Laboratorio Calculo Eficiencia Transformacion_analisis resultados
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Resultados Práctica Transformación Eficiencia de Transformación Para cálculo de eficiencia • Número de colonias transformadas • Cantidad de plásmido agregado a bacterias que están en placa a. Cantidad total de ADN de plásmido al inicio b. Cantidad de ADN de plásmido (en las bacterias) que se agregó a la placa • Cálculo transformantes por ug plásmido Número de colonias transformadas • Conteo en la placa • Si hay muchas se puede contar ¼ de la placa, o la mitad y multiplicar • Ej: 190 Ejemplo a partir de una colonia (una colonia en la solución de transformación) a. Cantidad total de ADN de plásmido al inicio Concentración de plásmido: 0,08 ug/uL Volumen de plásmido: 10uL Volumen de solución de transformación: 250uL Volumen LB (agregado antes de placas): 250uL Cantidad de plásmido agregado a bacterias que están en placa a. Cantidad total de ADN de plásmido al inicio ADN (ug)= conc. plásmido(ug/uL) x vol. plásmido (ul) Cantidad ADN= 0.08ug/uL x 10uL Cantidad total de ADN (plásmido) que usaron: 0.8ug Cantidad de plásmido agregado a bacterias que están en placa b. Cantidad de ADN de plásmido (en las bacterias) que se agregó a la placa (es una fracción del total) Fracción de ADN usado= Volumen en placa/Volumen total en tubo Fracción ADN= 100uL / 510 uL = 0.2 ¿de dónde salieron los 500uL? Total de plásmido en la placa= fracción x cantidad inicial plásmido Total de plásmido en la placa= 0.2 x 0.8ug = 0.16ug Cálculo transformantes por ug plásmido Eficiencia de transformación= número de transformantes / ug de plásmido en placa Eficiencia de transformación= 190 transformantes/0.16ug= 1187 transformantes/ug Aplicaciones transformación CYP1B1 • Un gen del citocromo p450 • CYP P450: Familia grande enzimas, la mayoría cataliza oxidación de sustancias orgánicas • Los sustratos de las enzimas CYP incluyen lípidos, hormonas esteroideas, sustancias xenobióticas (como los fármacos y drogas) • Mutaciones en CYP1B1 causan glaucoma primario congénito (herencia AR) Análisis funcional de mutaciones en CYP1B1 • Efecto de ciertas mutaciones en actividad enzimática • Se había publicado variación en actividad enzimática para variantes silvestres con diferentes haplotipos de los 5 SNPs en CYP1B1 • Analizamos las mutaciones incluidas en el haplotipo correspondiente Variantes analizadas Variante Mutación Haplotipo base (5 SNPs codificantes) Nomenclatura CYP1B1 Proteína ADN (5’-3’) 1 - CYP1B1.1 RALDN CGCCA 2 - CYP1B1.2 GSLDN GTCCA 3 - CYP1B1.3 RAVDN CGGTA 4 - CYP1B1.4 RALDS CGCCG 5 p.Y81N CYP1B1.2 GSLDN GTCCA 6 p.E229K CYP1B1.2 GSLDN GTCCA 7 p.G61E CYP1B1.3 RAVDN CGGTA 8 p.N203S CYP1B1.3 RAVDN CGGTA 9 p.L343del CYP1B1.4 RALDS CGCCG Secuencia Transformar levaduras Plásmido con gen CYP1B1 Extraer microsomas Introducir al gen silvestre las variantes deseadas por mutagénesis dirigida Transformar E. coli para tener muchas copias de los plásmidos con las variantes deseadas * Medir concentración de CYP1B1 en extractos Determinar actividad enzimática Mutagénesis Dirigida Mecanismo básico de mutagénesis dirigida Original CAG CAG GTC GTC (5) (1) Traducción Val CAG Proteína original Mutante + primer (2) CGG CAG primer (3) GCC GCC CAG GCC Traducción (6) + polimerasa Thr (4) Proteína mutante Replicación Cambio de un aminoácido Val → Thr Diseño de primers para mutagénesis dirigida 5’ Stratagene: 3’ * 3’ 5’ * • Primer tiene la mutación • Mutación debe de estar en el medio • Longitud de 25-45 nucleótidos y contenido GC de por lo menos 40%. • La Tm alrededor de 78˚C. • El extremo 3’ del primer tiene que ser C o G Siguientes pasos • Miniprep para aislar plásmidos • Secuenciar para confirmar cambio Vector pYeDP60 • Vector “shuttle”: se puede propagar en dos diferentes especies. Se debe poder replicar y tener una forma de selección en ambos organismos: – Parte E. coli: origen de replicación, marcador de selección es beta lactamasa (resistencia a ampicilina) – Parte levadura: ARS (autonomously replicating sequence), CEN (centrómero de levadura), marcador de selección (URA3, ADE2) • Promotor de galactosa: reprimido por glucosa, inducido por galactosa ADE2: enzima en la vía de adenina. Mutantes ADE2 son rojas URA3: enzima necesaria para producción de uracilo. Transformación Levaduras • Transformación de levadura es muy similar a la transformación de E.coli Levadura INVSc1-HR • Mutación en URA3 enzima para síntesis de uracilo. No puede crecer en medio sin uracilo • HR: expresa la enzima reductasa humana. La actividad de p450 depende de electrones que le da la citocromo p450 reductasa. La actividad endógena de la reductasa puede no ser suficiente, por eso se sobreexpresa para asegurar la expresión de CYP1B1. Extracción de microsomas • Microsomas son artefactos tipo vesícula que se forman a partir del RE cuando las células se rompen en el laboratorio • No se encuentran en las células in vivo • Se pueden separar del resto de la célula por centrifugación diferencial • Células sin romper, núcleos y mitocondrias sedimentan a 10 000g • Enzimas solubles y RE fragmentado (que contiene p450) quedan en solución • A 100 000g el RE sedimenta como un “pellet” pero las enzimas solubles quedan en sobrenadante • Así se aíslan y concentran microsomas con p450 Cantidad de proteína, concentración P450 • Concentración de proteína: espectrofotómetro • Concentración P450: método Omura y Sato Actividad Enzimática Kit P450-Glo Actividad enzimática Abundancia relativa Actividad enzimática relativa Hacer el cálculo de eficiencia de transformación con datos propios Ver manual de insTAclone Ejercicio adicional de cálculo de eficiencia
