TEMA 8.- TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE Y TÉCNICAS

TEMA 8.- TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE
Y TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE DNA.
1.-Tecnología del DNA recombinante
2.- Herramientas básicas necesarias para el conocimiento
y modificación del DNA
3.- Marcadores moleculares aplicados a la identificación
genética
TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE
1973 - Berg, Boyer y Cohen – Primeros experimentos de DNA recombinante
con los que introducen Genes en E.coli
Unión artificial de DNA
de distintos orígenes
1
Utilizacion: Clonación de genes es decir obtener copias del mismo
PRIMER PASO:
PASO cortar DNA que se quiere clonar y el vector que se va a
utilizar con enzimas de restricción
PLÁSMIDO
GEN
(otro tipo de vector)
SEGUNDO PASO: LIGACIÓ
LIGACIÓN. Mediante un enzima denominado ligasa se unen el
vector y el fragmento de DNA
+
MOLÉCULA DE DNA
RECOMBINANTE
TERCER PASO: Introducción de la molécula de DNA recombinante en las células
procariotas o eucariotas correspondientes para la obtención de numerosas copias
Procariotas: transformación, conjugación
Eucariotas: Electroporacion microinyección,
vectores virales, proyectiles de DNA
HERRAMIENTAS BÁ
BÁSICAS NECESARIAS PARA EL
CONOCIMIENTO Y MODIFICACIÓ
MODIFICACIÓN DEL DNA
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
VECTORES DE CLONACIÓN
GENOTECAS
IDENTIFICACIÓN DE CLONES O SECUENCIAS ESPECÍFICAS
PCR
MARCADORES MOLECULARES
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ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
…FINALES DE LOS 60
¿Cómo era posible que algunas bacterias resistiesen la
invasión de ciertos virus?
El DNA del virus se introduce en la bacteria, donde se
corta en pequeños fragmentos inactivándose
Demostraron que las bacterias sintetizaban endonucleasas
que cortaban el ADN en una secuencia corta y específica
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
- Nucleasa sintetizada por las bacterias como un
mecanismo de defensa natural
- Nucleasa capaz de reconocer y cortar una secuencia
específica de nucleótidos en una doble cadena
- Longitud de la secuencia reconocida de 4 a 8
- Reconocen secuencias palindrómicas y el corte es
simetrico
AAGCTT
TTCGAA
Primera enzima descubierta fue a partir de Haemophilus
influenzae
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PUEDEN CORTAR DE DOS FORMAS:
EXTREMOS COHESIVOS
EXTREMOS ROMOS
ALGUNOS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN DE LOS MILES
(>3000) QUE SE HAN AISLADO..
NOMENCLATURA: 1 letra del Genero, 2 letras de la especie, 1 letra
de la cepa (Opcional) y 1 numero romano ( si existen mas de una)
ALU I – primera enzima de restricción de Arthrobacter Luteus
Extremos romos
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VECTORES DE CLONACIÓN
Características generales:
- Replicación autónoma
- Mapa de restricción conocido: un único punto de corte
- Tengan marcadores selectivos:
- resistencia a antibióticos
- cambios de color
- De fácil recuperación
TIPOS:
-
Plásmidos
Fago λ
Cósmidos
YACs
BACs
Clonación de
fragmentos de
hasta 10 kb
PLÁSMIDOS
-ADN doble y circular
-Replicación autónoma; información no vital
-Pueden conferir resistencia a antibioticos
-Posibilidad de integración en cromosoma
principal bacteriano → EPISOMA
-Tamaño variable: 1 a 500Kb
FAGO λ
EXTREMOS COS
Clonación de
fragmentos de
hasta 25 kb
‰ DNA doble hélice lineal con ~ 48.000 pb
‰ infecta E. coli
‰ extremos cohesivos
complemenaria)
(COS):
extremos
5’
monocatenarios
(12
nucleótidos
de
secuencia
5
Cósmidos
Clonación de
fragmentos de
hasta 45 kb
Vectores híbridos Fago λ + plásmido
BACs (Bacterial Artificial Chromosomes)
Clonación de
fragmentos de
hasta 300 kb
YACs (Yeast Artificial Chromosomes)
Clonación de
fragmentos de
hasta 1000 kb
CONSTRUCCIÓN DE GENOTECAS
- Clonación de todas las secuencias del genoma de una especie
- Presente al menos una copia de cada gen o fragmento de DNA
- Numero de clones necesarios depende de
- Tamaño del inserto
- Tamaño del genoma
Fórmula de Clarke y Carbon N=
Ejemplo -E.coliTamaño: 4.300 Kb
P= 0,95
ln (1 - p)
ln (1 - f )
N= nº de clones necesarios
P= probabilidad de tener el genoma completo
F= tamaño medio del inserto/ tamaño genoma
1300 plásmidos
300 cósmidos
130 BACs
12 YACs
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IDENTIFICACIÓN DE CLONES O SECUENCIAS ESPECÍFICAS
PARA PODER IDENTIFICAR, AISLAR Y TRABAJAR CON LAS SECUENCIAS CLONADAS…
TODOS LOS MÉTODOS SE BASAN EN LA HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NÚCLEICOS
TRANSFERENCIA del ácido nucleico a una membrana o soporte físico (“blotting”)
+
HIBRIDACIÓN CON UNA SONDA
SONDA: Fragmento de DNA de secuencia conocida que
hibridará por complementariedad
OTROS TIPOS DE HIBRIDACIÓN PARA AISLAMIENTO DE SECUENCIAS
SOUTHERN BLOTTING Digestión del DNA con enzimas de restricción Separación mediante electroforesis
NORTHERN BLOTTING Similar a Southern blot pero para identificación de
secuencias de RNA
SLOT/DOT BLOTTING. No se realiza electroforesis, simplemente se deposita
y se transfiere a soporte sólido
HIBRIDACION IN SITU. Hibridación en preparaciones histológicas o células
en cultivo
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HASTA AHORA HEMOS HABLADO DE CLONAR DNA… existe otra
forma de “clonación de DNA”
PCR ¿Qué es?
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
FORMA DE CLONACIÓN “ IN VITRO”
FOTOCOPIADORA MOLECULAR
Técnica que nos permite amplificar o clonar
selectivamente un segmento específico de DNA, hasta
obtener una cantidad suficiente para su posterior
manipulación
¿Cuáles son los fundamentos?
EXTENSIÓN DEL CEBADOR: La DNA polimerasa realiza la extensión
del primer utilizando la cadena complementaria como molde
DNA Polimerasa
5’
3’
dNTPs
5’
dTTP
dATP
dGTP
dCTP
+
Mg
++
3’
8
EXTENSION DEL CEBADOR
Utilizando dos cebadores que son complementarios a los
extremos 3’ del fragmento de DNA de doble cadena que
queremos amplificar
3’
5’
DNA polimerasa
DNA Polimerasa
5’
3’
REPETICIÓN “n” VECES DE UN CICLO
CONSTITUIDO POR TRES ETAPAS
DESNATURALIZACIÓN
HIBRIDACIÓN DE
LOS CEBADORES
C
i
c
l
o
1
EXTENSIÓN
9
“n CICLOS”: ciclo 3
“n CICLOS”: ciclo 5
10
La cantidad de DNA dobla teóricamente con
cada ciclo de PCR, Después de cada ciclo, la
cantidad de DNA es dos veces la del ciclo
anterior.
Después de:
- 2 ciclos tenemos 2 x 2
- 3 ciclos - 2 x 2 x 2
- 4 ciclos 2 x 2 x 2 x 2
Así, después de ciclos de N ciclos
tendremos 2N.
Pero la reacción no puede
mantenerse indefinidamente, se
alcanza una fase de meseta, según lo
demostrado en las cifras que
aparecen en rojo.
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MARCADORES MOLECULARES
IDENTIFICACIÓN GENÉTICA
Patógenos
Test de paternidad
Trazabilidad
Autentificación de productos
Diagnóstico
de patologías
IDENTIFICACIÓN GENÉTICA: Bases moleculares
Los animales presentan diferencias en su ADN, a excepción
de los gemelos monocigóticos o los clones.
¿CÓMO SE GENERA ESTA GRAN VARIACIÓN GENÉTICA?
•Mezcla de cromosomas de origen paterno y materno en
cada generación en las especies de reproducción sexual.
• Recombinación genética que permite el intercambio de
fragmentos de cromosomas homólogos en la meiosis.
•Mutaciones que suponen cambios de bases o bien adición o
pérdida de algunas de ellas.
Causar patologías
Generar variabilidad
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• RFLPs : Polimorfismos tamaño de los fragmentos de restricción
• Microsatélites: repeticiones de un pequeño número de bases
• RAPDs : Random amplified polymorphic DNA
• SNPs: Single nucleotide polymorphisms
•…
Para su detección : amplificación por PCR
RFLPs : Polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción
Origen: mutaciones
delecciones
insercciones
reordenaciones
CARACTERÍSTICAS
• Detectables por PCR
• Bialélicos
• Muy abundantes
• Ampliamente distribuidos por el genoma
• Codominancia
• Alta reproducibilidad
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Ejemplo RFLP
_
199 pb
165 pb
34 pb
+
CC
Ampl.
TT
CT
_
+
1
2
3
4
5
6
7
8
MICROSATÉLITES
Secuencias del genoma que consisten en repeticiones de
1 a 6 pb.
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MICROSATÉLITES - Características - Su polimorfismo radica en el número de repeticiones
- Altamente polimórficos ( nº medio de alelos 10)
- Se han encontrado en todas las especies conocidas
- Muy numerosos y bien distribuidos por el genoma
- Posibilidad de hacer multiplex : amplificar varios
micros a la vez
TGLA227
TGLA126
ETH225 BM2113 TGLA122
BM1824
INRA23 ETH10
SPS115
TGLA 122
TGLA 126
TGLA 227
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RAPDs (Random ampliflied polymorphic DNA)
Ventajas
• Se utilizan primers diseñados al azar.
• Generalmente de pequeño tamaño (10-12 nucleótidos)
• No es necesario el conocimiento previo de la secuencia
El mayor inconveniente puede ser su baja reproducibilidad
SNPs (single nucleotide polymorphisms)
Son mutaciones, debidas a la variación de un nucleótido.
A
C
G
A
C
A
A
C
G
T
C
A
A
C
G
A
C
A
A
C
G
A
C
A
A
C
G
T
C
A
A
C
G
T
C
A
cerdo 1
cerdo 2
cerdo 3
AA
TT
AT
C/C
C/T
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SNPs Características
• Variación muy frecuente (1 cada 1000bp)
• Dos posibles alternativas en cada individuo
• Herencia muy estable ( t. mutación 10-6)
• Fácil estandarización
• Posibilidad de automatización
MARCADORES GENÉTICOS APLICADOS A LA IDENTIFICACIÓN
Un marcador de ADN, para ser utilizable en identificación
genética, necesita reunir una serie de características:
• Que sea muy polimórfico,
• Que esté distribuido por todo el genoma.
• Que tenga un bajo coste tanto en la obtención como en la
aplicación
• Que sea público .
• Que sea fácilmente interpretable de una forma objetiva.
• Que requiera poca cantidad y calidad de muestra a partir de la
que se obtendrá el ADN.
• Que sea fácilmente intercambiable entre laboratorios
• Que sea automatizable para aumentar el rendimiento y abaratar
los costes.
• Que sea estable
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