Biología molecular aplicada a inmunohematología

Métodos moleculares en la
identificación eritrocitaria
Dr. Higinio Estrada Juárez
Investigador en Ciencias Médicas
Hematología Perinatal
“Prevenir en un porcentaje significativo la aloinmunización
potencialmente fatal en los receptores de transfusiones requiere una
evaluación de los sistemas de grupos sanguíneos ABO y RhD. Siendo,
los sistemas Kell, Kidd, y Duffy los clínicamente más significativos “
Dr. Christoph Gassner, investigador principal del estudio publicado en Transfusion y Jefe de
Investigación y Desarrollo del Servicio de Transfusión Sanguínea de la Cruz Roja en Zurich, Suiza.
Criterios que definen un grupos sanguíneos
• El antígeno debe ser definido por un aloanticuerpo humano
• El antígeno debe ser un carácter heredado
• El gen que codifica debe haber sido identificado y secuenciado
• Debe conocerse su localización cromosómica
• El gen debe ser diferente y no un homólogo estrechamente
relacionado a los otros genes que codifican antígenos de grupos
sanguíneos de los sistemas existentes.
Sistemas de grupos sanguíneos
Sistema
Alelos
Ag
Alelos
Ag
Alelos
Ag
ABO
346
4
013 Scianna
9
7
025 Raph
4
1
002 MNS
51
48
014 Dombrock
20
9
026 John Milton Hagen
12
6
003 PPK
65
3
015 Colton
12
4
027 I
13
1
Rh
132,290
56
016 LW
10
3
028 Glob
13
2
005 Lutheran
20
21
017 Chido/Rodgers
3,4
9
029 Gil
8
1
006 Kell
83
35
018 H
120
1
030 RhAg
26
4
007 Lewis
53,20,2
6
019 Xk
35
1
031 FORS
2
1
008 Duffy
13
5
020 Gerbich
10
11
032 Junior
25
1
009 Kidd
36
3
021 Cromer
15
18
033 Langereis
42
1
010 Diego
91
22
022 Knops
35
9
034 Vel
4
1
011 Cartwrigth
4
2
023 Indian
4
4
35 CD59
012 Xg
2
2
024 Ok
5
3
036 V A C A N T E
001
004
Sistema
Sistema
NCBI dbRBC 27 Marzo 2015
Página web The ISBT Working Party for Red Cell Immunogenetics and Blood Group Terminology
1
Los grupos sanguíneos humanos
Hasta la década de 1990, el
diagnóstico y tipificación de sangre
dependían enteramente de técnicas
serológicas.
Durante más de un siglo, la
aglutinación ha sido el estándar de oro
para la detección de antígenos
eritrocitarios (RBC) y se utiliza en todos
los servicios de medicina transfusional.
Introducción
La reacción entre los antígenos eritrocitarios y los anticuerpos (suero/plasma de pacientes o reactivos
comerciales) es la base de las técnicas en inmunohematología:
•
Determinación de grupo ABO, Rh.
•
Determinación de antígenos de significancia clínica (Kell, MNS, Kidd, Duffy)
•
Detección de anticuerpos irregulares.
•
Pruebas de compatibilidad.
Limitaciones:
•
Fenotipo de pacientes politransfundidos.
•
Fenotipo de pacientes con GR recubiertos de Ig.
•
Identificación de variantes.
•
Discrepancias.
•
Falta de reactivos para detección de algunos antígenos.
•
Dificultad para crear paneles de detección e identificación de anticuerpos irregulares.
Introducción
• Las técnicas que involucran al ADN han llevado a
entender las bases moleculares de los sistemas
sanguíneos.
• Los eventos moleculares llevan a la formación de
antígenos distintos, y por ende, fenotipos
distintos.
• La mayoría son consecuencia de SNPs.
Las técnicas moleculares aprovechan esto para la Genotipificación
Utilidades
Donadores
• Para posibles
transfusiones de
concentrados
eritrocitarios
(búsqueda de
unidades antígeno
negativos).
• Para crear paneles
de células para
búsqueda de
anticuerpos
irregulares.
Resolución de
discrepancias
• D variantes
• Discrepancias ABO
Materno-fetal
• Para prevención de
EHRN (por
incompatibilidad
Rh).
• DNA fetal se puede
obtener a partir de
células amnióticas,
muestras de
vellosidades
coriónicas y de
plasma materno.
Rh
SC
FY
CROM
KN
I
CH/RG
RHAG
Sistema ABO
primer marcador
genético utilizado
GE
CO
YT
KEL
GLOB
RAPH
IN
GIL
AB0
DI
JMH
LE
OK
LW
LU
H
MNS
P1
XG
XK
DO
JK
Los antígenos de los grupos sanguíneos . .
son productos génicos!!!
Los antígenos son proteínas que están
codificados directamente por los genes
Los carbohidratos de los son antígenos
son controlados por los genes que
codifican glicosiltransferasas
Los polimorfismos de GS son definidos
genéticamente
Todos los genes ya han sido
secuenciados
Mecanismos moleculares de diversidad de los
grupos sanguíneos
Mecanismo molecular
Ejemplo
Polimorfismo de un solo nucleótido
• La mayoría de los grupos sanguíneos.
• T>C en GATA del gen FY (Fya-b-).
• ag>aa en el fenotipo Jka-b-.
Deleción
• RhD negativo por este mecanismo.
• Exón 2 del GYPC en el fenotipo Yus.
• RhD negativo 711Cdel.
Inserción
• RhD negativo por psudogen RHDΨ 37pb.
• Duplicación del exon 3 del GYPC en Lsa+.
• 798-804Gins del ABO que produce Ael.
Exón alternativo
• Exón 1 en individuos I negativo.
Eventos de conversión o recombinación
génica
• Muchos genes híbridos de los sistemas MNS y
Rh.
Ausencia o alteración de la interacción
requerida entre proteínas.
Presencia de genes modificadores
• RhAg en Rh nulo tipo regulador y tipo mod.
• In (Lu) en Lua-b- dominante.
Storry JR. BJH 2004;759-71, Daniels G Transplant Immunol 2005;14:143-53, Reid MD 2008; Immunohematol 24(4):166-9
Métodos moleculares para la genotipificación de grupos
sanguíneos
Rendimiento
Tecnología
Bajo




PCR punto final.
PCR-RFLP.
PCR-SSP.
PCR multiplex.
Mediano





PCR en tiempo real
Secuenciación Sanger y sus modificaciones.
BeadChip
Luminex XMAP
MLPA (Multiplex Ligation-depent Probe Amplification)
Alto






BloodChip
Taqman open Arrays.
Genome Lab SNP Stream,
Minisecuenciación (SNaPshot assays).
MALDI-TOF MS.
Secuenciación masiva.
Monteiro F y cols. 2011, ISBT Sc Ser 6:1-6
PCR Alelo Específico
• Uso de primers de secuencia específica.
• Permite la amplificación de secuencias específicas
para identificar distintos alelos de un gen.
Mixes de reacción
pre-alicuotados
basados en PCR –
(Sequence Specific
Primers: SSP).
Genotipificación
rápida.
Complemento a
tipificación
serológica.
J. of Mol Diag, 12:4 2010
Ensayos basados en PCR clásica (bajo rendimiento)
PCR-RFLP
AS-PCR o PCR-SSP
Multiplex PCR
Sin embargo . . .
Los ensayos basados en la PCR son propensos a diferentes tipos de
errores. Por ejemplo, la contaminación por la amplificación de
productos inespecíficos puede dar lugar a resultados falsos positivos.
Se menciona que la identificación de un genotipo particular no significa
necesariamente que el antígeno se expresa en la membrana de RBC.
Ensayos de mediano rendimiento
Real time PCR
• Variante de la PCR convencional en la cual se puede cuantificar el producto
simultáneamente a su amplificación (Detección en tiempo real del producto).
• Se distinguen entre sí por el método de
detección:
• Fluorocromo no específico.
• SYBR Green (se une a cualquier molécula
de ADN).
• Fluorocromo específico (sonda):
• Sondas TaqMan
• Sondas Molecular Beacons
• Sondas Scorpion
• Se cuantifica la fluorescencia emitida
Secuenciación tipo Sanger
¿Cuándo secuenciar?
Serología
Genotipificación
Secuenciación
MLPA
Ensayos de alto rendimiento
Ensayos de alto rendimiento
• Microarray
• BeadChip array
• BloodChip
• Genome Lab SNP stream
• Fluidic microarray systems (Luminex XMAP)
• TaqMan OpenArray
• MALDI-TOF MS (matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry)
• Mini-sequencing
Microarreglos
• Un micorarray de ADN permite llevar a cabo un
experimento sobre miles de genes al mismo tiempo.
• Cada punto en un microarray contiene múltiples hebras
idénticas de ADN.
• La secuencia de ADN en cada punto es único.
• Cada punto representa un gen.
• Miles de puntos están dispuestos en filas y columnas
ordenadas en una superficie sólida (por lo general vidrio).
• La ubicación exacta y la secuencia de cada punto se
registra en una base de datos informática.
• Los microarrays pueden ser del tamaño de un
portaobjetos de microscopio, o incluso más pequeño.
Genotipificación de 29
polimorfismos (37 fenotipos)
Rh, Kell, Kidd, Duffy, MNS, Diego,
Dombrock, Colton, Cartwright, y
Lutheran
Detecta 24 polimorfismos,
asociados a 38 variantes de
antígenos y fenotipos en un único
ensayo.
Microarrays
• Chip de DNA: Son una colección de sets de fragmentos de ADN
adheridas de forma ordenada a una superficie sólida.
• Para genotipificar múltiples regiones del genoma simultáneamente.
• Se basa en la capacidad de los ácidos nucleicos de hibridar con su
complementario.
• Detección: marcaje de la muestra con fluorocromos, plata o
quimioluminiscencia.
• Análisis de datos: bioinformática. Softwares especializados para cada
chip con bases de datos para generar los genotipos.
Microarrays
• En una misma prueba genera sobre 3000 resultados.
• Se basa en la detección de SNPs.
• El DNA genómico target aislado de sangre total se amplifica, se
captura y se marca con fluorescencia por elongación en sondas alelo
específicas inmovilizadas en micropartículas sintéticas. La
fluorescencia de cada perla se analiza en el Array Imaging System
(AIS). El software BioArray Solutions Information System (BASIS)
calcula y ajusta la intensidad de cada reacción para asignar un
genotipo y predecir un fenotipo para cada polimorfismo.
ADN array -Chips
• Gran número de muestras (buena plataforma para los donantes de
sangre)
• PCR multiplex
• Análisis rápido y automático pós-PCR para numerosos polimorfismos
de sangre
• Sistema cerrado para evitar la contaminación
• Análisis computarizado de los resultados
• Realiza las interpretaciones a partir de una base de datos
Conclusiones
• La existencia de las técnicas moleculares facilita la resolución de problemas
que no pueden ser resueltos con la hemaglutinación.
• Reactividad débil de algunos reactivos para ciertos antígenos.
• Tipificación de pacientes con transfusiones recientes.
• Identificación de riesgo de EHRN.
• Aumentar la fiabilidad de unidades antígeno negativos para transfusión.
• Llegar a un genotipo no significa necesariamente que el antígeno se va a
expresar en el GR.
• La mayoría de estas técnicas son muy costosas, por lo cual el enfoque que
se está dando en los estudios es la creación de algoritmos de identificación
para disminuir costos, manteniendo la calidad.
• How do we identify RHD variants using a practical molecular
approach? Revista Transfusion, volumen Importancia: • Prevenir la
aloinmunización en receptores. Receptor D parcial Tipificado Rh+
(Sueros clasificadores) Transfusión con Rh+ 54, Abril de 2014.
Formación de anti-D Donante D débil Tipificado Rh- (Sueros
clasificadores) Transfundido a receptor Rh- Formación de anti-D
• Free DNA Fetal Kit® RhD
SNPs (mutaciones puntuales missenses)
• AAGTCAGCTGGACTTCGAAGATGTATGGAATTCTTCCTATGGTGTGAATGATTCCTTCCCAGATGGA
GACTATGATCCAACCTGGAAGCAGCTGCCCCCTGCCACTCCTGTAACCTG
(FY B) A (Asp42)
(FY A) G (Gly42)
• RH: C/c (Ser103Pro); E/e (Pro226Ala)
• MNS: S/s
• Kell: K/k, Kpa /Kpb , Jsa/Jsb
• Diego: Dia /Dib
• Duffy: Fya/Fyb
• Kidd: Jka/Jkb
• Lutheran: Lua/Lub
• Dombrock: Doa /Dob
Tipos arrays genotipificacion
BLOODchip®
http://www.progenika.com/nort
h_america/index.php?option=co
m_content&task=view&id=317&I
temid=383
BioArray HEA BeadChip
http://www.immucor.com/Globa
l/Products/Pages/Red-CellGenotyping.aspx