Memorias del XIV Congreso de Bioenergética y Biomembranas. Sociedad Mexicana de Bioquímica A.C. 13 al 18 noviembre 2005; Oaxaca, Oaxaca. CARACTERIZACIÓN CINÉTICA DE LAS ENZIMAS GLUCOLÍTICAS DE Ustilago maydis Ramos Casillas L.E1, Guerra-Sánchez G1, Marín-Hernández A2, Moreno-Sánchez R2, Saavedra E2. 1 Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Prolongación de Carpio y Plan de Ayala, col. Casco de Santo Tomas. Miguel hidalgo, México D.F.; 2 Instituto Nacional de Cardiología, Juan Badiano No. 1, col. Sección XVI. Tlalpan, CP 14080, México D.F. [email protected], [email protected], [email protected] RESUMEN Ustilago maydis es un modelo importante para el estudio de la patogenicidad en plantas, puede ser fácilmente propagado bajo condiciones de laboratorio y se pueden aplicar técnicas moleculares para su estudio, sin embargo; hasta el momento se ignora las características de las vías metabólicas clásicas, como lo es la glucólisis. En este trabajo se determinó y comparó los parámetros cinéticos de las enzimas glucolíticas en levaduras de U. maydis cultivadas en medio rico y en medio de estrés nutricional, para establecer si el crecimiento del hongo en las diferentes condiciones nutricionales tiene efecto sobre las propiedades bioquímicas y/o la actividad de las enzimas de la vía. Cuando la levadura fué cultivada en medio mínimo, la actividad de las enzimas glucolíticas se vió aumentada al doble con respecto a la actividad de las enzimas del medio rico. Este incremento podría deberse a la necesidad del organismo de sintetizar, a partir de intermediarios glucolíticos, precursores para la síntesis de aminoácidos, nucleótidos y lípidos. Considerando los valores de velocidad máxima de las enzimas determinadas en ambas condiciones, la regulación de la glucólisis podría recaer en la HK y en la PFK debido a que presentan los valores más bajos. Se determinaron las constantes cinéticas Km y Vmax de la HK y la PYK, las cuales son similares a las resportadas para las enzimas de S. cerevisiae. La aldolasa de este fitopatógeno es del tipo II, dependientes de metal; por otro lado, la fosfoglicerato mutasa es independiente del cofactor 2,3BPG, aunque la secuencia de aminoácidos de esta enzima sugiere que este dependiente. Este trabajo reporta por primera vez la caracterización de las enzimas glucolíticas en este hongo fitopatógeno. INTRODUCCIÓN Ustilago maydis es un hongo basidiomiceto y es el agente causante de la enfermedad del carbón del maíz, comúnmente conocido como huitlacoche (1). Tiene un ciclo de vida dimórfico, alternando entre una fase haploide no patógena en forma de levaduras las cuales se dividen por gemación y una etapa de dicarión patógeno, la cual es iniciada con la fusión de dos levaduras compatibles. La formación de la etapa dicariótica es acompañada por un cambio morfológico a crecimiento filamentoso. Mientras que la levadura (esporidia) muestra crecimiento estrictamente saprófito, la propagación del dicarión filamentoso depende del hospedero (planta) (2). Desde hace 15 años, U. maydis ha sido un modelo importante para estudiar los mecanismos moleculares de la diferenciación y de las vías de señalización que determinan la patogenicidad del hongo. Desde un punto de vista biotecnológico, U. maydis ofrece la posibilidad de utilizarlo como productor de metabolitos y enzimas debido a su inocuidad para el humano. Tiene una fase haploide unicelular con un tiempo de generación rápido de 120 min (1) en medio rico, comparable con el de Saccharomyces cerevisiae (90 min) y Schizosaccharomyces pombe (120 min). Cuenta con un genoma de ≈ 20 Mb (5) ya secuenciado que permite aplicar estrategias genómicas para su estudio. Sin embargo; a la fecha no se han explorado los aspectos metabólicos de este fitopatógeno, en especial, la regulación a la que están sometidas las enzimas del metabolismo central. Este hongo, al igual que otros microorganismos, utiliza la vía glucolítica para la degradación de la glucosa para obtener energía en forma de ATP para el trabajo celular así como de intermediarios glucolíticos para la síntesis de precursores de aminoácidos y nucleótidos. Es probable que la glucólisis se vea afectada por las diferentes condiciones ambientales y nutricionales a las que está expuesto este fitopatógeno, por ejemplo, la temperatura ambiental y la humedad, la composición química del tallo, hojas y los granos del maíz donde se desarrolla el hongo. No existe información acerca de las propiedades bioquímicas de las enzimas glucolíticas de U. maydis, por lo que este trabajo de investigación profundizará sobre el funcionamiento de una vía tan importante en el metabolismo energético de este hongo. MATERIALES Y MÉTODOS Condiciones del cultivo Se empleó la cepa haploide FB2 (a2b2) de U. maydis. Se inocularon en condiciones de esterilidad 5x10 6 células/ml en 50 ml de medio rico YPD pH 7.0 (glucosa 1%, nitrato de amonio 0.15 %, peptona de caseína 0.25%, extracto de levadura 2% y 62.5 ml /l de sol. sales) y medio mínimo pH 7.0 (glucosa 1%, nitrato de potasio 0.15% y 62.5 ml /l de sol. sales). Se cultivaron a 28 oC por 48 hrs con agitación constante de 90 rpm. Al cabo de este tiempo las células se lavaron con agua destilada estéril y la pastilla se resuspendió en 2 ml de solución de rompimiento (50 mM buffer de fosfatos pH 7.0, 5 mM EDTA, 5 mM DTT, 1mM PMSF y 20% glicerol). Las células se rompieron agitando fuertemente en vortex con perlas de vidrio por 20 ciclos de 1 minuto con descansos de 1 minuto en hielo. La mezcla se centrifuga a 10 000 rpm por 30 min a 4oC y el sobrenadante se somete a ultracentrifugación a 100 000 rpm por una hora a 4oC. Finalmente, el sobrenadante se conserva a -70 oC para los ensayos enzimáticos. Determinación de las actividades de las enzimas glucolíticas Las actividades enzimáticas se determinaron empleando enzimas acoplantes que permiten medir la formación de NAD(P)H o desaparición de NADH en un espectrofotómetro a 340 nm tal como se ha descrito anteriormente (5). Los ensayos cinéticos se llevaron a cabo en condiciones de velocidad máxima a 28oC, que es la temperatura a la cual crece el hongo, en un buffer de reacción que contiene una mezcla de: 50 mM imidazol, 10 mM acetato, 10 mM MES y 10 mM TRIS a pH 6.4. Para el ensayo de la fosfogliceratocinasa (PGK), se empleó un buffer de fosfato de potasio 50 mM a pH 6.4. Se utilizaron entre 0.3 - 60 µg de extracto clarificado y las reacciones se iniciaron con la adición del sustrato específico para cada una de las enzimas. La actividad basal del extracto en ausencia de sustrato específico fue siempre restado. En todos los experimentos enzimáticos se ensayaron diferentes concentraciones de extracto para asegurar que la actividad detectada fuera proporcional a la concentración de extracto utilizado. También se aseguró que las enzimas acoplantes no fueran limitantes de la reacción. Se determinaron las constantes de afinidad (Km) de la hexocinasa (HK) para glucosa y ATP, y para la piruvato cinasa (PYK) por PEP y ADP. Además se determinó el efecto de inhibidores y activadores sobre la actividad de algunas enzimas de la glucólisis. RESULTADOS Velocidades máximas de enzimas glucolíticas en extractos de U. maydis Los ensayos enzimáticos se realizaron en la fracción soluble de por lo menos tres extractos clarificados diferentes para cada una de las condiciones de cultivo. Las actividades enzimáticas promedio para cada enzima en medio rico YPD pH 7.0, medio mínimo pH 7.0, se muestran en la Tabla 1. Tabla I. Actividad específica de las enzimas glucolíticas de U. maydis cultivado en Medio rico YPD y Medio Mínimo pH 7.0 ENZIMA HK Actividad específica (U/mg de proteína) YPD pH 7.0 MM pH 7.0 0.42 0.94 HPI Reacción directa Reacción reversa 0.69 1.14 2.2 2. 2 ATP-PFK 0.05 0.12 ALDO 2+ sin Co con 0.5 mM Co2+ 2+ con 0.5 mM Zn 0 0.67 0.14 0 0.65 0.12 TPI Reacción directa Reacción reversa 18 105 58 232 GAPDH 0.51 0.87 PGK 24 37 PGAM sin 2,3BPG + 0.12 mM 2,3BPG 3. 9 3. 4 2. 6 2. 4 ENO 0.12 0.15 PK sin F1,6BP + 0.1 mM F1,6BP 1. 3 1. 1 0.6 0.5 El número entre paréntesis indica el número de extractos individuales ensayados. U = µmoles/min. HK, hexocinasa; HPI, hexosa-6-fosfato isomerasa; ATP-PFK, fosfofructocinasa dependiente de ATP; ALDO, aldolasa; TPI, triosafosfato isomerasa; GAPDH, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa; PGK, fosfoglicerato cinasa; PGAM, fosfoglicerato mutasa; ENO, enolasa; PYK, piruvato cinasa; 2,3BPG, 2,3bifosfoglicerato; F1,6BP, fructosa-1,6-bifosfato. En general, la mayoría de las enzimas del hongo crecido en medio mínimo presentaron el doble de actividad comparadas con la condición de crecimiento en medio rico YPD. Esto podría deberse a que la condición de estrés nutricional podría estimular las vías para la síntesis de compuestos esenciales para el hongo tales como nucleótidos y aminoácidos, que no están presentes en el medio de cultivo mínimo. Caracterización cinética de la HK y PYK de U. maydis Con el objetivo de determinar si existían cambios en la expresión de isoenzimas en las dos condiciones de crecimiento, se determinaron los valores de las constantes de afinidad para las enzimas presentes en extractos del hongo crecido en ambas condiciones, los cuales se muestran en la Tabla 2. Tabla 2. Valores de Km de la HK y la PYK por sus sustratos. Sustrato HK PYK Glucosa ATP PEP ADP Medio rico YPD pH 7.0 (mM) 0.108 0.065 0.124 0.334 Medio Mínimo pH 7.0 (mM) 0.085 0.157 0.161 0.309 Efecto de activadores e inhibidores Existen principalmente dos tipos de fosfofructocinasas 1) la dependiente de ATP, presente en la mayoría de los organismos y que se menciona que es una de las enzimas que controlan el flujo de la vía y 2) la dependiente de pirofosfato (PPi) presente en algunos microorganismos y que utiliza PPi en lugar de ATP como donador del fosfato para fosforilar a la fructosa. En el caso de U. maydis, se observó actividad de PFK con ATP (Tabla 1), mientras que no hubo actividad en presencia de PPi, u otros donadores como el ADP y GTP, lo que indica que la PFK de U. maydis pertenece al grupo de las dependientes de ATP. La baja actividad de la PFK en este hongo en comparación con el resto de las enzimas de la vía (Tabla 1) podría sugerir que la concentración de enzima también es baja en la célula; sin embargo, también es conocido que las ATP-PFKs son enzimas alostéricas que tienen moduladores negativos potentes tales como altas concentraciones de ATP y citrato. Por lo tanto, se procedió a ensayar esta actividad en extractos dializados de medio rico YPD pH 7.0 y medio mínimo, con la finalidad de remover metabolitos que pudieran estar inhibiendo a la enzima. En el dializado de YPD pH 7.0 se evaluó el efecto de diferentes activadores de las PFKs tales como K+, NH4+, fructosa-2,6-bifosfato (F2,6BP) y AMP, en concentraciones que muestran efecto activador en las enzimas de otros microorganismos, evitando altas concentraciones que pudieran ser inhibitorias. Los resultados se muestran en la Tabla 3. Tabla 3. Activadores de la ATP-PFK Extracto no dializado Extracto dializado +10 mM KCl + 20 mM NH4Cl + 10 mM DTT + 10 mM NH4Cl + 20 µM F2,6P2 +10 mM NH4Cl + 1 mM AMP Actividad específica (U/ mg de proteína) 0.054 0.135 0.147 0.187 0.120 0.187 0.120 Efecto del 2,3-bifosfoglicerato sobre la actividad de la PGAM. Existen dos tipos de fosfoglicerato mutasas (PGAMs): las que requieren de 2,3 bifosfoglicerato (2,3BPG) para su actividad y las que son independientes de esta molécula. Los valores de actividad de PGAM en extractos de U. maydis sin dializar en ausencia del cofactor son altos y la adición de 0.12 mM no incrementa la actividad (Tabla 1), lo que sugiere que la PGAM del hongo pertenece a las enzimas independientes del 2,3BPG. Para descartar que el extracto sin dializar contenga esta molécula, se analizó el efecto de concentraciones variables de 2,3BPG en la PGAM de extractos dializados de levaduras cultivadas en medio rico YPD y medio mínimo pH 7.0. Tabla 4. Efecto del 2,3BPG sobre la PGAM de U. maydis Extracto no dializado Extracto dializado sin 2,3BPG + 0.12 mM 2,3BPG + 0.24 mM 2,3BPG Actividad específica U/ mg proteína YPD pH 7 MM pH 7 3.9 2.6 7.2 6.0 7.2 6.5 5.8 5.7 La actividad de la PGAM aumentó casi al doble al dializar el extracto, sin embargo, la adición de 0.12 mM prácticamente no tuvo ningún efecto en la actividad, mientras que al incrementar a 0.24 mM se observó un efecto parcialmente inhibidor. DISCUSIÒN. En las dos condiciones ensayadas, las enzimas que presentaron la actividad más baja son la HK y la PFK. Si el valor del flujo total de la vía es cercano a los valores de velocidad determinado para estas dos enzimas, entonces éstas podrían considerarse como etapas limitantes de la vía y por lo tanto controlar el flujo de la misma. Aunque la actividad de la enolasa es también baja, podría deberse a un efecto del ensayo acoplado y no de la actividad real de la enzima ya que el sustrato 2PG se utilizó como sal de Bario el cual tiene efecto precipitante en el ensayo enzimático. La cinética de la HK para glucosa y ATP fue de tipo hiperbólica. En el caso de la PYK de este hongo, también presentó curvas hiperbólicas con respecto a ambos sustratos. De especial interés es el comportamiento con el sustrato PEP, para el cual, las PYKs de otros tipos celulares muestran un comportamiento típicamente sigmoidal. Los valores de Km de la HK por glucosa y ATP son muy similares en la condición de medio YPD pH 7.0 y medio mínimo pH 7.0 (ver tabla 2), lo que indicó que la HK tiene prácticamente la misma afinidad por sus sustratos, no importando las condiciones nutricionales en las que se cultive la levadura. A pesar de que en medio mínimo la HK presentó mayor actividad (ver Tabla 1), no se pudo detectar cambios drásticos en la afinidad de la enzima por su sustrato, lo que sugiere que probablemente en medio mínimo hubo un incremento en la concentración, una activación o alternativamente una desinhibición de la misma isoenzima de la HK. Los valores de Km de la HK de Ustilago son comparables con los valores reportados para los de S. cerevisiae, de 0.1 mM y 0.2 mM para glucosa y ATP, respectivamente. La afinidad de la piruvato cinasa por ADP y PEP no varió en las dos condiciones de cultivo evaluadas como lo demuestran los valores de Km (Tabla 2). Valores similares se han reportado para Phycomyces blakesleeanus (hongo filamentoso) (3), ADP 0.52 mM y PEP 0.90 mM. Los valores que obtuvimos también concuerdan con los reportados para la PYK de S. cerevisiae (4) para el caso del PEP y ADP, respectivamente: en presencia de fructosa 1, 6bifosfato 0.099 mM y 0.16 mM; mientras que en ausencia de fructosa 1,6-bifosfato 10 mM para el PEP. La actividad que se midió para la PFK en el extracto dializado aumentó al doble con respecto al extracto no dializado (Tabla 3). Sin embargo, de los activadores ensayados sólo el NH4+ activó en un 38%. Así mismo se determinó que la concentración óptima de ATP es 1 mM, ya que a mayores concentraciones existe inhibición como se observa en muchas PFKs. Se ensayaron diferentes concentraciones de F6P y se requiere al menos 20 mM de F6P para que observar esta actividad. Además se ensayaron diferentes concentraciones de extracto y diferentes pHs, con el fin de incrementar la actividad de la PFK con resultados poco exitosos. Estos resultados sugieren que la actividad y/o concentración de PFK es baja en U. maydis y que por lo tanto esta enzima sí podría representar un punto de control importante en el flujo de la vía. La nula actividad de la aldolasa de U. maydis en ausencia de un metal divalente (Tabla 1) indica que esta enzima pertenece a la clase II de aldolasas, que requieren de un metal divalente para su actividad y que comúnmente se encuentra en hongos, algas y algunas bacterias. Las aldolasas tipo I, independientes de metal, son características de plantas y animales y su mecanismo de reacción es diferente. Se ensayó el efecto de diferentes concentraciones de metales divalentes que se sabe que también pueden ser utilizados por estas metalo-aldolasas (6) tales como el Co2+ y Zn2+ (Tabla 1), éste último es de relevancia fisiológica ya que es el metal divalente que se encuentra en mayor concentración en la mayoría de las células. Se obtuvo que el mejor catión para la aldolasa de U. maydis es el Co2+ a una concentración de 0.5 mM, mientras que con Zn2+ solamente se obtuvo un 20 % de la actividad obtenida con cobalto en ambas condiciones de cultivo. En el caso de la PGAM, los resultados cinéticos sugieren que es independiente de 2,3BPG; sin embargo, identificamos en el banco de secuencias del genoma de U. maydis una secuencia que presenta mayor similitud con las PGAM dependientes de esta molécula. Este resultado es de especial interés ya que la secuencia de aminoácidos de PGAMs de levaduras como S. pombe, Debaryomyces hansenii y Candida albicans presentan alta similitud con las secuencias de las enzimas del grupo de las dependientes de 2,3BPG (7). Una posibilidad es que U. maydis posea los dos tipos de enzimas y que en las condiciones del medio de cultivo sólo se esté expresando la enzima independiente del 2,3 BPG o que éste se encuentre unido con alta afinidad a la enzima y que el dializado no sea suficiente para despegarlo. Uno de los activadores alostéricos más importante de algunos tipos de piruvato cinasas (PYK) es la fructosa-1,6BP sintetizada por la PFK, la cual es una manera de señalarle a la última enzima de la vía, la PYK, para acelerar el flujo total de la glucólisis. La PYK de U. maydis no fue activada por este metabolito a concentraciones en el intervalo de 0.1-0.2 mM. Esto contrasta con lo reportado para la enzima de otros hongos tales como Phycomyces blakesleeanus (3) y Saccharomyces cerevisiae (4) que indican un efecto activador de este metabolito en las enzimas respectivas. CONCLUSIONES Las enzimas glucolíticas de U. maydis en condiciones de estrés presentan mayor actividad, probablemente porque se requieren precursores para la síntesis de aminoácidos como el PEP, 3-fosfoglicerato, 2 fosfoglicerato; para la síntesis de nucleótidos como la glucosa-6P, y para la síntesis de triglicéridos como la dihidroxiacetona fosfato. Los valores de afinidad de la HK y PYK por sus sustratos son similares en ambas condiciones de cultivo, por lo que el incremento en la velocidad en la condición de agobio nutricional puede deberse a un incremento en la concentración de enzima. La actividad de la PFK es muy baja con respecto a las demás enzimas evaluadas. Esto indica que esta enzima puede representar un punto de control importante para el flujo de la vía en este hongo. La ALDO pertenece a las aldolasas tipo II que requieren de un metal divalente para su actividad y la PGAM puede estar unida fuertemente al 2,3BPG. AGRADECIMIENTOS Agradecemos a la Biol. Rusely Encalada por su ayuda en la medición de algunas actividades. Este trabajo fue apoyado por los donativos 43811-Q a RMS y donativos del proyecto CGPI 20050887 del IPN. Ramos-casillas L. es becaria CONACYT (2004-2005) REFERENCIAS 1. Banuett F. (2002). Pathogenic development in Ustilago maydis a progression of morphological transitions that results in tumor formation and teliospore production. Molecular biology of fungal development. Marcel Dekker, Inc. 14: 349-398. 2. Kämper J. (2004). A PCR-based system for highly efficient generation of gene replacement mutants in Ustilago maydis. Mol Gen Genomics. 271: 103-110. 3. Arriaga D., Busto F., Del valle P and Soler J. (1989). A kinetic study of the pH effect on the allosteric properties of pyruvate kinase from Phycomyces blaskesleeanus. Biochimica et Biophysica Acta. 998: 221-230. 4. Kinderlerer J., Ainsworth S., Morris C. and Rhodes N. (1986). The regulatory properties of yeast pyruvate kinase. Biochem J. 234: 699-703. 5. 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