Cultivos Sumergidos

Cultivos
Sumergidos
Cultivos de líneas celulares en suspensión:
suspensión:
Conjunto de células homogéneas o agregados
celulares, suspendidas en medio líquido que
constituyen una línea celular
Cultivo de clones en suspensión :
Cuando la línea celular se establece a partir de
una sola célula
Obtención
Disgregación mecánica de callos friables
Para obtener células finamente suspendidas son necesarios
varios repiques y generaciones celulares
Tamiz (300 a
500 µm)
Callo friable
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1st repique
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• • •
2nd Repique
Las células en suspensión son generalmente similares a
células de tipo parenquimáticas:
•presentan grandes vacuolas
• poco citoplasma
• están rodeadas de una pared celular fina
•Gran tamaño (10-100µM)
•Tienden a la formación de agregados
•Presentan crecimiento lento
•Presentan baja demanda de oxígeno pero no
pueden vivir en anaerobiosis
A filamentous
cell of a shoot
cell
suspension of
Erythrina
A filamentous
septated cell
dividing
actively at
one end to
form an
aggregate
A giant filamentous
cell (G) Note the
difference in the size
between the giant
cell, the smaller
generally occurring
filamentious cells and
the isodiametric cell.
A giant (G) and
normal (N)
isodiametric cell in
a shoot cell
suspension culture
of Erythrina.
Los agregados de cientos de células son el resultado
de la no dehiscencia luego de la división celular.
Se pueden presentar inconvenientes como la
generación de gradientes en el suministro de
nutrientes.
A typical aggregate of small, viable,
isodiametric cells of a shoot cell
suspension culture of Erythrina
which occurs in the the exponential
and linear growth phases
Agitación
entre 70 y 150 rpm
• asegurar la aireación
• evitar la ruptura de las paredes celulares rígidas
debido al alto porcentaje de celulosa y al gran
tamaño de las células vegetales (de 10 a
100mm).
formas de cultivar suspensiones
Cultivos en Batch –
Se utiliza un volumen de medio finito durante cada ciclo
de cultivo que se preolonga hasta que algun nutriente se
convierta en limitante (frecuentemente la fuente de C)
Cultivos continuos o semicontinuos
El medio de cultivo es rellenado o reeemplazado durante
el ciclo
Agitadores orbitales
Orbital shaker
30-150 rpm
Parámetros para expresar la tasa de crecimiento:
Peso Seco:
Consiste en filtrar el volumen de suspensión tomado como muestra,
secarlo, con vacío, a 50 °C hasta peso constante.
La desventaja que presenta este método es que se destruye el material
vegetal.
Peso Fresco:
En este caso se filtra el material vegetal y se pesa.
La desventaja es que este dato puede ser falso, si el aumento de peso se
debe a aumento de volumen celular y no a un aumento irreversible de
masa celular.
Volumen de empaquetamiento (VPC):
Relación de volumen de células referido al volumen de suspensión. Se
basa en centrifugar en tubo graduado a 3000 r.p.m. durante 5 minutos una
fracción de suspensión celular.
VPC =
volumen de células
volumen de suspensión
Comparación entre peso fresco y peso seco
Las células en suspensión presentan
Tiempos de duplicación de 24-72 h
superiores índices de crecimiento que los callos
Posibilidad de perder la totipotencia
Habituación hormonal
Cambios en niveles de ploidía
Baja resistencia al stress mecánico
Cultivos contínuos
Cultivos contínuos
Cultivos contínuos cerrados:
Se remueve parte del medio metabolizado y
se reemplaza con medio fresco en forma
contínua o periódica. Al finalizar el ciclo se
“cosechan” células y medio.
Cultivos contínuos abiertos
Se remueve medio de cultivo pero también
células se mantiene la densidad celular a
niveles óptimos.
Cultivos contínuos cerrados:
Presentan fases exponencial, lineal y
estacionaria muy extendida
Se mantiene la viabilidad celular en fase
estacionaria
Cultivos contínuos abiertos:
El cultivo puede ser sostenido en
cualquier fase de crecimiento por años
•
Cultivo contínuo cerrado
Crecimiento
Cultivo en batch
0
5
10
15
20
25
Tiempo (días)
Cultivos en suspensión
Embriogenesis
Protoplastos
Metabolitos
secundarios
Biotransformaciones
Semillas artificiales
Modificación
celular
Transferencia de genes
Fusión