Cultivo y aislamiento de patógenos viables

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TEMA 10
CULTIVO Y AISLAMIENTO DE
PATÓGENOS VIABLES
ÍNDICE DE CONTENIDOS
Introducción
Preparación de medios artificiales
Condiciones para el aislamiento de patógenos
Microorganismos y oxígeno
Incubación en condiciones anaerobias
Incubación de microorganismos capnófilos
Temperatura de incubación, pH, humedad
Medios artificiales. Ejemplos.
Medios de aislamiento primario (medios de crecimiento)
Medios de enriquecimiento
Medios selectivos
Medios diferenciales
Medios cromogénicos
Cultivo de patógenos intracelulares obligados
Introducción
Regla de oro de la microbiología
Cultivo y
aislamiento de
microorganismos
Muestra
identificación
Cultivo puro
Realización
pruebas
susceptibilidad
Etapa limitante en la rapidez del
diagnóstico microbiológico
Medios de cultivo
Qué es un medio de cultivo
Medios deshidratados
Cientos de formulaciones
Empresas del sector farmacéutico
dedicadas a la producción y control de
calidad de los medios
Placas de petri y tubos con todos los
medios necesarios
EXISTEN CIENTOS DE
FORMULACIONES
DISPONILES EN EL
MERCADO
Preparación de medios de cultivo artificiales
Preparación
Esterilización
Autoclave
Tindalización
Filtración
Luz UV
Estufas a 180 ºC
Óxido de etileno
Adición de sustancias termolábiles
Vertido en placas de petri (medios sólidos) o
tubos (medios líquidos o medios sólidos)
Condiciones para el desarrollo de patógenos
Medio de cultivo
No exigentes (nutrientes (C, N, S, P) sales, tampón)
Exigentes (ídem. + sustancias complejas (sangre, suero,
huevo, patata, factor X, factor V, vitaminas)
Condiciones ambientales adecuadas
Atmósfera adecuada
Temperatura adecuada
Humedad
Tiempo de incubación
pH
Ausencia de factores inhibidores o antagonistas del
crecimiento
Relaciones de los microorganimos
con el oxígeno
Aerobios
Anaerobios facultativos
Anaerobios
Estufas para anaerobios
Bolsas para anaerobios
(generan H2 y CO2) (Gas-Pak)
Microaerófilos
Frascos con vela
Agar semisólido
Capnófilos
Atmósfera de CO2
Sistemas Gas Pak, Bio Bag
(bicarbonato y ácidos)
Utilización de estufas de CO2
Sistemas para anaerobiosis
Sistemas para incubación de
microorganismos capnófilos
Jarra con vela
Estufas CO2
Sistemas Biobag, Gas
Pak (bicarbonato y
ácidos)
CONDICIONES DE INCUBACIÓN
Temperatura de incubación
35-37 ºC
30 ºC
Otras temperaturas
Elevadas (42 ºC)
Bajas (4ºC)
enriquecimiento en frío
Intermedias (22 ºC)
Tiempo de incubación
pH
Clasificación de los medios de cultivo
Medios de aislamiento primario (medios de
crecimiento y medios enriquecidos)
Medios de enriquecimiento
Medios diferenciales
Medios selectivos
Medios cromogénicos
Ejemplos de medios de aislamiento primario o
medios de crecimiento y medios enriquecidos
Agar nutritivo
Agar infusión de cerebro y corazón (BHIA)
Agar triptona soja (TSA)
Agar sangre
Agar chocolate
Agar CLED (urocultivo)
Agar de Múeller-Hinton
Caldo de carne picada
Caldo tioglicolato
Agar BHIA (Infusión de cerebro y corazón )
Componentes
Cantidad
Propiedad
Extracto de cerebro
7,8 g/l
Fuente de nutrientes
Extracto de corazón
9,7 g/l
Fuente de nutrientes
Peptona
10 g/l
Fuente de proteínas
Dextrosa
2 g/l
Hidrato de carbono
Tampón fosfato
2,5 g/l
Regulación pH
NaCl
5 g/l
Sales
Agar
15 g/l
Agente solidificante
Objetivo
Medio rico, no selectivo, permite crecimiento de la mayoría de
microorganismos no exigentes
Ausencia de agentes inhibidores
CLED (cistina-lactosa-deficiente en electrolitos
Componentes
Cantidad
Digerido pancreático de gelatina
Digerido pancreático de caseína
Extracto de carne
Lactosa
L-cistina
Azul de Bromotimol
Agar
4 g/L
4 g/L
3 g/L
10 g/L
0,128 g/L
0,02 g/L
15 g/L
Medio rico y selectivo
Específico para urocultivo
Deficiencia de electrolitos inhibe la
movilidad de Proteus
Características y usos de algunos medios más
frecuentemente utilizados
Agar sangre
Triptona
Hidratos de carbono
NaCl
Tampón
Agar
5% sangre desfibrinada
Medio enriquecido y selectivo
Permite ver distintos tipos de
hemolisis, es diferencial
Recuento de patógenos mediante
la técnica de estría en placa
También se utiliza para cuantificación
de resultados:
Estimación del número de
microorganismos en la muestra
original en función del crecimiento:
Crecimiento escaso
Crecimiento moderado
Crecimiento abundante
Recuento de patógenos mediante el uso del
asa calibrada (u.f.c.)
Y también se utiliza para recuento de microorganismos
mediante siembra con asa calibrada, recuento de unidades
formadoras de colonias por mililito (u.f.c./mL)
Caldo con carne picada para
cultivo de anaerobios
Es un medio rico , pero es un caldo, un
medio líquido
Caldo con carne picada
fuente de
proteínas y nutrientes, potencial redox
bajo (ambiente reductor)
Añadido o no de glucosa
Anaerobios (parafina líquida)
Ejemplos de caldos de enriquecimiento
Son medios líquidos que llevan una concentración baja de agentes
inhibidores
Retrasan el crecimiento de los microorganismos comensales de la
microbiota
Permiten enriquecer la muestra en un determinado patógeno que era
menos abundante respecto al resto de la microbiota
Caldo selenito
Caldo tetrationato
Caldo Gram negativos
Subcultivar en medios más selectivos al cabo de 6-8 horas
Salmonella
Salmonella y Shigella
Salmonella y Shigella
Caldo selenito
Componentes
Cantidad Propiedad
Peptona
5 g/l
Fuente de proteínas
Lactosa
4 g/l
Hidrato de carbono
Selenito de sodio 4 g/l
Fosfato de sodio
10 g/l
Agente inhibidor de la mayoría de Enterobacterias,
incluyendo muchas especies de Shigella
Tampón
Objetivo
Enriquecimiento de especies de Salmonella en muestras de heces,
aguas fecales, etc.
Subcultivar al cabo de 8-12 horas en medio más selectivo (agar SS o
agar sulfito de bismuto)
Medios selectivos
Llevan una concentración alta de agentes inhibidores
Permiten crecer a unos microorganismos pero inhiben
el crecimiento de otros
Los agentes inhibidores son sustancias de diferente
naturaleza química
Agentes inhibidores: colorantes (azul de metileno, cristal violeta, verde
brillante, eosina), antibióticos, metales (Se, Bi), sales biliares, azida,
alcoholes (alcohol feniletílico), cloruro sódico a alta concentración
Ejemplos de medios selectivos
Moderadamente selectivos
MacConkey
EMB
Altamente selectivos
Agar salino manitol
Medio SS
Agar Hektoen
Agar sulfito de bismuto
Agar xylosa-lisina-dexosicolato
Agar PEA
Agar Columbia CNA
Staphylococcus
Salmonella y Shigella
Salmonella y Shigella
Salmonella y Shigella
Salmolella y Shigella
Gram positivos
Gram positivos
Agar MacConkey
Componentes
Cantidad
Propiedad
Peptona
17 g/l
Fuente de proteínas
Polipeptona
3 g/l
Fuente de proteínas
Lactosa
10 g/l
Azúcar fermentable
Sales biliares (conc. moderada)
1,5 g/l
Inhibidor de gram positivos
Cristal violeta
0,001 g/l
Inhibidor de gram positivos
NaCl
5 g/l
sales
Rojo neutro
Agar
Indicador de pH
13,5 g/l
Agente solidificante
Objetivo
Aislamiento y diferenciación de bacilos entéricos gram
negativos fermentadores y no fermentadores de la lactosa
Agar MacConkey
Diferenciación de bacilos entéricos gram negativos
fermentadores y no fermentadores de lactosa
Colonias rojas/rosa
Fermentadores de lactosa
No patógenos (E. coli, Klebsiella,
Citrobacter)
Colonias transparentes
No fermentan la lactosa
Patógenos (Pseudomonas,
Salmonella, Shigella, Yersinia,
Proteus)
Agar entérico Hektoen
Componentes
Cantidad
Propiedad
Peptona
12 g/l
Fuente de C y N
Extracto de levadura
3 g/l
Fuente de N
Sales biliares (alta conc.)
9 g/l
Inhibidor de gram positivos
Lactosa
12 g/l
Azúcar fermentable
Sacarosa
12 g/l
Azúcar fermentable
NaCl
5 g/l
Sales
Tiosulfato de sodio
5 g/l
Fuente de azufre e inhibidor
Citrato férrico amónico
1,5 g/l
Producción sulfuro
Salmonella/ inhibidor
Azul de timol
0,04 g/l
Agar
14 g/l
Indicador de pH
Agente solidificante
Objetivo: Aislamiento y diferenciación de especies de Salmonella y Shigella
de otros bacilos entéricos gram negativos en muestras fecales
Propiedades diferenciales del medio
Agar entérico Hektoen
Los fermentadores de lactosa (E. coli, Klebsiella, Enterobacter) se ven
amarillas. Los no fermentadores se ven incoloros. Salmonella tiene un
punto negro central por la producción de sulfuro. La mayoría de las
especies de Shigella no producen sulfuro.
Medio agar salino manitol (agar de Chapman)
Agente inhibidor
NaCl al 7,5% sólo crecen
Staphylococcus y Microccocus
Incluye manitol y rojo fenol como
indicador (medio diferencial)
Los microorganismos que fermentan el
manitol se observan como colonias
amarillas
Los que no fermentan el manitol se
observan blancos o del color del medio
Agar Alcohol Feniletílico (PEA)
Componentes
Extracto de carne
Triptosa
Cantidad
3 g/L
10 g/L
Propiedad
Fuente de C y N
Fuente de N
Feniletanol
2,5 g/L
Inhibidor de Gram negativos
Cloruro de sodio
5 g/L
Estabilizador osmótico
Agar
15 g/L
Agente solidificante
Aislamiento de microorganismos Gram positivos, especialmente
estafilococos y estreptococos, a partir de diversas muestras con microbiota
mixta. La adición de alcohol fenil etílico inhibe o reduce drásticamente el
crecimiento de bacterias Gram negativas porque inhibe la síntesis de ADN.
Además, previene la proliferación de colonias invasivas tipo “swarming”.
El alcohol fenil etílico es un antimicrobiano, antiséptico y desinfectante que
también se utiliza como esencia aromática y preservativo en farmacia y
perfumería. Las placas de este medio recién preparadas huelen a rosas.
Agar Alcohol Feniletílico (PEA)
Cuando a este medio se le adiciona sangre de oveja al 5%, se
convierte en un excelente medio para el aislamiento de bacterias
anaerobias presentes en
muestras clínicas donde hay una
microbiota abundante y heterogénea que contiene bacterias Gram
negativas de crecimiento rápido tal como Proteus.
Medios diferenciales
Permiten distinguir entre bacterias diferentes en base a un comportamiento
bioquímico (p.e., fermentación o no de la lactosa, fermentación del manitol,
producción o no de sulfuro, distintos tipos de hemolisis, etc.).
Pueden ser, a su vez, ricos, enriquecidos o selectivos
Ejemplos de medios diferenciales
MacConkey (moderadamente selectivo y diferencial)
EMB (moderadamente selectivo y diferencial)
Agar CLED (no selectivo, medio rico y diferencial)
Agar sangre (no selectivo, medio enriquecido y diferencial)
SM, SS, HE, XLD (altamente selectivos y diferenciales)
Agar sangre, CLED
Agar XLD,
EMB, MacConkey;
SS; HE; ADC
Agar SM
Medios cromogénicos
Medios diferenciales
Incorporan sustancias cromogénicas
Detección de actividades enzimáticas características
de determinados géneros o especies de bacterias
β- galactosidasa
β- glucosidasa
β- glucuronidasa
Producción de un color característico
identificación
β- galactosidasa
ONPG
Incoloro
ONP + galactosa
amarillo
Ejemplos de medios cromogénicos
CPS ID3
Chromogenic UTI (infecciones tracto urinario)
ChromAgar Orientation
UriSelect 4 (urocultivos)
Identificación bacterias en infecciones urinarias
Tres tipos de enzimas
Se puede añadir triptófano (prueba del indol o TDA)
se incrementa el número de microorganismos que se
pueden identificar
Medios diferenciales cromogénicos para la
identificación de bacterias en muestras de orina
E. coli
Enterococcus faecalis
Klebsiella pneumoniae
Pseudomonas aeruginosa
MEDIOS CROMOGÉNICOS PARA LEVADURAS
Un ejemplo de medio
cromogénico
ChromAgar Candida
Permite diferenciar e
identificar tres especies
de este género
(colonias verdes,
azules y transparentes)
Medios específicos
BCYE (agar tamponado con carbón
y extracto de levadura)
Bordet-Gengou
Regan-Lowe
Thayer-Martin
New York City
Lowestein-Jensen
CIN (cefsulodina-irgasán-novobiocina)
TCBS (tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa)
Pico de flauta de Loeffler
Diamond
Sabouraud
CCF, CCYE
Legionella
Bordetella pertussis
Bordetella pertussis
Neisseria meningitidis y N. gonorrhoeae
Neisseria gonorrhoeae y micoplasmas
genitales
Mycobacterium tuberculosis
Yersinia
Vibrio cholerae
Corynebacterium difteriae
Trichomonas vaginalis
Hongos
Clostridium difficile
Patógenos intracelulares obligados
Crecen sólo dentro de las células
No se ha encontrado un medio
completamente artificial para su
desarrollo
Treponema pallidum
No se pueden cultivar
Mycobacterium leprae en medios artificiales
(Legionella pneumophila
BCYE)
Cultivos de tejidos en el laboratorio
Cultivos celulares
Cultivos primarios
nº Cromosomas=2n
Células de riñón
Fibroblastos
Líneas celulares continuas aberraciones en
el nº de cromosomas
aneuploidía
Hep-2, HeLa, Vero
McCoy
A-549, RD, MDCK
efecto citopático de la
toxina de Clostridium
difficile
Clamidias
Virus
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