el control de aire. Las barras simbolizan el promedio de cuatro ratas ± SEM.
Choques eléctricos
Por ultimo, en la corteza prefrontal (figura 24A) presento una tendencia a disminuir la
expresión del receptor D2 con la aplicación de choques eléctrico a la intensidad de 0.3 mA,
en tanto que, con la intensidad de 0.1 mA no se presento un cambio significativo en la
expresión de receptor D2. Sin embargo, en la figura 24B, en el caudado se presento una
tendencia a aumentar la expresión de los receptores D2 en respuesta a la aplicación de los
choques eléctricos de ambas intensidades (0.1 y 0.3mA). Mientras que en el núcleo
acumbens (figura 24C) se muestra una tendencia a disminiur la expresión del receptor D2
con ambas intensidades de choques eléctricos.
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
Expresión del receptor D2 en Corteza prefrontal
B
A
1.0
0.6
n
=
4
0.8
D2/Β-Actina (UA)
D2/Β-Actina (UA)
1.0
n
=
4
0.8
Expresión del receptor D2 en Caudado
0.4
0.6
0.4
0.2
0.2
0.0
0.0
0
0.1
0.3
0
Choques eléctricos (mA)
C
0.1
0.3
Choques eléctricos (mA)
Expresión del receptor D2 en Núcleo acumbens
1.0
n
=
4
D2/Β-Actina (UA)
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0
0.1
0.3
Choques eléctricos (mA)
Figura 24. Cambios en los niveles de expresión del receptor D2 en la corteza prefrontal (figura A), el
caudado (figura B) y el núcleo acumbens (figura C) en respuesta a la aplicación repetida (4 días) de
choques eléctricos a 0.1 y 0.3 mA. Las barras representan el promedio de nueve animales ± SEM.
EXPERIMENTO 4
Análisis de los cambios en el efecto anhedónicoproducidos por un estímulo
motivacionales de recompensa y de castigo.
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
En la figura 25 se muestran los cambiosdel efecto anhedónico evaluado mediante la
prueba de preferencia por la sacarosa en animales que previamente (4 días antes)habían
sido tratados con estímulos motivacionales de recompensa como la administración de agua
y sacarosa a diferentes concentraciones (0.3 y 1 mM),y de castigo como la administración
de quinina a 0.3 y 1 mM.En el condicionamiento de la prueba los animales pretratados
conel vehículos consumieron más sacarosa en comparación con las ratas pretratadas con
sacarosa y quinina a 0.3 y 1 mM, sin embargo entre el grupo antes tratado con sacarosa a 1
mM se observo un consumo menor de sacarosa, comparado con el grupo pretratado con la
sacarosa a 0.3 mM. En tanto que los animales a los que se les había administrado quinina a
0.3 y 1 mM no mostraron cambios por el consumo de sacarosa entre ambas
concentraciones.
Efecto anhedónico
n
=
6
350
300
g de sacarosa
250
200
150
100
50
0
Vehiculo
0.3mM 1mM
Sacarosa
0.3mM 1mM
Quinina
Figura 25. Efecto anhedónico de la sacarosa de ratas que fueron pretratadas, cuatro días antes, con agua
(vehiculo), sacarosa a 0.3 y 1 mM y quinina 0.3 y 1mM. Los datos mostrados en la grafica representan el
consumo de los gramos de sacarosa de seis animales pretratados con agua, sacarosa y quinina a 0.3 y 1
mM en las sesiones del condicionamiento de la prueba de la preferencia por la sacarosa.
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
En la figura 26se muestra el resultado de la ingeta de sacarosade ratas que cuatro días
antes fueron tratadas con choques eléctricos a 0.1 y 0.3 mA (CH0.1 y CH0.3) y sin choques
eléctricos (SCH), los animales que tuvieron choques eléctricos a las intensidades de 0.1 y
0.3 mA presentaron un mayor consumo de sacarosa comparada con los animales que no
fueron tratados con choques eléctricos.
Efecto anhedónico
n
=
6
350
300
g de sacarosa
250
200
150
100
50
0
SCH
CH0.1mA
CH0.3mA
Figura 26. El efecto de la ingesta de sacarosa en ratas pretradas con choques eléctricos a 0.1 y 0.3 mA.
Como se muetras en la grafica, los animales pretratados con choques eléctricos consumieron mayor
sacarosa que los que no recibieron choques eléctricos.
A
6000
5500
5000
4500
Preferencia por la sacarosa
n
=
6
6500
6000
Tiempo (seg)
n
=
6
6500
Tiempo (seg)
B
Preferencia por la sacarosa
5500
5000
4500
4000
4000
H20
S0.3
S1
Pretratamiento
Q0.3
Q1
SCH
CH0.1
CH0.3
Pretratamiento
Figura 27. Preferencia por la sacarosa representada por el tiempo (seg) en que permaneció la rata en el
cuarto donde consumía sacarosa. La figura 27A, muestra el tiempo de preferencia por la sacarosa en ratas
pretratadas con agua, sacarosa y quinina a 0.3 y 1 mM, mientras que en la figura 27B, se observa el tiempo
en que el animal permaneció en el cuarto donde se ingeria sacarosa, esta ratas fueron pretratadas con
choques eléctricos a 0.1 y 0.3 mA y sin choques.
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
VII. DISCUSIÓN
EXPERIMENTO 1
Determinación en la liberación de dopamina por HPLC
En la primera parte de este trabajo estudiamos los cambios en la concentración de
dopamina ante estímulos motivacionales de recompensa y de castigo. En este estudio,
además de evaluar las áreas cerebrales involucradas en el sistema mesolimbico
dopaminergicos, tales como el núcleo acumbens y la corteza prefrontal, que se sabe que es
donde normalmente se libera dopamina ante estímulos naturales, nosotros decidimos incluir
dos áreas más: el caudado y el hipocampo, las cuales empleamos como el control positivo y
negativo,
respectivamente.
Adicionalmente,
en
este
trabajo
realizamos
cuatro
administraciones del estímulo motivacional, para tratar de simular las administraciones
repetidas que se presentan con las drogas de abuso.
Nuestros resultados, mostraron que en todos los estímulos motivacionales, la concentración
de dopamina fue mayor en el núcleo accumbens y el caudado, mientras que hubo menor
concentración en el hipocampo y la corteza prefrontal.
Por otra parte, la administración repetida de sacarosa no produjo cambios significativos en
los niveles de dopamina en ninguna de las áreas evaluadas, al compararlas con la
administración de agua. En contraste, cuando se realizó la comparación con el grupo “aire”,
que se trato de ratas a las que se manipuló de igual forma que a las ratas tratadas con
sacarosa pero que no se les administró sustancia alguna, se observó que los niveles de
dopamina aumentaron significativamente en la corteza prefrontal, el caudado y el núcleo
acumbens.
En cuanto a la administración del estímulo motivacional de castigo (quinina), al hacer la
comparación con el grupo tratado con el vehículo de esta sustancia (agua) observamos que
sólo se presentaron tendencias a disminuir los niveles de dopamina en la corteza, el
caudado y el núcleo acumbens, en tanto que existió una disminución estadísticamente
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
significativa en el hipocampo. Sin embargo, al realizar la comparación con el grupo de
aire se observó un aumento estadísticamente significativo en los niveles de dopamina en el
caudado y en el núcleo acumbens.
En contraste a los datos observados con la quinina y la sacarosa, la administración repetida
de choques eléctricos no mostró alteraciones en los niveles de dopamina en ninguna de las
áreas analizadas.
Como se pudo observar en los experimentos de la administración de sacarosa y de quinina,
en este trabajo se incluyeron dos grupos control. Uno de estos grupos fue tratado con el
vehículo de ambas sustancias (agua) y el otro fue el grupo tratado con aire. Este último
grupo lo decidimos incluir ya que surgió la duda de que si el agua por sí misma, al tratarse
también de un estímulo motivacional positivo, podría producir alteraciones en nuestros
resultados. Como se puede observar en los resultados, efectivamente existen diferencias al
realizar las comparaciones ya sea con el grupo de agua o con el grupo de aire. En este
sentido consideramos que resulta más real la comparación entre el grupo de aire, justamente
por la valencia motivacional del grupo de agua; por lo tanto de manera subsecuente nos
referiremos a los cambios en la dopamina en relación con el grupo control de aire
En línea con nuestros resultados de la concentración de dopamina, diversos estudios han
mostrado que la administración de estímulos motivacionales de recompensa que se persiven
de manera oral, tales como la sacarosa, el chocolate, los fonzies, produce aumentos en la
liberación de dopamina en el shell y el core del núcleo acumbens, así como en la corteza
prefrontal
(Bassareo et al., 2002).
De igual forma, la administración de estímulos
motivacionales de castigo tales como la admisitración de quinina, de choques eléctricos y
exposición al olor de la orina de un deprededador, también produce liberación de dopamina
en el shell y el core del núcleo acumbens, en la corteza prefrontal y en el estriado
(Abercombrie et al., 1989; Bassareo et al., 2002). En el 2002 Bassareo y colaboradores
reportaron que después de una pre-exposición a estímulos motivacionales, tanto de
recompensa como de castigo, se producía un fenómeno de habituación observado
específicamente a nivel del shell del núcleo acumbens, este fenómeno consistía en la
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
reducción casi total en la liberación dopamina en relación con la primera
administración.
En contraste a estás evidencias, estudios posteriores demostraron que la
pre-exposición a estimulos motivacionales no naturales, como la administración de etanol y
de nicotina, no presentaban el fenómeno de habituación. Estas observaciones puntualizaron
la existencia de diferencias importantes en la regulación adaptativa de la transmisión
dopaminergica, a nivel del shell del núcleo acumbens, después de la administración de
estimulos motivacionales naturales en comparación con las drogas, lo que sugieren que
pudiera estar relacionado con los efectos conductuales de las drogas de abuso (Bassareo et
al., 2003; Lecca et al., 2006). En contraste con estos resultados, en nuestros experimentos,
donde realizamos la administración de los diferentes estímulos motivacionales de manera
repetida, no nos fue posible observar tal fenómeno de habituación.
Hasta donde sabemos, nuestro estudio es el primero donde se analizan los cambios en los
niveles de dopamina posteriores a la administración repetidadel estímulo motivacional
natural, más allá de una sola administración. En este sentido, nuestros resultados podrían
indicar que la habituación se presenta en áreas cerebrales especificas, como el shell del
núcleo acumbens (Bassareo et al., 2002), en tanto que en otras áreas cerebrales podrían
seguir manifestando los aumentos en los niveles de dopamina tras la administración del
estímulo motivacional, tal como sucedió en la corteza prefrontal, el cuadado y el núcleo
acumbens.
El shell del núcleo acumbens está asociado con el sistema límbico y está involucrado en las
respuestas emocionales y de recompensa. La corteza prefrontal por su parte está
relacionada con el valor motivacional (salience) de los estímulos; mientras que el core del
núcleo acumbens y el caudado son áreas que están relacionadas con funciones motoras; por
lo tanto, el aumento en la actividad dopaminérgica en estas dos últimas se asocia con
respuestas motoras alteradas(Fulford y Marsde, l998). Debido a esto, los estudios que
evalúan los efectos producidos por los estímulos motivacionales analizan principalmente
los cambios que se presentan en corteza prefrontal y en núcleo acumbens, en tanto que
aquellos cambios que se presentan en la trasnmisión dopaminergica a nivel del caudado se
asocian más con el factor locomotor, que se activa con algunos estimulos motivacinales no
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
naturales como las anfetaminas (Fulford y Marsde, l998).En este sentido, en el presente
estudio no fue posible evaluar por sepado el shell y el core del núcleo acumbens, lo que
probablemente nos esta impidiendo el poder observar la posible habituación en la liberación
de dopamina, así como tal vez permitiría diferenciar la valencia de los estímulos
motivacionales. A pesar de ello, el análisis de los diferentes estímulos motivacionales nos
permitió observar que los estímulos motivacionales que se persiven de manera oral,
independientemente de su valencia, ya que se trata de un estímulo de recompensa y otro de
castigo, presentan similitudes en el aumento de dopamina a nivel del caudado y del núcleo
acumbens. En contraste, la exposición a choques eléctricos, aunque representa un estímulo
también aversivo como la quinina pero que presenta otra modalidad sensorial (táctil), no
presento cambios en la concentración de dopamina en ninguna de las áreas cerebrales. Por
otro lado, los cambios en los niveles de dopamina en la corteza pudieran estar sugiriendo la
sensibilidad dela cortez prefrontal para diferenciar la valencia entre los diferentes estímulos
motivacionales, ya que se observaró un aumento en la concentración de dopamina
solamente con el estímulo de recompensa, no así con el de castigo. Estos resultados en
conjuntos nos permiten sugerir que el sistema dopaminérgico presenta la sensibilidad para
discriminar entre los diferentes estímulos motivacionales, observándose como cambios en
las concentraciones de dopamina en las diferentes áreas cerebrales.
Estos datos en conjunto nos indian que, contrario a lo que esperábamos, no se observa un
fenómeno de habituación como lo reporta el grupo de Di Chiara (Bassareo,.2002). Esta
discrepancia podría radicar por ejemplo en el empleo de diferentes técnicas para evaluar la
liberación de dopamina. En nuestro caso empleamos HPLC en tanto que Di Chiara utilizó
microdialisis. En nuestro trabajo utilizamos tejido de rata que se obtuvo a los 20 min
después de la última administración del estímulo motivacional, que es al tiempo en el que
se ha reportado los aumentos más significativos en los niveles de dopamina, mientras que
en los estudios de microdialisis se obtuvieron cursos temporales, desde antes de la
administración del estímulo y hasta 180 min después. Esto nos hace plantearnos que seria
necesario emplear un mayor número de tiempos de evaluación, de tal manera que podramos
tener una ventana más amplia en la que podamos observar los posibles cambios en los
niveles de la dopamina.
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EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
Los datos en conjunto sugieren que el estímulo motivacional natural de
recompensa,como la administración de sacarosa, produce un efecto de habituación en todas
las áreas cerebrales analizadas al ser comparados con el vehículo de la sacarosa (agua). En
este trabajo, el cual en la literatura no se ha reportado, al menos con este tipo de estimulo
motivacional natural administrado de forma repetida, mientras que Di Chiara (2002) ha
reportado el mismo efecto en otras áreas cerebrales como el shell del núcleo y la corteza
prefrontal ante una sola exposición de sacarosa (Bassareo et al., 2002). Por otro lado, en
este estudio tambien se encontró en el caudado-putamen un aumento en la concentración
de dopamina en respuesta a este estímulo, al igual que lo reportan estudios basados en el
consumo excesivo de alimentos (
). Con respecto al estimulos motivacional natural de
castigo como la administración de quinina a diferentes concentraciones (0.3 y 1 mM)
mostro habituación en la liberación de dopamina en todas las áreas cerebrales estudiadas,
contrario a la literatura se ha encontrado que los estimulos motivacionales aversivos no
presentan habituación en áreas cerebrales como el core del núcleo acumbens y la corteza
prefrontal (Bassareo et al., 2002). Mientras que en el caudado se muestra un aumento en los
niveles de dopamina con la administración repetida de quinina, al igual que sucede con los
estímulos motivacionales no naturales (consumo de las drogas de abuso). Además de que la
concentración de dopamina parece depender del estímulo proporcionado y del área cerebral
analizada.
EXPERIMENTO 2
Análisis de los cambios en la expresión del RNAm del receptor dopaminergico del
subtipo D2.
Los resultados obtenidos, demostraron que no hubo expresión del RNAm de los receptores
dopaminergicos del subtipo D2 en ninguna de las áreas bajo ningún tratamiento,en tanto
que si se presentaron cambios importantes en la expresión del RNAm de subtipo D2 en el
caudado, corteza prefrontal y núcleo acumbens cuando se administro una sola vez sacarosa
a 1 mM. Estos datossugieren que la administración repetida de los estimulos
motivacionales naturales reduce la expresión del RNAm de los receptores D2 en la corteza
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EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
prefrontal, el caudado y el núcleo acumbens. Cabe resaltar que no hay estudios que
correlacionen la administración de los estimulos motivacionales naturales con la expresión
del RNAm de los receptores dopaminergicos.
EXPERIENTO 3
Determinación de los cambios en los niveles de receptor dopaminergico del subtipo
D2.
Nuestros resultadosobtenidos en este experimento mostraron que la administración repetida
de los estímulos motivacionales naturales, como la administración de sacarosa a 0.3 y 1
mM
mostró una tendencia a incrementar la expresión del receptor D2 en la corteza
prefrontal, mientras que el caudado se presento una tendencia a disminuir la expresión de
dichos receptores, entanto que no hubo cambios en la expresión del receptor en el
acumbens. En cuanto a la administración continua de quinina, mostró una disminución en
de la expresión del receptor D2, estadísticamente significativa, en el caudado, mientras que
no fue significativa en la corteza prefrontal y no hubos cambios en el acumbens. Con la
aplicación repetida de choques eléctricos, se observó una tendencia a disminuir
la
expresión del receptor D2 en la corteza prefrontal y el núcleo acumbens, mientras que en
el caudado se presento una tendencia aumentar la expresión del receptor D2. Con estos
datos se demuestra que la expresión del receptor de dopamina del subtipo D2 se encuentran
disminuidos en el caudado con la administración de los estimulos motivacionales como la
sacarosa y quinina a 0.3 y 1 mM. Esto nos indica que la expresión del receptor depende de
el área analizada y del estimulo proporcionado.
EXPERIMENTO 4
Análisis de los cambios en el efecto hedónico
En la prueba de la preferencia por sacarosa parece presentarse un efecto anhedónico en los
tratamientos, tanto de quinina como de sacarosa.
Discusion generales
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EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
A nivel del sistema mesolímbico dopaminérgico, la dopamina se libera ante estimulos
motivacionales naturales de recompensa que tienen que ver con la sobrevivencia de la
especie y del individuo, tales como la ingesta del alimento, de agua, la conducta sexual y la
conducta materna. Este tipo de respuestas, presentan propiedades hedónica (efecto
placentero) y pueden actuar como reforzadores positivos, mediante la generación de un
comportamiento de aprendizaje y de repetición. Tambien se ha observado que con los
estímulos motivacionales naturales de castigo se presenta un incremento de dopamina,estas
respuestas presentan propiedades reforzantes negativas, que aumentan y mantienen la
conducta aprendida para escapar del estímulo o tratar de evitarlo.De manera interesante, se
ha encontrado que los estimulos motivacionales no naturales como la administración de
drogas de abuso también producen liberación de dopamina en el sistema mesolímbico
dopaminérgico.
El principal hallazgo de este estudio es que la habitución (reducción de la concentración de
dopamina) se presenta en diferentes áreas cerebrales dependiendo del estímulo
motivacional natural. En los estimulos motivacionales naturales de castigo se presenta
habituación en todas las áreas cerebrales, cuando se compara con el grupo control al cual se
le administro agua, en tanto que con los el grupo control que se le administro solo aire
muestra un aumento en la cocnetración de dopamina.
VIII. CONCLUSIONES
Liberación de dopamina.
1. En todos los estímulos, la concentración de DA es diferente en las áreas cerebrales,
encontrando menor concentración en hipocampo y corteza prefrontal, mientras que
en caudado y núcleo accumbens hubo una mayor concentración.
2. Estos datos sugieren que los estímulos motivacionales de recompensa y castigo
producen habituación en la liberación de dopamina, aunque en diferente proporción.
Además de que la liberación de dopamina parece depender del estímulo
proporcionado y del área cerebral analizada.
Página 93
EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE DOPAMINA Y DE LOS RECEPTORES D-like DOPAMINÉRGICOS
EN LASRESPUESTAS A ESTÍMULOS MOTIVACIONALES DE RECOMPENSA Y DE CASTIGO EN RATAS
Perspectivas
De manera alternativa, existe la posibilidad de que en nuestro modelo se necesiten un
mayor número de administraciones del estímulo para poder observar el fenómeno de
habituación referido por el grupo de Di Chiara,
IX.
BIBLIOGRAFÍA
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ANEXO
SOLUCIONES PREPARADAS
HPLC
-
Solución de la fase móvil: se disolvieron 320mg de EDTA, 1g de octil sulfato de
sodio, 8g de Na2HPO4, 500ml de agua ionizada, 350ml de metanol grado HPLC y
se aforó a 2000ml con agua de desionizada a pH de 3.1.
INMUNO-BLOT
-
Solución homogenizadora: RIPA 100mM, pH 7.4: se disolvieron 0.876g de NaCl,
0.186g de EDTA, 0.1g de SDS, 0.5g de Na-Deoxicolato en 0.606g de Tris-HCL (el
cual fue disuelto primero con 70ml de agua miliQ y se ajusto el pH a 7.4) después
se le adicionó 30ml de agua miliQ para completar la solución de 100ml.
-
Inhibidores de Proteasas:
IAA(0.001M): se disuelven 6.6mg en 30ml de agua desionizada.
TLCK (0.09M): se disuelven 33, 23mg en 1ml de agua desionizada
PMSF (1,74mg/ml de DMSO): se disuelven 52.3mg en 30ml de DMSO.
-
Solución A: 2% de Carbonato de sodio (Na2CO3), 0.40% de Hidróxido de sodio
(NaOH) y 0.02% de Tartrato de sodio y potasio.
-
Solución B: 0.50% de Sulfato de cobre pentahidratado
-
Solución C: 49ml de solución A y 1ml de solución B (recién preparada)
-
Solución D: Reactivo de Foulin 1N (dilución 1:2), recién preparada
-
Solución de Tris-HCl 1,5M (pH 8.8): se disuelven 23.64g de Tris-HCl aforado a
100ml de agua desionizada y se ajusta a pH 8.8 con NaOH 1N. Guardar la solución
en refrigeración (2-8°C).
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Solución de Tris-HCl 1,0M (pH 6.8): se disuelven 15.76g de Tris-HCl y aforar a 100ml
de agua desionizada y ajustar el pH a 6.8 con HCl 1N. Guardar la solución en refrigeración
(2-8°C)
-
Solución stock de Acrilamida (30%): se disuelven 30g de acrilamida y 0.8g de Bisacrilamida (N-N-Methylene-Bis-Acrilamina) en 50ml de agua desionizada. Se afora
a 100ml. La solución se filtra y se guarda en refrigeración a 2-8°C.
-
Solución SDS 10%: se disuelven 10g de SDS en 100ml de agua desionizada. Se
conserva a temperatura ambiente.
-
Solución de persulfato de amonio al 10%: se disuelve 0.1g de persulfato de amonio
en 1ml de agua desionizada. Esta solución se conserva a 2-4°C.
-
Buffer de carga 10X
-
Buffer de corrida
Buffer de Transferencia 10X. se pesan y se mezclan con agua miliQ los siguientes
reactivos: Tris-HCl (3,0275g). Glicina (14.4413g) y se afora a 1000ml. Para preparar 200ml
de buffer de transferencia se disuelven 30ml de la solución antes preparada, 140ml de agua
miliQ y 40ml de metanol. Debe de ser en ese orden para evitar la precipitación de las sales.
-
Solución TBS (10X): se pesan 12.1g de Tris-HCl o Tris-base y 89 g de NaCl y se
afora a 1000ml. Se almacena en el refrigerador.
-
Solución TBST (Tween) al 0.1%. a un litro de TBS 1X se le agraga 1ml de Tween
20.
-
Solución de TBST-leche 5%: se pesan 5g de leche en polvo (Svelty) y se afora a
100ml con solución TBST al 0.1%, se mezcla y se mantiene en agitación
constantemente.
-
Solución Reveladora: A 180ml de agua miliQ a una temperatura de 38°C se le
agregaron 29g de revelador y se agita vigorosamente
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