No. Proyecto: SC93-160 UTILIZACION DE PROTEINAS VIRICAS

No. Proyecto: SC93-160
UTILIZACION DE PROTEINAS VIRICAS RECOMBINANTES EXPRESADAS EN
DIFERENTES SISTEMAS PARA EL ESTUDIO DE LOS MECANISMOS
INMUNITARIOS RELEVANTES EN PESTE PORCINA AFRICANA
Equipo Investigador:
José Angel Martínez Escribano (Dr. Vet.)
Covadonga Alonso Martí (Dra. Med.)
Adolfo Eiras Martínez (Dr. Far.)
Fernando Alonso Moreno (Dr. C.B.)
Angel Ezquerra Martínez (Dr. C.Q.)
Francisco Ruiz Gonzalvo (L.V.)
Javier Domínguez Juncal (Dr. Med.)
Fernando Rodríguez González (Dr. C.B.)
Paulino Gómez Puertas (Dr. C.B.)
Alejandro Brun (L.B.)
Equivalente de jornada completa: 2,90
Centro de Investigación:
Centro de Investigación en Sanidad Animal (C.I.S.A.). INIA.
28130 VALDEOLMOS (MADRID)
Tel: 91/620 23 00 - Fax: 91/620 22 47
Duración:
Enero 1993 - Diciembre 1995
Coste:
Miles de pesetas: 21.823
Financiación INIA 100%
PLANTEAMIENTO Y OBJETIVOS
Hasta el comienzo de este proyecto se habían realizado pocos avances en la caracterización de
los mecanismos inmunitarios relevantes en la protección frente al virus de la Peste Porcina
Africana. Por otra parte, nada se sabía de las proteínas que podían mediar un respuesta
inmune protectora. La ausencia de modelos experimentales de protección y la complejidad
estructural del virus habían dificultado estos estudios y por tanto la consecución de una
vacuna.
Los objetivos de este proyecto han sido la caracterización de aquellas proteínas que
determinan la respuesta inmune protectora frente al virus de la Peste porcina africana y los
mecanismos inmunes que estimulan. Para esta caracterización se han dado los siguientes
pasos: 1) establecimiento de modelos experimentales de protección utilizando virus
atenuados; 2) análisis de la respuesta humoral y celular en los animales protegidos; 3)
caracterización de las proteínas que median los diferentes mecanismos; 4) determinación de
la capacidad protectora de las proteínas víricas expresadas en diferentes sistemas.
RESULTADOS
·
Se han establecido tres modelos experimentales de protección frente al VPPA
utilizando aislados atenuados del virus obtenidos por pase en cultivo celular. Estos virus
confieren protección frente a la infección de aislados altamente virulentos.
·
Se ha determinado que el VPPA induce anticuerpos neutralizantes
neutralizantes en todos los cerdos
convalecientes de la enfermedad. Estos anticuerpos son capaces de neutralizar al virus
mediante dos mecanismos: 1) inhibición de la unión del virus a la célula; 2) inhibición de la
penetración del virus en la célula.
·
Se ha demostrado
demostrado que la neutralización del VPPA es un fenómeno dependiente de la
composición de lípidos de la membrana del virus. Virus con una proporción mayor de
fosfatidilinositol son mejor neutralizados. Con pases en cultivo celular se alteran la
proporción de lípidos en la membrana del virus.
·
Se han caracterizado tres proteínas víricas como responsables de la inducción de
anticuerpos neutralizantes, la p72, p30 y p54. Anticuerpos frente a la p72 y p54 son capaces
de inhibir la unión del virus a la céula. Anticuerpos frente a la p30 inhiben la internalización.
·
La proteína del virus con homología al receptor linfocitario CD2 confirió protección
frente a la enfermedad y/o infección en animales inmunizados con esta proteína expresada en
baculovirus. La inmunización con proteínas que estimulan los dos mecanismos de
neutralización antes mencionados también confirieron protección frente a la enfermedad.
·
Se han determinado aspectos de la patogenia de la enfermedad basados en los
mecanismos de muerte celular y establecimiento de infección productiva. El virus provoca
tanto en células que infecta como en no susceptibles (linfocitos B y T) una fuerte apoptosis. Se
ha estudiado la función reguladora de la apoptosis de un gen con homología al BCL2
humano, encontrando que este gen retarda la muerte de las céulas infectadas previniendo
apoptosis y por tanto permitiendo que el virus establezca una infección productiva y
probablemente una persistencia.
·
Se han generado reactivos que permitir n establecer aspectos importantes de la
patogenia y la respuesta inmune frente al VPPA, así como la caracterización de los receptores
virales. Anticuerpos monoclonales frente a macrófagos porcinos inhiben fuertemente la
infección del virus. Se han puesto a punto métodos de diagnóstico serológico de la
enfermadad basados en la utilización de proteínas recombinantes
INFORMACION CIENTIFICA Y TECNICA PROPORCIONADA POR EL PROYECTO.
POSIBLES APLICACIONES
Establecimiento de modelos experimentales de protección: Se han desarrollado tres modelos
de protección frente al virus de la Peste porcina africana basados en virus atenuados por pase
en cultivo celular. Dos de ellos inducen protección frente a virus virulentos sin mortalidad
previa ni síntomas clínicos (608VR y 1207VR). El tercero (E75CV) produce mortalidad (1040%) con viremia y síntomas clínicos. El rango de virus frente a los que quedan protegidos
los animales es superior con los dos primeros. La patología inducida por el virus atenuado
E75CV ha sido estudiada en profundidad, observándose algunos cambios en las poblaciones
linfocitarias (LB), disminución drástica del receptor de IL2 y cambios ganglionares
relacionados con linfoproliferación como consecuencia de una prevención del fenómeno de
apoptosis o muerte celular programada.
Análisis de la respuesta inmune humoral en cerdos protegidos frente a la VPPA: Se ha
podido determinar que el VPPA induce anticuerpos neutralizantes en todos los animales
protegidos frente a la infección y/o enfermedad. Estos anticuerpos neutralizan al virus
mediante dos mecanismos diferentes: 1) inhibición de la unión del virus a la célula y 2)
2)
inhibición de la internalización del virus. Estos dos mecanismos operando conjuntamente
neutralizan entre el 85 y el 100% de la infectividad viral. Un estudio de la fracción residual
no neutralizada encontrada con la mayoría de los sueros permitió determinar que esta se
produce debido a la existencia de anticuerpos que bloquean la neutralización completa del
virus y no a la generación de variantes antigénicas del virus, a la baja afinidad de los
anticuerpos, a una alta constante de disociación del complejo virus-anticuerpo, o a una baja
cantidad de anticuerpos neutralizantes presentes en los sueros. Por último, se comprobó que
virus altamente pasados en cultivo celular presentaban dificultades para ser neutralizados.
Un estudio en profundidad de los mecanismos que impedian a estos virus ser neutralizados
reveló que una diferencia en la concentración en fosfatidilinositol entre virus de alto y bajo
pase era la responsable de las diferentes susceptibilidades de los virus a ser neutralizados.
Caracterización de las proteínas víricas implicadas en la neutralización del virus: Se han
clonado y expresado en diferentes sistemas múltiples antígenos víricos, especialmente
aquellos que provocaban una respuesta fuerte de anticuerpos durante la infección, o aquellos
antígenos tempranos que pudieran mediar una respuesta citotóxica efectiva. De todos los
antígenos analizados, sólo la p72, p30 y p54 indujeron anticuerpos neutralizantes en animales
infectados. Un estudio en detalle de las proteínas implicadas en los diferentes mecanismos de
neutralización, reveló que anticuerpos frente a la p72 y p54 estan implicados en la inhibición
de la unión del virus a la célula, mientras que anticuerpos frente a la p30 inhiben la
internalización del virus.
Estudio del valor protector de proteínas del virus frente a la infección por el virus de la PPA:
Experimentos de inmunización de cerdos con proteínas del VPPA expresadas en diferentes
sistemas, reveló que la proteína del virus homóloga al receptor linfocitario CD2, la aglutinina
del virus, indujo protección frente a la enfermedad en animales inmunizados, y en algunos
casos frente a la infección. En estos animales protegidos no fueron detectados anticuerpos
neutralizantes. Cerdos inmunizados con las proteínas responsables de la inducción de
anticuerpos neutralizantes por separado no resultaron protegidos frente al desafío con virus
virulentos. Sin embargo, cuando se inmunizaron con combinaciones de proteínas que
estimulaban los dos mecanismos de neutralización (p54 + p30 + p72 o bien p30 + p54), todos
los animales quedaron protegidos frente a la enfermedad.
Estudios sobre patogenia y respuesta inmune: Ha podido comprobarse que el virus produce
durante la infección (virus virulentos) una fuerte inducción de apoptosis en los órganos
linfoides, tanto en células infectadas (células macrofágicas) como en aquellas que no se
infectan por el virus (linfocitos B y T). Esta alteración de las células implicadas en la
respuesta inmune supone un deterioro de la capacidad de desarrollar una respuesta frente a
la infección. Una caracterización del gen del virus A179L, con homología al BCL2 humano,
ha revelado que este gen tiene como función la de retrasar la muerte de la célula infectada
previniendo la apoptosis y por tanto permitiendo una infección productiva. Otra posible
función de este gen podría ser el establecimiento de una infección persistente. Se ha analizado
también la carga viral en animales infectados con aislados virulentos y atenuados. En ambos
casos, mediante citometría de flujo, se ha podido comprobar que a igualdad de título de virus
en sangre, los porcentajes de células infectadas varían de unos animales a otros, y estas
pertenecen a la fracción monocito/macrófago
monocito/macrófago y granulocitos en exclusividad. Los porcentajes
de células infectadas en sangre periférica determinaron el pronóstico de la enfermedad. A
mayor porcentaje mayor probabilidad de que los animales murieran en las primeras
semanas.
Asimismo, se ha comprobado también la aparición de alteraciones en las proporciones de
c‚lulas
c‚lulas inmunes y receptores leucocitarios en cultivos infectados y en sangre periférica de
cerdos inoculados con virus virulentos y atenuados. Aparentemente, tras un período de
activación celular inespecífica se produce una disminución de casi todas las poblaciones
linfocitarias y especialmente linfocitos B. El receptor de IL2 es la molécula de activación m s
afectada tanto in vitro como in vivo.
Desarrollo de reactivos :
Se ha desarrollado un amplio panel de anticuerpos monoclonales frente a poblaciones
celulares y moléculas de diferenciación. Entre los más interesantes, se han encontrado dos
que reconocen macrófagos y que interfieren con la infección del virus. En la actualidad se
están caracterizando las moléculas que reconocen y las proteínas del virus que interaccionan
con ellas.
Se han obtenido anticuerpos monoclonales frente a proteínas del virus, algunos de ellos
neutralizantes. Estos anticuerpos se están caracterizando mejor en ensayos de mapeo
antigénico.
Se ha generado una colección de recombinantes de genes víricos en el vector vaccinia para
ensayos funcionales y de respuesta citotóxica.
Se han puesto a punto métodos de recombinación homóloga en el VPPA que han permitido la
obtención de numerosos recombinantes que expresan genes marcadores o que han permitido
la caracterización de genes esenciales para el virus. Los virus recombinantes que expresan
genes marcadores han facilitado los ensayos de neutralización con virus que no producían
placas en cultivo celular (virus de bajo pase).
FORMACION DE PERSONAL
Elaboración y presentación de la tesis doctoral de Fernando Ramiro Ibáñez, titulada
"Patogenia de la peste porcina africana: interacción del virus con el sistema inmune", en la
Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid. Mayo, 1995. Apto "cum
"cum
laude".
Elaboración y presentación de la tesis doctoral de Fernando Rodríguez Gonz lez, titulada
"Caracterización de la proteina estructural p54 del virus de la peste porcina africana", en la
Facultad de Biológicas de la Universidad Autónoma de Madrid. Octubre, 1994. Apto "cum
"cum
laude".
PUBLICACIONES
Artículos Científicos
Rodriguez, F., Alcaraz, C., Eiras, A., Yáñez, R.J., Rodriguez, J.M., Alonso, C., Rodriguez,
J.F. and Escribano, J.M. 1994. Characterization and molecular basis of heterogeneity of the
African swine fever virus envelope protein p54. J. Virol 68, 7244-7252.
Alcaraz, C., Rodriguez, F., Oviedo, J.M., Eiras, A., De Diego, M., Alonso, C. and Escribano,
J.M. 1995. Highly specific confirmatory Western blot test for African swine fever virus
antibody detection using the recombinant virus protein p54. J. Virol. Meth. 52, 11-119.
Gómez-Puertas, P., Rodríguez, F., Ortega, A., Oviedo, J.M., Alonso, C. and Escribano, J.M.
1995. Improvement of African swine fever virus neutralization assay using recombinant
viruses expressing chromogenic marker genes. J. Virol. Meth. 55, 271- 279.
Ramiro-Iba¤ez, F., Escribano, J.M. and Alonso, C. 1995. Application of a monoclonal
antibody recognizing protein p30 to detect African swine fever virus infected cells in
peripheral blood. J. Virol. Meth. 55, 339-345.
Canals, A., Dominguez, J., Tomillo, J., Babín, M. and Alonso, F. 1995. Inhibition of IL-2R
and SLA classII expression on stimulated lymphocytes by a supressor activity found in
homogenates of ASFV infected cultures. Arch. Virol. 140, 1075-1085.
Rodriguez, F., Ley, V., Gómez-Puertas, P., García, R., Rodríguez, J.F. and Escribano, J.M.
1996 The structural protein p54 is essential for African swine fever virus viability. Virus Res.
40, 161-167.
Ruiz-Gonzalvo, F., Rodríguez, F. and Escribano, J.M. 1996. Functional and immunological
properties of the baculovirus-expressed hemagglutinin of African swine fever virus. Virology
218, 285-289.
Artículos de divulgación
Escribano, J.M., Alcaraz, C. and Gonzalvo, F.R. 1993. New perspectives in African swine
fever virus protection. In coordination of Agricultural Research African swine Fever, pp 113129. Edited by A. Galo. Luxenbourg: Commission of the European Communities.
Escribano, J.M. 1993. La biotecnología, una revolución agraria. El Boletín 8, 13-19.
Escribano, J.M. 1993. Aportaciones de la biotecnología en la obtención de vacunas de nueva
generación. Ciencias Veterinarias (Biotecnología
(Biotecnología aplicada a la especie porcina) 10, 47-52
Trabajos presentados a congresos, reuniones o simposios
African swine fever virus pathogenesis after quantitative or qualitative changes in peripheral
blood cell populations. 10th International conference on poxviruses and iridoviruses. Banff
(Canada). April 30-May 5, 1994.
Characterization of a novel mechanism of African swine fever virus DNA diversification
based on repeat unique sequence variation within a genome coding region. 10th International
conference on poxviruses and iridoviruses. Banff (Canada).
(Canada). April 30-May 5, 1994.
Deletion of p54 gene from African swine fever virus. Biological consequences.10th
International conference on poxviruses and iridoviruses. Banff (Canada).
(Canada). April 30-May 5,
1994.
Neutralization of African swine fever virus. Influence of passage history of the virus. The first
european meeting of virology. Wurzburg (Germany).
(Germany). September 10-13, 1995.
Development of an African swine fever virus-based expression vector.
vector. The first european
meeting of virology. Wurzburg (Germany).
(Germany). September 10-13, 1995.
Expresión de la glicoproteína S del virus de la Gastroenteritis porcina transmisible en el virus
de la vacuna. An lisis de la respuesta inmune secretora en el ratón. IV Congreso Nacional de
Virología. Madrid (España). Septiembre 1995.
Gómez-Puertas, P., Rodríguez, F., Oviedo, J.M y Escribano, J.M. La neutralización de
aislados del virus de la Peste porcina africana con idéntica estructura antigénica de epitopos
críticos es dependiente del número de pases en cultivo celular. IV Congreso Nacional de
Virología. Madrid (España). Septiembre 1995.
Oviedo, J.M., Rodríguez, F., Blasco, R., Shafer, A.L., Katz, J., Torres, A. y Escribano, J.M.
Nuevas aportaciones al diagnóstico de la Peste porcina africana. Expresión de antígenos en
vectores eucarióticos, larvas de insectos y utilización de proteínas quiméricas. IV Congreso
Nacional de Virología. Madrid (España) Septiembre 1995.
Ramiro-Ibáñez, F., Escribano, J.M. y Alonso, C. Caracterización y cuantificación de las
poblaciones celulares infectadas en sangre periférica durante la infección por el virus de la
Peste porcina africana mediante la expresión de la proteína p30. IV Congreso Nacional de
Virología. Madrid (España). Septiembre 1995.
Ramiro-Ibáñez, F., Ortega, A., Brun, A., Escribano, J.M. y Alonso, C. Interferencia del virus
de la Peste porcina africana con los mecanismos de apoptosis linfocitaria in vitro e in vivo.
Implicaciones en patogenia. IV Congreso Nacional de Virología. Madrid (España)
Septiembre 1995.
Ramiro-Ibáñez, F., Ortega, A., Ruiz-Gonzalvo, F., Escribano, J.M. y Alonso, C. Cambios en
las poblaciones celulares implicadas en la respuesta inmune y sus marcadores de activación a
lo largo de la infección por el virus de la Peste porcina africana. IV Congreso Nacional de
Virología. Madrid (España). Septiembre 1995.
Brun, A., Rodríguez, F., Diego, M.D. y Escribano, J.M. Desarrollo de un nuevo vector de
expresión basado en el virus de la Peste porcina africana. IV Congreso Nacional de Virología.
Madrid (España). Septiembre 1995.
Rodriguez, F., Ley, V., Gómez-Puertas, P., García, R., Rodríguez, J.F. y Escribano, J.M. La
proteína estructural p54 es esencial en la replicación del virus de la Peste porcina africana.
IV Congreso Nacional de Virología. Madrid (España). Septiembre 1995.
Gómez-Puertas, P., Rodríguez, F., Oviedo, J.M., Ruiz-Gonzalvo, F., Alonso, C., Coll, J. and
Escribano, J.M. Neutralization of African swine fever virus: Mechanisms, proteins
implicated and influence of phospholipid composition of virus membranes. XI Poxvirus and
Iridovirus Meeting. Toledo (España). Mayo 1996
Rodríguez, F., Brun, A., De Diego, M., Sobrino, F., Parra, F. and Escribano, J.M.
Development of an African swine fever virus-based expression vector. XI Poxvirus and
Iridovirus Meeting. Toledo (España). Mayo 1996.
Ramiro-Ibáñez, F., Ortega, A., Brun, A., Escribano, J.M. and Alonso, C. Apoptosis:
amechanism of cell killing and lymphoid organ impairment during acute African swine fever
virus infection. XI Poxvirus and Iridovirus Meeting. Toledo (España). Mayo 1996.