Transición Epitelial-Mesenquimal (EMT) en Cáncer Mamario

Transición Epitelial-Mesenquimal (EMT) en Cáncer Mamario
Alejandro Cervantes Arias, David J. Argyle
University of Edinburgh, The Roslin Institute
Estudiante de Doctorado
Introducción
La Transición Epitelial-Mesenquimal (EMT) es un proceso presente durante la
embriogénesis, carcinogénesis, metástasis y recurrencia tumoral. Durante este proceso, las
células epiteliales pierden sus características y adquieren propiedades mesenquimales: pérdida de
adhesión celular, aumento en movilidad e invasividad, resistencia a apoptosis, y cambios
morfológicos. Este complejo proceso involucra diversos factores de transcripción y posteriores
objetivos transcripcionales epiteliales y mesenquimales, incluyendo E-Cadherina, -catenina,
Fibronectina, y Vimentina. Particularmente, la vía de señalización del Factor de Crecimiento
Transformante beta (TGF-B) es crucial para la inducción de la EMT, durante la cual las células
de cáncer mamario pueden adquirir características de célula madre (célula troncal). Mi proyecto
de investigación se ha basado en la evaluación del TGF-B como promotor del proceso de EMT
durante la metástasis en carcinoma mamario de HUMANOS, perros y gatos. Además, hemos
trabajado investigando un posible vínculo entre la EMT y la teoría de las células madre de cáncer
a través del tratamiento celular con TGF-B.
EMT
Polaridad
arriba-abajo
Células epiteliales
Epitelio (nicho)
Células
mesenquimales
Polaridad
frente-atrás
Vaso sanguíneo
MET
Polaridad
frente-atrás
Polaridad
arriba-abajo
Epitelio (nicho)
Objetivos:
Hemos demostrado que el TGF-B puede inducir EMT en células de carcinoma mamario
de humanos, perros y gatos, y aparentemente también permite que las células adquieran
características de célula madre; como resistencia a la apoptosis y auto-renovación. Si logramos
confirmar esto, el TGF-B puede ser un blanco para bloquear la EMT durante el progreso del
cáncer y así, desarrollar una potencial cura.
Resultados:
Las células estimuladas con TGF-B mostraron morfología mesenquimal (forma alargada) y
un visible incremento en marcadores mesenquimales y factores de transcripción así como una
disminución en marcadores epiteliales confirmado por análisis de Western Blot. También
mostraron mayor habilidad de invasión en ensayos de cierre de herida. Las células estimuladas
migraron mas rápido que las no estimuladas, colonizando así la herida. Además, la habilidad
para formar mamo-esferas (las cuales son representativas de células madre de cáncer) fue mayor
en células estimuladas, mostrando a su vez incremento en marcadores mesenquimales,
sugiriendo un vínculo entre la EMT y las células madre de cáncer. Se llevaron a cabo estudios de
expresión de proteína mediante los cuales confirmamos que las células estimuladas expresan
marcadores mesenquimales en mayor proporción que las no estimuladas.
Finalmente, células estimuladas y no estimuladas fueron clasificadas en CD133+ y
CD133- (CD133 es un marcador de células madre) para así poder evaluar su respuesta a agentes
quimioterapéuticos. Las células fueron expuestas a diferentes concentraciones de los
quimioterapéuticos Doxorubicina y Mitoxantrona, donde se pudo observar que en las células
clasificadas como CD133-, las estimuladas con TGF-B mostraron mayor resistencia.
Cambios morfológicos:
Se observaron cambios en morfología celular en líneas celulares de carcinoma mamario
de perros (REM), gatos (CMC) y humanos (MCF7), en donde las células sin tratamiento
permanecían con morfología epitelial mientras las células tratadas con TGF-B a 10ng/ml
mostraron morfología mesenquimal (forma alargada y pérdida de contacto celular), lo cual puede
ser el primer paso de invasión y metástasis en células cancerosas.
Grupo control (MCF7)
MCF7 + TGF
Formación de mamo-esferas:
Las células tratadas pudieron formar de manera más fácil y rápida células esferoidales en un
medio de cultivo sin suero y con bajos niveles de glucosa en recipientes de baja adherencia a una
densidad baja. Estas esferas son representativas de células madre de cáncer.
REM
CMC
MCF7
Cambios a nivel molecular:
Se realizaron estudios de expresión de proteínas por medio de análisis de Western Blot, en donde
se pudo confirmar que las células tratadas expresaban marcadores mesenquimales en mayor
proporción comparadas con las células no tratadas. Así mismo, los marcadores epiteliales se vieron
reducidos significativamente en las células estimuladas con TGF- .
Ensayo de cierre de herida:
Posterior a realizar una “herida” con una punta de pipeta de 200 µl en pozos cubiertos por
células, se compararon las distancias relativas de migración, en donde pudimos observar que las
células tratadas con TGF- cerraron la herida más rápido que las células no tratadas, dando a entender
que su respuesta migratoria es mejor. Tanto las células de carcinoma mamario canino como las de
carcinoma mamario felino que fueron estimuladas con TGF-
migraron más rápido que las no
estimuladas. Para calcular el porcentaje de la distancia relativa de migración se utilizó esta fórmula:
% = 100 (A-B) /A, en donde A = ancho de herida antes de incubación y B = ancho de herida después
de incubación.
Ensayo de quimio-sensibilidad:
Previamente se separaron las células CD133+ y CD133- (CD133 es un marcador de células
madre) para evaluar la respuesta a quimioterapia de células que supuestamente deben ser mas
resistentes. Se sometieron las células a diferentes concentraciones de los agentes quimioterapéuticos
Doxorubicina y Mitoxantrona, en donde se observo que entre las células CD133-, las tratadas con
TGF- mostraron más resistencia que las no tratadas.
Conclusiones
Estos datos confirmaron que durante la EMT, las células de carcinoma mamario adquieren
características de células madre mediante TGF-B, sugiriendo que la EMT y el fenotipo de célula
madre están estrechamente relacionados durante la migración celular y metástasis. Estos hallazgos
indican que la vía del TGF-B puede ser un blanco importante para el desarrollo de terapias nuevas
contra el cáncer y su progreso.
A
B
Perspectivas:
• Interferencia de ARN por medio de siRNA de ciertos genes como Tribbles1,
posiblemente involucrados en este proceso.
• Ensayos de invasión celular in vitro.
• Ensayos de invasión celular in vivo utilizando la membrana corio-alantoidea de
embriones de pollo como modelo (membrana con alto número de vasos sanguíneos).