LA PROTEOMICA Y SU APLICACIÓN AL CAMPO FARMACOLOGICO

Dr. Javier Ambrosio
El análisis proteómico en la evaluación del efecto de fármacos.
El estudio del genoma, por medio de la genómica, ha permitido ir a lo
mas profundo del conocimiento de la composición del material genético de los
organismos que han sido estudiados. Se conoce el número de genes, se les ha
clasificado y se ha logrado determinar su localización en los cromosomas3. Si
bien el avance ha sido espectacular, aún quedan dudas importantes por
resolver y que se enfocan hacia sus productos de expresión: las proteínas.
Esto se debe a que no siempre hay correlación entre las secuencias de
aminoácidos (aa) obtenidas para las proteínas expresadas con las deducidas
teóricamente, las cuales han sido predichas desde las secuencias génicas, no
se consideran posibles modificaciones post-transduccionales y no hay
certidumbre de la función celular de la proteína producida. De todos los
genomas conocidos, hay secuencias génicas de las que se desconoce que
proteínas producen y por ello no se han localizado ni se sabe cual es su
función6, 7.
La química de proteínas no permite el estudio de varias de ellas en un
mismo tiempo, requiere de proteínas puras o cristalizables y no considera las
dinámicas de expresión que las células realizan, ni la influencia de las
condiciones en las que se estudian los organismos y por esto la velocidad de
caracterización de las proteínas no es igual a la que se viene utilizando para los
genomas6,7.
El término proteoma, acuñado en 1994, es equivalente al de genoma e
implica la descripción del juego completo de proteínas expresadas, así como la
observación de la manera como se modifican conforme transcurre la expresión
por el genoma entero en toda la vida de una célula. En un sentido menos
universal, el proteoma sirve para describir el complemento de proteínas
expresado por una célula en un momento dado. Al día de hoy, la proteómica
es una disciplina científica que promete ser el puente de nuestro entendimiento
de las secuencias de los genomas y las conductas celulares; o bien, como una
herramienta para determinar la función de los genes 8. La proteómica ha venido
a subsanar los problemas de la caracterización bioquímica de las proteínas
mencionados previamente y ello porque en un proteoma, o mapa proteómico,
es posible la visualización de todas las proteínas de una muestra analizada.
Para efectuar los análisis proteómicos se utilizan diferentes estrategias
experimentales como los análisis por doble dimensión en gel de poliacrilamida,
la electroforesis capilar, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), los
microarreglos de proteínas y la espectrometría de masas de proteínas. Los
análisis incluyen la evaluación de mezclas complejas, el análisis parcial de las
secuencias de aminoácidos, el empleo de la bioinformática y la determinación
de la biología de sistemas proteicos6, 7 y dado que tienen una amplia
versatilidad, se logran la identificación de proteínas, la evaluación de
modificaciones post-transduccionales (como glicosilación y fosforilación), la
determinación de la función (como determinaciones enzimáticas o bioensayos),
la determinación de la acción de fármacos, la identificación de interacciones
entre proteínas y la identificación misma de las proteínas.
La base de la proteómica tiene que ver con las características de los
aminoácidos y sus propiedades; ellos pueden ionizarse y, dependiendo de los
residuos ácidos o básicos que contengan, adquieren una carga neutra
individual conocida como punto isoeléctrico (pI). Tanto el pI como la masa de la
molécula son los responsables de que se pueda llevar a cabo la separación
eficiente de cada uno de los aminoácidos (aa) o bien de los péptidos o
proteínas del tejido en que estén contenidos. La separación de las proteínas, o
de sus péptidos, luego de digestiones parciales controladas, que combinan
tanto el pI como la masa de éstas, han sido utilizadas desde los setentas
mediante los ensayos conocidos como electroforesis en segunda dimensión (2D) que combina el isoelectroenfoque con la electroforesis unidimensional
clásica. En la actualidad, la 2-D ha sido perfeccionada y ha dejado de ser
artesanal para producir resultados con mas de un 95% de reproducibilidad y
exactitud. Esta confianza que brinda este tipo de análisis se debe a que hace
uso de sistemas comerciales de gradientes de pH estabilizados, de diferentes
longitudes y rangos de pH, los cuales permiten la separación por un
isoelectroenfoque eficiente de las proteínas o péptidos en estudio. También se
ha utilizado la electroforesis capilar (EC), sin embargo, su utilidad es reducida
en comparación con la 2-D en geles de poliacrilamida, ya que no es eficiente
para separar mezclas muy complejas de proteínas. Por lo consiguiente, la 2-D
se considera el corazón del análisis proteómico por la resolución, la
visualización y recuperación de las proteínas separadas. Luego, con el uso de
tinciones específicas de los geles obtenidos, la detección de las manchas
generadas se hace de forma sensible y eficiente. Los geles que resultan son
capturados digitalmente, procesados con equipos de fotodocumentación,
comparados o no con bases de datos que existen al respecto en INTERNET y
esto permite un avance notable en la caracterización bioquímica inicial de
varias proteínas en un solo ensayo. En un gel de 2-D, dependiendo del tamaño
del mismo, se pueden visualizar e identificar mas de 500 proteínas o péptidos y
si a ello se le suma la combinación de tinciones especìficas, en el mismo gel se
puede determinar cuales proteínas son glicoproteínas, fosfoproteínas o
adicionalmente, si se realizan electrotransferencias de los geles a membranas
de nitrocelulosa o PVDF y se cuenta con anticuerpos específicos, se puede
ampliar la caracterización de las proteínas implicadas. Esta estrategia de
análisis, como puede verse, abre un universo de estudio para el conocimiento e
identificación de las proteínas e incluso, permite establecer si ellas han sufrido
alguna modificación post-transduccional. La comparación de geles obtenidos
para el análisis de proteínas sometidas a determinadas condiciones de estudio
(por ejemplo: antes y después de un tratamiento farmacológico de una
población celular o de ciertos organismos patógenos) permite evaluar el efecto
del tratamiento en la expresión de las proteínas involucradas y determinar la
correlación de las condiciones de los ensayos con la expresión de las mismas.
De acuerdo a lo anterior, mediante el análisis proteómico descrito, es posible
establecer si hay alteración en el patrón proteico debido a la acción del agente
de estudio, del fármaco o de las condiciones en las que se realizaron los
ensayos6y7.
La segunda parte del análisis proteómico es la identificación y la
determinación de la composición de los aminoácidos mediante espectrometría
de masas (EM), la cual es específica para el análisis de proteínas (ejemplo de
ellas son los equipos de MALDI-TOF, TOF-TOF o “electrospray”). El análisis se
efectúa a aquellas proteínas que hayan resultado de interés luego del análisis
por 2-D, para ello, los péptidos o las proteínas seleccionadas son recuperados
desde los geles, deshidratados, digeridos enzimáticamente con tripsina y
analizados en los EM. Los patrones espectrales obtenidos son analizados y
comparados con bases de datos que existen al respecto en INTERNET y se
determinan las características de las proteínas o los péptidos. El análisis por
EM se logró cuando por primera vez se indujo a que las proteínas o los
péptidos se ionizaran en el alto vacío por aplicación de un rayo láser que incide
en la matriz en la que se depositan las muestras. Los iones producidos viajan a
diferente velocidad (dependiendo de su masa) hacia un sistema detector, sitio
del EM en el cual se registran tanto el tiempo de vuelo como la carga de los
iones y ello permite generar los patrones espectrales de las proteínas o los
péptidos. Las bases de datos, disponibles hasta el momento, ya cuentan con
los valores de EM de muchas proteínas y para algunas de las cuales se conoce
perfectamente su composición de aa. Estos datos mas las condiciones
utilizadas en su análisis por 2-D permiten la identificación de la proteína o a
cual pertenece el péptido. La composición de aa exacta de los péptidos o las
proteínas, se hace por otro posterior análisis de EM, sólo que en estos, las
proteínas son digeridas nuevamente, marcadas en sus regiones carboxilo
terminal, separadas por HPLC y analizadas por EM de ionización de pequeñas
alícuotas de los péptidos obtenidos. Nuevamente, con la comparación por
bioinformática de los resultados obtenidos se logra determinar la composición
de aa de los péptidos y su identificación sin necesidad de haber purificado,
cristalizado y determinado las propiedades estructurales de las proteínas. Esta
tecnología de EM permite que en un aparato MALDI-TOF o TOF-TOF puedan
evaluarse hasta 100 proteínas en un lapso de medio día y en una semana se
logren identificar todas las proteínas contenidas en un gel de 2-D. La
composición de aa de las proteínas es un proceso mas largo y requiere de al
menos dos días para el análisis de una mezcla de 3 o 4 proteínas. Con esta
tecnología, en una semana puede tenerse la secuencia de aa completa de por
lo menos 10 proteínas. Este proceso es muy eficiente comparado con la
microdegradación de EDMAN, en la que sólo pueden identificarse un número
limitado de aa en porciones amino terminal no bloquedas y en cantidades del
orden de mg (en EM se evalúan pico o ng). La única limitante sería que la
proteína caracterizada no hubiera sido estudiada previamente y no haya
registro de ella, sin embargo, cada vez crecen las bases de datos y lo que hay
aún es mucho mayor en el orden de 20000 veces en comparación con las
estructuras de las proteínas purificadas6y7.
Son muchas las aplicaciones de la proteómica en la biomedicina: se
pueden encontrar marcadores proteicos de diferenciación de especies, de
desarrollo tisular y celular, de diagnóstico, de seguimiento y del control de
terapias farmacológicas, de evaluación de fármacos o de sustancias con
potencial farmacológico7 y de determinación de potencial toxicológico9. Las
últimas aplicaciones, relacionadas con aspectos farmacológicos, han sido
englobadas en lo que se conoce como proteómica funcional, la cual permite
varios aspectos: 1. Identificación de moléculas que interaccionan, 2.
Determinación de sustratos enzimáticos, 3. Definición de selectividad de
fármacos, 4. Localización de proteínas, 5. Caracterización de efectos de
proteínas expresadas in vivo, 6. Evaluación de relaciones estructura/función, 7.
Determinación de modificaciones post-transduccionales inducidas y 8.
Descubrimiento de nuevos fármacos5. Además, se ha considerado que con el
empleo de la proteómica en la farmacología se podrán determinar los
mecanismos de toxicidad ya que es posible hacer evaluaciones en orina, suero
y otros fluídos biológicos. Esto, también se piensa, tendrá impacto en el
aseguramiento de la calidad de nuevos fármacos o de aquellos introducidos
recientemente.5
En nuestro laboratorio hemos logrado la caracterización bioquímica e
inmunoquímica de proteínas del citoesqueleto de parásitos, hemos combinado
la microscopía de luz con la de fluorescencia y la electrónica de transmisión1,2,4
y debido a ello hemos tenido que recurrir a la adaptación del análisis 2-D para
definir isoformas2, hemos logrado establecer perfiles de digestión de proteínas
específicas, así como la identificación de epítopos por reconocimiento de
anticuerpos específicos4. Recientemente, como parte de una colaboración
multidisciplinaria con científicos dedicados al diseño, síntesis y evaluación de
sustancias derivadas de otras con acción farmacológica (Grupo del Dr. R.
Castillo. Fac. de Química, UNAM) y de parasitólogos del CMN (Grupo Dra. L.
Yépez) estamos evaluando por proteómica, en nuestro laboratorio, el efecto de
las sustancias sobre la expresión de proteínas de diferentes parásitos y
estamos en proceso de la identificación de varias de ellas involucradas.
Aún cuando hemos logrado, como grupo muldisciplinario, el apoyo
financiero para realizar la primera parte de los estudios proteómicos, no
contamos en nuestras instalaciones con la parte complementaria por carencia
de equipo específico y, a nivel nacional, las alternativas son escasas y algunas
de ellas aún están aún en fase de adaptación. Potencialmente, como lo
muestran los resultados que se han venido obteniendo, y los que se
conseguirán, llegará el momento en que requeriremos realizar la proteómica
completa. Ello nos permitirá continuar con los estudios, determinar el nivel de
acción en las proteínas de las sustancias sintetizadas e identificarlas y valorar
su potencial utilidad.
Aunque lo que hemos venido haciendo tiene un enfoque farmacológico,
la tecnología de proteómica completa que continuaremos implementando podrá
ser aplicada en cualesquiera de los campos de la biomedicina que lo requieran,
como lo muestran otros estudios que hemos realizado en otros campos de la
biomedicina diferentes del ámbito parasitológico y farmacológico. Por estos
motivos creemos que dado el potencial de la proteómica, todo lo que se refiera
a ella debe ser apoyada y podrá tener directa aplicación en los diferentes
aspectos mencionados en el campo biomédico. Cabe mencionar que, a nivel
mundial (en los países que así lo han considerado) esta ya es una tecnología
adoptada por los laboratorios de investigación y los avances que han logrado
en el estudio de proteínas ha sido notable.
Referencias.
1. Ambrosio J et al. Partial characterisation of a myosin-like protein of Taenia
solium parasites. Parasitology. 114 (6): 545-553. 1997. 2.-------. Actin expression
in Taenia solium cysticerci (Cestoda). Tisular distribution and detection of
isoforms. Cell Biol Int. 2003. 3. Craig J. The Sequence of the Human Genome.
Science. 291 (16): 1304- 1351. 2001. 4. González-Malerva L et al. Muscular
myosin isoforms of Taenia solium. Cell Biology International. 28: 885-894. 2004.
5. Labaer J. Introduction to Proteomics. CSHL course 2004. 6. Liebler P.
Introduction to proteomics. Humana Press. 2002. 7. Pandey y Mann.
Proteomics to study genes and genomes. Nature. 405 (15): 837-846. 2000.
8. Simpson R. Proteins and Proteomics. A laboratory manual. Cold Spring
Harbor Laboratory Press. New York, USA. 2003. 9. Steiner S and Anderson L.
Pharmaceutical proteomics. Annaks of the New York Academy of Sciences.
919: 48-51. 2000.
Lo presentado aquí ha sido auspiciado por DGAPA-UNAM IN201003 y
CONACYT V43629-M