Comparación de dos métodos de fijación para la estabilización de

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Rev Biomed 1998; 9:7-11.
Artículo Original
Comparación de dos métodos de
fijación para la estabilización de
glicocálix bacteriano.
Karina Echandi1, Francisco Hernández2.
1
Centro de Información de Medicamentos (CIMED) Facultad de Farmacia, 2Facultad de Microbiología, Unidad de Microscopia Electrónica y Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales, Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica.
RESUMEN.
Introducción. La información obtenida de estudios
ultraestructurales depende entre otros aspectos del
tipo de fijación y por lo tanto del nivel de
conservación de las estructuras evaluadas. En el
caso de la pared bacteriana el empleo de lisina y
rojo de rutenio mejoran la visualización de sus
componentes y permiten una imagen más
contrastada que la obtenida mediante métodos de
fijación clásicos.
Material y métodos. Se empleó la cepa ATCC
27853. De pseudomonas aeruginosa para evaluar
dos protocolos de fijación para microscopia electrónica de transmisión. El método estándar, consistente en una fijación secuencial, primero con
glutaraldehido (GA) al 2,5% en amortiguador de
fosfatos por 2 horas y luego con tetraóxido de
osmio (Os O4) al 1% por una hora, ambos fijadores
en amortiguador de fosfatos (pH 7.2). El otro método de fijación consistió en una fijación inicial con
una mezcla de GA al 2.5%, rojo de rutenio al
0.075% y lisina 50 mM en amortiguador de
cacodilato. Luego se fijó nuevamente durante 100
minutos con una solución de glutaraldehido, rojo
de rutenio y cacodilato (0.1 mM pH 7.2) y posteriormente se fijó con Os O4 durante una hora.
Ambas preparaciones se deshidrataron, embebieron en resina, se cortaron en un ultramicrótomo y
analizaron al microscopio electrónico de transmisión.
Resultados. En las preparaciones obtenidas por el
método estándar se aprecia la estructura de la pared propia de los organismos Gram negativos, sin
embargo, el material exterior a la pared no se
visualiza fácilmente. Por el contrario, en la fijación
a prueba se aprecia una imagen más contrastada,
lo que facilita la identificación de los diversos elementos de la pared y se aprecia fácilmente el exterior a la pared.
Discusión. El método evaluado facilita la observación del glicocálix, que aparece como un material electrodenso irregular, localizado en la parte
Solicitud de sobretiros: Dr. Francisco Hernández-Chavarría, Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica, Ciudad Universitaria "Rodrigo
Facio", Codigo Postal 2060, San José, Costa Rica, América Central.
Recibido el 122/Mayo/1997. Aceptado para publicación el 26/Nov./1997.
Vol. 9/No. 1/Enero-Marzo, 1998
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externa de la pared bacteriana. Por lo tanto, se propone el empleo de esta fijación para el análisis
ultraestructural de glicocálix. (Rev Biomed 1998;
9:7-11)
Palabras clave: Ultraestructura, pared celular
bacteriana, rojo de rutenio, glicocálix.
SUMMARY.
Comparison of two methods of fixation for the
stabilisation of bacterial glicocalix.
Background. Information obtained from
ultrastructual studies depends on the fixation
method used. In the case of bacteria cell wall, the
application of lisine and ruthenium red improves
the observation of their components and allows for
a more contrasted image than standard methods
using only glutaraldehyde and osmium.
Material and methods. Pseudomonas aeruginosa
strain ATCC 27853 was used to evaluate two
protocols of fixation for electron microscopy. The
standard method consisting in a sequential fixation
2,5% glutaraldehyde (GA) in phosphate buffer for
2 hrs, then the specimens were fixed again with
1% osmium tetroxide (Os O4) for 1 hr. The other
fixation method used a mixture of 2,5% GA,
0.075% rethenium red, and lysine (50 mM) in
cacodilate buffer for initial fixation. Specimens
were fixed again in the same fixative solution, for
100 minutes, and later they were fixed once more
1% Os O4 for one hour. Both groups of samples
were dehydrated, resin embedded, cut ultrafinely
into sections and analyzed under the electron
microscope.
Results. The samples fixed with the standard
method showed a good conservation of their cell
walls, however no material on the exterior of the
cell wall was easily visualized. On the other hand,
specimens prepared with the method showed a
better rutenium red, lisine, and osmium, contrasted
image which allowed for the identification of
different elements of the cell wall and the exterior
of the wall appeared clearly.
Revista Biomédica
Discussion. The method of fixation adding
ruthenium red and lysine to the solution of GA or
Os O4 permits the observation of glicocalix, that
appears as an electron-dense material attached to
the outer membrane. Therfore the use of this
fixative solution is proposed for use in
ultrastructural studies of bacterial cell-wall and
glicocalix. (Rev Biomed 1998; 9:7-11)
Key words: Ultrastructure, bacterial cell wall,
ruthenium red, glicocalix.
INTRODUCCION.
Los estudios sobre ultraestructura celular, ya
sea de organismos eucarióticos o procarióticos
están condicionados por el límite de resolución del
equipo utilizado, por los métodos de fijación empleados (que sólo pueden revelar los componentes celulares estabilizados satisfactoriamente) y finalmente por los métodos empleados para incrementar el contraste (1). Un ejemplo de este tipo
de interacción se presenta con las descripciones
ultraestructurales de la membrana citoplasmática,
que tres décadas atrás se describía como una estructura compuesta por una bicapa lipídica, contenida entre dos capas proteícas, tal como se apreciaba al microscopio electrónico, lo cual es producto de un articifio de laboratorio, dado por la
fijación exclusiva con tetraóxido de osmio, pues
este era el fijador empleado en aquellos estudios
(2). Actualmente los estudios de criofractura muestran imágenes que corresponden al modelo aceptado de mosaico fluido.
De manera similar, la estructura de los componentes de la pared bacteriana se describe más
detalladamente conforme se refinan las técnicas.
Por ejemplo, lo que tradicionalmente se describió
como el espacio periplásmico y como exclusivo de
bacterias Gram negativas, hoy se describe como
periplasma y está constituido por peptidoglican
menos laxo que el del resto de la pared y este
periplasma es común a bacterias Gram negativas y
Gram positivas, aunque es más prominente en las
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Métodos de fijación bacteriana.
primeras (3). También las estructuras externas a la
pared -como cápsula, microcápsula o glicocálixson difíciles de conservar, por lo que usualmente
requieren de medios de fijación y sustitución a temperaturas inferiores a los -100oC (4).
Los componentes extracelulares, como la
cápsula, microcápsula y glicocálix, son factores de
virulencia importantes, pues le permiten a la bacteria adherirse a superficies, como paso previo a
la colonización de un nuevo nicho, o bien le permiten mimetizarse y evadir la respuesta inmune del
hospedero. No obstante, con los métodos de fijación estándar este material extracelular no se pone
de manifiesto, por lo que en este trabajo se presenta una técnica alternativa de fijación que incluye rojo de rutenio para estabilizar esos materiales
extracelulares, gracias al efecto estabilizador del
rojo de rutenio sobre grupos aniónicos (5), lo que
pone de manifiesto el glicocálix (6).
MATERIAL Y MÉTODOS.
Se inocularon 100 µL de una suspensión
(ca.3 x 108 /mL) de Pseudomonas aeruginosa
(cepa ATCC 27853) en placas de Müeller Hinton
sin antibióticos e incubaron a 37oC durante 24 h.
Las colonias obtenidas se colectaron y subdividieron en dos porciones. Una de las cuales se suspendió en amortiguador de fosfatos (pH 7.2) y fijó
siguiendo el esquema clásico de fijación para
microscopia electrónica, utilizando una primera fijación con glutaraldehido al 2.5% por 2 horas a
4oC y una post fijación con tetraóxido de osmio
por una hora a 4oC. Ambos fijadores se diluyeron
en amortiguador de fosfatos 0.1 mM a pH 7.2. La
suspención de bacterias fijadas se incluyó en un
cuágulo de plasma (7), se seccionó en cubos de
ca. 1 mm 3 , que se fijaron nuevamente con
glutaraldehído al 2.5% durante 30 minutos, se lavaron con el amortiguador de fosfatos, se fijaron
de tetraoxido de osmio, como se describió anteriormente. Luego los bloques se deshidrataron en
una gradiente de etanol (30% a 100%) por 10 minutos en cada alcohol, a temperatura ambiente y
se incluyeron en resina Spurr de baja viscosidad
para obtener secciones finas (ca. 90 nM de grosor), que se tiñieron con acetato de uranilo y citrato
de plomo.
La otra porción de la suspención bacteriana
se suspendió en amortiguador de cacodilato (0.1
mM pH 7.2), se fijó durante 20 minutos a temperatura ambiente con una mezcla de glutaraldehído
al 2.5%, rojo de rutenio al 0.075% y lisina 50 mM
en amortiguador de cacodilato. Luego se fijó nuevamente durante 100 minutos con una solución de
glutaraldehído (2.5%) y rojo de rutenio (0.075%)
en el amortiguador de cacodilato, pero sin lisina
(6). El resto del proceso fue similar al descrito anteriormente. Ambas preparaciones se analizaron en
un microscopio electrónico de transmisión (Hitachi
H 7000).
RESULTADOS.
En las muestras fijadas por el método
estándar se obtiene buena información del citoplasma, pero la membrana citoplasmática y la pared
bacteriana aparecen poco definidas; además, el
exterior de las bacterias aparece limpio debido a la
pérdida de materiales de glicocalix (figs. 1 y 2).
Por otra parte, cuando se incluyó lisina y rojo
de rutenio en la solución fijadora se aprecia un
mayor contraste, que delimita mejor los componentes como membrana citoplásmica, capa de
peptidoglican, periplasma y membrana externa
(figs. 3 y 4). Además, externamente a la pared
bacteriana aparece un material amorfo electrón
denso, que corresponde al glicocálix.
DISCUSIÓN.
El método de fijación empleado en
microscopia electrónica más frecuentemente consiste en una doble fijación secuencial con aldehidos.
Generalmente se utiliza glutaraldehido, en una concentración entre el 1% y 6% en amortiguador de
fosfatos a pH 7.2, o una mezcla de glutaraldehido
y formaldehido, conocida como solución fijadora
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Figuras 1 y 2.- Micrografías electrónicas de transmisión, correspondientes a un corte transversal y otro longitudinal de
Pseudomonas aeruginosa. Muestras procesadas con el método estándar, utilizando una doble fijación con glutaraldehido
y osmio. Se observa una buena conservación del citoplasma y pared bacteriana, pero el glicocálix no se evidencia. (Barra=0.25 µM).
de Karnowski. Luego de un período de 1 a 2 h de
fijación, los especímenes se lavan en el mismo
amortiguador, para fijar nuevamente en tetraóxido
de osmio, usualmente al 1%, durante 30 a 60 minutos. Tal método ha brindado magníficos resultados para describir la ultraestructura tanto de células eucariotas como procariotas. El primer fijador
estabiliza fundamentalmente la matriz proteica de
la células y el segundo los lípidos. Sin embargo, el
glicocálix, integrado fundamentalmente por
mucopolisacáridos y localizado externamente a la
membrana o a la pared bacteriana, según se trate
de células eucariotas o procariotas, no se evidencia con esta fijación estándar, por lo que las células aparecen limpias, como se aprecia en las figuras 1 y 2.
El método de fijación alterno, que emplea
lisina y rojo de rutenio en amortiguador de
cacodilato, estabiliza los polímeros constituyentes
de la cápsula e incrementa su electrodensidad, lo
que facilita la observación al microscopio electrónico de las estructuras externas a la membrana
Revista Biomédica
citoplasmática (figs. 3 y 4). El amortiguador de
cacodilato no es muy empleado en microscopia
electrónica por su contenido de arsénico y elevado precio.
En la mezcla de fijación la lisina actúa como
agente estabilizador de la cápsula y glicocálix, cuyo
efecto es muy efectivo a concentraciones a 100 mM
y que en sólo diez minutos de exposición a la superficie bacteriana la estabilizaría (6). Además, tiene la habilidad de formar largos polímeros cuando
reacciona con glutaraldehido, produciendo puentes cruzados de diferente longitud, lo que provee
enlaces efectivos confiriendo gran estabilidad a los
constituyentes capsulares durante el proceso de
deshidratación (6) y aumentando la electrodensidad
de la preparación. Por otro lado, el rojo de rutenio
se une a grupos aniónicos y sirve de receptor para
el osmio, lo que en última instancia se traduce en
un aumento de la electrodensidad en el glicocalix,
lo que se evidencia en los resultados obtenidos.
Por lo tanto, recomendamos la inclusión de lisina
y rojo de rutenio en la fijación de suspensiones
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Métodos de fijación bacteriana.
Figuras 3 y 4.- Micrografías electrónicas de transmisión de Pseudomonas aeruginosa. Al fijador, tanto glutaraldehido
como osmio, se agregó rojo de rutenio y lisina. Se aprecia un mayor contraste y aparece el glicocálix como un meterial
electrón denso (flechas pequeñas) rodeando las bacterias. En la pared bacteriana se aprecian fácilmente los elementos
constitutivos. La flecha grande señala la capa de peptidglican, al lado interno aparece la membrana citoplasmática como
una línea negra y hacia el exterior el periplasma y la membrana externa. (Barra=0.25 µM).
bacterianas para evidenciar los componentes externos a la pared bacteriana. Además, no es recomendable emplear amortiguador de fosfatos y rojo
de rutenio juntos, pues en esta combinación precipitan los fosfatos.
AGRADECIMIENTO.
Se agradece las sugerencias y la corrección de estilo
hechas por los revisores anónimos de la Revista Biomédica
y el apoyo de la Vicerrectoría de Investigación de la Universidad de Costa Rica.
REFERENCIAS.
1.- Robinson DG, Ehlers U, Herken R, Herrmann B, Mayer
F, Schurmann FW. Methods of preparation for electron
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London: Springer-Verlag 1987:1-19.
3.- Beveridge TJ. The periplasmic space and the periplasm
in Gram-positive and Gram-negative bacteria. ASM News
1995; 61:125-130.
4.- Sluiman HJ, Lokhorst GM. The ultrastructure of cellular
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freeze substitution. Protoplasma 1988; 144:149-159.
5.- Nagano Y, Shimai K, Kushida T, Kushida H. Staining
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6.- Jacqes M, Graham L. Improved preservation of bacterial
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1989; 11:167-169.
7.- Hernández F, Coto E, Colmenares A, Moreira L. Aplicación del método de coagulación de plasma al estudio
ultraestructural de especímenes biológicos. Rev Biol Trop
1991; 39:177-180.
2.- Robertson JD. The anatomy of biological interfaces. En:
Physiology of membrane disorders. New York: Plenum
Medical Book Company. 1986:3-23.
Vol. 9/No. 1/Enero-Marzo, 1998