Caracterización de bacterias con capacidad sulfato

CARACTERIZACION DE BACTERIAS CON CAPACIDAD SULFATO-REDUCTORA Y SU APLICACION EN EL
PROCESO DE BIODESULFURACION DE COMBUSTOLEO MEXICANO
Juárez Rubén, Rodríguez Abelardo, Torres Luis, Jiménez Blanca
Instituto de Ingeniería. Coordinación de Ambiental. Grupo Tratamiento y Reuso. Universidad Nacional Autónoma
de México. Apartado Postal 40-742. Coyoacán 04510. México, D.F.
RESUMEN
Los crudos y derivados que México exporta están caracterizados por su alto contenido de azufre (entre 1.5 y
4.5%), que excede los requerimientos internacionales (menos de 1%) para evitar las emisiones al aire de
bióxidos de azufre. Este hecho hace que el precio del combustóleo mexicano sea entre 35 y 40 % menor que
el de otros países con menor contenido de azufre. Una alternativa al proceso de hidrodesulfuración catalítica,
llevado a cabo en algunas refinerías para tratar petróleo y algunos derivados, es la desulfuración biológica. Un
primer paso para desarrollar este tipo de proceso es el aislamiento, caracterización e identificación de bacterias
capaces de desulfurizar petróleo y fracciones de él. En este trabajo, fueron caracterizadas 24 cepas
previamente aislados del medio ambiente de acuerdo con su capacidad para reducir sulfatos en agua y las
características de crecimiento en medio Postgate B (a diferentes valores de pH) provistas o no con
combustóleo. Algunas de las cepas resultaron con una elevada actividad sulfato reductora. El 83 % de las
cepas crecieron en presencia de combustóleo, aún cuando contiene grandes cantidades de vanadio y níquel. El
porcentaje de remoción para la mayoria de las cepas resultó mayor cuando el pH del proceso fue de 7 y el
periódo del proceso de 7 días; para las pruebas a pH 5, se encontraron mejores remociones de sulfatos al día
14.
Palabras
clave
: bacterias
atmosférica
sulfato-reductoras,
bio-desulfuración,
combustóleo,
contaminación
INTRODUCCIÓN
Los crudos y derivados que México exporta están caracterizados por su alto contenido de azufre (entre 1.5 y
4.5%), demasiado altos para satisfacer los requerimientos internacionales permitidos (menos de 1%) para las
emisiones al aire de bióxidos de azufre. Este hecho hace que el costo del combustóleo mexicano sea entre 35
y 40 % menor que el de otros países. Una alternativa a el costoso proceso de hidrodesulfuración catalítica,
llevado a cabo en algunas refinerías para tratar petróleo y algunos derivados, es la desulfuración biológica.
El desarrollo de este proceso comprende los siguientes pasos: a) preparación de la emulsión combustóleoagua, b) desarrollo del inóculo, c) proceso de biodesulfuración, d) esterilización, e) recuperación del
combustóleo y f) recuperación de azufre y subproductos, de los cuales es el aislamiento, caracterización e
identificación de microorganismos con capacidad para desulfurar petróleo y sus fracciones la etapa limitante.
Los microorganismos útiles pueden provenir de una Colección Internacional o de sitios específicos donde se
sospeche la existencia de esta clase de bacteria.
En este trabajo se caracterizaron 24 cepas anaerobias previamente aisladas del medio ambiente de acuerdo a
su capacidad para reducir sulfatos en agua así como las características de su crecimiento en medio Postgate
B (a diferentes valores de pH), provistas o no con combustóleo. Las cepas se obtuvieron de sedimentos del mar
del Golfo de Campeche y Oaxaca (Golfo de Tehuantepéc y chimeneas hidrotermales) y de un sistema
anaerobio de aguas residuales localizado en Toluca.
MATERIALES Y MÉTODOS
Las bacterias fueron almacenadas en medio API RP (Widdel and Bak, 1991) y transferidas a medio fresco cada
tres meses. La biomasa fue cultivada en medio Postgate B libre de sulfatos (Widdel and Bak, 1991) ajustada a
valores de pH de 5 y 7. La concentración del inóculo fue siempre del 5 % del volumen total. Se evaluó el
crecimiento a través de la medición de la densidad óptica (DO) a 610 nm (absorvancia) de una dilución acuosa
(1/10). Los sulfatos se midieron de acuerdo con los Standard Methods (APHA, AWWA, y WPCF, 1989). Estas
mediciones se llevaron a cabo en diferentes días de el proceso. La concentración inicial de sulfatos fue de 2.17
g/l. El combustóleo empleado en este trabajo se obtuvo de la refinería de Tula (Hidalgo) y se caracterizó
previamente de acuerdo con ASTM (Institute of Petroleum, 1970) en términos de su contenido de C, O, N, H y
S, así como Ni, K, Na, Cu, Ca, Mg, Cl-1 y V (Longoria, 1995). El crecimiento celular en presencia de
combustóleo se evaluó incorporando 1 % del combustóleo a el medio Postgate B antes de inocular la biomasa.
La actividad sulfato-reductora (ASR) se calculó como sigue:
ASR = g de sulfato removido/(volumen * tiempo de proceso)
(1)
La actividad específica se consideró como:
Act. específica = g de sulfato removido/(DO*tiempo de proceso)
(2)
RESULTADOS Y DISCUSIONES
La caracterización físico-química del combustóleo empleado se muestra en la tabla 1. El contenido de algunos
metales, como Ni, K, Na, Fe y V es bastante alta, como puede observarse. La relación C/O/N/H, así como la
capacidad calorífica son parámetros extremadamente útiles al evaluar los cambios del combustóleo después
del proceso de desulfuración.
Tabla 1. Características fisicoquímicas del combustóleo empleado en este trabajo.(Longoria, 1995).
DETERMINACIÓN
RESULTADOS
DETERMINACIÓN
RESULTADOS
CENIZAS
0.274% PESO
NÍQUEL (Ni)
5.54 ppm
CARBÓN
84.91% PESO
POTASIO (K)
4.17 ppm
NITRÓGENO
0.37% PESO
SODIO (Na)
15.45 ppm
HIDRÓGENO
10.25% PESO
HIERRO (Fe)
4.99 ppm
OXÍGENO
0.14% PESO
COBRE (Cu)
< 1.0 ppm
AZUFRE
4.33% PESO
CALCIO (Ca)
6.82 ppm
VALOR CALORÍFICO
9.63 Kcal/g
MAGNESIO (Mg)
0.55 ppm
GRAVEDAD ESPECÍFICA
0.999
CLORUROS (Cl)
0.12 ppm
TEMP. DE IGNICIÓN
197oC
VANADIO (V)
311 ppm
El crecimiento celular se midió como el incremento en la densidad óptica (DO) de las cepas a pH 5 y 7 durante
14 días (no se muestran datos). Los niveles de biomasa más altos fueron alcanzados indistintamente a 14 días
para el pH 7 y, 5 días para el pH 5. Los niveles de biomasa (densidad óptica entre paréntesis) más altos se
alcanzaron para las cepas número 12 (0.208), 22 (0.238), 17 (0.195) y 8 (0.185), siempre al quinto día. Al
contrario, las cepas con mejor crecimiento celular a pH 7 fueron la 3 (0.868), 4 (0.635), 14 (0.377), 6 (0.372) y
23 (0.346), siempre al día 14. Algunas cepas mostraron remarcado desarrollo, tales como la 5, 23, 22, 8 y 7,
con valores de remoción de 92.8, 87.3, 79.6, 65.0 y 61.0 % (al 14o día; pH 7). Las mismas cepas disminuyeron
el sulfato inicial en cantidades tal altas como 8.63, 5.03, 6.36, 11.67 y 10.9 % (al 7o día) y 9.6, 20, 13.56, 12.5
y 14.2 (al 14o día) cuando el pH fue de 5. Las mejores cepas trabajando a pH 5 resultaron ser las cepas 9 (60.4
%), 6 (54.4 %), 12 (23.23 %) y 15 (21.43 %).
La remoción del sulfato por las 24 cepas anóxicas a pH 5 (para el 5o y 14o día) y a pH 7 (para el 7o y 14o día) se
muestran en la figura 1. Como puede observarse, el porcentaje de remoción para la totalidad del grupo de cepas
resultó consistentemente más alto cuando el pH del proceso fue de 7. Los valores de remoción más altos se
encontraron al 7o día para la mayoría de los experimentos a pH 7, pero un comportamiento contrario fue
observado cuando se trabajó a pH 5; es decir, que se presentó una mejor remoción de sulfatos al día 14,
siendo menor las remociones del día 5. Este hecho implica que será más conveniente trabajar a pH 7 en el
proceso industrial.
100
90
pH 5 5° día
80
pH 5 14° día
pH 7 7° día
pH 7 14°día
70
% de remoción
60
50
40
30
20
10
0
cepas
Fig. 1. Capacidades remoción de sulfatos de las cepas trabajadas
En cuanto a la actividad sulfato reductora (figura 2), el desarrollo de las diferentes cepas anóxicas fue como
sigue: a pH 5, día 5; las ASR logradas por las cepas variaron en el intervalo de 8.43 x 10-4 a 2.30 x 10-3 g de
sulfato/l * h, correspondiendo a las cepas 19 y 21, respectivamente. A pH 7, día 7; las ASR fueron tan grandes
como 1.47 x10-3 a 1.2 x 10-2 g de sulfato/l * h para las cepas 17 y 5, respectivamente. Otras cepas interesantes
son la 8, 14 y 24 (a pH 5) así como 8, 22 y 23 (a pH 7) porque se encuentran dentro de los mejores resultados
obtenidos de actividad sulfato reductora.
0.006
0.01
0.005
0.008
0.004
0.006
0.003
0.004
0.002
0.002
0.001
0
Actividad Especifica g SO4/D.O. x·h
Actividad Volumétrica g SO4/·L-x h
0.012
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
cepas
A.Vol pH 5
A.Vol pH 7
A. Esp. pH 5
A. Esp. pH 7
Fig. 2. Actividades sulfato reductoras y específicas de las cepas a pH 5 y 7
En cuanto a la actividad específica, la cual es un parámetro arbitrario para tomar en cuenta la velocidad del
crecimiento celular así como las capacidades de la sulfato-reducción, la tendencia fue como sigue: Cuando el
pH del proceso fue de 5 (5o día), las actividades específicas fueron 9.67 x 10-5 a 6.34 x 10-4 g de sulfato/DO * h,
para las cepas 22 y 14, respectivamente. Cuando el pH del proceso fue 7 (14o día), las actividades específicas
fueron 8.84 x 10-5 a 9.20 x 10-4 g de sulfato/DO * h, para las cepas 1 y 18, respectivamente. Otras cepas con
potencial de aplicación son 4, 16 y 21 (a pH 5), así como 5, 9, 16 y 24 (a pH 7), pues sus actividades
específicas se presentan como las más altas, en comparación con las de las demás cepas.
Las pruebas para crecimiento en presencia de combustóleo demostró que 20 de las 24 cepas fueron capaces
de crecer en presencia de 1 % de combustóleo. Las cepas que no presentaron esta capacidad bajo ciertas
condiciones de cultivo fueron las cepas etiquetadas como 17, 18 y 20 (procedente del reactor anaerobio,
Toluca) y 19 (de sedimentos del mar, Campeche). Es interesante notar que tres de las cuatro cepas vienen del
sistema anaerobio de aguas residuales. El resto de las bacterias se aislaron de sedimentos del mar en lugares
localizados cerca de características de explotación de hidrocarburos. Este hecho indica el contacto previo
entre las cepas y los hidrocarburos. Se observó una fragmentación en pequeños goteos debido a la actividad
bacteriana durante el cultivo en presencia de aceites pesados. Aún cuando no fue evaluada la remoción de
azufre en esta prueba, es interesante remarcar la reacción bacterial a través de la presencia de combustóleo.
Algunos microorganismos han demostrado producir emulsificadores, los cuales son extremadamente útiles
para el proceso del hidrocarburo en general. Singh y colaboradores por ejemplo (Singh et al., 1990) reportaron
la producción de bioemulsificadores por una cepa Cándida tropicalis durante la fermentación del hidrocarburo.
Nuestros resultados serán tema de estudios posteriores.
RECONOCIMIENTOS
Este trabajo fue financiado por la Dirección General de Asuntos del Personal Académico, proyecto IN-100594 y
el Programa Universitario del Medio Ambiente UNAM. Las cepas fueron amablemente proporcionadas por el Dr.
Jorge Romero del Intituto de Ciencias del Mar y Limnología UNAM.
Tabla 2. Actividad específica de las cepas a pH 5 y 7
5° día
CEPA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
pH 5
gSO4/DO
2.78E-03
1.93E-03
2.37E-03
6.48E-03
4.72E-03
4.58E-03
1.82E-03
1.73E-03
2.12E-03
1.90E-03
1.82E-03
1.56E-03
2.64E-03
4.39E-03
2.88E-03
4.91E-03
1.70E-03
5.09E-03
2.76E-03
2.27E-03
3.33E-03
1.42E-03
3.74E-03
3.06E-03
14° día
h
1.12E-03
5.18E-03
2.38E-03
5.58E-04
1.30E-03
8.58E-04
8.84E-04
1.05E-03
4.21E-04
9.52E-04
1.06E-03
8.90E-04
1.40E-03
9.75E-04
8.75E-04
1.08E-03
7.47E-04
1.50E-03
8.68E-04
9.96E-04
1.34E-03
6.99E-04
1.08E-03
9.48E-04
REFERENCIAS
7° día
14° día
pH 7
gSO4/DO h
8.84E-05
1.51E-04
3.99E-04
1.94E-04
1.63E-04
2.22E-05
1.54E-04
5.73E-05
7.79E-04
3.71E-04
2.81E-04
1.07E-04
5.30E-04
2.20E-04
6.83E-04
3.38E-04
7.35E-04
2.27E-04
5.53E-04
1.22E-04
3.37E-04
1.27E-04
4.67E-04
1.30E-04
3.47E-04
8.87E-05
3.47E-04
1.13E-04
5.38E-04
2.70E-04
7.65E-04
2.08E-04
5.16E-04
7.01E-04
9.20E-04
5.79E-04
4.79E-04
1.58E-04
4.18E-04
2.39E-04
3.06E-04
1.16E-04
5.59E-04
2.20E-04
7.26E-04
3.17E-04
8.23E-04
1.56E-04
APHA, AWWA and WPCF (1989). Standard Methods para la examinación de agua y aguas residuales. 17th.
Edition. Washington DC.
Longoria R: (1995), Comunicación Personal. Reporte del análisis de una muestra de combustóleo proveniente
de la refinería de Tula, Hidalgo. Instituto de Investigaciones Eléctricas. México.
Singh M., V. Saini, D. Adhikari, J. Desai and V. Sista (1990) Production of bio-emulsifier by a SCP-producing
strain of Cándida tropicalis during hydrocarbon fermentation. Biotechnology Letters. 12(10), 743-746.
The Institute of Petroleum (1970) IP Standards for petroleum and its products. 29th,. Edit. The Elsevier
Publishing Co. United States of America.
Widdel F. and F. Bak (1991) Gram-negative mesophilic sulphate-reducing bacteria. In: The Prokaryotes: A
handbook on the Biology of Bacteria. Balows, Trouper, Dworki, Harder and Schleifer (Edits). Pp 3352-3377