S2-MCS05

Evaluación colinérgica central de derivados del aminofenol.
J. Espinosa, N. Plata , O. Picazo, J. Trujillo.
Sección de Estudios de Posgrado e Investigación, Escuela Superior de Medicina, Instituto
Politécnico Nacional. Plan de San Luis y Díaz Mirón s/n CP 11340. México, D.F.
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RESUMEN
Una estrategia que ha demostrado eficacia en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, es la encaminada
a contrarrestar el déficit colinérgico cerebral. Por lo anterior y considerando la similitud estructural entre
algunos derivados del p-aminofenol y la acetilcolina, se realizó una evaluación ex vivo de la actividad
inhibitoria de estos compuestos sobre la acetilcolinesterasa (AChE), se calculó su unión a receptores
muscarínicos y se exploró su efecto sobre un modelo de amnesia inducido con escopolamina. Se obtuvieron
curvas dosis-respuesta de los compuestos y se compararon con tacrina. La magnitud de la inhibición fue
similar a la obtenida con otros inhibidores de AChE pero se observaron menos efectos colinérgicos
autonómicos. Mediante las simulaciones de acoplamiento (“docking”) se demostró que la succinamida y la
succinimida de p-aminofenol se unen a receptores muscarínicos M1. Finalmente, los efectos inducidos por la
escopolamina fueron revertidos por la amida pero no por la imida.
1. INTRODUCCIÓN
La muerte neuronal acompaña a varias enfermedades neurodegenerativas entre las que se incluye la
enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Parkinson, la esclerosis múltiple, la enfermedad de
Hungtington y varias neuropatías. Dentro de estas enfermedades, una en las que se ha enfocado la atención
debido a su alta incidencia, es la EA. Aunque en su fisiopatología se han implicado diversos sistemas de
neurotransmisión, el sistema colinérgico ha sido el más estudiado. 1,2
La sinapsis colinérgica asegura su funcionalidad con la síntesis de acetilcolina (ACh) su unión a receptores
muscarínicos (RM) y nicotínicos (RN) presinápticos y postsinápticos, y su rápida hidrólisis por la enzima
acetilcolinesterasa (AChE). La acetilcolinotransferasa (enzima clave para la síntesis de ACh) sólo se
deteriora en estadios muy avanzados de la enfermedad; quizá sea ésta la causa de que el suministro de
precursores (colina) no haya resultado terapéuticamente eficaz. Los RM parecen estar disminuidos, pero
existen datos contradictorios de algunos ensayos clínicos realizados con agonistas muscarínicos en pacientes
con EA. La barrera que hay que enfrentar con los agonistas muscarínicos, para convertirlos en herramientas
terapéuticamente eficaces, es la de sus efectos adversos periféricos sobre el corazón, las glándulas y el
músculo liso. 3
Una estrategia que ha demostrado eficacia para detener el progreso de la EA es la encaminada a evitar la
degradación de ACh, con el objetivo de contrarrestar su déficit cerebral. Así, fármacos que inhiben de forma
reversible la AChE cerebral, como tacrina, donepecilo o galantamina, evitan la hidrólisis del neurotransmisor,
y de esta manera favorecen la elevación de los niveles de ACh en la hendidura sináptica y mejoran el déficit
cognitivo de los pacientes con EA. 3,4
Otra estrategia terapéutica consistiría en la aportación de agonistas y moduladores alostéricos de los RN
neuronales y de los RM, ya que ahora se sabe se encuentran relacionados con procesos de neuroprotección y
de memoria y aprendizaje. 3,4
Actualmente en la búsqueda de nuevos tratamientos que incrementen y mantengan la mejoría clínica de los
pacientes con EA, las investigaciones se están enfocando a los fármacos que combinen más de un mecanismo
de acción; como es el caso de la galantamina, la cual además de inhibir a la AChE modula alostéricamente la
actividad de los RN.
2. OBJETIVO
Evaluación ex vivo de la actividad inhibitoria de succinamida y succinimida acetilada de p-aminofenol sobre
la acetilcolinesterasa (AChE) cerebral, establecer sus afinidades por los receptores muscarínicos M1 mediante
cálculos teóricos y evaluar sus efectos sobre el modelo de amnesia inducido por escopolamina.
3. METODOLOGÍA
Animales de experimentación. Se utilizaron ratas Wistar macho (250±20 g) que se mantuvieron en
condiciones constantes de temperatura y humedad, con ciclo luz/oscuridad de 12/12 horas y con agua y
comida a libre demanda.
Reactivos y fármacos. Todos los reactivos utilizados para la síntesis de los compuestos fueron de grado
analítico. El anhidrido succínico y el p-aminofenol, atropina, tacrina y escopolamina fueron comprados a la
casa Sigma-Aldrich.
3.1. Síntesis y caracterización de los compuestos
a. Síntesis de amidas. Las amidas se sintetizan haciendo reaccionar mol a mol el aminofenol correspondiente
con anhídrido succínico en agitación continua a temperatura ambiente por dos horas. El compuesto resultante
se lava dos veces con agua acidulada pH 4 y se seca en una estufa al vacío. Se determina la pureza de los
compuestos por cromatografía en capa fina y se caracterizan por UV, IR, RMN de 1H y 13C y espectrometría
de masas.
b. Síntesis de imidas. Se obtienen por deshidratación de la amida usando acetato de sodio como catalizador
disuelto en 5 mL de anhídrido acético; la reacción se lleva a cabo a 85ºC en agitación continua por 3 h. El
compuesto se seca en una estufa al vacío y se lava con agua acidulada pH 4. Se determina la pureza de los
compuestos por cromatografía en capa fina y se caracterizan por UV, IR, RMN de 1H y 13C y espectrometría
de masas.
O
O
O
O
H3C
O
O
N
HO
N
H
O
O
N
O
O
ACh
Succinamide
Succinimide
ACh
1
2
ACh
1
Figura 1. Estructura química de2los derivados del p-amiofenol. Ach: acetilcolina. 1: succinamida de
p-aminofenol. 2: succinimida acetilada de p-aminofenol
3.2. Actividad anticolinesterásica ex vivo
Preparación del tejido y la enzima. Después del tiempo y la dosis indicada de tratamiento, y previa anestesia
con éter, se abrió la cavidad torácica. Se cateterizó el corazón y mientras éste siguió latiendo se perfundieron
10-15 mL de solución de fosfatos 0.1M pH 7.4 a temperatura ambiente al mismo tiempo que se cortó la aorta
abdominal. Al terminar de perfundir cada ratón se decapito, y el cerebro se removió, limpió, pesó y
homogeneizó con solución de fosfatos 0.1M pH 7.4 frío (5% p/v), y posteriormente se centrifugó a 500g por 5
minutos a 4ºC. El sobrenadante se utilizó para medir la actividad enzimática. 12,1314
Una vez obtenidos los homogeneizados correspondientes y previa incubación por 30 minutos con
etopropazina 0.1mM (para evitar la participación de la BuChE en la actividad enzimática) 12 los estudios
cinéticos se realizaron siguiendo una modificación de la técnica de ultramicrodeterminación de actividad de
la AChE de Bonting-Featherstone utilizando ACh como substrato a una concentración final de 10mM. El
contenido de proteína se determinó por el método de Biuret. Cada experimento se hizo por triplicado.
3.3. Realización de cálculos teóricos (“docking”) de la afinidad de los compuestos al receptor muscarínico M1
Las simulaciones de acoplamiento fueron llevadas a cabo con el programa Autodock. Se usó el modelo de
homología del receptor muscarínico M1. Se adicionaron hidrógenos polares a la proteína, continuando con la
minimización de energía usando el programa NAMD y el AMBER para campos de fuerza. Finalmente,
cargas de Kollman y parámetros de solvatación fueron asignados a los átomos de la proteína. 5,6
La ACh, la escopolamina, la succinamida de p-aminofenol y la succinimida acetilada de p-aminofenol fueron
construidas y optimizadas empleando Hyperchem. Cada molécula fue equipada de cargas Gasteiger y los
ángulos de torsión usando AUTOTORS. Los mapas de selectividad que representan a la proteína en los
actuales experimentos de acoplamiento fueron calculados usando la herramienta AUTOGRID, incluida en el
AUTODOCK. Las dimensiones de los mapas fueron de 100 x 100 x 100 puntos con un espacio de 0.8 Å. Las
dimensiones de los mapas fueron los suficientemente grandes para cubrir la superficie completa de la
proteína.5,6
Para las simulaciones de acoplamiento se empleo la hybrid Lamarkian Genetic Lagorithm/local search. Una
población inicial de 300 individuos, 50 000 000 de evaluaciones de energía y 50 000 generaciones y 100
corridas independientes fueron agrupadas para realizar los experimentos de acoplamiento, mientras que el
resto de los parámetros fueron mantenidos sin modificaciones. 5,6
3.3. Modelo de amnesia inducida por escopolamina
Animales. Los animales de experimentación se mantuvieron bajo condiciones de luz controlada 12:12h en
ciclo invertido una semana antes de iniciar el entrenamiento. El día previo al ensayo se limitó la comida.
El entrenamiento se realizó en una caja de Skinner de Med Associates Inc.(WMPC 1999). Los animales se
dividieron en grupos de 10, de la siguiente manera: un grupo-salina; grupo escopolamina; grupo tacrina;
grupo tacrina-escopolamina y grupos para cada compuesto problema para administrar 4 diferentes dosis (10,
5, 2.5, y 1.25 mg/kg).
La prueba de autoaprendizaje se realiza como sigue: un animal hambriento se coloca en la cámara
condicionante (caja de Skinner) para encontrar trozos de comida (estímulo no condicionado [US]) en el
contenedor de comida y se da un secuencia pavloviana (estímulo-estímulo [S-S]) de luz y palanca (estímulo
condicionado[CS]) y comida (US). Después de un número de secuencias, el animal experimentará el CS y
presentará la respuesta condicionada (CR), tal como tocar o presionar la palanca. El incremento o decremento
de CR se considerará como una mejoría o deterioro del aprendizaje, respectivamente. Cada animal se coloca
en la cámara experimental por un período de habituación de 10-15 min teniendo acceso a 20 trozos de comida
(45 mg cada uno). Se dan 3 sesiones de autoaprendizaje: 20 ensayos las dos primeras y 10 ensayos en la
ultima sesión, con 24 h de diferencia entre cada una. Se registran los resultados obtenidos en el tercer día de
sesión. 7
4. RESULTADOS
a. Síntesis de los compuestos y actividad inhibitoria ex vivo
Tabla 1. Resultados de la síntesis de los compuestos y de la actividad inhibitoria ex vivo
COMPUESTO
Succinamida
Succinimida
acetilada de paminofenol
Tacrina
antiACETILCOLINA
gaucheACETILCOLINA
RENDIMIENTO
%
80
63
PUNTO DE FUSION
°C
224-226
145-147
DISTANCIA O-N
Å
5.7755
DI50
mg/kg
5.48 + 0.96
5.01+1.02
9.26+1.45
5.2
2.73
b. Cálculos teóricos de la afinidad de los compuestos al receptor muscarínico M1.
Tabla 3. Energías de unión de los compuestos probados sobre el receptor muscarínico M1.
Compuestos
Acetilcolina
Escopolamina
Succinamida de p-aminofenol
Succinimida acetilada de paminofenol
ΔGb (kcal/mol) (sitio de unión
del ligando)
-4.77
-10.48
-6.95
-7.15
ΔGb (kcal/mol) (sitio alostérico)
N/A
N/A
-7.81
N/A
c. Efecto de los derivados del aminofenol sobre el modelo de amnesia inducido por escopolamina.
*
16
14
Promedio de CR
12
Control
Esc
Esc + Tac
Esc + Amida
Esc + Amida
Esc + Amida
Esc + Amida
10
8
6
4
2
0
*
##
1.25
2.5
5
10
#
#
Figura 2. Inhibición de la amnesia inducida por escopolamina tras la inyección de dosis crecientes de la
succinamida de p-aminofenol. Cada barra representa la media + E.E. de ocho animales. * P<0.01; # P<0.05
y ## P<0.01 vs. esc + tac.
12
Control
Esc
Esc + Tac
Esc + Imida 10
Promedio de CR
10
8
6
4
2
0
*
*
Figura 3. Inhibición de la amnesia inducida por escopolamina tras la inyección de la succinimida acetilada
de p-aminofenol. Cada barra representa la media + E.E.de 8 animales. *P<0.01; control vs. esc e imida 10
mg/kg.
5. DISCUSIÓN
De las simulaciones de acoplamiento se pudo observar que los dos derivados del ácido succínico se unen al
sitio de unión de la ACh pero con menos afinidad que escopolamina y ACh,. Sin embargo, en las
simulaciones de acoplamiento se pudo observar que la succinamida de p-aminofenol se une a un sitio
alostérico del receptor muscarínico, sitio que se encuentra cercano al sitio de regulación de la transducción de
la señal. Estos hallazgos son congruentes con los resultados obtenidos en la prueba de autoaprendizaje, donde
se observo que solo la amida revierte el efecto amnésico inducido por la escopolamina aparentemente por su
efecto a nivel de la modulación de la transducción de la señal.
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