Nivel de contaminación con Salmonella en harinas de carne y

Rev. Med. Vet. (Bs As) Vol 69(4):194-200, 1988.
Nivel de contaminación con Salmonella en harinas de carne y hueso
1
Comparación de métodos y propuesta de muestreo
P. lsequilla*, J. Lasta**, Silvia Michanie*** y F. Quevedo****
Palabras clave: Harinas, carne, hueso, aislamiento, salmonelosis.
Realizado en el Laboratorio de Alimentos del Centro Panamericano de Zoonosis, OPS/OMS, y en el Laboratorio de
Tecnología de Alimentos de la Facultad de Ciencias Veterinarias, Univ. Nac. de La Plata.
*Servicio Nacional de Sanidad Animal. Secr. de Agric.,Ganad. y Pesca Paseo Colón 922. Vet. en Salud Pública, Fac. de
Ciencias Veterinarias, UBA.
**Dep. de Tecnología de Carnes, Centro de Investigaciones en Ciencias Veterinarias, INTA, C.C. 77 - 1708 Morón - Pcia.
Bs. As.
***Protección de Alimentos, Centro Panamericano de Zoonosis, Organización Panamericana de la Salud, C.C. 3092. 1000
Correo Central, Bs. As.
**** Programa de Salud Pública Veterinaria, Organización Panamericana de la Salud, Organización Mundial de la Salud,
525 Twenty-third St., N.W., Washington, D.C. 20037, EE.UU.
Resumen
Las harinas de carne y hueso, al ser utilizadas como componentes de raciones animales, pueden ser fuente de
salmonelosis de los animales y, en forma indirecta, en los humanos. En este estudio se compararon diversas
metodologías para la búsqueda de Salmonella en las harinas de carne y hueso: un método tradicional con dos rápidos,
combinación de las muestras en húmedo y en seco. No se encontraron diferencias significativas entro el método
tradicional y el de combinación húmeda. Asimismo, no se encontró correlación entro el pH y la humedad de las harinas
con el aislamiento de Salmonella por los tres métodos utilizados. Se aisló Salmonella en el 69% de los lotes analizados.
Para el control de Salmonella en estos productos se sugiere un plan de muestreo de 2 clases, donde n = 5 y c = 2.
Key words: Bone-meat mea¡, isolation, salmonellosis.
Summary
Simplified methods for detecting Salmonella in bone-meat meal
Bone-meat meal used in animal feeds can be a source of salmonellosis in animals and an indirect cause of the disease in
man. Traditional methods for detecting Salmonella in bone-meat meals were compared with two simplified techniques in
which humid or dry compositing samples were used. No significant differences were observed between the traditional
methods and that with humid compositing samples. Also, the three methods showed no correlation between the pH and
humidity of the meals and the isolation of Salmonella. Salmonella were isolated in 69% of the batches analyzed. A
two-class sampling plan in which n = 5 and c = 2 is suggested for detecting Salmonella from these products.
Introducción
Las harinas de carne y hueso, gracias a su elevado contenido en proteínas de alto valor biológico, son muy utilizadas en
la preparación de raciones destinadas a la alimentación animal. Las materias primas empleadas para la obtención de
estos subproductos son sometidas a un proceso térmico que es suficiente para destruir las formas vegetativas de los
microorganismos presentes en ellas. Sin embargo, en algunos establecimientos las harinas son almacenadas a granel y
sin ninguna protección, procedimiento que permite la recontaminación con diversas bacterias y especialmente con
Salmonella, por medio de insectos (8), roedores, gorriones (9), manipuladores (10), aerosoles (7); esto explica porqué con
gran frecuencia se informa acerca de la contaminación de estos. productos y además, se los señala como vehículo de
infecciones en los animales y en forma indirecta, como fuente de enfermedades transmitidas por alimentos a humanos
(4).
Algunos países han establecido especificaciones microbiológicas exigentes para la importación de harinas, entre las
cuales se encuentra la ausencia de Salmonella, mientras otros reprocesan en el puerto de entrada el producto para
destruir esta bacteria. Para la República Argentina la exportación de harinas de carne y hueso constituye una importante
fuente de divisas (Cuadro l). En varias oportunidades, sin embargo, el país ha tenido dificultades en la comercialización
de este producto debido al hallazgo de Salmonella por alguno de los países importadores.
Por su parte, los laboratorios de la industria privada y los ofíciales deben efectuar los análisis correspondientes, en
especial los conducentes a detectar Salmonella. El tiempo que insume su realización, el alto costo y el elevado número de
unidades analíticas que deben ser estudiadas constituyen importantes problemas. Por esto, se han propuesto diversos
métodos para obviar esos inconvenientes; entre ellos se encuentran los llamados de combinación húmeda y de
combinación seca de las muestras (13), que reducen considerablemente el número de unidades analíticas a estudiar,
disminuyendo el tiempo, el trabajo y el costo de los análisis,
Este estudio tuvo por objeto: 1) comparar los métodos rápidos de combinación de muestras en húmedo y en seco con los
métodos tradicionales para la búsqueda de Salmonella; 2) determinar el grado de contaminación con Salmonella en las
harinas de carne y hueso; 3) determinar los serovares de salmonelas y su sensibilidad frente a los principales antibióticos
y 4) elaborar una propuesta de plan de muestreo.
© Isequilla, Lasta, Michanie y Quevedo. Todos los derechos reservados.
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Materiales y Métodos
Muestreo
Las muestras de harinas de carne y hueso se tomaron en 5 establecimientos del Gran Buenos Aires. Se recogieron de
bolsas cerradas por medio de utensilios estériles muestras de ca. 500 g y se colocaron en bolsas nuevas de polietileno.
Se tomaron 130 unidades de muestra de 13 lotes, a razón de 10 unidades de muestra por lote (5). Las harinas estudiadas
contenían entre 40 y 65% de proteínas.
1. Determinación de pH
Por medio de un potenciómetro se midió el pH a una suspensión acuosa de harinas al 10%
2. Determinación de humedad
Se determinó la humedad sobre l0 g de muestra hasta peso constante, con un equipo Ultra X-UX70.
3. Determinación de la actividad acuosa
Se calculó la actividad del agua (aw) sólo en los lotes 6, 9, y 10, utilizando un higrómetro de punto de rocío YSI modelo 91
4. InvestIgacion de Salmonella
Método Tradicional (MT)
Por este método se analizó el total de las 130 unidades de muestra en forma individual. El pre-enriquecimiento no
selectivo de 25 g (o unidad analítica de muestra) en 225 mi de caldo lactosado se incubó por 18-24 horas a 32 ºC y fue
seguido por enriquecimientos selectivos en tetrationato y en selenito cistina, según los métodos recomendados por
ICMSF (6, pero incubados hasta 48 horas (2).
Para el aislamiento selectivo realizado a las 24 y 48 horas se empleó agar de verde brillante (DIFCO) y agar de xilosa
lisina desoxicolato (DIFCO), por triplicado. Un mínimo de tres colonias presuntivas de Salmonella por placa fueron
caracterizadas bioquímicamente por medio de 12 pruebas (6).
La confirmación serológica se realizó con “Salmonella O Antiserum Poly A1 " (DIFCO), las cepas confirmadas se
remitieron al Instituto Nacional de Microbiología "Carlos G. Malbrán", Buenos Aires, Argentina, para la serotipificación.
Métodos Rápidos
Combinación Húmeda (CH)
En este método (13) 25 g de cada una de las 130 unidades de muestra fueron individualmente pre-enriquecidas en 225
ml de caldo lactosado. Luego de incubación por una noche a 32 ºC se tomó 1 ml de cada uno de los pre-enriquecimientos
correspondientes al mismo lote y se transfirieron a un único frasco conteniendo 100 ml de caldo de tetrationato; se realizó
igual procedimiento sembrando en caldo de selenito cistina. El aislamiento y confirmación de Salmonella se continúo
como se indicó para el método tradicional.
* La referencia a nombres comerciales no representa recomendación por parte de las Instituciones auspiciantes ni de los
autores.
Combinación Seca (CS)
Este método (3, 13) consistió en tomar 25 g de cada una de las 10 unidades de muestra provenientes de un mismo lote;
los 250 g resultantes se mezclaron en un homogeneizador estéril, cuyas cuchillas reemplazadas por paletas, permitieron
una rápida y eficaz homogeneización. Se sembraron 25 g de esta mezcla en 225 ml de caldo de lactosa incubándose a 32
ºC por 18 -24 horas. El enriquecimiento selectivo se realizó sembrando 1 ml de caldo de lactosa en 30 ml de caldo de
tetrationato y en igual volumen de caldo de selenito cistina, respectivamente. Para el aislamiento y confirmación de
Salmonella se procedió como se indicó en el método tradicional..
5. Antibiogramas
Se estudió la sensibilidad de 62 cepas de Salmonella serotipificadas aisladas de las harinas de carne y hueso mediante la
técnica de Bauer y col. (1). Las concentraciones de antibióticos en los discos utilizados (DIFCO) expresadas en g fueron:
Colistina 5, Triple Sulfas 150, Ampicilina 10, Cloramfenicol l0, Kanamicina 10, Tetraciclina 10, y Estreptomicina 5.
6. Análisis estadístico
Los resultados se analizaron por las pruebas de correlación (12).
Resultados
En el cuadro 2 se presentan las características y los resultados de los lotes estudiados.
Los valores de aw calculados en los 3 lotes referidos presentaron promedios de 0.59, 0.58 y 0.71, respectivamente.
Tanto los valores de pH como los de humedad mostraron poca variación; no se encontró correlación entre ellos y el
aislamiento de Salmonella por ninguno de los tres métodos usados.
En el 69% de los lotes se aisló Salmonella. Con el método tradicional los análisis revelaron 9 lotes contaminados con
Salmonella del total de 13 estudiados, mientras la combinación húmeda y la combinación seca fueron positivas para 7 y 2
lotes, respectivamente (Cuadro 2). Para conocer la significación de estas diferencias se aplicó la técnica de
chicuadrado, por la que se encontraron diferencias significativas (p<0.05) de los métodos tradicionales y húmedo con
respecto al método de combinación seca.
Se aislaron 149 cepas de Salmonella, de las cuales 62 fueron serotipificadas. Los serovares fueron en orden decreciente:
12 (19,3%) anatum; 11 (17,4 %) S. cubana; 9 (14,5 %) S. typhimurium; 8 (12,9%) S. livingstone;7 (11,3% ) S. bredeney; 4
(6,4%) S. agona y S. rnontevideo, cada uno; 2 (3,2%) S. minesotta, S. ohio y S. oranienburg, cada uno; y 1 (1,6% ) S.
newport. Estas 62 cepas resultaron sensibles a todos los antibióticos ensayados.
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Discusión
En este estudio se encontró que el 69% de los lotes y el 36 % de las unidades de muestra contenían Salmonella; los lotes
presentaron valores extremos de unidades de muestra contaminadas entre 0 y 100% (Cuadro 2). El alto porcentaje de
contaminación de los lotes señala fallas y escaso control durante el proceso y/o almacenamiento.
En cuanto a la comparación de métodos, el análisis estadístico mostró que las diferencias entre el método tradicional y el
de combinación húmeda no eran significativas pero eran en cambio significativas entre estos métodos y el de
combinación seca. Este hallazgo descartaría el uso futuro de esta última técnica. La probable razón de esto puede ser la
distribución no uniforme de salmonelas en la muestra y la cantidad tan pequeña (2,5 g) de cada unidad de muestra que se
usa para el análisis. Huhtanen (3) encontró al comparar aislamientos a partir de siembras de 300, 30 y 3 g
respectivamente, que en estas últimas caía a la mitad el número de muestras positivas respecto de las anteriores. En el
método de combinación húmeda se favorece el desarrollo de salmonelas en el pre-enriquecimiento de cada unidad de
muestra y su distribución en el medio de cultivo, permitiendo recuperarlas aunque sólo se tome el 0,4 % (1 ml) del
volumen total del mismo; es decir, este método permite el desarrollo de salmonelas antes de hacer la mezcla húmeda, a
diferencia del método de CS que no lo permite.
Silliker (14) al hacer el análisis por el método de CH encontró diferencias con el tradicional en la recuperación de
salmonelas. Esas diferencias fueron mayores que las halladas por nosotros. Sin embargo, en un trabajo posterior (13) el
mismo autor no observó diferencias significativas entre el MT y el CH; en este segundo estudio las diferencias
encontradas fueron inferiores a las nuestras. Esto podría deberse a que cada una de sus mezclas contenía cinco
unidades, en cambio en nuestro caso tenían diez, produciéndose, posiblemente en algunas circunstancias, un efecto de
dilución. Esto puede apoyarse en que los dos lotes, el 10 y el 13 positivos en MT y negativos en CH, tenían pocas
unidades de muestra contaminadas, 1 y 2, respectivamente. En base a nuestro estudio, la técnica de combinación
húmeda ha mostrado su eficiencia en la detección de Salmonella, sin que muestre diferencias significativas con el método
tradicional. Su aplicación para el control de estos subproductos, dado el elevado número de unidades de muestra
contaminadas que se presentan dependerá de la propuesta de plan de muestreo que se acepte, debiendo hacerse
mezclas de un número de unidades de muestra que signifiquen un balance entre lo práctico para el laboratorio y la
necesidad de conocer el número de unidades de muestra contaminadas en un lote.
Muy posiblemente no se pueda alcanzar de inmediato la condición óptima (ausencia de Salmonella) en los lotes de
harinas de carne y hueso dado que no existen aún en muchos países las condiciones para ello (5); por lo tanto la
propuesta de plan de muestreo debería aceptar provisoriamente un número de unidades contaminadas. El número de
unidades a analizar (n) y el número de unidades contaminadas o defectuosas (c) a aceptar deberán establecerse en base
a lo que la industria pueda realizar bajo las mejores prácticas de fabricación y lo que los servicios oficiales puedan
controlar. Hemos señalado que en este caso, una propuesta de plan de muestreo deberá aceptar necesariamente un
número de unidades defectuosas; considerando esto se estima que si se aceptaran hasta 2 unidades defectuosas sobre
5 analizadas, habría una probabilidad de 0.84 que se aprueben lotes con hasta 30% de unidades defectuosas, lo cual es
razonable en base a los resultados obtenidos o nivel de contaminación de los lotes estudiados por nosotros. Proponemos
por ello un criterio de aceptación, para lo cual considerarnos un plan de 2 clases (5).
Conclusiones
En base a los resultados obtenidos, se sugiere como propuesta de plan de muestreo para determinar la presencia de
Salmonella en harinas de carne y hueso:
a) tomar 5 unidades de muestra de aproximadamente 500 g cada una de un mismo lote, en forma aleatoria simple.
b) los criterios de aceptación se basan en un Plan de 2 clases: n = 5 y c = 2, donde n, número de unidades de muestra a
analizar y c, número máximo de unidades contaminadas con Salmonella a aceptar.
Agradecimiento
Nuestro agradecimiento a la Dra. Teresa Eiguer, Centro Nacional de Referencia de Enterobacterias, Instituto Nacional de
Microbiología, por la serotipificación de las salmonelas; a los establecimientos productores de las harinas por permitirnos
tomar las muestras.
Cuadro 1. Toneladas y montos percibidos por la Republica Argentina por la exportaci6n de harinas de carne y hueso
durante el período 1972-1982
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Fuente: Secretaría de Agricultura, Ganadería y Pesca, Boletín Estadístico 1983, Junta Nacional de Carnes, República
Argentina.
Cuadro 2. Algunas características químicas y compara6i6n de tres métodos para el aislamiento de Salmonelas en 13
lotes de harina de carne y hueso obtenidos de 5 establecimientos procesadores del Gran Buenos Aires
a ND: No determinada
b Obtenido por cálculo según Silliker (14).
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