ESTABLECIMIENTO ASÉPTICO EN LA MICROPROPAGACIÓN in

Tierra Tropical (2011) 7 (2): 205-220
ESTABLECIMIENTO ASÉPTICO EN LA MICROPROPAGACIÓN in vitro
DE BANANO WILLIAMS (AAA, SUBGRUPO CAVENDISH)
D.F. Ortega, A.C. Tamayo1, J. Calderón, R. Galván
Universidad EARTH
Las Mercedes de Guácimo, Limón, Costa Rica
Recibido 23 de diciembre 2011. Aceptado 15 de enero 2012.
RESUMEN
La reproducción asexual de plantas es una técnica muy importante para la multiplicación in vitro
de banano, debido a la esterilidad de la especie. La multiplicación in vitro ha permitido la
reproducción masiva de la especie para plantaciones comerciales. Sin embargo, una de las
limitantes para la micropropagación in vitro de Musa sp. ha sido la alta tasa de contaminación en
los explantes en la Fase I del cultivo, debida principalmente a contaminación endógena,
acentuada en zonas tropicales, donde las condiciones de alta temperatura y pluviosidad hacen
que los microorganismos encuentren un hospedero ideal en esta especie. Se planteó la necesidad
de establecer un adecuado protocolo de desinfección que proporcionara un establecimiento de
explantes de banano Williams con bajo porcentaje de contaminación, como fase inicial para la
micropropagación in vitro de la especie a través de meristemos. El estudio se realizó en el
laboratorio de la Universidad EARTH, cuyo campus se encuentra ubicado en la región tropical
húmeda de Costa Rica. Los explantes de banano Williams fueron obtenidos de las plantaciones
de la finca comercial dentro del campus. Se diseñaron siete protocolos o tratamientos, cada uno
con 25 repeticiones, que consistieron en: P1: [4 % de NaClO + Tween 80 por 20 min] + [1,5 %
de NaClO + Tween 80 por 10 min]; P2: [I 1 % en etanol 70º] + P1 con desinfección
individualizada; P3: [I 1 % en etanol 70º] + P1; P4: tratamiento de secado de los explantes en
invernadero durante siete días + [etanol 70º por 5 min] + [4 % de NaClO + Tween 80 por
30 min] + [1,5 % de NaClO + Tween 80 por 15 min]; P5: tratamiento de estrés hídrico a los
explantes en invernadero durante siete días + P1; y P6: P4 + siembra en MS líquido con
estreptomicina / penicilina, doble ensayo a 100 mg/L y 200 mg/L. Los resultados fueron
evaluados siete días después de la siembra, analizando las variables explantes viables, no
contaminados, y explantes no viables, contaminados y necróticos. El protocolo que consiguió
disminuir considerablemente la contaminación, en la fase de establecimiento aséptico de
Musa sp., fue el P6. El efecto positivo que muestra la desinfección con etanol de 70º y el
aumento en los tiempos de la doble desinfección con hipoclorito es potenciado a su vez por el
tratamiento de los explantes con una solución antibiótica de estreptomicina / penicilina.
Palabras clave: banano Williams, estreptomicina, etanol, explantes, hipoclorito, meristemos,
penicilina, protocolo, yodo.
ABSTRACT
Sexual reproduction of plants is an important technique for the multiplication in vitro of banana,
due to the sterility of the species. The in vitro multiplication has permitted the massive
reproduction of the species for commercial plantations. However, one of the limitations for
in vitro micropropagation of Musa sp. has been the high rate of contamination of the explants of
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Contacto: Ana Cristina Tamayo ([email protected])
ISSN: 1659-2751
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the Phase 1 of the plant, principally due to endogenous contamination, accentuated in tropical
zones where the conditions of temperature and high rainfall provide an ideal environment for
microbial proliferation. There exists a need to establish a disinfection protocol for the
establishment of explants of banana Williams with a low percentage of contamination, for the
initial phase of in vitro micro-propagation of the species, using meristems. The experiment was
conducted in a laboratory at EARTH University, whose campus in located in the humid tropic
region of Costa Rica. The explants of banana Williams were obtained from the plantations of the
commercial farm on campus. Seven protocols or treatments were designed with 25 repetitions
each, that consisted of P1: [4 % NaClO + Tween 80 for 20 min] + [1,5 % NaClO + Tween 80 for
10 min]; P2: [I 1 % in 70º ethanol] + P1 with individual disinfection; P3: [I 1 % in 70º ethanol] +
P1; P4: drying treatment of the explants in the greenhouse for seven days + [70º ethanol for
5 min] + [4 % NaClO + Tween 80 for 30 min] + [1,5 % NaClO + Tween 80 for 15 min]; P5:
water stress treatment, in the greenhouse, for seven days + P1; and P6: P4 + planting in MS
liquid with streptomycin / penicillin, double trial with 100 mg/L and 200 mg/L. The results were
evaluated seven days after planting, analyzing the variables viable explants, no contamination
and non-viable explants, contaminated and necrotic. The protocol that considerably reduced the
contamination, in the aseptic establishment phase of Musa sp., was P6. The positive effect of
disinfection with 70° ethanol and the increase in times of double disinfection with hypochlorite
is enhanced by the treatment of the explants with an antibiotic solution of streptomycin /
penicillin
Key words: banana Williams, streptomycin, ethanol, explants, hypochlorite, meristems,
penicillin, protocol, iodine.
INTRODUCCIÓN
El cultivo de tejidos vegetales se define como el conjunto de técnicas destinadas a lograr cultivos
de órganos, tejidos, células, e incluso protoplasmas, en medios de cultivos artificiales, bajo
condiciones asépticas (Canchignia et al., 2008) y bajo condiciones ambientales controladas,
buscando obtener plantas libres de contaminantes y por ende, libres de enfermedades (Castro et
al., 2002). Igualmente, la reproducción in vitro es un método adecuado para la propagación
masiva de plantas, lo que facilita la comercialización de genotipos seleccionados.
La reproducción asexual de plantas mediante cultivo de tejidos es posible debido a la
totipotencialidad presente en las células meristemáticas, que se localizan en diferentes órganos
de las plantas. Dicha característica permite a estas células estar en capacidad de desarrollar un
nuevo individuo sin que sea necesaria la fusión previa de gametos. De esta forma, dan lugar a
una respuesta morfogenética formando directamente órganos o embriones somáticos
(organogénesis o embriogénesis directa) (Aguilar et al., 2008).
Para el presente estudio, se eligieron los meristemos como explantes para micropropagación
mediante organogénesis directa. Sin embargo, y aunque no sea este el caso, el proceso de
micropropagación in vitro puede partir de células diferenciadas, atravesando una
desdiferenciación celular acompañada de crecimiento tumoral que da lugar a la formación de
callos, los cuales bajo las condiciones adecuadas dan lugar a la formación de órganos o
embriones somáticos (organogénesis o embriogénesis indirecta).
Este tipo de estrategias de propagación son importantes en banano y plátano porque permiten
obtener plantas libres de fitopatógenos y facilitan el intercambio de germoplasma (Vuylsteke,
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1998). En la micropropagacion in vitro de Musa sp. se distinguen tres etapas. Etapa I: iniciación
del cultivo, donde se realiza la desinfección y excisión de los explantes, la incubación del
cultivo, y mantenimiento del mismo (transferencia a medio fresco con regularidad). Etapa II:
multiplicación. Etapa III: establecimiento de la planta, donde se induce la formación de raíces,
así como la aclimatación de la planta, primero a condiciones in vitro y posteriormente a
condiciones ex vitro, hasta llegar finalmente al establecimiento en campo.
En anteriores trabajos de micropropagación in vitro de Musa sp., llevados a cabo por el
laboratorio de cultivo de tejidos de la Universidad EARTH, se ha presentado una alta tasa de
contaminación en los explantes en la iniciación del cultivo. Esa contaminación fue debida
principalmente a contaminación endógena, acentuada además por la alta temperatura y
pluviosidad de la región donde se realiza la recolección del material, ya que el campus de la
Universidad EARTH se encuentra en la región tropical húmeda. El objetivo de este estudio fue
establecer un adecuado protocolo de desinfección que proporcione un establecimiento de
explantes de banano Williams con bajo porcentaje de contaminación, como fase inicial para la
micropropagación in vitro de la especie a través de meristemos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Para este estudio se utilizaron como fuente de meristemos, hijuelos de espada recolectados en
diferentes zonas de cultivo de las plantaciones de la Finca Comercial de la Universidad EARTH
(Figura 1). La finca cuenta con aproximadamente con 316 ha destinadas a la producción de
banano (variedad Williams), localizada dentro del campus de la Universidad EARTH en Las
Mercedes de Guácimo, Limón, Costa Rica.
Figura 1. Tipo de hijuelos seleccionados en campo para la obtención de meristemos.
Para la desinfección de explantes, se usaron hipoclorito de sodio al 4 %, Tween 80, jabón
bactericida, etanol 95° y 70°, solución de yodo al 1% en etanol de 70º y solución de
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estreptomicina / penicilina. Como antioxidante se usaron 100 mg/L de ácido ascórbico, para
reducir la oxidación debida a polifenoles.
Se preparó el medio de cultivo MS (Murashige & Skoog) 1962, suplementado con
N6-bencilaminopurina (BAP), el cual contiene los macronutrientes: NH4NO3, KNO3, CaCl2,
MgSO4 y KH2PO4. También contiene los micronutrientes H3BO4, MnSO4, ZnSO4, Yoduro de
potasio, Molibdato de sodio, CuSO4 5H2O y CoCl2; FeEDTA; los vitaminas MS de mioinositol,
piridoxina, ácido nicotínico, glicina y tiamina; y Phytagel. Como fuente de carbono se usaron
sacarosa, debido a que los explantes no son completamente autótrofos y no pueden cubrir sus
necesidades nutricionales con la fotosíntesis que pueden realizar in vitro. Se utilizó citoquinina
en el medio de cultivo a una concentración de 1 mg/L durante la Fase I, y a 3 mg/L durante la
Fase II, para conseguir la proliferación de células meristemáticas, así como el crecimiento de
yemas laterales, proporcionando además un efecto anti-senescente. El pH del medio MS se
ajustó a 5.8.
Se diseñaron siete tratamientos o protocolos, con la finalidad de valorar cuál de ellos era el más
efectivo para la desinfección en la fase de establecimiento in vitro de banano Williams
(Cuadro 1). Para cada uno de los tratamientos se realizaron 25 repeticiones en un diseño
completamente al azar. Los resultados fueron obtenidos y evaluados siete días después de la
siembra para cada uno de los protocolos ensayados, atendiendo a las variables explantes viables
(no contaminados) y explantes no viables (contaminados, y necróticos).
Cuadro 1. Protocolos la desinfección en la fase de establecimiento in vitro.
Protocolo
Procedimiento
P1
[4 % de NaClO + Tween 80 / 20 min] + [1,5 % de NaClO + Tween 80 / 10 min]
P2
[I 1 % en etanol 70º] + P1 con desinfección individualizada
P3
[I 1 % en etanol 70º] + P1
P4
Pretratamiento de estrés hídrico a los explantes en invernadero durante 7 días +
[etanol 70º / 5 min] + [4 % de NaClO + Tween 80 / 30 min] + [1,5 % de NaClO +
Tween 80 / 15 min]
P5
Pretratamiento de estrés hídrico a los explantes en invernadero durante 7 días + P1
P6
P4 + siembra en MS líquido con estreptomicina / penicilina; doble ensayo a
100 mg/L y 200 mg/L
Para el protocolo de doble desinfección, P1, se realiza una primera desinfección con NaClO al
4 % y una segunda con NaClO al 1,5 %. Los pasos de este protocolo serán básicos para los
demás protocolos, pero con las modificaciones descritas en cada uno. Los pasos son:
1. Lavar los explantes con H2O + jabón bactericida líquido por 5 minutos. Se depositan los 25
explantes por cada recipiente, que queden verticalmente (Figura 2). A continuación se añade
H2O + jabón bactericida líquido, y se agitan durante 5 minutos. Por último, se elimine
totalmente el jabón con agua corriente.
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Figura 2. Disposición de explantes en el recipiente.
2. Se añade la solución de NaClO (4 %) + Tween 80 (4 mL/L) al recipiente donde se
encuentran los explantes. Se introducen en la cámara de flujo, aplicando etanol de 70º a la
superficie del recipiente. Se deja actuar 20 minutos en oscuridad, se agitan los explantes y se
elimina la solución de NaClO.
3. Se vierte agua esterilizada en el recipiente de los explantes, se agita y se elimina el agua hasta
tener tres lavados. Después de realizar el último lavado se conservan tapados dentro de la
cámara de flujo laminar.
4. Se reduce el explante eliminando capas externas (Figura 3). Se elimina la capas exteriores de
la parte foliar del explante, cuidando de no dañarlo internamente. Los explantes cortados se
introducen en un beaker autoclavado, que debe permanecer tapado.
Figura 3. Reducción de los explantes eliminando las capas externas.
5. Se añade una solución de NaClO al 1,5 % + Tween 80 en el beaker y se deja actuar por
10 minutos en oscuridad. Se agita frecuentemente y luego se elimina la solución de
hipoclorito.
6. Añadir H2O esterilizada hasta completar un total de tres lavados.
7. Se introducen en la cámara los frascos con 30 mL de solución de cisteína a 100 mg/L, cada
uno. Se realiza la reducción de los explantes hasta un tamaño aproximado de 2 cm.
8. Sumergir los explantes en solución de ácido ascórbico, 100 mg/L, durante 2-10 minutos (dos
explantes por frasco).
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9. Sembrar un solo explante por frasco con medio de cultivo (MS sólido + 1 mg/L de BAP).
Debe quedar bien sumergido en el medio de cultivo y en posición vertical (Figura 4).
Figura 4. Explante reducido y sembrado en el medio de cultivo.
El protocolo P2 toma como base el protocolo anterior pero incluyendo dos diferencias
especificas. La primera de ellas consistió en realizar aplicaciones de yodo al 1 % en una solución
de etanol de 70º a los explantes. Estas aplicaciones se realizaron antes y después del primer corte
para reducir el tamaño, y antes y después del segundo corte. Con este procedimiento se buscaba
que al utilizar un antiséptico de amplio espectro previamente a la realización de los cortes. Los
agentes contaminantes presentes en las capas más superficiales de los explantes no pudieran
contaminar las capas más internas de los mismos.
Además, a la hoja de los machetes y cuchillos utilizados, se les aplicó solución de yodo antes de
cortar un nuevo explante, para evitar que aquellos que estuvieran posiblemente contaminados
con bacteria endógena infectaran a los sanos. Como medida de contención que ayudara a evitar
esto último, se implantó la segunda diferencia, que consistía en realizar las desinfecciones de los
explantes de la forma más individualizada posible, en grupos de cinco en la primera desinfección
y de forma totalmente individual en la segunda.
El protocolo P2 se desarrolla en los siguientes pasos:
1. En el campo, colocar los explantes sobre bolsas de plástico (Figura 5). Aplicar la solución de
yodo (yodo al 1% disuelto en etanol 70°) a todos los explantes antes de comenzar los cortes.
Corte y aplicación posterior de la solución yodada a cada uno de los explantes. Introducir los
explantes en bolsas de plástico para su transporte.
Figura 5. Explantes colectados en campo dispuestos sobre una bolsa plástica.
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2. En el laboratorio aplicar una solución de yodo a los explantes. Realizar el corte y volver a
aplicar la solución de yodo. Guardar los explantes en bolsa plástica a 5 °C de forma que
queden separados unos de otros sin ningún contacto directo entre ellos.
3. Lavar los explantes con H2O + jabón líquido por cinco minutos, aproximadamente. Lavar en
grupos de cinco explantes. Colocar los distintos grupos en beakers separados (cinco
explantes por beaker).
4. Añadir la solución de NaClO (4 %) + Tween 80 (4 mL/L) a cada beaker. Introducir en la
cámara de flujo laminar. Agitar los explantes y después dejar actuar 20 minutos.
5. Lavar tres veces con agua destilada estéril.
6. Se corta cada explante y se coloca en un frasco esterilizado, en recipientes individuales
(Figura 6).
Figura 6. Explantes tratados en recipientes individuales.
7. Una vez terminado el corte del ultimo explante, añadir solución de NaClO al 1,5 % + Tween
80 (4 mL/L) en todos los frascos y dejar actuar 10 minutos. Eliminar el hipoclorito de todos
los frascos.
8. Añadir H2O esterilizada a los frascos hasta completar un total de tres lavados.
9. Se realiza un corte para la reducción de los explantes antes del tratamiento (Figura 7).
Figura 7. Reducción de los explantes antes del tratamiento.
10. Sumergir los explantes en solución de ácido ascórbico, 100 mg/L, durante 2 min a 10 min
(Figura 8).
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Figura 8. Explantes en solución de acido ascórbico.
11. Sembrar un explante por cada frasco con medio de cultivo (MS + 1mg/L de BAP).
(Figura 9).
Figura 9. Explante sembrado después del tratamiento.
El protocolo P3 se basa, al igual que el anterior, en el protocolo P1, incluyendo solo una de las
dos diferencias integradas en el protocolo P2. La diferencia es la aplicación de yodo al 1 % en
una solución de etanol de 70º a los explantes. Se procede tal y como se describe en el punto 1 del
protocolo P2, y a continuación se procede según el protocolo P1. Esto permitiría conocer el
efecto de la solución de yodo en la desinfección, y compararlo con el efecto conjunto de dicha
solución más la desinfección individualizada.
En el caso del protocolo P4, se procedió a evaluar el efecto sobre la desinfección de un
antiséptico de amplio espectro, etanol de 70º, junto a un aumento en los tiempos de doble
desinfección con hipoclorito sódico. Para ello se procede según el protocolo P1 excepto las
siguientes diferencias.
1. Una vez efectuado el lavado con H2O y jabón bactericida, y previamente a la inmersión en
NaClO al 4 % + Tween 80 (4 mL/L), los explantes son rociados con etanol de 70º, dejándolo
actuar durante 5 minutos. La inmersión en NaClO + Tween 80 tendrá una duración total de
30 minutos.
2. La segunda desinfección con NaClO al 1,5 % + Tween 80 (4 mL/L) tendrá una duración total
de 15 minutos.
3. Se utilizará un frasco con solución de ácido ascórbico por cada explante.
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4. El protocolo presentó una variable adicional, que consistió en realizar a los explantes un
pretratamiento de estrés hídrico en invernadero durante siete días, antes de someterlos al
procedimiento de desinfección.
Por lo anterior, y para evaluar esta variable independientemente de las demás, se diseñó el
protocolo siguiente. El protocolo P5 consiste en realizar el protocolo P1 partiendo de explantes
que han sido previamente sometidos a estrés hídrico durante siete días en invernadero.
Para el sexto protocolo, P6, se pretendía evaluar el efecto sobre la desinfección que tendría una
solución antibiótica de estreptomicina / penicilina, junto con el etanol de 70º y el aumento en los
tiempos de desinfección. Se evaluaron dos concentraciones de la solución antibiótica: 100 mg/L
y 200 mg/L.
Según el frasco de antibiótico comercial, dicho preparado debe disolverse con 20 mL de agua
destilada estéril, la concentración requerida es de estreptomicina 10 000 µg/mL y de penicilina
10 000 U/mL. Esta solución madre se encuentra por tanto a una concentración de estreptomicina
de 10 mg/ml. Sin embargo, para este estudio se comenzará con 100 mg/L, es decir 0,1 mg/mL.
Por tanto para preparar un volumen de 250 mL de MS líquido con antibiótico son necesarios
2,5 mL de la solución madre del antibiótico. Para preparar MS líquido a una concentración del
antibiótico de 200 mg/L son necesarios 5 mL de la solución madre. La concentración de
penicilina será a 100 U/mL en el primer ensayo y 200 U/mL en el segundo ensayo.
Se procede según el Protocolo P4, teniendo en cuenta las siguientes diferencias.
1. Previamente al proceso de desinfección, se prepara un medio MS líquido con la misma
composición y pH que el medio MS sólido con el que se ha venido trabajando, pero con la
diferencia de no añadir el gelificante phytagel.
2. Posteriormente, y una vez que los explantes se encuentran en la solución de ácido ascórbico,
se añade la solución antibiótica al medio MS líquido en la cámara de flujo laminar.
3. A continuación, con una jeringa y aguja estériles se toman 20 mL de agua destilada estéril, y
se añaden al frasco que contiene el antibiótico en polvo. Con la aguja se atraviesa el tapón de
plástico del frasco; se aplica etanol de 70º a este tapón antes de introducir la aguja. Invertir
varias veces el frasco hasta que el antibiótico quede bien disuelto. Introducir de nuevo la
aguja y tomar 2,5 mL de la solución antibiótica para el primer frasco y 5 mL para el segundo.
Una vez que se tiene en la jeringa la cantidad deseada, se retira la aguja de la jeringa y se
coloca el filtro. El antibiótico se agrega gota a gota al medio líquido. Cerrar el frasco y agitar.
4. Dispensar el medio MS líquido + antibiótico en frascos estériles (aproximadamente 25 mL
por frasco). Para ello, se retira la tapa de todos los frascos y se añade el medio líquido a cada
uno de ellos. Se añaden los explantes que se encuentran en la solución de ácido ascórbico. Se
toma el explante y se deposita en un frasco con MS líquido + antibiótico (1 explante por
frasco). Se colocan los frascos en agitación suave (Figura 10). Se mantiene bajo estas
condiciones durante siete días y se transfiere a medio sólido.
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Figura 10. Explantes en medio liquido en agitación.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se evaluaron los explantes a los siete días posteriores a la respectiva siembra para cada uno de
los protocolos evaluados. Con protocolo P1, se observó una contaminación del 31,0 % de los
explantes sembrados (Figura 11), representando la contaminación bacteriana el 24,6 %, y la
fúngica solo el 4,9 % (Figura 12). Estos resultados coinciden con resultados obtenidos con
anterioridad, y a su vez con resultados obtenidos por otros grupos de investigación en la zona,
donde la mayoría de las contaminaciones observadas se deben a bacteria, posiblemente
consecuencia de una contaminación endógena. Dicha contaminación puede deberse posiblemente
a Bacillus spp. (Van den houwe y Swennen, 2000). Esto podría explicar su persistencia y las
dificultades encontradas para alcanzar un efectivo establecimiento aséptico, ya que estos bacilos
gram positivos se caracterizan por la formación de esporas que son resistentes a los agentes
desinfectantes químicos, al frío, al calor e incluso a radiaciones. Por ello se modificó el protocolo
P1, que se había utilizado con anterioridad, con la expectativa de disminuir el porcentaje de
contaminación en la Fase I. Por otro lado el 69,0 % de los explantes estaban aparentemente libres
de contaminación aun cuando fueron evaluados a las dos semanas (Figura 13).
Explantes no viables (%)
50
40
30
20
10
0
P1
P2
P3
P4
P5
P6-100 P6-200
Protocolos
Figura 11. Resultados obtenidos de los diferentes protocolos evaluados en porcentaje de
explantes no viables.
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Figura 12. Contaminación bacteriana (izquierda) y fúngica (derecha) en protocolo P1.
Figura 13. Explantes libres de contaminación (izquierda) y explante evaluado dos semanas
después de la siembra (derecha), de protocolo P1.
El porcentaje de contaminación observado con el protocolo P2 fue de un 24 %. Sin embargo, los
explantes sanos y libres de contaminación representan un valor prácticamente idéntico al que
refleja el protocolo anterior, 68 %. Esto fue debido a que el 8 % de los explantes fueron
incapaces de seguir adelante porque presentaron necrosis; por lo tanto, el porcentaje total de
explantes no viables asciende al 32 % (Figura 11).
Existieron dos problemas principal que acarrea el uso de yodo como desinfectante en el
establecimiento aséptico de Musa spp. Por una parte provoca necrosis en los tejidos del explante
y por otra parte, conlleva a la muerte o a un estancamiento en el desarrollo del mismo, aún 30
días después de la siembra presentó casi la misma forma y tamaño (Figura 14).
Figura 14. Explante de protocolo P2: evaluado siete días desde la siembra (izquierda) y
explantes no evaluado 30 días desde la siembra (derecha).
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Sólo parece haber una lectura parcialmente positiva de estos resultados, y fue que la
contaminación por bacteria se redujo a un 16 % con el protocolo P2. Para evaluar si esta
disminución en el porcentaje de contaminación por bacterias se debía al uso del yodo como
desinfectante, o por el contrario, se debía a la desinfección individualizada incluida en este
protocolo, se diseñó el Protocolo P3.
La media del porcentaje de contaminación alcanza, en el caso de protocolo P3, el 32,8 %
(Figura 11), mayoritariamente por bacterias. Luego, la reducción en la contaminación bacteriana
observada en el Protocolo P2 no fue debida al uso de la solución de yodo durante el proceso de
desinfección, sino más bien al proceso de desinfección individualizada. Además, la solución de
yodo al 1 % en alcohol de 70º es una solución muy concentrada y ni aún así consigue disminuir
la contaminación bacteriana, sino que por el contrario, provocó necrosis y muerte o
estancamiento del desarrollo en los explantes. Por tanto, de esto se deriva que, si utilizamos una
solución menos concentrada, a fin de disminuir el efecto necrótico, no será eficiente como
desinfectante.
Por lo anterior, se descartó el uso de la solución de yodo en el establecimiento aséptico de los
explantes. Sin embargo, pareció que la desinfección individualizada reduce el porcentaje de
contaminación bacteriana, pero es un procedimiento muy lento, tedioso y más costoso, siendo
inviable desde el punto de vista del proceso de producción.
El resultado para el protocolo P4 fue bastante positivo: 13,5 % de explantes contaminados y
86,5 % de explantes libres de contaminación (Figura 11). Se deduce que la aplicación de etanol
de 70º, más el aumento en los tiempos de la doble desinfección con hipoclorito, disminuyen
considerablemente el porcentaje de explantes contaminados en la Fase I.
Tanto el sano aspecto observado en los tejidos de los explantes (Figuras 15 y 16), que se debe a
un proceso de desinfección poco agresivo contra el mismo, como la rápida respuesta observada
en el desarrollo de los tejidos, que parece deberse a que los explantes utilizados para este
protocolo, pertenecen a ejemplares que proceden a su vez de micropropagación in vitro,
probablemente expuestos a una concentración residual de bencilaminopurina. Sin embargo, esto
no fue comprobado.
Figura 15. Explantes de protocolo P4, evaluados siete días (izquierda) y dos semanas (derecha),
después de la siembra.
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Figura 16. Explantes de protocolo P4, libres de contaminación.
No obstante, en el protocolo P4 se partió de explantes que habían sido sometidos a un proceso de
estrés hídrico durante siete días en el invernadero. Por lo que, para evaluar cómo dicho proceso
de deshidratación influye en la desinfección, se realizó el protocolo P1 partiendo igualmente de
estos explantes. El resultado fue una contaminación del 47 %, lo que evidenció que esta variable
no favorecía un establecimiento aséptico en sí misma, sino que por el contrario propiciaba un
aumento en el porcentaje de contaminación. Este procedimiento se identificó como protocolo P5.
Teniendo en cuenta los buenos resultados del protocolo P4, se decidió incluir y evaluar una
nueva variable a dicho protocolo, que consistía en sembrar en medio MS líquido +
estreptomicina / penicilina, una vez que se ha realizado la desinfección descrita para el protocolo
P4. Con ello se perseguía potenciar el efecto que la aplicación de etanol de 70º y el aumento en
los tiempos de la doble desinfección con NaClO, habían alcanzado en el establecimiento
aséptico. Esto resultó, para el protocolo P6, en un 6,6 % de contaminación con un 93,4 % de
explantes sanos para el ensayo de 100 mg/L de estreptomicina - 100 U/mL penicilina y un 9 %
de contaminación y un 91 % de explantes sanos para el ensayo de 200 mg/L de Estreptomicina 200 U/mL penicilina (Figuras 11 y 17).
Figura 17. Explantes en protocolo P6-100 mg/L (izquierda) y en protocolo P6-200 mg/L, ambos
evaluados siete días después de la siembra.
Estos explantes estuvieron un total de cuatro días en agitación con MS líquido + antibiótico, y
tras dicho período se sembraron en medio MS sólido sin antibiótico (Figura 18). En un principio
se pretendía que estuvieran un total de siete días en agitación, pero no se pudo prolongar más de
cuatro días porque los explantes comenzaron a presentar signos de oxidación. Por esta razón, se
decidió finalizar el tratamiento con antibiótico, y sembrarlos en medio MS fresco y sólido, a lo
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que respondieron favorablemente. Los explantes fueron evaluados nuevamente 15 días después
de sembrados y conservaban el mismo aspecto sano y continuaban en crecimiento (Figura 19).
Figura 18. Explantes en protocolo P6-100 mg/L (izquierda) y en protocolo P6-200 mg/L
(derecha), ambos evaluados cuatro días después de la siembra.
Figura 19. Explantes en protocolo P6, evaluados 15 días después de la siembra.
En otros estudios, donde utilizaron un medio líquido + Rifampicina esterilizada por filtración,
han mostrado buenos resultados en el establecimiento aséptico de Musa, con un 100% de
explantes libres de contaminación (Van den houwe y Swennen, 2000; Lima y Moraes, 2006).
Dicho tratamiento incluso es capaz de revertir la contaminación de los explantes contaminados, y
además no parece provocar fitotoxicidad.
CONCLUSIONES
De acuerdo con los resultados obtenidos, el protocolo que consiguió disminuir
considerablemente la contaminación, en la fase de establecimiento aséptico de Musa, fue el
protocolo P6. El efecto positivo que mostraron la desinfección con etanol de 70º y el aumento en
los tiempos de la doble desinfección con hipoclorito fue potenciado a su vez por el tratamiento
de los explantes con una solución antibiótica de estreptomicina / penicilina.
Por otro lado, se descarta la utilización de la solución de yodo al 1 % en etanol de 70º para la
desinfección de los explantes, ya que produce necrosis en los explantes, así como muerte o
estancamiento en el desarrollo de los mismos. Además de no observarse ningún efecto positivo
en la disminución de la contaminación. Tampoco se recomienda el estrés hídrico previo del
material biológico en invernadero durante siete días, ya que incluso se ha observado un aumento
en el porcentaje de contaminación.
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La contaminación endógena, que ha sido descrita durante la micropropagación in vitro de
Musa sp., puede ser provocada mayoritariamente por Bacillus spp. Sin embargo, Bacillus spp.
son sensibles a la combinación estreptomicina / penicilina, por lo que los resultados parecen
indicar que la contaminación endógena observada puede deberse mayoritariamente a dichos
microorganismos. El uso de dicha combinación de antibióticos logró reducir drásticamente la
contaminación bacteriana en la Fase I de la micropropagación in vitro de banano Williams. No
obstante, para poder asegurar esta afirmación sería necesario realizar un estudio de
caracterización morfológica y bioquímica de los agentes contaminantes que se presentaron en la
Fase I de la investigación. Además, ese tipo de estudio proporcionaría información suficiente
como para seleccionar los antibióticos más eficientes contra estas bacterias contaminantes.
RECOMENDACIONES
Se aconseja realizar, por un lado, el seguimiento de los explantes tratados con antibióticos, a fin
de descartar una posible fitotoxicidad, así como un posible descenso en la tasa de multiplicación.
Por otro lado, se aconseja determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI), que permitiría
ajustar la concentración necesaria, a fin de reducir los costes de producción ocasionados por el
consumo de antibiótico. Se recomienda a su vez realizar un seguimiento de contaminación,
fitotoxicidad, y tasa de multiplicación de los explantes procedentes del protocolo P6 y comparar
los resultados con los explantes establecidos mediante los protocolos P1 y P4.
Se ha observado que la contaminación endógena se presenta con frecuencia durante los ciclos de
multiplicación (Fase II) a partir de explantes aparentemente sanos. Por ello, además de implantar
el protocolo P6 en la Fase I, se aconseja que durante el proceso de multiplicación se identifiquen
mediante códigos adecuados las distintas líneas de multiplicación, a fin de facilitar el proceso de
eliminación de aquellas líneas que presenten contaminación a posteriori. De esta forma se
consigue seleccionar las líneas sanas, que se utilizarán para la producción masiva de ejemplares
de banano Williams.
Por último, y a fin de disminuir la contaminación en las distintas fases del proceso de
micropropagación in vitro, se deben seguir recomendaciones generales básicas en todo proceso
de multiplicación, como son: recolectar el material de campo en las épocas más secas; mantener
limpios y desinsectados cuartos, equipos y áreas de trabajo; evitar el movimiento de material
entre laboratorios; y usar ropa de trabajo adecuada y medidas preventivas para reducir la
contaminación procedente de los operarios. Los instrumentos deben flamearse durante periodos
prolongados, ya que se ha reportado la resistencia de esporas de Bacillus spp. tanto al calor como
a inmersiones prolongadas en alcohol de 70º y 95º. Por lo tanto, si el flameado no es correcto, los
instrumentos podrían esparcir Bacillus spp. a los cultivos limpios. Finalmente, se debe cuidar la
zona de trabajo al interior de la cámara, evitando usar los 20 primeros centímetros del interior de
la misma.
LITERATURA CITADA
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