hibridación de ácidos nucleicos hibridación de ácidos nucleicos

HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS
HIBRIDACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS
¿Cómo se mantienen unidas las dos hebras?
• Puentes de hidrógeno entre las bases.
• Interacciones hidrofóbicas entre las
bases adyacentes de una misma hebra.
HIBRIDACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS
FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA
HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS
• Número de pares GC vs. pares AT
• Grado de complementariedad
• Largo de las hebras
• Concentración de sal en la solución
• Temperatura
• Concentración de formamida
HIBRIDACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS
FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA
HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS
• Número de pares GC vs pares AT
– Mayor número de enlaces de H entre
la hebras  mayor estabilidad de los
híbridos.
•
3 enlaces de H entre G y C
•
2 enlaces de H entre A y T
HIBRIDACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS
FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA
HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS
• Grado de complementariedad
– Menor complementariedad de bases,
 menos enlaces de H formados
 menor estabilidad
HIBRIDACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS
FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA
HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS
• Largo de las hebras
– Mayor largo de las hebras (cDNAs) >200pb
 más enlaces de H
 mayor estabilidad del híbrido.
– Menor largo de las hebras (oligos) <50pb
 Mayor especificidad
 Menor probalidad de hibridación cruzada
HIBRIDACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS
FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA
HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS
• Concentración de sal en la solución
•  [sal]   estabilidad del híbrido
– Cationes monovalentes (Na+) o divalentes (Mg++)
– Las cargas negativas de los grupos fosfato se
repelen unas a otras.
– Los iones positivos en solución reducen la repulsión
electrostática entre las hebras.
HIBRIDACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS
FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA
HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS
• Temperatura
– Mayor Tº  aumenta la energía cinética de las
hebras y desestabiliza la estructura de los ácidos
nucleicos.
 las hebras se separan.
HIBRIDACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS
FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA
HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS
• pH
–  [OH- ]
 ionización de los grupos fosfatos
favoreciendo la repulsión electrostática
entre las hebras.
• Concentración de formamida
– Probablemente forma enlaces de H con los
ácidos nucleicos.
– Desestabiliza la formación de híbridos
HIBRIDACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS
El efecto combinado de estos factores puede ser
expresado en una ecuación para el calculo de la Tm
• ¿Qué es la Tm?
Tm = temperatura de melting o de separación de las hebras.
La Tm es una medida de la estabilidad de los híbridos definida
como la temperatura a la cual 50% de los híbridos se encuentran
formados y 50% permanecen disociados.
50%
5’ - - - - - - - - - - -3’
3’ - - - - - - - - - - 5’
50%
5’ - ------3’ - 5 ’
--3’
HIBRIDACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS
El efecto combinado de estos factores puede ser
expresado en una ecuación para el calculo de la Tm
Para DNA:DNA
Tm = 81,5 ºC + 16,6log[Na] + 41(%G+C) - 0,63(%formamida) - (500/L)
Para DNA:RNA
Tm = 79,8 ºC + 18,5log[Na] + 58,4(%G+C) + 11,8(%G+C)2 0,5(%formamida) - (820/L)
Para oligonucleotidos en 1 M Na+
Tm (oC) = 4 (G+C) + 2 (A+T)
REACCIÓN EN CADENA
DE LA POLIMERASA
1985 - Mullis & Falloona
PCR
ADN polimerasa
Replicación
5’
3’
5’
3’
Primer/cebador/iniciador
3’
5’
Eventos en la Replicación del DNA:
- Apertura del ADN doble cadena (hebras en simple cadena)
- Polimerización de “primer” de ARN
- Síntesis de ADN doble cadena utilizando los “primers”
- Eliminación de los “primers” de ARN y síntesis de ADN en su lugar
- Unión de los fragmentos de ADN
ADN polimerasa
-
Polimeriza ADN copiando una hebra de ADN molde
Requiere de un “primer” para comenzar con la síntesis
Utiliza desoxinucleotidos (dNTP´s=ATP+CTP+GTP+TTP)
Requiere de un catión divalente (Mg2+)
PCR
Sistema de AMPLIFICACIÓN de ADN de
ALTA SENSIBILIDAD
INGREDIENTES:
- ADN molde (obtenido a partir de una muestra-cultivo-etc.)
- ADN polimerasa termoestable!
- Primer Forward/Plus/Más (oligo de ADN sintetizado químicamente)
- Primer Reverse/Minus/Menos (oligo de ADN sintetizado químicamente)
- dNTP´s = ATP + CTP + GTP + TTP
- Buffer de reacción
- Cloruro de Magnesio (Mg2+)
- Agua
ADN polimerasas termoestables
PCR
Actividad 72-75ºC, sin inactivación a 95ºC
FIDELIDAD
PRODUCTOS
2darios
PROCESIVIDAD
longitud de
amplicones
Taq DNA polimerasa: SIN proofreading
(exonuc. 3’
5’)
Baja: 10-5
Posible
Baja: to 2-4 kb
Pfu DNA polimerasa: CON proofreading
Alta: 10-7
Posible
Baja
Alta
Posible
Alta: to 15-30 kb
Baja / Alta
NO
Baja
Baja
Posible
Baja
Baja / Alta
Posible
Baja
ENZIMAS
Long amplif. DNA pol.: CON proofreading
Hot start DNA pol.: inhibida a Tamb.; se
activa a 95ºC
Tth DNA polimerasa: activ. sobre ADNdc +
activ. sobre ARN: Mn2+
SIN proofreading
RT-PCR
Mezclas T. Reversas + DNA pol.: RT-PCR
2 etapas
Una cuestión de CICLOS
PCR
Temperatura
100
Melting
94 oC
50
1
Desnaturalización de
ADN doble cadena
0
Tiempo
ADN simple
cadena
5´
3´
3´
5´
ADN molde
ADN simple
cadena
Una cuestión de CICLOS
PCR
Temperatura
100
Melting
94 oC
50
1
Annealing
Primers
Pegado de primers en
secuencia específica
50 oC
0
Tiempo
5´
3´
3´
5´
ADN simple
cadena
ADN simple
cadena
Una cuestión de CICLOS
PCR
Temperatura
100
1
Melting
94 oC
50
Annealing
Primers
Extension
72 oC
50 oC
Extensión de ADN
0
Tiempo
5´
3´
3´
5´
5´
3´
5´
simple
ADN doble
cadena
simple
3´ ADN doble
cadena
PCR
12
CICLO 1
Temperatura
100
Melting
Melting
94 oC
Annealing
Primers
50
Extension
94 oC
72 oC
50 oC
0
Tiempo
5´
3´
3´
3´
5´
5´
5´
3´
PCR
2
CICLO 2
CICLO 1
Temperatura
100
Melting
Melting
94 oC
Annealing
Primers
50
Extension
72
oC
94 oC
Annealing
Primers
50 oC
50 oC
0
Tiempo
3´
5´
3´
5´
3´
3´
5´
3´
3´
5´
3´
5´
5´
5´
3´
5´
PCR
2
CICLO 2
CICLO 1
Temperatura
100
Melting
Melting
94 oC
Annealing
Primers
50
50 oC
0
Extension
72 oC
94 oC
Annealing
Primers
Extension
72 oC
50 oC
Tiempo
5´
5´
3´
5´
5´
3´
5´
3´
5´
5´
3´
5´
PCR
3
5´
3´
5´
5´
5´
Amplicon
buscado
3´
5´
5´
5´
5´
3´
5´
5´
3´
5´
5´
5´
5´
3´
5´
5´ 3´
PCR
5´
5´
Amplicon
buscado
3´
5´
3´
5´
5´
3´
5´
5´
5´
5´
5´
5´
5´
5´
3´
5´
5´
5´
5´
5´
5´
4
5´
3´
5´
5´
5´
5´
5´
5´
5´
5´
3´
5´
5´
5´
5´
3´
3´
30-35 CICLOS
PROGRAMA
n
5´
PCR
5´
Copias del fragmento amplificado
El factor
limitante son
los reactivos
de PCR
1
2
4
8
16
32
64
128
256
512
1,024
2,048
4,096
8,192
16,384
32,768
65,536
131,072
262,144
524,288
1,048,576
2,097,152
4,194,304
8,388,608
16,777,216
33,554,432
67,108,864
134,217,728
268,435,456
536,870,912
1,073,741,824
1,400,000,000
1,500,000,000
1,550,000,000
1,580,000,000
1.6E+09
1.4E+09
1.2E+09
Copias= 2N
1.0E+09
8.0E+08
6.0E+08
4.0E+08
2.0E+08
0.0E+00
0
5
10
15
20
25
30
35
PCR cycle
10
9
8
DNA copy number (log)
¿Cómo veo
el resultado?
1.8E+09
DNA copy number
DNA copy number
PCR
CYCLE NUMBER
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
7
6
5
4
3
2
1
0
0
5
10
15
20
PCR cycle
25
30
35
PCR
1 - Gel de agarosa
Agarosa
(polimero de galactosa) 100ºC  50-60ºC
+
Buffer de electroforesis
(xej. TAE)
Gelificación: Matriz pororsa
microscopica para separación
de ácidos nucleicos
_
Equipo de electroforesis
convencional
_
Tiempo
Fuente
poder
+
+
- Las moléculas de ADN están cargadas
negativamente
Cuba
electroforética
- Separación por TAMAÑO
Sistema de electroforesis horizontal
Buffer de
corrida
Pocillo o well
Gel agarosa
Dirección de corrida
Electrodo
positivo
Electrodo
negativo
Fuente de
poder
1
2
PEINE
Preparación:
1. Se coloca un peine para formar
los pocillos (wells) de siembra.
2. Se saca el peine.
3. Se añade una solución de siembra a la muestra (colorante; 50%
glicerol).
4. Se siembra la muestra (inmersión) y se corre.
ADN/ARN
POSITIVO.
3
4
5. El “frente de corrida” está indicado por el
colorante.
6. El gel es transiluminado con luz UV; el Br
Etidio, intercalado en la doble cadena, produce fluorescencia rosada; se fotografían
las bandas.
cámara
transiluminador
Spn
mefA
16S
Spn
ermB
16S
PCR
Factores que influyen sobre la amplificación
por PCR
- Agua
 calidad óptima MilliQ o bi-destilada o similar
- ADN molde
 calidad de extracción (óptimo kit)
 cantidad de ADN
 presencia de inhibidores de la PCR (agente quelante)
PCR
Factores que influyen sobre la amplificación
por PCR
- dNTP´s
 concentración
 calidad
Rango concentración  20-200 µM
Efectos
+
inhibición de Taq
PCR
Factores que influyen sobre la amplificación
por PCR
-Magnesio (Mg2+)

concentración  astringencia
>> concentración  << astringencia
>> Mg2+
 << “especificidad”
Rango concentración  1-5 mM
0 0,5
1 1,5 2 2,5
3 3,5 4 C(-) M
Mg2+
Factores que influyen sobre la amplificación
por PCR
PCR
Primers
 concentración
 temperatura de pegado o annealing
 secuencia nucleotídica (pegado propio/formación de
dimeros)
Rango concentración  0,1-0,5 µM
2
1
0,4 0,1 0,01 C(-) M
Zippelius A., Clin Cancer Res 6:2741 (2000)
µM
Efectos
+
productos inespecíficos
-
< rendimiento PCR
PCR
Factores que influyen sobre la amplificación
por PCR
Primers
Gradiente de temperatura
Efectos
TºC
TºC
No amplificación
Productos
inespecíficos
Puesta a punto
PCR
5
6
7
C
Temperatura
44
,7º
55
,2º
C
4
49
,3º
C
C
44
,7º
3
44
,7º
C
C
2
55
,2º
1
49
,3º
C
44
,7º
C
Variación de Temperatura y Mg2+
8
~950pb
lnuB
M
900bp
500bp
/------1,5 mM ------ /-------3 mM ---------/
MgCl2
Primers
PCR
DISEÑO DE PRIMERS
Longitud:
18-24 nucleotidos (largos 30-35 ntds)
Contenido GC: 40-60%
Tºannealing:
Tm= 2ºC x (A+T) + 4ºC x (C+G) – 5ºC (óptima 50-64ºC)
Tºmelting:
Tm= 2ºC x (A+T) + 4ºC x (C+G)
Formulas simplificadas
Secuencia:
Evitar ≥3 C o G en el extremo 3´
Evitar complementariedad interna en el extremo 3´
Evitar complementariedad entre primers (dimerización)
Concentración: 0,1-0,5 μM  0,2μM útil para la mayoría de casos
Almacenamiento:
Solución stock 1-0,1mM en H2O o buffer TE a -20ºC
PCR
Secuencia de los Primers
ATCTCTGACTCAGGACCTACACAGACTAGACATAGACCATAATGGTTGACAGACACTT
TAGAGACTGAGTCCTGGATGTGTCTGATCTGTATCTGGTATTACCAACTGTCTGTGAA
Primer Forward/Plus
5’- AGACTGAGTCC-3’
ATCTCTGACTCAGGACCTACACAGACTAGACATAGACCATAATGGTTGACAGACACTT
Primer Reverse/Minus
3’-GGTTGACAGACA-5’
TAGAGACTGAGTCCTGGATGTGTCTGATCTGTATCTGGTATTACCAACTGTCTGTGAA
Secuencia de los Primers
PCR
5´-ATA TGG CAG CTT CAG TGC TGC CAT-3´
ATCGCACTGAC TAT ACC GTC GAA GTC ACG ACG GTA AGTGGACTGC
Se deben analizar las secuencias de los primers!!!
Potencial formación
de estructura de
hebilla
5´-ATA TGG CAG CTT CAG TGC TGC CAT-3´
TT
C
5´-ATATGGCAG
3´-TACCGTC G G
T
Potencial
pegado entre
primers
C
A
5´-ATA TGG CAGCTTCAG TGC TGC CAT-3´
3´-TAC CGT CGT GAC TTCGACGGT ATA-5´
5´-ATA TGG CAGCTTCAGTGCTGCCAT-3´
3´-TAC CGT CGT GAC TTCGACGGTATA-5´
CAPTURA DE PRIMERS! Menos moléculas disponibles!
PCR
VENTAJAS DE PCR SOBRE OTRAS TECNICAS
ALTA SENSIBILIDAD
ALTA ESPECIFICIDAD
RAPIDEZ
SIMPLICIDAD
DESVENTAJA
PROBLEMAS DE CONTAMINACION
(Trazas de ADN templado específico o productos
amplificados por PCR)
CONTROLES
PCR
Muestra  búsqueda del gen X
Posibles resultados
Tubos
1
Muestra
+
-
-
+/-
+/-
+/-
2
Control (+) gen X
+
+
-
+
+
+
3
Control (-) gen X
-
-
-
-
-
+
4
Muestra
+
+
+
-
+
+
5
Control (+) gen extracción
+
+
+
+
+
+
6
Control (-) gen extracción
-
-
-
-
+
-
Validez del ensayo 
SI
SI
NO
NO
NO
NO
Resultado 
+
-
Error
gen X
Error
extr.
ADN
Cont. Cont.
PCR
PCR
extr. gen X
PCR
COMPARTIMENTALIZACIÓN DE ESPACIOS
Millar, BC. JCM 40:1575-80 (2002)
COMPARTIMENTALIZACIÓN DE ESPACIOS
 Problemas de contaminación: falsos positivos
 Infraestructura y equipamiento: tres áreas separadas, equipadas con
material de laboratorio y de bioseguridad exclusivos para cada una:
Area pre-PCR
Preparación
de reactivos
Aislamiento de
á. nucleicos
MIX + ADN
molde
Amplificación
y detección
Amplicones
MIX: Buffer + Cl2Mg + Taq
+ dNTP´s + Primers + H2O
Congeladores de -20ºC
Ciclador térmico
Microcentrífuga
Tips/pipetas con barrera anti-aerosoles
Area
Equipo de electroforesis
Transiluminador UV
Equipo fotográfico
post-PCR
PCR
ÁREA EXCLUSIVA PARA
PREPARACIÓN DE MIX
PCR
ÁREA DE ELECTROFORESIS
PCR
A tener en cuenta!
96.3°C
Uniformidad del bloque
Punto
más frío
Punto
más
caliente
93.8°C
Escala térmica
PCR
PERFIL TERMICO
El undershoot consume
gran parte del hold
TECNICAS DERIVADAS/ BASADAS EN PCR
 PCR Nested: amplificación de una secuencia dentro de otra
previamente amplificada
 PCR Multiplex: varios targets diferentes en forma simultánea
 PCR-RFLP
: polimorfismo genético
 Transcriptasa Reversa-PCR : detección de mRNA
 Real
Time PCR : cuantificación de copias iniciales – en tiempo real
 In situ PCR : detección en tejido mismo, ubicación del fragmento
 IC-PCR
: inmunocaptura previa a PCR
OTRAS ESTRATEGIAS PARA INVESTIGACIÓN SE VERÁN MAS ADELANTE
NESTED-PCR
 PCR anidada, o nested PCR: 2 etapas (rounds)
1º round
2º round
Target
F1
R1
Producto 1º round
Target
F2
Sensibilidad
Especificidad
 PCR
seminested:
 PCR
seminested:
R2
Producto 2º round
1º round: F1+R1
2º round: F1+R2, ó, F2+R1
PCR standard
Reacciones
1
2
3
PCR MULTIPLEX
Reacciones
1
MULTIPLEX-PCR
Amplificación simultánea de varias
secuencias blanco
-La eficiencia de cada amplificación no es necesariamente similar:
Secuencia de DNA de los diferentes targets (%GC)
Temperatura de hibridación de los diferentes primers
Tamaño de las diferentes secuencias target
Artefactos / dímeros entre diferentes primers
B. Strommenger, et al. JCM. 41: 4089-94 2003.
RFLP = Restriction fragment length polymorphism
Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restricción
PCR-RFLP
...C
...G
T
A
C
G
G
C
A
T
A
T
G
C
C
G
T
A
T
A
A
T
C...
G...
Secuencia de reconocimiento
...C
...G
T
A
C
G
G
C
A
T
A
T
C
Gen
G
G
C
T
T
A
A
Polimorfismo
A
1
A
2
A
3
A
4
1
2
A
T
C...
G...
3
4
PCR-RFLP
mefA
Subclase mefE
mefA
Subclase mefA
mefA positivo
Restricción BamHI
348bp
mefA
Subclase mefE
284bp + 64bp
mefA
Subclase mefA
Fenotipo M (gen mefA)
Grupo génico emparentado a blaCTX-M-2
HincII SphI
blaCTX-M-2
blaTOHO-1
blaCTX-M-4
blaCTX-M-5
blaCTX-M-5B
blaCTX-M-6
0
40
90
HincII PstI
HincII
326 356 400
EcoRV
900
752
BsaHI
BsaHI
BsaHI
BsaHI
Sitios de Restricción
BsaHI
BsaHI + EcoRV
BsaHI + PstI
SphI
SphI + PstI
Petroni, A. y col. 2002. Antimicrob. Agents Chemother. 46:1462–1468
PCR-RFLP gen qnrB  analisis 23 alelos
HindIII
Si
200+323
1-3-5/19-6-7-9-10-11-12
13-13bis-16-17-22-23
2/20-4-4bis-814-15-18-21
Bgl II
Si
No
158 + 365
2/20-14-15-18
4-4bis-8-21
EcoRV
No
8-21
Si
65+458
4-4bis
No
14-1518
175+348
11-22
194+329
EcoRV
3
No
11
NsbI
No
98+140+285
6-13-13bis-16-23
Si
Si
5/19-10
85+98+340
Si
No
2/20
6-16
BsrDI
SacII
Si
Si
1-5/19-6-7-9-10-12-13
13bis-16-17-23
158+365
No
Si
65+458
22
NmuCI
13-13bis-23
175+348
KpnI
Si
Bgl II
3-11-22
NsbI
Si
No
Si
No
189+334
6
76+447
23
16
523 bp
No
13-13bis
SacII
No
12
Si
Si
55+85+9
98+425 8+285
1-17
7-9
No
10
Si
194+329
5/19
ARNm
Transcriptasa Reversa-PCR
AAAA(A)n 3´
5´
Detección de ARN
(ARNm)
Expresión de un gen
5´
Transcripción
Reversa
ARNm 5´
ADNc 3´
Transcriptasa Reversa tiene
actividad: ADN-polimerasa,
ARN-dependiente
AAAAA(A)n 3´
3´-TTTTT -5´
(12-18mer)
Primer poli-T
AAAAA(A)n 3´
5´
RNAsa H
ARNm 5´
ADNc 3´
Primers de ARN
AAAAA(A)n 3´
5´
ADNpol I
Si el ARNm no esta poli-A 
primer con secuencia al azar o
específico si se conoce
secuencia.
ADNc 5´
ADNc 3´
3´
5´
PCR
Real Time-PCR
SYBR-Green
Económico
Fácil de usar
Sensibilidad
Unión a doble
cadena
Sonda (ej. Taqman; Beacons)
Específico
Sensibilidad
Multiplex
Costo
- Detección de genes en tiempo real
- Cuantificación de número de copias de ADN (diagnóstico,
monitoreo, carga viral, etc.)
- Cuantificación del ARNm (expresión génica, análisis
diferencial en distintas condiciones, etc.)
- > especificidad (Solo sistemas con sonda)
- > velocidad de resultados
- < contaminación de reactivos
Real Time-PCR
PCR vs RT-PCR
Área de
detección en
gel con BrEt
10
9
PLATEAU
DNA copy number (log)
8
7
Área de
detección para
RT-PCR
6
5
4
AMPLIFICACIÓN
EXPONENCIAL
3
2
1
0
0
5
10
15
20
PCR cycle
25
30
35
Real Time-PCR
SYBR-Green
- Se intercala en ADN doble cadena
- No es toxico como el BrEt
(ideal para reemplazar BrEt en lab de PCR standard costo safe)
- Se une a CUALQUIER ADN doble cadena
(xej: dimero de primers, producto de PCR inespecífico)
 confirmación por curva de melting!
- Detección en formato MONOPLEX
En cual de las 3 etapas del ciclado
de PCR ocurre la emisión?
PRODUCTOS NO ESPECIFICOS (artefactos) : Incrementa fluorescencia
durante la reacción  más frecuente SYBR-green.
- Unión inespecífica de primers (mispriming)  amplicon inespecífico
- Dímeros: hibridación entre primers generando pequeños amplicones (⋍50bp)
Real Time-PCR
Sonda
PCR vs
RT-PCR
ADN
molde
Polimerasa
Primers
dNTPs
TaqMan
Probe
Emisión de fluorescencia
(distintos fluoroforos  multiplex)
Real Time-PCR
CURVA de DESNATURALIZACION o
MELTING
Un amplicon, conociendo la secuencia, debe tener un tamaño y un %GC conocido
 Tºmelting
dímeros
Parámetro Ct (Cycle Threshold)
50 a
g (C
t 30
.15 )
(Ct 2
7 .19)
500 a
g
5 fg (
Ct 23
. 01 )
500 f
g (Ct
16.0 1
)
50 fg
(Ct 1
8.65)
5 pg
(Ct 1
2.74)
Valor para el cual la
señal supera el nivel
basal o background y
se considera positivo
93)
.
3
t3
C
(
g
5a
0.5 ag (No Ct)
Real Time-PCR
3. intensifier
1. halogen
tungsten lamp
2b. emission
filters
2a. excitation
filters
4. sample plate
5. ccd
detector
350,000
pixels
Real Time-PCR
Sistema de detección
de fluorescencia
Ciclador térmico
Real Time-PCR
Journal of Clinical Virology 28:233-238, 2003
Real Time-PCR
Multiplex RT-PCR
Sinsimer et al.JCM 43:4585-91 2005
detección de Sau R (Van + Met)
- 16S especifico genero Staphylococcus
- spa diferencia S. aureus de otros Staph.
- mecA, resistencia a beta-lactamicos
- vanA, resistencia a glicopeptidos
16S + spa
1) MRSA
2) MSSA + MR-SCN
MSSA
16S + spa
+ mecA
+ vanA
VMRSA
16S + spa
+ mecA
MRSA
1) VMRSA
2) MRSA + VRE
3) MSSA + MR-SCN + VRE
4) etc.
Inmuno-PCR
Immuno-PCR vs ELISA
S
B
St
Anticuerpo B
unido a ADN
Anticuerpo
unido a
proteína
protein
Immuno-PCR
P
E
protein
ELISA
Inmuno-PCR
Amplicon puede ser detectado por electroforesis o por ELISA
HIBRIDACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Unión específica por complementariedad de bases
*5´- T T G A T C T G G C A T C G A G T-3´
3´-… T C A A C T A G A C C G T A G C T C A A A … -5´
HIBRIDACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS


Target

A. nucleico
Gen, o secuencia
a identificar. No es
necesario conocer
su secuencia.
El A. nucleico se
fija a un soporte
sólido: membrana
de nitrocelulosa o
de nylon.
Probe (sonda)  , homología c/target:
 Fragm. de restricción del mismo gen;
no es preciso conocer su secuencia.
 Amplicón (PCR) del mismo gen, o de
otros con secuencias conservadas.
 Oligonucleótido sintético.
Homología
alto
grado de identidad de
bases. Las cadenas
de la sonda hibridan
con las del target por
ser complementarias.
La especificidad depende de la relación entre la identidad de la sonda con el target (VP), y con posibles sitios 2darios en el ADN fuente (FN). Se controla mediante lavados, regulando la astringencia:
capacidad de disociar dos cadenas complementarias; máxima astringencia: 100ºC y 0 mM [salina].
Construcción de la sonda: síntesis de novo de ADN en presencia de dNTP-
Marcación/detección: determinan la sensibilidad del método.
 Radioactiva: [32P]-dNTP.
 Complejos moleculares: biotina-avidina (streptavidina), o digoxigenina-Anti-digoxigenina, asociados a enzimo-inmuno ensayo.
ADN
Autorradiografía
Isótopo radiactivo
Emisión ß
Revelado
Digoxigenina
Precipitado de color
Revelado
Fosfatasa
alcalina
Anti-Dig, conjugado a FA
+ sustrato FA
Biotina
Producto soluble coloreado
Peroxidasa
Avidina, conjugada a PX
Revelado
+ sustrato PX
½ ácido
Abs. 450 nm
Fluoresceína
Revelado
Fosfatasa
alcalina
Anticuerpo, conjugado a FA
+ sustrato
Luminol
QUIMIOLUMINISCENCIA
Autorradiografía
Métodos basados en
hibridización de
ácidos nucleicos:
Southern blot: fragmentos de ADN separados mediante electroforesis en gel de agarosa, transferidos y fijados a la membrana de hibridización.
Northern blot: ídem anterior, para ARN.
Dot blot: ADN “sembrado en puntos” en la membrana.
Colony blot: colonias crecidas sobre la membrana, lisadas in
situ, fijando el ADN bacteriano a la membrana.
Hibridización reversa: sonda fijada a microplaca (c. viral, Amplicor, Roche), o a tiras de membrana
(Line probe assay, LIPA); target en solución.
SOUTHERN BLOT
Gel
Papel filtro
Membrana
Bomba de
vacio
SOUTHERN BLOT
Incubación ON
con sonda
(68ºC)
Membrana con
ADN transferido
Lavados para
eliminar sonda
excedente
(SSC y SDS)
Incubación con
Ab-AntiDIG
Revelado
Incubación
con sustrato
cromogénico
(NBT + BCIP)
Lavados para
eliminar AbAntiDIG
excedente (Ác.
Maleico)
SOUTHERN BLOT
Detección y localización de genes de ß-lactamasas de espectro extendido codificados en
plásmidos conjugativos de aislamientos clínicos de V. cholerae de Argentina.
(A. Petroni y col., Antimicrob. Agents Chemother. 46(5): 1462-8, 2002).
1
2
3
Vch Eco Vch Eco Vch Eco Vch
4
Eco
Wells
Gel agarosa 0,7%
ADN plasmídico 160 kb
140
54
Wells
Membrana hibridizada
con sonda blaCTX-M-2
Membrana lavada
con H2O a 100ºC,
y rehibridizada con
sonda blaPER-2
140
54
Wells
140
54
COLONY BLOT
Repique de colonias sobre
una membrana de nylon
Placa original
Selección de colonias
positivas en la placa original
Hibridación
con la
sonda marcada
Procesamiento
ADN de
cadena simple
fijado a la
membrana
DOT BLOT
Hibridación con la sonda específica para el
gen vanA
HIBRIDACIÓN REVERSA
LiPA
Line Probe Assay
Cromógeno
Precipitado púrpura
Fosfatasa
alcalina
Biotina
Estreptavidina
ADN amplificado
Tira de
nitrocelulosa
Sonda de ADN
inmovilizada
HIBRIDACIÓN REVERSA
LiPA
Line Probe Assay
MICROARRAY
MICROARRAY
-Detección de genes
-Variantes alelicas
-Expresión de genes
FRAGMENTO DNA
SOPORTES
OLIGONUCLEOTIDOS
Discriminación de una mutación
puntual:
- Diferencias de hasta 1 nucleótido.
- Discriminación de alelos
- Detección de resistencia
Detección de genes:
- Resistencia, Virulencia,
Caracterización especieespecifica, Metabolismo, etc.
Expresión génica diferencial:
- Diferente perfil de genes
expresados dependiendo el
tratamiento aplicado
MICROARRAY
Verde
Verde +
Rojo Rojo
= Amarillo
Hibridación en microarrays
1
Cy5
Cy5 = 633 nm
2
Cy3 = 532 nm
Cy3
Expresión de 1 > 2
Expresión de 1 = 2
Expresión de 1 < 2
Microarray de levadura
El nivel de expresión de cada gen es representado por
la intensidad de la señal asociada a un color:
Rojo (Cy5) = > expresión en la muestra experimental
Verde (Cy3) = < expresión en la muestra experimental
Por convención el RNA de referencia es marcado con
Cy3.
V. parahaemolyticus (15)
V. cholerae (29)
M
M
V. vulnificus (15)
II
V. mimicus (4)
C
C
Determinantes de
R
resistencia (32)
R
O
O
Microarray para detección
A
A y caracterización de Vibrio:
R
R -Especie
-Serogrupo
R
R -Biotipo
A
A -Resistencia a ATB
-Factores de virulencia
Y
Y
Vora G. et al. PNAS 102:19109-14
LUMINEX
Hasta 100 colores
A
A
B
B
C
C
D
D
D
A
B
D
C
X ej: La muestra 1 es
positivo para la
presencia de los
genes A y D.
En policubeta
X 96 muestras!!!
100 genes a 96 muestras =
9600 determinaciones !!!
Y en una sola largada!!!
SECUENCIACIÓN DE
ÁCIDOS NUCLEICOS
Sanger
Secuenciación de ácidos nucleicos
P
P
O
O
P
O
P
O
P
O
OH
P P P
O
OH
5’
Desoxiribonucleotido
3’
Secuenciación de ácidos nucleicos
P
P
O
O
P
O
P
O
H
P P P
O
OH
5’
Desoxiribonucleotido
3’
Di-desoxiribonucleotido
Secuenciación de ácidos nucleicos
- Complejidad 
ALTA
- Interpretación 
ALTA
ADN
molde
Polimerasa
primer
dNTP´s
dideoxidNTP´s
Secuenciación de ácidos
nucleicos
Secuenciación de ácidos nucleicos
¿?
¿?
Secuenciación de ácidos nucleicos
Primer-F
- Lectura en
doble cadena
ADN molde
- Lectura de
cada cadena
- Reversocomplementario
Primer-F 
5´- A G C T A G T C A G G A G T - 3´
Primer-R 
5´- A C T C C T G A C T A G C T- 3´
Primer-F 
5´- A G C T A G T C A G G A G T - 3´
Primer-R 
5´- A C T C C T G A C T A G C T- 3´
R&C
- Contig
(comparación
de secuencias
obtenidas)
Primer-R

Primer-F 
Primer-R (R&C)

Secuencia consenso 
5´- A G C T A G T C A G G A G T -3´
5´- A G C T A G T C A G G A G T - 3´
5´- A G C T A G T C A G G A G T -3´
5´- A G C T A G T C A G G A G T - 3´
Secuenciación de ácidos nucleicos
-
Secuencia consenso  BLAST (Base de datos GenBank),
Búsqueda de ORF,
Comparación con otras secuencias,
etc.
gtaggcatcaattcgcgaggagagttgttgcgaagagagggctttgcgcaaaatgctgtcaaactcgggattgcaccagt
gggcaaaattggtctgcgagttaatggcggcacagctaagcatcggtcggaaaaagctgtcaggatcgttactgtcagtt
gcccaaccggacaacgtcagatcatggttcatatccattaatcgcgcctcctgaaaacggccctctaccgggatgatctt
cactttcacacccacctgagccatatcagcctgaatcagctctgcggttttcagcggactggggttccaggcctgagagc
tggtaggtacccagagttgtaacgtcaggttttccagccccagcgcttttaactgctcgcgcgattttgccgggttgtac
tcggtaattttagcttcgttgtcataagcccacgaggcgcgaggcaaaatagatgccgcggtttccgccgtaccgtagta
aatagattgcattaaccgttggttgttaatggccagcgctagcgcatgtcgtacggcagggttgttcaacggcggtttat
ccgtgttgaacgccagataggcgatattcatccccggacgcagcgtcaggcgcagccgcgggtcatcacgcagtatgctg
agctggctggcggcaggccatgccaggacgtcgcactcgccggtcagtaatttcgataagcgtccggtcccgccagagcc
gagatccaccacgacctgcggcatcaagggggtaccacgccagaatttttcatgccgttgtaggcgaatatattggcctg
cacgattttctgaaagttggtacgggcctgtgccgacgggttgtctgtcgagtaattcctggcgatcctgttttgctaat
ttggcggcatattcggccgacatcacagaggcataatgtgtggcaaggtgccacaagaaggaggcgtcgggttgatttaa
gcgaaattcaacggtgttgttgtccagtttacgcacgctttggacgttatcggcgaactgcaggctatcaaaataaggaa
aactgctaccattgacattatgccacggatgctggcgatcaaagatgcgctcgaaggtaaataccacatcgtccgcattt
agtttgcgggtgggcgtgaaccaggcagtcttttgaaacggaacatcgcgtcgtaaatggaagcggtaggttgcgccgtt
atctaatacttcccagctttcagccagttctggcaccaggcgataggtgtagggatcgacatcaagcagtcggtcataca
attgggccgctaatgtgtctacgatgagaccgctgcttgctttttgtggattgaacgtattgacctgcccgctaacgcaa
tagacaaagccactgtcacgaatatcagcgtacgaggcctgctcaggcgcagctgcagcctgaccactcagaaatccagc
catcacgatcagagatgataaaaccaggcgcataattttaaagggttatatataaagaagctatcttactaatacttaat
gacatttgccattaccgtttgtttttggggcagtggggttgataaccgcgaattcgacatcgcgtactggtcaaaattca
tacccgctatccactttgcatatactcttgtagctatcttagcattttcatggcccctctgactcgcttaaa
Alineamiento de secuencia en BLAST
GenBank
Análisis de secuencia
ttgaaaggagacaggagcatgaatagaataaaagttgcaatactgtttgggggttgctcagaggagcatgac
gtatcggtaaaatctgcaatagagatagccgctaacattaataaagaaaaatacgagccgttatacattgga
attacgaaatctggtgtatggaaaatgtgcgaaaaaccttgcgcggaatgggaaaacgacaattgctattca
gctgtactctcgccggataaaaaaatgcacggattacttgttaaaaagaaccatgaatatgaaatcaaccat
gttgatgtagcattttcagctttgcatggcaagtcaggtgaagatggatccatacaaggtctgtttgaattg
tccggtatcccttttgtaggctgcgatattcaaagctcagcaatttgtatggacaaatcgttgacatacatc
gttgcgaaaaatgctgggatagctactcccgccttttgggttattaataaagatgataggccggtggcagct
acgtttacctatcctgtttttgttaagccggcgcgttcaggctcatccttcggtgtgaaaaaagtcaatagc
gcggacgaattggactacgcaattgaatcggcaagacaatatgacagcaaaatcttaattgagcaggctgtt
tcgggctgtgaggtcggttgtgcggtattgggaaacagtgccgcgttagttgttggcgaggtggaccaaatc
aggctgcagtacggaatctttcgtattcatcaggaagtcgagccggaaaaaggctctgaaaacgcagttata
accgttcccgcagacctttcagcagaggagcgaggacggatacaggaaacggcaaaaaaaatatataaagcg
ctcggctgtagaggtctagcccgtgtggatatgtttttacaagataacggccgcattgtactgaacgaagtc
aatactctgcccggtttcacgtcatacagtcgttatccccgtatgatggccgctgcaggtattgcacttccc
gaactgattgaccgcttgatcgtattagcgttaaaggggtgataagcatggaaataggatttacttttttag
atgaaatagtacacggtgttcgttgggacgctaaatatgccacttgggataatttcaccggaaaaccggttg
acggttatgaagtaaatcgcattgtagggacatacgagttggctgaatcgcttttgaaggcaaaagaactgg
ctgctacccaagggtacggattgcttctatgggacggttaccgtcctaagcgtgctgtaaactgttttatgc
aatgggctgcacagccggaaaataacctgacaaaggaaagttattatcccaatattgaccgaactgagatga
tttcaaaaggatacgtggcttcaaaatcaagccatagccgcggcagtgccattgatcttacgctttatcgat
tagacacgggtgagcttgtaccaatggggagccgatttgattttatggatgaacgctctcatcatgcggcaa
atggaatatcatgcaatgaagcgcaaaatcgcagacgtttgcgctccatcatggaaaacagtgggtttgaag
catatagcctcgaatggtggcactatgtattaagagacgaaccataccccaatagctattttgatttccccg
ttaaataaacttttaaccgttgca
Análisis de secuencia
Representación gráfica
ATG
TAA
Gen X
Gen Y
Gen Z
Gen X
Gen Y
Gen Z
Secuenciación de ácidos nucleicos
Detección de mutaciones que confieren sensibilidad
disminuida a quinolonas en Salmonella enterica
G
A
A
A
Asp
T
T
Tyr
Asn
WT
Salmonella con 1
mutación en el codón
87 (Asp  Tyr)
CIP
NOR
Salmonella sin
mutaciones
(cepa salvaje)
NAL
160
Nº aislamientos
140
CIP
I
NAL
NOR
S
120
100
NAL S
NAL R
80
60
40
20
0
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
40
42
Halo de inhibición a CIPROFLOXACINA (mm)
44
46
Pirosecuenciación
ADN molde
ADN Polimerasa
Replicación de ADN
Primer
dNTPs
C T G
Pirosecuenciación
dATPS
ATP Sulfurilasa
Luciferasa
Apirasa
APS+PPi→dATP
dATP→Luz
dNTP→dNDP+dNMP+Fosfato
Detección de mutaciones en el gen gyrA de
Salmonella enterica
Mutación D87G
Codon 83 WT
Codon 87 WT
Mutación S83F
Doble mutación
S83A y D87N
Hopkins et al, 2007. Journal of Microbiological Methods 68:163–171