Análisis ELISA para la determinación cuantita

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Análisis ELISA para la determinación cuantitativa de Cortisol en suero o plasma humano
Presentación
55050
[REF]
96 determinaciones
Estuche completo
[IVD]
Uso previsto
Cortisol (Hidrocortisona, Componente F), un esteroide C21 con un peso
molecular de 363,5 Dalton, es el glucocorticoide humano más
importante. Es formado y secretado por la corteza suprarrenal.
El 90% del cortisol está ligado a la plasmaproteína transcortina y un 7%
está ligado a la albúmina. El resto, la parte no ligada, es la forma
biológicamente activa del cortisol, que puede ser determinada en suero,
plasma, saliva u orina.
Entre las hormonas secretadas por la corteza suprarrenal, juega
solamente el cortisol, mediante el mecanismo de retroacoplamiento
negativo, un papel en la regulación de la secreción de ACTH.
Los glucocorticoides intervienen regulando en los importantes procesos
fisiológicos del metabolismo de hidratos de carbono (por ej. glucogénesis,
síntesis de glicógeno o aumento de glucosa sanguínea), proteínas
(incremento del catabolismo, inhbición de la síntesis) y lípidos. Ellos
participan también en la inhibición de reacciones alérgicas e inflamatorias. El cortisol entonces juega un papel importante en reacciones de
estrés del cuerpo humano, por ej. operaciones, enfermedades mayores o
en traumas severos.
Notas de seguridad
No ingiera los reactivos. Evite el contacto con los ojos, piel y membranas
mucosas. Todas las muestras de pacientes y [CAL] deben ser manipulados
como posibles agentes potencialmente infecciosos. [CAL] han sido
encontrados negativos para HBsAg y anticuerpos contra VHC y VIH 1 + 2
en los donantes. Use ropa protectora y guantes desechables según las
buenas prácticas de laboratorio (GLP).
Todos los materiales contaminados con muestras o [CAL] deben inactivarse por métodos aprobados (autoclavado o tratamiento químico) según
las regulaciones aplicables.
[STOP] irrita los ojos, la piel y membranas mucosas. En caso de contacto,
lave intensamente con abundante agua y consultar un médico.
Estabilidad
Los reactivos son estables hasta las fechas de caducidad señaladas en las
etiquetas individuales cuando se almacenan a 2...8°C.
Después de abierto los reactivos deben almacenarse a 2...8°C y utilizarse
dentro de 60 días (ver también „Nota“).
[MIC]
- Están selladas en un envase de aluminio con un desecante.
- Antes de abrir, las tiras deben estar a temperatura ambiente.
- Las tiras no utilizadas deberán ser devueltas al envase con cierre y
almacenadas con el desecante. Las tiras almacenadas de esta manera a
2...8°C pueden ser usadas dentro de 60 días (ver “Nota”).
- No toque el bordo superior o el fondo de los micropocillos con los
dedos.
La determinación de cortisol se efectúa para el diagnóstico clínico de
anormalías de la síntesis glucocorticoide 1, por ej. sospecha del síndrome
de Cushing, enfermedad de Addison o insuficiencia de la corteza
suprarrenal.
Preparación de reactivos
Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente (15...25°C) antes
del uso. Los reactivos que no están en uso deben almacenarse siempre a
2...8°C.
Principio
- EIA Competitivo El análisis CORTISOL ELISA de HUMAN está destinado al uso profesional.
El ELISA se basa en la interacción competitiva de cortisol de la muestra y
un conjugado enzimático–hormonal por una cantidad limitada de
anticuerpos anti-cortisol monoclonales (ratón). Por eso la cantidad de
conjugado hormonal-enzimático ligado es inversamente proporcional a la
concentración de cortisol en la muestra.
Solución de trabajo de lavado [WASH]
- Diluir [WS] a 1200 ml con agua fresca, desionisada en recipiente
apropiado. Enjuague el frasco varias veces.
Después de la incubación de la muestra y del conjugado hormonalenzimático, el conjugado no ligado es eliminado por lavado. Con la
adición de la solución sustrato (paso 2) se desarrolla un color azul, que se
transforma a amarillo después de parar la reacción. La intensidad del
color es inversamente proporcional a la concentración de cortisol de la
muestra.
No use muestras hiperlipémicas o hemolíticas así como muestras que
contienen azida de sodio.
La absorbancia de los calibradores y muestras se determina haciendo uso
de un lector de micropocillos ELISA o sistemas completamente
automatizadas (p.ej. instrumentos de las líneas HumaReader o ELISYS de
HUMAN). Los valores de concentración de muestras desconocidas se
determinan mediante una curva de calibración obtenida con ayuda de
calibradores de concentraciones conocidas de cortisol.
Reactivos y contenidos
[MIC]
12
Tiras de Micropocillos (en portatiras)
Tiras (divisibles) de 8 pocillos
[CON]
[WS]
[SUB]
[STOP]
Solución de lavado (tapa negra)
Concentrado para aprox. 1200 ml
TWEEN 20
TRIS-NaCl-buffer
14 ml
Solución sustrato (tapa amarilla)
listo para usar
3,3', 5,5'- Tetrametilbenzidina (TMB)
Peróxido de hidrógeno
Buffer acetato de sodio
DMSO
14 ml
Solución de parada (tapa roja)
Acido sulfúrico
Agentes preservantes: Concentración total < 0,6%
Procedimiento
Siga el procedimiento exactamente como se describe.
Notas de uso
U1: No mezcle o use componentes de diferentes números de lote. No
mezcle tapas de envases (riesgo de contaminación). No use reactivos
despúes de sus fechas de expiración.
U4: [MIC] – saque el número requerido y colóquelos firmemente en el
portatiras.
Conjugado enzimático-antígeno (tapa blanca)
listo para usar, coloreado rojo
Conjugado cortisol – HRP
pH 7.3  0.1
BSA
0.4 %
TRIS/MOPS buffer
0.05 mol/l
NaCl
0.1 mol/l
30 ml
Las muestras pueden almacenarse 3 días a 2...8°C o hasta 30 días a -20°C.
Congele y descongele solamente una vez. Las muestras descongeladas
deben ser homogeneizadas. Elimine el material particulado por
centrifugación o filtración.
U3: Note el reparto [CAL], las muestras y los controles cuidadosamente
en la hoja provista en el estuche.
A - G Calibradores (tapa blanca)
7x1.0mllistos para usar, en suero humano
Concentración de cortisol: 0 (A), 20 (B),
50 (C), 100 (D), 200 (E), 400 (F) y 800 (G) ng/ml
25 ml
Muestra
Suero o Plasma EDTA
U2: No use reactivos que pueden ser contaminados o que tienen aspecto
diferente o olen diferentemente que normal.
con anticuerpos (ratón) anti-cortisol
[CAL]
- Estabilidad: Hasta 2 semanas a 15...25°C.
pH 7.3  0.1
0.2 %
3.0 mmol/l
pH 3.5 – 4.0
0.26 g/l
0.015 %
0.05 mol/l
<5%
0.5 mol/l
U5: Analice cada [CAL], control o muestra por duplicado. Pipetéelos en el
fondo de los micropocillos.
U6: Siempre deben agregarse los reactivos en el mismo orden y tiempo
para minimizar diferencias en los tiempos de reacción entre los
micropocillos. Es importante para obtener resultados reproducibles.
El pipeteo de las muestras no debe exceder de 10 minutos. De lo
contrario pipetee la curva [CAL] en las posiciones indicadas en la
mitad del intervalo de la serie. Si se emplea más de una placa, repetir
la curva de calibración para cada placa.
U7: Evite/remueva burbujas de aire antes de las incubaciones y lecturas
de absorbancia.
U8: [SUB] inicia y [STOP] termina una reacción cinética. Evite la luz
intensa durante el desarrollo del color.
U9: [MIC] -Después de cada pipeteo agite suavemente durante 20-30 sec.
sin verter las soluciones para asegurar una buena mezcla. Si está
disponible, mezcle en un mezclador de pocillos (p.ej. HumaReader).
Procedimiento de lavado
El procedimiento de lavado es crítico. Un lavado insuficiente producirá
una mala precisión o absorbancias falsamente elevadas.
L1: Aspire el contenido, agregue [WASH], aspire después de aproximadamente 30 sec. de enjuague y repita el lavado.
L2: En el caso de lavadores automáticos, se deben llenar y enjuagar con
[WASH] y después lavar los pocillos 3 veces. Asegúrese que el lavador
llene los pocillos completamente y los espire eficientemente después
de 30 sec. (líquido remanente: < 15 µl).
L3: Después del lavado, remueva el líquido remanente invirtiendo los
micropocillos sobre papel absorbante.
Esquema de pipeteo
Los reactivos y las muestras deben estar a temperatura ambiente antes
del uso.
Paso 1
[CAL] A-G; en duplicado
Muestras, controles; en duplicado
Pocillo [µl]
A1...F2
G2...
20
--
--
20
200
200
Valores normales
8:00 horas (de la mañana)
Valores de cortisol
Niños 4
 5 días
2-12 meses, 2-15 años
16-18 años
6 – 200 ng/ml
24 – 230 ng/ml
24 – 290 ng/ml
Adultos5
50 – 250 ng /ml
Factor de cálculo: 1 ng/ml = 2,76 nmol/l
Cada laboratorio debe determinar sus propios rangos de referencia
utilizando los instrumentos/equipos, métodos de colección de sangre y
técnicas de análisis usuales empleados normalmente en dicho
laboratorio.
Características de la ejecución
La sensibilidad analítica de la prueba CORTISOL ELISA es de 1,1 - 1,5 ng/ml
de material de muestra.
Las muestras con una concentración de cortisol por encima de 800 ng/ml
deben diluirse con [CAL] A (0 ng/ml) al 1+9 y debe multiplicarse el
resultado por 10.
Mezcle
Las características de ejecución de la prueba pueden consultarse en el
informe de verificación, accesible vía
Incube por 60 min. a 20...25°C
www.human.de/data/gb/vr/el-cort.pdf o
[CON]
www.human-de.com/data/gb/vr/el-cort.pdf
Lave 3 veces, como descrito (ver L1/L2 + L3)
[WASH]
400
400
100
100
100
100
Paso 2
[SUB]
Nota
Incube por 15 min. a 20...25°C (ver U8)
[STOP]
Si no puede acceder a las características de la ejecución vía internet,
póngase en contacto con su distribuidor local quien se las proporcionará
sin costo alguno.
Mezcle cuidadosamente
Mida la absorbancia a 450 nm lo más pronto posible o dentro de
30 min. después de terminar la reacción usando una longitud de onda
de referencia de 620 - 690 nm (si está disponible).
Validación del análisis
Los resultados son válidos si se cumplen los siguientes criterios:
La absorbancia media (DO) de [CAL] A ≥ 1,0.
La diferencia entre los duplicados de [CAL] A no excede de un 10%.
Cálculo
Grafique las absorbancias mesuradas contra las concentraciones de [CAL]
en papel milimetrado lineal. La interpolación apropriada de los puntos
mesurados graficados da lugar a una curva de calibración desde la cual
puede determinarse la concentración del analito en la muestra.
Para calcular las concentraciones del analito, seleccionar una opción apropriada y validada para el cálculo de la curva (recomendación: punto a
punto).
Control de calidad
Según las buenas prácticas de laboratorio (GLP) deben analizarse
controles con cada curva de calibración. Para asegurar el funcionamiento
adecuado de la prueba, debe efectuarse un número estadísticamente
significativo de controles para establecer los valores medios y rangos
aceptables. Las muestras de control de calidad deben analizarse según las
regulaciones locales. Los resultados deben estar dentro de los rangos
establecidos.
[CON] puede contener partículas negras que aún no interfieren en el
resultado del test.
Los componentes del estuche son estables hasta la la fecha de caducidad
aún después de abiertos. Sin embargo, la posibilidad de una
contaminación está directamente relacionada con el número de tomas
del reactivo. Por lo tanto, el límite de 60 días en frascos abiertos se fijó por
razones de seguridad.
La manipulación debe siempre estar de acuerdo con las buenas prácticas
de laboratorio (GLP*). ¡Los criterios de validación del análisis deben
cumplirse siempre!
(*Esto incluye: Coloque la tapa debida en el vial y ciérrelo firmemente / Saque de los viales
de stock solamente los reactivos necesarios para la corrida si entraran en contacto con otras
soluciones contaminantes como lo son las muestras, etc. / Las soluciones de stock siempre
deben regresarse a 2...8°C si no se usan.)
Literatura
1. Orth D.N et al., Williams textbook of endocrinology, (S.D. Wilson and
D.W. Foster eds.), Philadelphia: Saunders, 578-579 (1992)
2. Perry L.A., Grossman A.B., Ann. Clin. Biochem. 34, 345-359 (1997)
3. Oelkers W. et al., In: Rationelle Diagnostik in der Endokrinologie
(Ziegler R. et al. eds.) Stuttgart: Thieme, 137 (1993)
4. Jonetz-Mentzel L., Wiedemann G., J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 31,
525-529 (1993)
5. Murphy B.E.P., J. Clin. Endocrinol. Metab. 27, 973-990 (1967)
EL-CORT
INF 5505001 E
11-2013-24M
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Interpretación de resultados
La concentración de cortisol está sujeta a fuertes fluctuaciones
circadianas con valores altos por la mañana y bajos por la noche. Por esta
razón es muy importante realizar siempre determinaciones de cortisol de
muestras que fueron obtenidas a una hora definida (comúnmente
8 horas de la mañana). Solamente entonces puede resultar una
interpretación útil (véase valores normales).
Valores de cortisol por encima de los valores normales (hipercortisolismo)
señalan al síndrome de Cushing, el cual es indicado en pacientes con
concentración anormal de transcortina, por ej. en adiposidad, embarazo o
hipotiroidismo. Sin embargo, tampoco puede excluirse el síndrome de
Cushing con valores en el rango normal 2.
Hipocortisolismo (valores de cortisol en repetidas determinaciones por
debajo de valores basales) es comprobable en insuficiencia primaria y
secundaria de la corteza suprarrenal, la cual debe confirmarse efectuando
una determinación de ACTH 3.
La determinación de cortisol por sí sola es insuficiente para un
diagnóstico. La anamnesis así como exámenes clínicos adicionales,
especialmente parámetros diagnósticos (hormonales), deben tenerse en
cuenta.
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