peptidos terapeuticos, en particular analogos del peptido substancia

k
OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
19
k
ES 2 094 160
kInt. Cl. : C07K 7/02
11 N.◦ de publicación:
6
51
ESPAÑA
C07K 7/22
A61K 38/08
k
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
12
kNúmero de solicitud europea: 90912128.7
kFecha de presentación : 16.08.90
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 438 566
kFecha de publicación de la solicitud: 31.07.91
T3
86
86
87
87
k
54 Tı́tulo: Péptidos terapéuticos, en particular análogos del péptido substancia P.
k
73 Titular/es: The Administrators of
k
72 Inventor/es: Coy, David, H. y
k
74 Agente: Morgades Manonelles, Juan Antonio
30 Prioridad: 16.08.89 US 394727
the Tulane Educational Fund
1430 Tulane Avenue
New Orleans Louisiana 70112, US
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.01.97
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
ES 2 094 160 T3
16.01.97
Aviso:
k
k
Moreau, Jacques-Pierre
k
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 094 160 T3
DESCRIPCION
Esta invención hace referencia a “Péptidos terapéuticos, en particular análogos del péptido substancia
P”, que se produce de manera natural.
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La substancia P (SP), tiene numerosos efectos farmacológicos, incluyendo vasodilatación e hipotensión,
contracción del músculo blando no vascular, estimulación de la secreción salivaria y pancreática, la despolarización de varias neuronas y liberación de histamina de las células mastoides. Se piensa que la SP juega
una variedad de papeles fisiológicos, (muchos de los cuales están asociados con la inducción de dolor).
Estos incluyen la regulación de peristaltia y actividad del músculo blando en el tracto gastro-intestinal,
la regulación de la secreción salivaria y pancreática, la regulación de la respuesta inflamatoria a la herida
de tejido periférico, neurotransmisión, y regulación de neuro-inmuno-modulación.
Mantyh et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5193 de razón de la presencia de receptores
de la substancia P en lugares de herida en el sistema nervioso central, y sugiere que la SP puede estar
involucrada en regular la respuesta a las heridas en el sistema nervioso central ası́ como en los tejidos periféricos. La substancia P es también un agente proliferador, estimulando la proliferación de fibroblastos,
linfocitos-T, células endoteliales, células de músculo blando y astrocitos.
La SP pertenece a una familia de péptidos bioactivos conocidos como las taquininas. La estructura,
actividad y función de SP y otras taquininas está descrita en Payan (1989) Ann. Rev. Med. 40:341.
Como se describe en Payan, la SP comparte propiedades comunes farmacológicas y una secuencia terminal carboxilo que se conserva (Phe-X-Gly -Leu-Met-NH2 , donde X es un residuo ramificado alifático
o aromático amino ácido) en las otras taquininas. Las principales actividades biológicas, y la capacidad
para enlazar con un receptor, residen en la secuencia terminal carboxilo de estos péptidos. La selectividad
hacia un receptor especı́fico de taquinina se determina por la secuencia amino-terminal de los péptidos:
Iverson et al., (1989), The Tachinin System, Conferencia presentada en el 11th American Peptide Symposium. La conservación de la secuencia terminal carboxilo se extiende más allá del SP y otras taquininas
de mamı́fero a otros péptidos bioactivos, según se muestra en la Tabla 1. Numerosos derivados de SP,
hechos mediante la modificación de la cadena lateral y/o la substitución D-amino ácido, se ha mostrado
que actúan como antagonistas receptores de la SP. Folkers, U.S Patent n◦ 4.481.139, describe antagonistas
de la substancia P hecha por medio de la substitución del amino ácido D ó L. Estos antagonistas incluyen
el undecapéptido análogo espantida (D-Arg-Pro -Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Leu-NH2), ası́
como análogos truncados de la substancia P. Jensen et al. (1988) Am. J. of Phisiol. 254: G883 caracterizó la capacidad de varios antagonistas de la SP para inhibir la acción de la bombesina. Jensen et al.
estudiaron cuatro análogos de la SP: Arg-D-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Phe-Phe-D -Trp-Leu-Met-NH2 ; ArgD-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe-D -Trp-Leu-Met-NH2 ; D-Arg-D-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe-D
-Trp-Leu-Leu-NH2 ; y
D-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Leu-NH2. Jensen et al. también estudiaron dos
análogos de la SP con los tres primeros residuos amino ácidos borrados, D -Pro-Gln-Gln-D-Trp-PheD-Trp-Leu-Met-NH2 y D-Pro-Gln-Gln -D-Trp-Phe-D-Trp-D-Trp-Met-NH2. Ninguno de estos enlaces
receptores de péptidos son, sin embargo, especı́ficos al receptor SP. Se encontró que todos inhibı́an la
liberación de amilasa estimulada por la bombesina. Jensen et al. concluyeron que “la capacidad para
inhibir la acción de la bombesina es una propiedad general de los análogos de la SP que funcionan también
como antagonistas receptores de la SP y que los antagonistas receptores de SP son cada uno inhibidores
de la acción de la bombesina mediante el funcionamiento como antagonistas receptores de bombesina”.
Woll et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:1857 encontraron que el antagonista de la substancia P D-Arg -Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Leu-NH2 era un potente antagonista de la
bombesina en células 3T3 de murina suiza.
Agonistas y antagonistas de un amplio aspecto de hormonas péptido biológicamente activas, incluyendo la substancia P, han sido sintetizadas mediante la introducción de modificaciones de los enlaces
péptidos de las hormonas péptido, ver Spatola (1983) en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,
Peptides, and Proteins (B. Weinstein, ed.) M. Dekker, New York & Basel, p. 267-357, para una revisión
reciente del campo.
Empleamos aquı́ las siguientes abreviaturas no comunes:
60
Nle = H2 N-CH-COOH (norleucina)
|
(CH2 )3 -CH3 grupo de identificación
2
ES 2 094 160 T3
Nal = Naftilalanina
SP = Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2 (substancia P).
5
De acuerdo con un primer aspecto de esta invención, proporcionamos un análogo de la substancia P
de la fórmula:
A8
A10
A11
\
|
|
|
A1 -A2 -A3 -A4 -A5 -A6 -A7 -N- CH-CO-A9 -NH-CH-R5 -CH-V1
/
|
R3
R2
R1
10
15
en donde
A1 = el isómero D o L de Arg o Lys;
A2 = el isómero D o L de Pro;
20
A3 = el isómero D o L de Lys;
A4 = el isómero D o L de Pro;
A5 = el isómero D o L de Gln;
25
A6 = el isómero D o L de Gln;
A7 = el isómero D o L de Phe, Trp, β-Nal, o-X-Phe en donde X es F, Cl, Br, NO2 , OH o CH3 , o de
p-X-Phe en que X es F, Cl, Br, NO2 , OH o CH3 ;
30
A8 = el grupo de identificación del isómero D o L de Trp, β-Nal, Phe, o-X-Phe en donde X es F, Cl,
Br, NO2 , OH o CH3 , o de p-X-Phe en que X es F, Cl, Br, NO2 , OH o CH3 ;
A9 = Gly o el isómero D o L de Trp, β-Nal, Phe, o-X -Phe en donde X es F, Cl, Br, NO2 , OH o CH3 ,
o de p-X-Phe en que X es F, Cl, Br, NO2 , OH o CH3 ;
35
A10 = el grupo de identificación del isómero D o L de Leu, Nle, Ala, Val o de Ile;
A11 = el grupo de identificación del isómero D o L de Leu, Nle, Ala, Val o de Ile;
R3 es H o un alquilo C1−12 ; R5 es CH2 -NH; y V1 es
40
O
k
-C-O-R10 ,
o
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50
55
O
R11
k /
-C-N
\
R12
en donde cada R10 , R11 y R12 independientemente, es H, un alquilo C1−12 , un fenil-alquilo C7−10 ,
o un naftil-alquilo C12−20; y R1 y R2 , que enlazan con el nitrógeno del grupo α-amino en el amino
ácido N-terminal son, independientemente, H, un alquilo C1−12 , un fenil-alquilo C7−10, o COE14
siendo un alquilo C1−20, un alquenilo C3−20, un alquinilo C3−20 , un fenilo, un naftilo o un fenil alquilo C7−20, en el supuesto de que cuando uno de R1 o R2 es COE14 , el otro debe ser un hidrógeno;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En un segundo y alternativo aspecto de esta invención, se proporciona un análogo de la substancia P
de la fórmula:
R51
60
A25
A26
A27
A28
A29
A30
A31
\
|
|
|
|
|
|
|
A21 -A22 -A23 -A24 -NH-CH-R54 -CH-R56 -CH-R58 -CH-R60 -CH-R62 -CH-R64 -CH-V10
/
R52
3
ES 2 094 160 T3
donde
A21 = el isómero D o L de Arg o Lys;
5
A22 = el isómero D o L de Pro;
A23 = el isómero D o L de Lys;
A24 = el isómero D o L de Pro;
10
A25 = el grupo de identificación del isómero D o L de Gln;
A26 = el grupo de identificación del isómero D o L de Gln;
A27 = el grupo de identificación de D-Trp; o el grupo de identificación del isómero D o L de Phe;
15
A28 = el grupo de identificación del isómero D o L de Trp, β-Nal, Phe, o-X-Phe en donde X es F, Cl,
Br, NO2 , OH o CH3 , o de p-X-Phe en que X es F, Cl, Br, NO2 , OH o CH3 ;
A29 = el grupo de identificación del amino ácido D -Trp; o el grupo de identificación del isómero D o L
de Phe;
20
A30 = el grupo de identificación del isómero D o L de cualquiera de los amino ácidos Leu, Nle, Ala, Val
o Ile;
A31 = el grupo de identificación del isómero D o L de cualquiera de los amino ácidos Leu, Nle, Ala, Val
o Ile;
25
R54 es CO-NH o CO-NCH3 ; cada R56 R62 y R64 ,
independientemente, es cualquiera de CO-NH o CH2 -NH; R58 es CO-NR69 en que R69 es H o un alquilo
C1−12 o CH2 -NH; R60 es CO-NH; y V10 es
30
O
k
-C-O-R66 ,
o
35
40
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50
55
O
R67
k /
-C-N
\
R68
en donde cada R66 , R67 y R68 independientemente, es H, un alquilo C1−12, un fenil-alquilo C7−10 , o un
naftil-alquilo C12−20; y R51 y R52 , que enlazan con el nitrógeno del grupo α-amino en el amino ácido
N-terminal son, independientemente, H, un alquilo C1−12 , un fenil-alquilo C7−10 , o COE24 siendo un
alquilo C1−12 , un alquenilo C3−20 , un alquinilo C3−20, un fenilo, un naftilo, o un fenil-alquilo C7−10 , en
el supuesto de que cuando uno de R51 o R52 es COE24 , el otro debe ser un hidrógeno; bajo el supuesto de
que al menos uno de R56 , R58 , R62 o R64 es CH2 NH; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Describimos a continuación incorporaciones en las que el análogo se muestra capaz de actuar como un
inhibidor competitivo de la substancia P que ocurre naturalmente por enlace al receptor, y deja de exhibir
la actividad biológica in vivo del péptido que ocurre naturalmente. En incorporaciones preferentes, el
sitio activo del péptido lineal se encuentra en la mitad terminal carboxilo del péptido lineal.
Por un enlace no péptido se entiende que el átomo de carbono que participa en el enlace entre dos
residuos está reducido desde un carbono carbonilo a un carbono metileno, esto es, CH2-NH; o, de modo
menos preferible, CH2 -S, CH2 -CH2 , CH2 -CO, o CO-CH2 . (Se da una descripción detallada de la quı́mica
de enlaces no-péptidos en Coy et al., (1988) Tetrahedron 44, 3: 835-841, incorporada aquı́ como referencia, Tourwe (1985) Janssen Chim. Acta 3: 3-15, 17-18, incorporada aquı́ como referencia, y Spatola
(1983) en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, (B. Weinstein, ed.) M.
Dekker, New York and Basel, pp. 267-357, incorporada aquı́ como referencia).
Los análogos especı́ficos de la SP descritos a continuación, poseen todos el enlace seudopéptido CH2 NH.
60
Preferiblemente, nuestros análogos son el 25% homólogos, más preferiblemente, el 50% homólogos,
con los péptidos que se producen de forma natural.
4
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Ejemplos de análogos de la substancia P preferidos son:
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Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly–Leu-b[CH2 -NH]Leu -NH2 ;
D-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe-D-Trpb[CH2 -NH]Leu -Nle-NH2 ;
D-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leub[CH2 -NH] Nle-NH2 .
Nuestros antagonistas a la SP son útiles en el tratamiento de un paciente que sufre enfermedades que
incluyen inflamación neurogénica, por ejemplo artritis reumatoide, colitis ulcerante, eccema y enfermedad
de Crohn. Nuestros antagonistas a la SP son útiles como agentes anti-proliferativos, por ejemplo en el
tratamiento de carcinoma de pulmón de célula pequeña o desórdenes que incluyan la proliferación de
fibroblastos.
Las propiedades anti-proliferativas de nuestros antagonistas a la SP, permiten también su uso en la
prevención de cicatrización neuronal (facilitando ası́ la regeneración de nervios). La acción de nuestros
antagonistas en la neurotransmisión permite su uso como analgésicos no opiados. Su uso como analgésico
no opiado, puede permitir la restauración de la respuesta al opio.
Nuestros antagonistas son también útiles como agentes antisecretorios, actuando, por ejemplo, en las
glándulas salivarias o en el páncreas.
En las fórmulas genéricas dadas anteriormente, cuando cualquiera de R1 , R2 , R10 -R12, R51, R52 o
R66-R68 es un grupo aromático, lipofı́lico, cuya actividad in vivo puede ser duradera, y puede facilitarse
la entrega de nuestros compuestos al tejido objetivo.
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El grupo de identificación de un α-amino ácido es el átomo o grupo de átomos, distintos del átomo
de carbono del α-carbonilo, el átomo de nitrógeno de α-amino o el átomo H, enlazado con el átomo de
carbono α-asimétrico.
Para ilustrar mediante ejemplos, el grupo de identificación de la alanina es CH3 , el grupo de identificación de la valina es (CH3 )2 CH, el grupo de identificación de la lisina es H3 N+ (CH2 )4 y el grupo de
identificación de la fenil-alanina es (C6 H5 )CH2 . El grupo de identificación de un amino ácido β- o γ-, es
el átomo o grupo de átomos análogo enlazado a, respectivamente, el átomo de carbono β- o γ-. Cuando
el grupo de identificación de un amino ácido no está especificado, puede ser α- β- o γ-.
Otras caracterı́sticas y ventajas de la invención, se harán aparentes por la descripción que sigue de
las incorporaciones preferentes de la misma.
La figura n◦ 1, es un par de gráficos que ilustran el efecto de seudopéptidos de espantida, D-Arg-ProLys -Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Leu-NH2 (panel izquierdo) y de la SP Arg-Pro-Lys-Pro-GlnGln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met -NH2 (panel derecho), en la liberación de amilasa estimulada por la SP desde
las acinas pancreáticas.
b
45
La figura n◦ 2, es un gráfico que muestra el efecto de Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly–Leu[CH2 -NH]Leu -NH2 ; en la liberación de amilasa estimulada por la SP desde las acinas pancreáticas.
La figura n◦ 3, es un par de gráficos que ilustran la capacidad de varios seudopéptidos de la SP y de
la espantida para inhibir el enlace de 125 I-BH-substancia P a acinas pancreáticas.
50
La figura n◦ 4, es un gráfico que muestra la capacidad de seudopéptidos de la SP y de la espantida
para inhibir el enlace de 125 I-(Tyr4 ) bombesina a acinas pancreáticas.
Describimos ahora la estructura, sı́ntesis, y uso de incorporacones preferentes de nuestros análogos de
la SP.
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60
Nuestros péptidos tienen todos modificaciones, por ejemplo, un enlace no péptido en al menos una de
las posiciones indicadas en las que el átomo de carbono que participa en el enlace entre dos residuos, se
reduce de un carbono carbonilo a un carbono metileno. El método de reducción del enlace péptido que
produce este enlace no péptido está descrito en Coy et al., solicitud de la Patente U.S.A. N◦ de serial
879.348, EP-A-0.257.742, asignada al mismo titular de la presente solicitud, y que se incorpora aquı́ como
referencia.
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Nuestros péptidos pueden suministrarse en la forma de sales farmacéuticamente aceptables. Ejemplos
de sales preferidas son aquéllas con ácidos orgánicos terapéuticamente aceptables, por ejemplo, acético,
láctico, maleico, cı́trico, málico, ascórbico, succı́nico, benzoico, salicı́lico, metano-sulfónico, toluenosulfónico o ácido pamoico, ası́ como ácidos poliméricos tales como ácido tánnico o carboxi-metil-celulosa,
y sales con ácidos inorgánicos tales como los ácidos hidrohálicos, por ejemplo ácido clorhı́drico, ácido
sulfúrico o ácido fosfórico.
Sı́ntesis de análogos de substancia P.
10
Sigue a continuación la sı́ntesis de los antagonistas de la substancia P Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-PhePhe-Gly –Leub [CH2 -NH]Leu-NH2 . Pueden prepararse otros análogos de la substancia P haciendo las
modificaciones apropiadas del método sintético siguiente.
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El primer paso es la preparación de la resina intermedia Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly- Leu[CH2 -NH]Leu-NH2 -bencidril-amina como sigue.
La resina de bencidril-amina-polistireno (Vega Biochemicals, Inc.) (0,97 g, 0,5 mmol) en la forma de
ion cloruro, se sitúa en el tanque de reacción de un sintetizador de péptidos Beckman 990B programado
para realizar el siguiente ciclo de reacción: (a) cloruro de metileno; (b) 33% ácido trifluoro-acético (TFA)
en cloruro de metileno (2 veces por 1 y 23 min. cada); (c) cloruro de metileno; (d) etanol; (e) cloruro de
metileno; y (f) 10% de trietil-amina en cloroformo.
La resina neutralizada se agita con alfa-t -butoxicarbonilo (Boc)-leucina y di-isopropil-carbo-di -imida
(1,5 mmol cada uno) en cloruro de metileno durante una hora, y la resina amino ácido resultante se cicla
entonces a través de los pasos (a) a (f) en el programa anterior de lavado. Aldehı́do de Boc-leucina (1,25
mmol), preparado por el método de Fehrentz y Castro, Synthesis, p. 676 (1983), se disuelve en 5 ml de
dimetil-formamida (DMF) seca y se añade a la suspensión salina TFA de la resna seguida por la adición
de 100 mg (2 mmol) de ciano-borohidruro sódico, (Sasaki and Coy, Peptides 8: 119-121 (1987); Coy et
al., id). Después de agitación durante una hora, la mezcla de resina se encuentra que es negativa a la
reacción de ninhidrina (un minuto), indicando una derivatización completa del grupo amino libre.
Los siguientes amino ácidos (1,5 mmol), se acoplan entonces sucesivamente en la presencia de diisopropil -carbo-di-imida (1,5 mmol), y la resina amino ácido resultante se cicla por los pasos de lavadodesbloqueo de (a) a (f) en el mismo procedimiento que anteriormente: Boc-Gly (Boc-Gly se acopla a
un exceso de 6M del p-nitro -fenil-éster), Boc-Phe, Boc-Phe, Boc-Gln, Boc-Gln, (Boc -Gln se acopla a
un exceso de 6M del p-nitro-fenil-éster), Boc-Pro, Boc-Lys, y Boc-Arg. La resina completada se lava
entonces con metanol y se seca con aire.
La resina descrita anteriormente (1,6 g, 0,5 mmol) se mezcla con anisol (5 ml) y fluoruro de hidrógeno
anhidro (35 ml) a 0◦ C y se agita durante 45 minutos. El exceso de fluoruro de hidrógeno se evapora
rápidamente bajo una corriente de nitrógeno seco y el péptido libre se precipita y se lava con éter. El
péptido en crudo se disuelve en un volumen mı́nimo de 2 M de ácido acético, y se purifica en una columna
(2,5 x 90 cm) de Sephadex G-25 que se lava por disolución con dos M de ácido acético, seguido por una
cromatografı́a de media presión de preparación en una columna (1,4 x 45 cm) de sı́lice (10-15 µm Vidac
C18 que se lava por disolución con gradientes lineales de acetonitrilo en 0,1% de ácido trifluoroacético
usando un controlador de gradiente Eldex Chromatrol (tasa de flujo 1 ml/minuto). Cuando es necesario,
se purifican adicionalmente los análogos por re-cromatografı́a en la misma columna con ligeras modificaciones respecto a las condiciones de gradiente cuando es necesario. La homogeneidad de los péptidos
se aseguró por cromatografı́a de capa delgada y cromatografı́a lı́quida de alta presión de fase inversa
analı́tica y la pureza fue del 97% o mayor. El análisis de amino ácidos, dió las relaciones esperadas
de amino ácido. La presencia del enlace péptido reducido se demostró por espectrometrı́a de masa de
bombardeo rápido de átomos.
Cada uno de los análogos dió una buena recuperación del ion molecular correspondiente a la masa
molecular calculada.
Otros complejos pueden prepararse como anteriormente y ensayados para eficiencia como agonistas o
antagonistas en el siguiente programa de ensayo.
60
Fase 1
Liberación de amilasa desde acina pancreática.
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ES 2 094 160 T3
5
La SP estimula la liberación de amilasa en acinas pancreáticas, la estimulación o inhibición por las
acinas pancreáticas se utiliza como una medida de la actividad agonista o antagonista, respectivamente,
de un péptido. Acinas dispersas del páncreas de un animal se suspenden en 150 ml de solución normal
de incubación. La liberación de amilasa se mide como se ha descrito previamente (Gardner et al. (1977)
J. Phisiol. 270: 439). La actividad de la amilasa se determina por el método de Ceska et al. [Ceska et
al. (1969) Clin. Chem. Acta 26: 437 y Ceska et al. (1969) Clin. Chem. Acta 26: 445] utilizando el
reactivo Phadebas. La liberación de amilasa se calcula como el porcentaje de la actividad de amilasa en
las acinas, al principio de la incubación, que se liberó en el medio extracelular durante la incubación.
10
Fase 2
Inhibición competitiva del enlace de
15
20
125
I-Bolton -Hunter-SP.
El enlace de 125 I-Bolton-Hunter-SP (125I-BH-SP) a acinas pancreáticas dispersas se mide como se ha
descrito previamente (Jensen et al. (1984) Biochem. Biophis. Acta 804: 181 y Jensen et al. (1988) Am.
J. of Phisiol. 254: G883). La incubación contiene 0,125 nM de 125I-BH-SP y 0,1% de bacitracina en
solución de reserva de incubación normal y se efectuó durante 30 minutos a 37◦C. El enlace no saturable
de 125 I-BH-SP es la cantidad de radioactividad asociada con las acinas cuando la incubación contiene
0,125 nM de 125 I-BH-SP más una SP sin etiquetar. Todos los valores dados son para enlace saturable,
esto es, enlace medido con 125I-BH-SP solamente (enlazado total). En todos los experimentos el enlace
no saturable fué de <30% del enlazado total.
Fase 3
25
Inhibición competitiva de
30
35
125
I-[Tyr4−] bombesina.
La 125I-[Tyr4− ] bombesina (1100 Ci/mmol) se prepara utilizando una modificación del método descrito
previamente (Jensen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 6139). Iodo-Gen (mg) se disuelve en
5 ml de cloroformo y 5 µl de esta solución (1 µg de Yodo-Gen se transfiere a un vial bajo una corriente de
nitrógeno). A este vial se añaden 50 µl de KH2 PO4 , 6 µg de bombesiba [Tyr4 ] en 50 µl de agua y se añade
1 mCi de Na125 I, mezclados e incubados durante 6 minutos a 4◦ C, en cuyo momento se añade la mezcla
de iodación a un vial de 1 M de ditiotritol y se incuba a 80◦ C durante 60 minutos. La mezcla de iodación
se carga entonces en un cartucho Sep -Pack y se lava por disolución con 0,25 M de tetraetilamonio, y se
purifica usando cromatografı́a lı́quida de alto rendimiento de fase inversa (HPCL) y lavada por disolución.
Resultados de pruebas de péptidos de ensayo.
40
45
50
Un número de análogos de la substancia P, o de la antagonista espantida de la substancia P, conteniendo cada uno un enlace no péptido, pueden ser sintetizados y ensayados en uno o más de los
ensayos descritos en las Fase 1-Fase 3 anteriores. La estructura de la substancia P es Arg-Pro-Lys-ProGln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2. La espantida es un análogo de SP. La estructura de la espantida
es D-Arg-pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp -Leu-Leu-NH2 . La estimulación o inhibición de la liberación de amilasa por las acinas pancreáticas dispersas se utilizó como un ensayo para la actividad
agonista de la SP o para la actividad antagonista de la SP, respectivamente. A una concentración de
10 µM, nueve de diez pseudo péptidos derivados de la SP y de la espantida fracasaron en estimular la
liberación de amilasa cuando estaban presentes solos (tabla 2). Un péptido, Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-GlnPhe-Phe-Glyb [CH2 -NH]Leu -Leu-NH2 tenı́a actividad agonista causando un aumento triple de liberación
de amilasa (tabla 2). Cada uno de los nueve pseudo péptidos sin actividad agonista fue examinado para
actividad como un antagonista de la SP. A una concentración de 10 µM cada uno de los análogos derivados del pseudo péptido espantida inhibieron la liberación de 1 nM-SP-estimulada amilasa (tabla 2). Tres
pseudo péptidos de la SP,
Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly–Leu-b[CH2 -NH]Leu -NH2 ,
55
Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Pheb [CH2 -NH]Gly-Leu-Leu-NH2 , y
Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-b[CH2 -NH]Phe-Phe-Gly-Leu-Leu-NH2 causaron inhibición (tabla 2).
60
Las capacidades relativas de cada péptido para inhibir la liberación de amilasa estimulada por la SP
se determinaron por el efecto de la dosis de péptido en la inhibición. Se efectuaron estudios de inhibición-dosis para cada uno de los nueve pseudo péptidos, utilizando una concentración de la SP (1 nM)
7
ES 2 094 160 T3
que causa una estimulación mitad máxima (figura n◦ 1). Los resultados para los cinco pseudo péptidos
derivados de la espantida se muestran en la figura n◦ 1, panel izquierdo.
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40
D-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leub[CH2 -NH] Nle-NH2 resultó equi-potente de la espantida, causando una inhibición detectable a 0,03 µM e inhibición mitad máxima a 1,8 µM (Tabla 3). El
D-Arg-Pro-Lys-Pro -Gln-Gln-D-Trp-Phe-D-Trpb[CH2 -NH]Leu-Nle-NH2 resultó dos veces menos potente
(IC50 3,5 µM, Tabla 3).
D-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Glnb[CH2 -NH]D-Trp-Phe-D-Trp -Leu-Nle-NH2 fué 2,6 veces (IC50 4,7 µM)
menos potente que la espantida. D-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trpb[CH2 -NH]Phe-D-Trp-Leu-Nle-NH2
fué 3,5 veces (IC50 6,4 µM) menos potente y D-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trp-Pheb[CH2 -NH]D -TrpLeu-Nle-NH2 fué 17 veces (IC50 30 µM) menos potente que la espantida (Tabla 3).
Los resultados para los análogos de pseudo péptido de la SP se muestran en la figura n◦ 1, panel
derecho.
Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly–Leu-b[CH2 -NH]Leu-NH2 fué el más potente derivado de la
SP que causó una inhibición detectable a 0,3 µM y una inhibición mitad de la máxima a 7,1 µM (Tabla
3, derecha). Arg-Pro-Lys -Pro-Gln-Gln-Phe-Pheb[CH2 -NH]Gly-Leu-Leu-NH2 y Arg-Pro -Lys-Pro-GlnGlnb[CH2 -NH]Phe-Phe-Gly-Leu-Leu-NH2 fueron menos efectivos, causando una inhibición detectable a
10 µM. Son, respectivamente, 7 veces y 46 veces menos potentes que el Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-PhePhe-Gly–Leu -b [CH2 -NH]Leu-NH2 (Tabla 3, derecha). Arg-Pro-Lys-Pro-Gln -Gln-Pheb [CH2 -NH]PheGly-Leu-Leu-NH2 no exhibió actividad inhibitoria a concentraciones tan elevadas como 30 µM (Figura
1, derecha). El pseudo péptido antagonista derivado de la SP más potente fué Arg-Pro-Lys-Pro-Gln
-Gln-Phe-Phe-Gly–Leub[CH2 -NH]Leu-NH2 (Figura n◦ 1, Tabla 2).
Los efectos inhibitorios del pseudo péptido antagonista derivado de la SP más potente, Arg-Pro-Lys
-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly–Leub[CH2 -NH]Leu-NH2 se muestran en la figura n◦ 2. Se incubaron acinas
con concentraciones crecientes de la SP. La liberación de amilasa fué detectable con 0,1 nM de la SP, fué
mitad de la máxima con 1 nM de SP2, y fué máxima con 10 nM (figura 2). La adición de Arg-Pro-LysPro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly –Leub [CH2 -NH]Leu-NH2 causó un desplazamiento paralelo hacia la derecha
en la curva dosis-respuesta de liberación de amilasa estimulada por la SP. El cambio fue proporcional a la
concentración de Arg-Pro-Lys-Pro-Gln -Gln-Phe-Phe-Gly–Leub [CH2 -NH]Leu-NH2 añadido, pero no hubo
cambio en la respuesta máxima (figura n◦ 2). D-Arg -Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leub[CH2 NH]Nle-NH2 dió resultados similares (datos no mostrados).
La interacción de análogos derivados de la SP y de la espantida con los receptores de SP de las acinas
pancreáticas, se midió por la capacidad de un péptido para inhibir el enlace de 125I-BH-SP a acinas. (Ver
tabla 3 y figura n◦ 3).
Los pseudo péptidos derivados de la espantida muestran un campo de potencias.
45
50
Los pseudo péptidos derivados de la SP muestran también un rango de potencias. El Arg-ProLys-Pro-Gln -Gln-Phe-Phe-Gly-Leub [CH2 -NH]Leu-NH2 causa una inhibición detectable a 0,1 µM, y una
inhibición mitad de la máxima a 3 µM. El Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Glyb[CH2 -NH]Leu-LeuNH2 es 1,5 veces menor en potencia, el Arg -Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Pheb [CH2 -NH]Gly-Leu-Leu-NH2
es 20 veces menos potente, y el Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln -Pheb [CH2 -NH]Phe-Gly-Leu-Leu-NH2 y el ArgPro-Lys-Pro-Gln -Glnb[CH2 -NH]Phe-Phe-Gly-Leu-Leu-NH2 son más de 62 veces menos potentes, que el
Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe -Gly-Leub [CH2 -NH]Leu-NH2 .
Al contrario de los análogos de la SP estudiados previamente, nuestros péptidos ensayados parecen
ser especı́ficos al receptor de la SP.
55
60
El Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leub [CH2 -NH]Leu-NH2 fué ensayado para su capacidad
de inhibir la liberación de la amilasa producida por varios secretagogos pancreáticos (tabla 4). El ArgPro-Lys-Pro -Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leub[CH2 -NH]Leu-NH2 inhibió la liberación de amilasa estimulada
por la SP, pero no alteró la liberación de amilasa estimulada por la bombesina, CCK-8, Carbacol, VIP,
secretina, GRP A23187 o TPA.
Los antagonistas de receptor más potente se ensayaron para su capacidad para inhibir el enlace de la
8
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20
bombesina 125 I-[Tyr4 ] a los receptores de bombesina de las acinas pancreáticas. La espantida inhibió el
enlace de la bombesina 125I-[Tyr4 ] según se ha expresado previamente (Jensen et al. (1988) Am. J. of
Phisiol. 254: G883) causando una inhibición mitad de la máxima a 3 ± 1 µM e inhibición completa a 100
µM (figura 4). D-Arg-Pro-Lys -Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leub[CH2 -NH]Nle-NH2 inhibió el enlace
de la bombesina 125 I-[Tyr4 ] pero fué 3 veces menos potente que la espantida causando una inhibición
mitad de la máxima a 10 µM (p< 0,04 comparada a la espantida), (figura n◦ 4). Arg-Pro-Lys-Pro-GlnGln-Phe -Phe-Gly-Leub [CH2 -NH]Leu-NH2 no causó una inhibición detectable hasta concentraciones por
encima de 30 µM y tenı́a una Ki calculada de 300 ± 20 µM. La espantida y el D-Arg-Pro-Lys-Pro-GlnGln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leub[CH2 -NH]Nle-NH2 tenı́an una afinidad de 3 a 10 veces más baja para inhibir
el enlace a la bombesina 125 I-[Tyr4 ] según se compara a 125I-BH-SP.
La capacidad del Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe -Gly-Leu b[CH2 -NH]Leu-NH2 para inhibir el
enlace a la bombesina 125 I-[Tyr4 ], fué 70 veces menor que su capacidad para inhibir el enlace de la
125
I-BH-SP.
Nuestros análogos de SP pueden ser administrados a un mamı́fero, particularmente a un humano, en
uno de los modos tradicionales (por ejemplo, oralmente, parenteralmente, trans-dérmicamente, o trans
-mucosamente), en una formulación de liberación sostenida usando un polı́mero biodegradable biocompatible, o mediente entrega in situ utilizando micelas, geles y liposomas.
Los péptidos pueden administrarse a un paciente humano en una dosis de 0,5 µg/kilo/dı́a a
5 mg/kilo/dı́a.
TABLA 1
25
Los cinco residuos terminal-carboxilo de una variedad de péptidos bioactivos.
Péptido
Secuencia terminal carboxilo
Bombesina
Neuromedina-β
Neuromedina-C
Litorina
Neuroquinina-A
Neuroquinina-B
Substancia P
Secuencia prototı́pica de la taquinina
-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2
-Thr-Gly-His-Phe-Met-NH2
-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2
-Val-Gly-His-Phe-Met-NH2
-Phe-Val-Gly-Leu-Leu-NH2
-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH2
-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2
-Phe-X-Gly-Leu-Met-NH2
(donde X = un residuo amino
ácido ramificado alifático
o aromático).
30
35
40
45
TABLA 2
El efecto de varios pseudo péptidos derivados de SP y espantida en liberación de amilasa basa y
estimulada por SP.
50
55
60
Péptido añadido
Liberación de amilasa (% total)
Solo
SP (nM)
Ninguno
3,4 ± 0,5
6,6 ± 0,7
Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe
-Gly-Leub [CH2 -NH]Leu-NH2 (10µM).
3,1 ± 0,7
4,3 ± 0,5∗
|Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe
-Glyb [CH2 -NH]Leu-Leu-NH2 (10µM).
10,4 ± 0,7
NT-agonista
9
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TABLA 2 (Cont.)
5
10
15
20
25
30
∗
Péptido añadido
Liberación de amilasa (% total)
Solo
SP (nM)
|Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe
b
[CH2 -NH]Gly-Leu-Leu-NH2 (10µM).
3,1 ± 1,0
5,4 ± 0,7∗
|Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Pheb[CH2
-NH]Phe-Gly-Leu-Leu-NH2 (10µM).
3,8 ± 0,7
6,4 ± 1,0∗
|Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Glnb[CH2 -NH]
Phe-Phe-Gly-Ley-Leu-NH2 (10µM).
3,1 ± 0,9
6,1 ± 1,0∗
D-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe
-D-Trp-Leub[CH2 -NH]Nle-NH2 (10µM)
3,8 ± 0,05
3,6 ± 0,1∗
D-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe
-D-Trp-b[CH2 -NH]Leu-Nle-NH2 (10µM).
3,9 ± 0,8
4,2 ± 0,2∗
|D-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe
b
[CH2 -NH]D-Trp-Leu-Nle-NH2 (10µM).
4,0 ± 0,5
5,6 ± 0,8∗
D-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trpb[CH2
-NH]Phe-D-Trp-Leu-Nle-NH2 (10µM).
4,1 ± 0,5
4,8 ± 1,2∗
D-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Glnb[CH2 -NH]D
-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Nle-NH2 (10µM).
3,8 ± 0,3
4,5 ± 0,8∗
Significativamente menos que SP solo p = 0,05.
∗∗
Significativamente mayor que sin adiciones p < 0,01.
Los péptidos marcados “|” no caen dentro del alcance de esta invención.
35
40
Las acinas fueron incubadas a 37◦ C durante treinta minutos con un nM SP y concentraciones de 10 µM
de varios análogos de pseudo péptidos de la SP y de la espantida, bien solos, o bien en combinación. La
liberación de amilasa se expresó como porcentaje de la actividad de amilasa en acinas al principio de la
incubación que fue liberada en el medio extracelular durante la incubación. Los valores son medios de
1 SEM por al menos cinco experimentos separados. En cada experimento, cada valor se determinó por
duplicado. Las abreviaturas son:
NT-agonista = no ensayado como un antagonista porque era un agonista.
TABLA 3
45
Capacidades de la SP, espantida y pseudo péptidos para inhibir el enlace de
amilasa estimulada por SP.
I-BH-SP o liberación de
Enlazado
125
I-BH-SP
Inhibición de
liberación de amilasa
estimulada 1Nmsp
Ki o Kd (µM)
IC50 (µM)
|-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe-D
-Trp-Leu-Leu-NH2 ; (espantida).
2,1 ± 0,6
1,8 ± 0,1
D-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe-D
-Trp [CH2 -NH]Leu-Nle-NH2 .
2,2 ± 0,7
1,8 ± 0,25
50
Péptido
55
60
125
10
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TABLA 3 (Cont.)
Enlazado
125
I-BH-SP
Inhibición de
liberación de amilasa
estimulada 1Nmsp
Ki o Kd (µM)
IC50 (µM)
D-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe-D
-Trpb [CH2 -NH]Leu-Nle-NH2 .
3,6 ± 0,7
3,5 ± 0,6
|D-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe
b
[CH2 -NH]D-Trp-Leu-Nle-NH2 .
14,7 ± 2,0
30 ± 5,0
D-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trpb[CH2
-NH]-Phe-D-Trp-Leu-Nle-NH2 .
6,3 ± 3,3
6,4 ± 1,4
D-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Glnb[CH2 -NH]D
-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Nle-NH2 .
4,3 ± 1,1
4,7 ± 1,3
|Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly
-Leu-Met-NH2 (SP).
0025 ± 1,1
No-agonista
Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly
-Leub [CH2 -NH]Leu-NH2 .
4,3 ± 0,3
7,1 ± 0,9∗
|Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly
b
[CH2 -NH]Leu-Leu-NH2 .
5,6 ± 2,2
No-agonista
41,3 ± 16,7
>30
|Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe [CH2 -NH]
Phe-Gly-Leu-Leu-NH2 .
265 ± 16,7
>30
Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Glnb[CH2 -NH]Phe
-Phe-Gly-Leu-Leu-NH2 .
310 ± 88,0
>30
5
Péptido
10
15
20
25
30
|Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe
b
[CH2 -NH]Gly-Leu-Leu-NH2.
b
35
40
Los péptidos marcados “|” no caen dentro del alcance de esta invención.
Los valores son valores medios ± 1SEM125, los valores Kd para SP están obtenidos de valores de
análisis Scatchard de estudios de enlazado de la SP etiquetada 125I- de los valores Ki para agonistas o
antagonistas mediante estudios de enlace de 125 I-BH-SP que fueron obtenidos de acuerdo con la ecuación:
45
50
Ki = (R/1-R) (SB/S+A) donde R es el enlace observado saturable de 125 I-BH-SP en la presencia de
un antagonista (B) expresada como una fracción de la obtenida cuando B no está presente; A es la
concentración de 125I-BH-SP (0,125 nM). B es la concentración de antagonista, S es la Kd de la SP
determinada por el análisis de Scatchard: No -agonista = péptido no ensayado para actividad inhibitoria
debido a su actividad agonista cuando está presente sólo.
55
60
11
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TABLA 4
Capacidad del Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe -Gly-Leub [CH2 -NH]Leu-NH2 para afectar la liberación
de amilasa estimulada por varios secretagogos.
5
Secretagogo
Liberación de amilasa (% total)
Leu11 , b 10-11-SP
sola
(20 µM)
Ninguno
Substancia P (1 nM)
CCK-8 (0,1 nM)
Bombesina (0,3 nM)
Carbacol (10 µM)
VIP (0,3 nM)
Secretina (0,1 µM)
CGRP (0,1 µM)
A23187 (0,1 µM)
TAP (0,1 µM)
2,7 ± 0,4
8,7 ± 1,8
19,7 ± 4,2
14,8 ± 4,1
22,7 ± 4,1
20,5 ± 3,5
18,9 ± 3,6
12,1 ± 3,3
9,9 ± 1,5 ±
32,2 ± 5,7
10
15
20
∗
25
30
2,3 ± 0,3
4,3 ± 0,5∗
21,6 ± 4,9
14,3 ± 3,1
20,7 ± 4,3
18,9 ± 4,1
18,8 ± 4,1
12,0 ± 3,9
11,6 ± 1,6
30,2 ± 5,6
Significativamente menos que con secretagogo solo p < 0,001
Las acinas se incubaron durante treinta minutos a 37◦ C con varios secretagogos pancreáticos solos
o con Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leub[CH2 -NH]Leu-NH2 . En cada experimento, cada valor
se determinó por duplicado, y los resultados dan medianas de ± 1SEM de al menos cuatro experimentos
separados. Abreviaturas: CCK-8, COOH terminal octapéptido de la colecistoquinina; VIP, péptido intestinal vaso-activo, respectivamente; CGRP péptido relacionado con el gen de la calcitonina; A23187 y
TAP, 1,2-o-tetradecanoilforbol-1,3-acetato.
35
40
45
50
55
60
12
ES 2 094 160 T3
REIVINDICACIONES
1. Péptidos terapéuticos, en particular análogos del péptido sustancia P, de la fórmula:
A8
A10
A11
\
|
|
|
A1 -A2 -A3 -A4 -A5 -A6 -A7 -N- CH-CO-A9 -NH-CH-R5 -CH-V1
/
|
R3
R2
R1
5
10
en donde
A1 = el isómero D o L de Arg o Lys;
15
A2 = el isómero D o L de Pro;
A3 = el isómero D o L de Lys;
A4 = el isómero D o L de Pro;
20
A5 = el isómero D o L de Gln;
A6 = el isómero D o L de Gln;
25
A7 = el isómero D o L de Phe, Trp, β-Nal, o-X-Phe en donde X es F, Cl, Br, NO2 , OH o CH3 , o de
p-X-Phe en que X es F, Cl, Br, NO2 , OH o CH3 ;
A8 = el grupo de identificación del isómero D o L de Trp, β-Nal, Ph, o-X-Phe en donde X es F, Cl, Br,
NO2 , OH o CH3 , o de p-X-Phe en que X es F, Cl, Br, NO2 , OH o CH3 ;
30
A9 = Gly o el isómero D o L de Trp, β-Nal, Phe, o-X -Phe en donde X es F, Cl, Br, NO2 , OH o CH3 ,
o de p-X-Phe en que X es F, Cl, Br, NO2 , OH o CH3 ;
A10 = el grupo de identificación del isómero D o L de Leu, Nle, Ala, Val o de Ile;
35
A11 = el grupo de identificación del isómero D o L de Leu, Nle, Ala, Val o de Ile;
R3 es H o un alquilo C1−12 ; R5 es CH2 -NH; y V1 es
O
k
-C-O-R10 ,
40
45
50
o
O
R11
k /
-C-N
\
R12
en donde cada R10, R11 y R12 independientemente, es H, un alquilo C1−12 , un fenil-alquilo C7−10 , o un
naftil-alquilo C12−20 ; y R1 y R2 , que enlazan con el nitrógeno del grupo α-amino en el amino ácido Nterminal son, independientemente, H, un alquilo C1−12 , un fenil-alquilo C7−10 , o COE14 con E14 siendo
un alquilo C1−20 , un alquenilo C3−20 , un alquinilo C3−20 , fenilo, naftilo o fenil -alquilo C7−10 , en el
supuesto de que cuando uno de R1 o R2 es COE14 , el otro debe ser un hidrógeno;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. Péptidos terapéuticos, en particular análogos del péptido sustancia P, de la fórmula:
55
60
R51
A25
A26
A27
A28
A29
A30
A31
\
|
|
|
|
|
|
|
A21 -A22 -A23 -A24 -NH-CH-R54 -CH-R56 -CH-R58 -CH-R60 -CH-R62 -CH-R64 -CH-V10
/
R52
caracterizado en que:
13
ES 2 094 160 T3
A21 = el isómero D o L de Arg o Lys;
A22 = el isómero D o L de Pro;
5
A23 = el isómero D o L de Lys;
A24 = el isómero D o L de Pro;
A25 = el grupo de identificación del isómero D o L de Gln;
10
A26 = el grupo de identificación del isómero D o L de Gln;
A27 = el grupo de identificación de D-Trp; o el grupo de identificación del isómero D o L de Phe;
15
A28 = el grupo de identificación del isómero D o L de cualquiera de los amino ácidos β-Nal, Phe, o-X
-Phe en donde X es F, Cl, Br, NO2 , OH o CH3 , o de p-X-Phe en que X es F, Cl, Br, NO2 , OH o
CH3 ;
A29 = el grupo de identificación del amino ácido D -Trp; o el grupo de identificación del isómero D o L
de Phe;
20
A30 = el grupo de identificación del isómero D o L de cualquiera de los amino ácidos Leu, Nle, Ala, Val
o Ile;
A31 = el grupo de identificación del isómero D o L de cualquiera de los amino ácidos Leu, Nle, Ala, Val
o Ile;
25
30
35
40
45
50
55
60
R54 es CO-NH o CO-NCH3 ; cada R56 R62 y R64 , independientemente, es cualquiera de CO-NH o CH2 -NH;
R58 es CO-NR69 en que R69 es H o un alquilo C1−12 o CH2 -NH; R60 es CO-NH; y V10 es
O
k
-C-O-R66 ,
o
O
R67
k /
-C-N
\
R68
en donde cada R66 , R67 y R68 independientemente, es H, un alquilo C1−12, un fenil-alquilo C7−10 , o un
naftil-alquilo C12−20; y R51 y R52 , que enlazan con el nitrógeno del grupo α-amino en el amino ácido
N-terminal son, independientemente, H, un alquilo C1−12 , un fenil-alquilo C7−10 , o COE24 siendo un
alquilo C1−12, un alquenilo C3−20 , un alquinilo C3−20 , fenilo, naftilo, o un fenil -alquilo C7−10, en el
supuesto de que cuando uno de R51 o R52 es COE24 , el otro debe ser un hidrógeno; bajo el supuesto de
que al menos uno de R56 , R58 , R62 o R64 es CH2 NH; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
3. Péptidos terapéuticos, en particular análogos del péptido sustancia P, de acuerdo con la 1a¯ Reivindicación, caracterizado en que la fórmula es: H -Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leub[CH2 NH]Leu-NH2 ; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
4. Péptidos terapéuticos, en particular análogos del péptido sustancia P, de acuerdo con la 2a¯ Reivindicación, caracterizado en que la fórmula es H-D -Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe-D-Trpb[CH2 NH]Leu-Nle -NH2 , o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
5. Péptidos terapéuticos, en particular análogos del péptido sustancia P, de acuerdo con la 2a¯ Reivindicación, caracterizado en que la fórmula es : HD-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leub[CH2 NH]Nle -NH2 , o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
6. Péptidos terapéuticos, en particular análogos del péptido sustancia P, de acuerdo con la 2a¯ Reivindicación, caracterizado en que la fórmula es: H-D -Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trpb[CH2 -NH]PheD-Trp-Leu-Nle -NH2 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
7. Péptidos terapéuticos, en particular análogos del péptido sustancia P, de acuerdo con la 2a¯ Reivindicación, caracterizado en que la fórmula es: H-D -Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Glnb[CH2 -NH]D-Trp-PheD-Trp-Leu-Nle -NH2 , o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
8. Péptidos terapéuticos, en particular análogos del péptido sustancia P, de acuerdo con la 1a¯ Reivindicación, caracterizado en que:
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A1 = el isómero D o L de Arg;
A2 = Pro;
5
A3 = Lys;
A4 = Pro;
A5 = Gln;
10
A6 = Gln;
A7 = Phe o D-Trp;
A8 = el grupo de identificación de Phe;
15
A9 = Gly o D-Trp
A10 = el grupo de identificación de Leu; y
A11 = el grupo de identificación de Leu o de Nle.
20
9. Péptidos terapéuticos, en particular análogos del péptido sustancia P, de acuerdo con la 2a¯ Reivindicación 2, caracterizado en que:
A29 = el grupo de identificación de D-Trp.
25
10. Péptidos terapéuticos, en particular análogos del péptido sustancia P, de acuerdo con la 2a¯
Reivindicación, caracterizado en que:
A21 = el isómero D o L de Arg;
30
A22 = Pro;
A23 = Lys;
A24 = Pro;
35
A25 = el grupo de identificación de Gln;
A26 = el grupo de identificación de Gln;
A27 = el grupo de identificación de Phe o de D-Trp;
40
A28 = el grupo de identificación de Phe;
A29 = el grupo de identificación de D-Trp;
A30 = el grupo de identificación de Leu; y
45
A31 = el grupo de identificación de Leu o de Nle.
50
55
60
NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
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