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ANEXO Mapeo genético y mapas cromosomas politenicos- Clase 1
Coordinadora: Dra Beatriz Goñi
Colaboradora: Lic. Ana María Soler
Sección Genética Evolutiva
INCLUYE información sobre el ciclo de vida de Drosophila melanogaster,
identificación de los sexos, genoma y nomenclatura y otros, empleada en el práctico.
También se incluye información complementaria sobre ligamiento y mapeo genético.
Drosophila melanogaster como modelo
La mosca del vinagre, Drosophila melanogaster, es un organismo eucariótico
empleado como modelo de experimentación en Genética. 1) Tiene un ciclo vital
relativamente corto a temperatura ambiente, entre 10-14 días; 2) es fácil de criar en
botellas o tubos de vidrio con un medio de cultivo barato y sencillo de preparar; 3) una
gran productividad, una pareja produce varios cientos de descendientes; 4) un número
cromosómico bajo, 4 pares de cromosomas; y 5) un gran número de caracteres
heredables que afectan la morfología del adulto. Se han descubierto un gran número de
mutaciones y se ha logrado un vasto conocimiento de su genoma. Las cepas de
Drosophila portadoras de genes/o marcas se ha vuelto un importante modelo genético
en la investigación de las ciencias básicas de la vida, medicina y agricultura.
Introducción a la biología y genética de D. melanogaster
Ciclo de vida:
1
D. melanogaster (Clase: Insecta; Orden: Diptera) es un insecto holometábolo,
cuyo ciclo vital consta de cuatro estadios: huevo, larva, pupa y adulto. Las hembras
depositan huevos en la superficie del medio de cultivo desde el tercer día de vida adulta
y continúan hasta su muerte. Los huevos son pequeños, blancos y oblongos, con un par
de filamentos anteriores. Su desarrollo comienza luego de la fecundación. Luego de 1 o
2 días, las larvas emergen de los huevos. Como la cutícula de los insectos no es elástica,
la larva muda periódicamente. Existen tres estadios larvales, separados por las
correspondientes mudas. Durante el 3er estadio larval, la larva se alimenta hasta que
finalmente se mueve fuera del medio hacia un lugar seco donde se detiene para pupar.
Durante el estadio pupal, ocurre la metamorfosis y a los 4 días emerge el adulto.
Medio de cultivo:
Las moscas se pueden cultivar en un medio compuesto por agar-levadura-harina
de maíz-glucosa, un antimicótico y un bactericida. Este medio se dosifica en tubos ó
botellas de vidrio ó plástico. En buenas condiciones de cultivo y a 25°C transcurren
alrededor de 10 días desde la puesta de los huevos
hasta la emergencia del imago. Si la temperatura
permanece entre 22°C y 26°C, se producirá una
nueva generación de moscas en aproximadamente 2
semanas (por ello el práctico se realiza cada 15
días). Los huevos son puestos en la superficie del
alimento (o medio de cultivo). Cuando la larva 1
emerge del huevo, comienza a introducirse en el
medio de cultivo. Si observa éste a la lupa podrá
distinguir las mandíbulas de las larvas en
movimiento. La larva 3 es fácil de observar pues se
dirige fuera del medio de cultivo hacia un lugar seco
donde se detiene a pupar.
Anestesiado y observación de las moscas:
Se utilizará los vapores de trietilamina.
1) Transfiera las moscas a un tubo anestesiador (= Falcon 50ml), tape el mismo con
un tapón de polyfom y dosifique vapores del anestésico dentro de dicho tubo por
el orificio del tapón.
2) Una vez que todas las moscas estén inmovilizadas, deposítelas sobre una tablilla.
Las moscas permanecerán anestesiadas por aproximadamente 45 minutos. La
exposición prolongada a (fuertes vapores de) trietilamina puede matar a las
moscas, las que se observarán con alas y patas extendidas en ángulo recto al
cuerpo y con ojos oscurecidos y deformados. En tal caso descarte las moscas
muertas.
3) Observe los caracteres de la mosca salvaje (o mutante) y diferencie los sexos:
OBSERVE en la lupa. Ajuste la lupa al menor aumento y haga foco, si es
necesario, cambie el aumento. No coloque la luz muy cerca de las moscas puesto
que el calor excesivo las deshidratará y acabará matándolas.
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Identificación de los sexos:
1. Tamaño del adulto. La hembra es generalmente más grande que el macho.
2. Forma del abdomen. El abdomen de la hembra se curva y termina en punta
mientras que el abdomen del macho es redondeado y más corto.
2. Marcas en el abdomen. Bandas claras y oscuras se alternan en la porción
posterior de la hembra mientras que en el macho se encuentran fusionadas y
forman una banda oscura.
3. Presencia de peine sexual. En los machos existe un pequeño penacho de setas en
el segmento basal del tarso en el primer par de patas llamado “peine sexual”.
Este es el único carácter sexual secundario que diferencia los machos jóvenes de
las hembras.
5. Genitalia externa. La genitalia es
un carácter sexual primario. En
las hembras se encuentra el
ovipositor en la punta del
abdomen, mientras que en el
macho
existen
ganchos
pigmentados, ordenados en
forma circular y localizados en el
extremo caudal.
3
Características del fenotipo salvaje de D. melanogaster:
Ojos: rojos, de forma oval y con muchas facetas
Alas: bordes lisos, venación uniforme, se extienden más allá del abdomen
Setas: Largas y suaves
Color del cuerpo: básicamente gris, con un patrón de áreas claras y oscuras
El genoma de D. melanogaster:
D. melanogaster presenta un número cromosómico
2n=8. Los pares cromosómicos se numeran del I al IV,
siendo el I el par sexual, y del II al IV los pares
autosómicos. El par sexual en hembras es XX y en
machos es XY.
El genoma de D. melanogaster ha sido
completamente secuenciado. Mide alrededor de 165
millones de bases y se estima que contiene unos 14.000
genes. La posición relativa de muchos genes a lo largo
de los cromosomas ha sido identificada y mapeada
basándose en la frecuencia de recombinación de genes
vecinos.
Nomenclatura empleada en genética de Drosophila:
Las moscas de tipo salvaje y los alelos que dan este fenotipo se designan con el
símbolo de “+”. Este símbolo se puede referir al genoma entero o a un determinado gen.
Simbología utilizada (recesivos), ej.:
•
Genes que se localizan en el mismo grupo de ligamiento:
dp ec
- si el individuo es homocigota para ambos loci: dp ec/dp ec
- si es heterocigota:
dp+ ec+/ dp ec ó
+ +/ dp ec
•
Genes localizados en diferentes cromosomas:
b+/b ; dp+/dp ; ey+/ey
•
ó
+/b ; +/dp ; +/ey
Genes ligados al sexo, ej:
XmX+ , XmY
ó
m/+ ♀♀ , m/Y ♂♂
Ligamiento y Mapeo
Determinación del grupo de ligamiento:
El concepto de organización linear de genes, basado en la frecuencia de recombinación genética entre ellos fue introducido por Sturtevant (1913). En Drosophila,
como en otros organismos, el mapeo genético se lleva a cabo normalmente en dos pasos: la asignación de una mutación a un cromosoma y luego el mapeo dentro del cromosoma.
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En un caso simple de una nueva mutación que provenga de una cepa salvaje, el
cruzamiento reciproco con una cepa marcadora permitiría inmediatamente establecer el
ligamiento al sexo. La manera más simple para asignar mutaciones a un cromosoma autosómico es cruzar la cepa mutante con una cepa heterocigota para diferentes marcadores dominantes para ambos cromosomas (ej. Cy/bwD; H/Sb), y luego retrocruzar los machos F1 con hembras de la cepa mutante original (para nuevas mutaciones recesivas) ó
con hembras salvajes (para nuevas mutaciones dominantes).
Al menos uno de los pares de marcas para cada cromosoma deberá estar sobre
un cromosoma balanceador, ej. In(2LR)O para Cy (Curly) e In(3LR)TM3 para Sb (Stubble), permitiendo a la cepa con cuatro marcas ser mantenida sin selección. Este cruzamiento permitirá inmediatamente establecer el ligamiento para el cromosoma II o III.
La elección precisa de los marcadores dominantes para la asignación del grupo
de ligamiento dependerá del fenotipo de la nueva mutación.
Condiciones estándar para mapeo genético:
Puesto que las distancias de mapa pueden variar como resultado tanto de diferencias genéticas y/o del medio ambiente, Bridges sugiere: 1) que las hembras crezcan
entre 1–6 días a 25º C antes del cruzamiento; 2) establecer el cruzamiento en tubos y
transferir a botellas (o tubos grandes) después de 1 día; 3) descartar parentales después
de 5 dias o antes de que la primera pupa pueda verse; 4) analizar la progenie por lo menos una vez al día durante todo el período de emergencia de los cultivos. Los cultivos
no deben estar atestados de moscas, puesto que producen proporciones aberrantes. Cultivos con cinco pares de parentales seria lo indicado (para cepas con buena fertilidad).
Loci de referencia:
En los comienzos de la genética de Drosophila, ciertos genes mutantes fueron
adoptados como puntos de referencia primarios o secundarios a partir de los cuales se
mapearon otras mutaciones. Estos se caracterizan por su fácil clasificación fenotipica y
una buena viabilidad (según Ashburner, 1989):
X: y, v, B (Morgan & Bridges, 1916)
II: S, b, pr, c, sp (black fue la primera referencia) (Bridges & Morgan, 1919)
III: ru, h, D, H, ca (Dichaete fue la primera referencia) (Bridges & Morgan 1923)
Actualmente existe una considerable confusión sobre la posición de algunos loci
en relación a las distancias “estándar”. Todas las distancias de mapa son provisorias
por lo que no existe un mapa de posición o de distancia “estándar”. Lo que normalmente
se entiende por este término es la posición de mapa dada por Lindsley & Grell (1968).
Mapas genómicos
La disponibilidad de mapas de ligamiento sustentados por un buen número de
marcas genéticas contribuye a la orientación de los grandes scaffolds generados en la
secuenciación genómica, y que, junto con datos del trabajo computacional del ensamblado de los scaffolds, proporcionan evidencias para la creación de mapas genómicos
detallados. El modelo Drosophila pretende ilustrar estos conceptos.
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Mapa citogenético en Drosophila
Una de las principales virtudes del género Drosophila como sistema modelo ha
sido la facilidad de generar mapas citogenéticos detallados. De hecho, el primer mapeo
definitivo en los cromosomas de D. melanogaster fue realizado por Bridges en 1916. El
descubrimiento subsiguiente de los cromosomas politénicos de las glándulas salivales
de esta especie y su codificación en mapas citogenéticos y genéticos de estructura fina,
provee una importante herramienta genética para mapear genes mediante la detección
de diversidad en las poblaciones, e inferir filogenias entre especies relacionadas.
Stutervant y Tan (1937) establecieron que los genes en los brazos cromosómicos
son sinténicos entre especies (sintenia = describe la co-localización de loci genéticos
sobre el mismo cromosoma de una especie. Este concepto esta relacionado con ligamiento genético).
En una muy perspicaz combinación estratégica de mapeo génico y estudios evolutivos, H.J Müller (1940) propuso que los genomas de las especie de Drosophila fueran
subdivididos en elementos homólogos representados por brazos cromosómicos. Utilizando a D. melanogaster como referencia, Müller propuso que cada uno de los cinco
brazos cromosómicos mayores más el cromosoma dot fueran designados por una nomenclatura que fuera usada para identificar los grupos de ligamiento equivalentes
(Schaeffer et al 2008).
La organización ancestral de los elementos de Müller encontrados para el subgénero Drosophila consiste en seis cromosomas acrocéntricos. Sin embargo, una variedad
de reordenamientos cromosómicos han alterado esta organización en el subgénero
Sophophora (ver FIGURA 1). Como se observa, no existe una perfecta correspondencia
entre los elementos de Müller y los brazos cromosómicos en las especies de
Drosophila, debido a que ocurrieron otros reordenamientos además de las fusiones
cromosómicas. En contraste a la fuerte conservación de la sintenía genica en
Drosophila, el orden de los genes en los brazos cromosómicos está pobremente
conservada debido a la acumulación de inversiones.
FIGURA 1. Relaciones filogenéticas entre las especies de Drosophila seleccionadas para la construcción de librerias BAC, según Schaeffer et al 2008. Se identifican las principales especies de los grupos
blanco y los dos subgeneros. Se detalla el cariotipo de cada especie según la correspondencia de los brazos cromosómicos con los elementos de Müller/SturtevantNovitski (Müller 1940, Sturtevant and Novitski, 1941).
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El análisis de las secuencias involucradas en estos reordenamientos pueden proveer de una valiosa información acerca de los mecanismos que han conducido a la reorganización de estos genomas a lo largo de su evolución.
El amplio rango de conservación del contenido génico en los elementos de
Müller es útil para asignar y organizar los scaffolds genómicos en los brazos
cromosómicos. Sin embargo, la hibridación de una secuencia de ADN marcador sobre
cromosomas politénicos es necesaria para confirmar la ubicación de secuencias sobre
los cromosomas. Mientras que lo mapas politénicos proveen de una herramienta
inmejorable para orientar los grandes scaffolds (>1Mb), los pequeños scaffolds son
difíciles de mapear de esta manera. Es así que se han desarrollado métodos
computacionales para ayudar al mapeo de estos pequeños scaffolds.
¿Que es un scaffold?
Un scaffold es una porción de la
secuencia del genoma reconstruido a partir
de clones secuenciados por la técnica de
“whole-genome shotgun”.
Los scaffolds se componen de
contigs y gaps. Un contig es una secuencia
genómica en la que se conoce el orden de
las bases con un nivel de confianza alto.
Los gaps se producen cuando la secuencia
conocida (read) de los dos extremos de por
lo menos un fragmento se superpone con
otra secuencia conocida de dos contigs diferentes. Genes de secuencia conocidas son
utilizados para organizar la localización cromosómica relativa de los scaffolds en el
genoma.
El secuenciamiento genómico y el ensamblado del genoma de 11 especies de
Drosophila provee una oportunidad de actualizar, organizar y sintetizar los mapas
genéticos y físicos de cada especie y estandarizar la calidad, presentación y
nomenclatura de cada mapa citogenético (Schaeffer et al 2008).
BIBLIOGRAFIA y material de consulta
1. A Database of Drosophila Genes & Genomes. http://flybase.org/
2. Ashburner, M. (1989). Drosophila: A Laboratory Handbook and Manual. Two
volumes. : xliii + 1331pp; 434pp.
3. Schaeffer S.W.,et al. (2008). Polytene chromosomal maps of 11 Drosophila
species: the order of genomic scaffolds inferred from genetic and physical maps.
Genetics 179: 1601-1655.
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Mapa citogenético en Drosophila
OBJETIVOS
Identificar los cromosomas politénicos en especies de Drosophila.
Aplicación de la técnica citogenética del aplastado.
Se realizará la técnica del aplastado aplicada a los cromosomas politénicos de las
glándulas salivares de D. simulans, D. ananassae y D. willistoni. (ver protocolo
“Técnica politénicos”).
ACTIVIDADES EXPERIMENTALES
Clase Práctica Politénicos I:
Introducción a la técnica de aplastado de las glándulas salivares de Drosophila.
Disección de glándulas salivares en citrato de sodio 1%.
Identificación de las glándulas y otras estructuras asociadas a la parte anterior de la
larva.
Clase Práctica Politénicos II:
Desarrollo de la Técnica del aplastado de las glándulas salivares de Drosophila.
Observación de los preparados realizados en la clase anterior. Identificación de los
cromosomas de cada especie utilizando el (fotomapa) mapa citogenético revisado según
Schaeffer et al (2008).
Observación de los cromosomas gigantes:
a) Identifique los núcleos, los cromosomas politénicos, el cromocentro y el bandeo
natural de los brazos. Considere el cariotipo presentado en la FIGURA 1.
b) Individualice los brazos cromosómicos de las especie D. simulans, D. ananasse y D.
willistoni utilizando el citomapa de referencia (según Schaeffer et al 2008). Las dos
últimas especies poseen inversiones polimórficas en las poblaciones naturales ¿que
espera observar en los cromosomas politénicos de estas especies?
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