Splicing en el citoplasma

Splicing en el citoplasma
pre-mRNA splicing in platelet cytoplasm acts
as a key regulatory event in the production of
IL-1ß during platelet activation.
Cell (2005) 122: 317–325
Escaping the Nuclear Confines: Signal-Dependent
Pre-mRNA Splicing in Anucleate Platelets
Cell (2005) 122: 379–391
Hematopoyesis
normal
Hematopoietic
Stem Cell CD34+
Sangre
Periférica
U1 70K Protein is localized
in the cytoplasm of
megakaryocytes and in
proplatelets that extend
from megakaryocytes
Cell (2005)122: 379–391
Critical spliceosome factors are present in
the cytoplasm of:
megakaryocytes
megakaryocytes with proplatelet extensions
circulating platelets
Cell (2005)122: 379–391
Localization of U snRNAs in Megakaryocytes, Megakaryocytes
with Proplatelet Extensions, and Circulating Platelets
Ab anti-TMG
(cap) para
detectar U
snRNA
nuclear
citoplasmatico
Cell (2005)122: 379–
391
Activated platelets splice endogenous IL-1β pre-mRNA into mature
message and translate the mRNA into protein
actina
Il-1ß
Cell (2005)122: 379–391
Platelet extracts splice in vitro
transcribed IL-1β pre-mRNA
A) immunolocalization
of U1 70K protein in mature platelets
(B) Platelet lysates were left
unfractionated (total plts) or were
separated into six fractions on
sucrose gradients. U1 70K : Western
analysis
(C) In vitro-transcribed IL-1β premRNA was incubated with
unfractionated platelet lysates
(total plts), fractions 1–6, without
platelet lysates (unspliced control) or
with HeLa cell nuclear extracts (last
lane). In vitro-transcribed intronless
IL-1β mRNA (spliced control) was
analyzed on the same gel as a
positive control for spliced message.
Cell (2005)122: 379–391
Extensión del repertorio genético regulatorio de las
células eucariotas
9 Megacoriocitos y plaquetas han desarrollado un
sistema para poder distribuir al cistoplasma el
precursor de Il-1ß sin procesar
Seguridad: los mensajeros con intrones son
degradados en el núcleo para evitar que se
traduzcan rindiendo productos indeseables
Clases de intrones
Auto - splicing
√ Grupo I: genes nucleares, mitocondriales y
cloroplásticos que codifican para ARNr, ARNt y
ARNm
√ Grupo II: transcriptos primarios de ARNm
mitocondrial o cloroplástico en hongos, algas y
plantas
No auto - splicing
√ Splicing de transcripto primario de ARNm:
spliceosoma
√ Splicing de ARNt de levaduras
Reacciones de transesterificación
Mecanismo de Splicing: intrones
grupo I
Intrones grupo I
Gen de 26S ARNr + ARN Pol de E. coli
•
Splicing del ARN
• Circularización del intrón
• AUTOSPLICING no requiere proteína extra
Cech y col., 1982
Intrones grupo I
Autociclización del intrón
1 Intrón lineal
2 + alta T, Mg2+,
sales
3 Marcador de
intrón C
intrón L
Cech y col., 1982
intrón C
Intrones grupo I
Clonación de ARNr 26S en vector
Transcripción con P*-ATP
Autosplicing dependiente de GTP
Incubación con y sin GTP
Cech y col., 1982
Intrones grupo I
• Autosplicing ocurría en ausencia de proteína
Precusor de spl + [α-32P]GTP + condiciones de spl
Seph G50, electroforesis, producto*
Intrón incorporaba *
• Marcación del extremo 5’ del intrón con [α-32P]GTP y
secuenciación del producto
Secuencia del intrón lineal con extra G en 5’
• Tratamiento con RNasa T1
G unida a extremo 5’ por enlace fosfodiester 3’-5’
Cech y col., 1982
Modelo de autosplicing
Intrón dentro de 26S
Circularización y re-linealización del intrón
Modelaje molecular
Ribozimas
Son ARNs catalíticos
M1ARN es el componente catalítico de
RNasa P
(Altman, 1983)
Mecanismo de Splicing: intrones grupo
II: intermediario lazo
Primera reacción de transesterificación
Consensus Group II intron Structure
6 domains,
“Helical Wheel”
Domain I
contains binding
sites for the 5’
exon (keeps the
5’ exon from
floating away
after the first
splicing step)
Mecanismo de Splicing: intrones grupo
II: intermediario lazo
La unión
de los
exones
libera el
lazo
(intrón)
Group II Splicing
Pathway
(1) The 2’ OH of a special
internal A attacks the 5’ splice
site creating a branched intron
structure.
(2) The 3’ OH of the 5’ exon
attacks the 3’ splice site,
ligating the exons and
releasing the intron as a lariat
structure.
Mecanismo de splicing de los ARNt
Mecanismo clásico
1. Ataque al sitio 5’spl por nt del intrón o por nt libre
2. Ataque del primer exón sobre el segundo exón
Conservación de uniones fosfodiester
ARNt
1. tARN endonucleasa
2. ARN ligasa
Para lograr el splicing del ARNt se
necesitan las dos enzimas + ATP
Clases de intrones
Auto - splicing
√ Grupo I: genes nucleares, mitocondriales y
cloroplásticos que codifican para ARNr, ARNt y
ARNm
√ Grupo II: transcriptos primarios de ARNm
mitocondrial o cloroplástico en hongos, algas y
plantas
No auto - splicing
√ Splicing de transcripto primario de ARNm:
spliceosoma
√ Splicing de ARNt de levaduras
Splicing: intrones grupo I y II
Reacciones de transesterificación
Mecanismo de Splicing: intrones
grupo I
Intrones grupo I
Gen de 26S ARNr + ARN pol de E. coli
•
Splicing del ARN
• Circularización del intrón
• AUTOSPLICING no requiere proteína extra
Cech y col., 1982
Intrones grupo I
Autociclización del intrón
1 Intrón lineal
2 + alta T, Mg2+,
sales
3 Marcador de
intrón C
intrón L
Cech y col., 1982
intrón C
Intrones grupo I
Clonación de ARNr 26S en vector
Transcripción in vitro con P*
Autosplicing dependiente de GTP
Incubación con y sin GTP
Cech y col., 1982
Intrones grupo I
• Autosplicing ocurría en ausencia de proteína
Precusor de spl + [α-32P]GTP + condiciones de spl
Seph G50, electroforesis, producto*
Intrón incorporaba *
• Marcación del extremo 5’ del intrón con [α-32P]GTP y
secuenciación del producto
Secuencia del intrón lineal con extra G en 5’
• Tratamiento con RNasa T1
G unida a extremo 5’ por enlace fosfodiester 3’-5’
Cech y col., 1982
Modelo de autosplicing
Intrón dentro de 26S
Ciclización y linealización del intrón
Modelaje molecular
Ribozimas
Son ARNs catalíticos
M1ARN es el componente catalítico de
RNasa P
(Altman, 1983)
Mecanismo de Splicing: intrones grupo
II: intermediario lazo
Primera reacción de transesterificación
Consensus Group II intron Structure
6 domains,
“Helical Wheel”
Domain I
contains binding
sites for the 5’
exon (keeps the
5’ exon from
floating away
after the first
splicing step)
Mecanismo de Splicing: intrones grupo
II: intermediario lazo
La unión
de los
exones
libera el
lazo
(intrón)
Group II Splicing
Pathway
(1) The 2’ OH of a special
internal A attacks the 5’ splice
site creating a branched intron
structure.
(2) The 3’ OH of the 5’ exon
attacks the 3’ splice site,
ligating the exons and
releasing the intron as a lariat
structure.
Mecanismo de splicing de los ARNt
Mecanismo clásico
1. Ataque al sitio 5’spl por nt del intrón o por nt libre
2. Ataque del primer exón sobre el segundo exón
Conservación de uniones fosfodiester
ARNt
1. tARN endonucleasa
2. ARN ligasa
Para lograr el splicing del ARNt se
necesitan las dos enzimas + ATP
Mecanismo de splicing de los ARNt
Procesamiento adicional de los
ARNm eucariotas
ARNm maduros de eucariotas tiene
características estructurales en ambos
extremos
• extremo 5´: cap
• extremo 3´: colita de poli (A)
Estructura del cap
Marcación de Cap con [β,γ-32P]ATP
primer nt del ARN
No removible por fosfatasa alcalina
protegido
• Cuál es el agente bloqueante?
7-metil-guanosina
Capping
Su función
principal es
prevenir la
hidrólisis
del enlace
fosfodiéster
7-methylguanosine
7-methyl G5’ppp5’N
m7G
Tipos de cap
Capping
Capping ocurre co-transcripcionalmente enseguida
después de la iniciación
• Guanililtransferasa (nuclear) transfiere residuos G al
extremo 5´
• Metiltransferasa (nuclear y citoplasmática) agrega grupos
metilo a la G 5´ terminal y en la posición 2´ de ribosas de
nt próximos
Capping
γ
(GT)
(S-adenosylmethionine)
Estructura del Cap
¿Cuándo se agrega el Cap?
•
•
Transcripción depende del capping (en CPV)
Transcripción no depende del capping (en vaccinia)
•
En adenovirus capping ocurre temprano en el proceso de transcripción
1. [3H]A
marca m7GpppA y otras A de pre ARNm
2. Separación de precursores por gradiente de centrif
3. Hibridiz de ARNs a fragmento de restricción pequeño incluyendo sitio de
iniciación de la transcripción
Fragmentos hibridizados tenían CAP
Capping en eucariotas ocurre antes que el pre-ARNm llegue a 30nt
Función del Capping
• Protege el extremo 5´ del ARNm
Estabilidad del ARNm
• Aumenta la transducibilidad del ARNm
Requerido para la iniciación de la síntesis de proteínas
• Aumenta el transporte del ARNm desde el núcleo
al citoplasma
• Aumenta la eficiencia del splicing de ARNm
Protección
1.
ARN viral con cap, bloqueado
o libre inyectados en oocitos
2.
Purif y análisis de
sedimentación grad glicerol
Degradación por incubación
8hs
Decapping por Β-eliminación
pppGm-ARN, pppG-ARN sin inc
pppGm-ARN, pppG-ARN con inc
Incubación en extracto de
germen de trigo
ARN sin cap menos estables
Furuichi y col. 1977
Transducibiliadad
• ARNm accede al ribosoma vía proteína de
unión al cap
ARNm desnudo
• Cap en ARNm poliadenilado
297 veces
traducción
traducción
Transporte
•
Cap facilita el transporte del ARN maduro fuera del núcleo
X U1 snARN bajo promotor de hU6snARN (pol III no cap)
inyectado en oocitos con [α-32P]GTP + 5S ARNr + α-amanitina
Pol III U1
P
o
l
I
Pol II U1
I
I
U
1
Hamm y Mattaj, 1990
¿Como protege el cap al extremo 5’ de la degradación?
¾ Por unión del complejo CBP
¾ CBP consiste de 2 subunidades
CBP 80 y CBP 20
¾ CBP acompaña al ARNm al poro nuclear y
ayuda a su marcación para la exportación
CBP 80
RNAP II
CBP 20
CBP 80
CBP 20
RNAP II
Segunda función del cap
¾ Marca a los pre-mRNAs para otros procesamientos
¾ RNA sin cap
a) no poliadenilación
b) no splicing
in vitro e in vivo
Tercera función del cap
¾ Iniciación de la traducción
¾ Los factores de iniciación de la traducción eIF4E
y eIF4F son proteínas de “unión al cap”
¾ Los ARNs sin cap no son traducidos
Las enzimas del capping se unen a la CTD fosforilada
GT is released in conjunction with Ser5 dephosphorylation
MT remains associated with the CTD
Bentley, D. Curr. Op. Cell Biol. 14, 336-342 (2002)
mRNA capping enzyme is recruited to the transcription complex by
phosphorylation of the RNA polymerase II carboxy-terminal domain
GENES & DEVELOPMENT(1997) 11:3319–3326
Capping enzyme binds to phosphorylated
RNAP II.
Purified RNAP II was phosphorylated in vitro
with TFIIH and [γ-32P]ATP. Capping enzyme was
added and the mixture was precipitated with
preimmune serum (lane 1) or anti-Capping
enzyme antibodies (lanes 2–5). As competitors for
binding to the capping enzyme, parallel reactions
contained GST (lane 3), GST–CTD (lane 4), or
phosphorylated GST–CTD (lane 5).
Solamente GST-CTD(P) compitió
por el binding
anticapping
enzyme Ab
RNAP II O
Competition experiment
La enzima de capping se une directamente al CTD fosforilado
Purified capping enzyme was incubated with glutathione–agarose beads
carrying GST, GST–CTD, or phosphorylated GST–CTD protein. The beads
were pelleted and washed extensively.
RNA turnover
Decapping / Deadenilación
Wilutz, C. J. et al. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 237-246 (2001)