Hibridación Natural entre Laurel y Tepa

UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS FORESTALES
HIBRIDACIÓN NATURAL ENTRE LAUREL (Laurelia sempervirens [R. ET P.] TUL.)
Y TEPA (L. philippiana LOOSER O Laureliopsis philippiana [LOOSER] SCHODDE).
Profesor Guía : Claudio Donoso
Tesis de Grado presentada como
parte de los requisitos para optar al
Título de Ingeniero Forestal
DIEGO ALARCÓN ABARCA
VALDIVIA - CHILE
2000
CALIFICACIÓN COMITÉ DE TITULACIÓN
NOTA
PROFESOR PATROCINANTE :
Claudio Donoso Zegers
7,0
PROFESOR INFORMANTE
:
Rodrigo Vengara Lagos 7,0
PROFESOR INFORMANTE
:
Angélica Aguilar Vivar
7,0
El Profesor Patrocinante acredita que el presente trabajo de Titulación cumple con
los requisitos de contenido y de forma contemplados en el Reglamento de
Titulación de la Escuela. Del mismo modo, acredita que en el presente documento
han sido consideradas las sugerencias y modificaciones propuestas por los demás
integrantes del Comité de Titulación.
Prof. Claudio Donoso Zegers
A los frutos del esfuerzo y tesón de Lila y Claudio, mis padres.
Al comienzo del camino de Paula Sofía y Claudio Andrés.
AGRADECIMIENTOS
El autor desea agradecer a Claudio Donoso, quien con su trabajo, perseverancia y visión
señeras, constituye un ejemplo para generaciones de profesionales del bosque, cuyo
apoyo hizo posible el desarrollo de cada una de las etapas de esta tesis.
Al otro lado de los Andes, a Andrea Premoli y Cinthia Souto, del Laboratorio Ecotono,
de la Universidad Nacional del Comahue, en Bariloche, por su vital ayuda en esta tesis
en el estudio de variación isoenzimática.
A Rolando Martínez, del Laboratorio de Síntesis Orgánica del Instituto de Química de la
Universidad Austral de Chile, por su importante apoyo en el análisis de compuestos
secundarios foliares.
Especiales son los agradecimientos a Héctor Lobos "Lobito", Rodrigo Sagardía y José
Felipe Monacci, más que por la importante ayuda brindada en la colecta de muestras,
por su amistad a toda prueba y apoyo en los momentos precisos.
A Rodrigo Vergara, Moisés Osorio, Sigrid Calderón, Andrea Santana, Jorge Higuera,
Marcelo Opazo, Matías Pizzi, Ximena Miranda, Felipe Portales, Paulo Canales, Soledad
Celis, Daniela Barrientos, Víctor Limarí, Verónica Fredes, Juan Andrés Benavides,
Carolina Alvarez y Alberto Zúñiga, quienes de una u otra forma han brindado valiosa
colaboración en distintas fases de esta tesis.
INDICE DE MATERIAS
1.
INTRODUCCIÓN....................................................................................................3
2.
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA .............................................................................5
2.1
Hibridación: características y principios del fenómeno ....................................5
2.2
Consecuencias e importancia de la hibridación ................................................14
2.3
Caracterización de Laurelia sempervirens y L. philippiana.............................17
2.3.1
Clasificación taxonómica ................................................................................ 17
2.3.2
Descripción de las especies............................................................................. 17
2.3.3
Distribución natural de L. sempervirens ........................................................ 19
2.3.4
Distribución natural de L. philippiana ........................................................... 21
2.3.5
Antecedentes sobre la ecología de las especies ............................................. 22
2.3.6
Importancia de L. sempervirens y L. philippiana .......................................... 23
3.
MATERIAL Y MÉTODO ....................................................................................24
3.1
Poblaciones en estudio...........................................................................................24
3.2
Estudio de características morfológicas y anatómicas .....................................26
3.2.1
Análisis mediante Índice de Hibridación ....................................................... 33
3.2.2
Análisis mediante Diagrama de Dispersión ................................................... 33
3.2.3
Dendrograma a partir de análisis de cluster ................................................... 33
3.2.4
Análisis factorial por componentes principales ............................................. 35
3.3
Estudio de compuestos secundarios de las hojas...............................................35
3.4
Estudio de variación isoenzimática .....................................................................39
3.4.1
Extracción y almacenamiento de las muestras............................................... 39
3.4.2
Preparación del gel de almidón....................................................................... 41
3.4.3
Corrida electroforética..................................................................................... 42
3.4.4
Tinción del gel.................................................................................................. 44
3.4.5
Registro e interpretación ................................................................................. 44
4.
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS .........................46
4.1
Estudio de características morfológicas y anatómicas .....................................46
4.1.1
Caracterización según elementos foliares de registro directo....................... 46
4.1.2
Caracterización según coeficientes morfométricos ....................................... 50
4.1.3
Caracterización según rasgos de tipo cualitativo ........................................... 55
4.1.4
Índice de Hibridación de Anderson ................................................................ 57
4.1.5
Diagrama de dispersión de Anderson............................................................. 61
4.1.6
Análisis de Clusters para los coeficientes morfométricos............................. 63
4.1.7
Análisis Factorial por Componentes Principales ........................................... 65
4.2
Estudio de compuestos secundarios de las hojas...............................................68
4.3
Variación isoenzimática en las poblaciones en estudio.....................................71
4.4
Elementos de coherencia con los principios de hibridación............................80
5.
CONCLUSIONES..................................................................................................83
6.
RESUMEN..............................................................................................................85
7.
BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................86
APÉNDICES...........................................................................................................94
Apéndice 1. Coeficientes medios de morfología foliar por individuo ............95
Apéndice 2. Cálculo del Índice de Hibridación ...............................................101
Apéndice 3. Cromatogramas de Flavonoides ..................................................107
INDICE DE CUADROS
1. Comparación de las características de Laurelia sempervirens y L. philippiana ......... 17
2. Individuos incluidos en la muestra, según población y sector ..................................... 26
3. Rasgos cuantitativos de la morfología foliar, y unidades de registro........................... 29
4. Rasgos cualitativos de la morfología foliar, y valores de registro................................ 30
5. Coeficientes de relación morfométrica empleados en el análisis ................................. 32
6. Elementos a registrar a partir de cada mancha en los cromatogramas ........................ 38
7. Sistemas buffer empleados en las corridas electroforéticas.......................................... 42
8. Enzimas de las cuales se analizó su variación y sistema buffer requerido .................. 43
9. Características foliares de registro directo en las poblaciones estudiadas................... 46
10. Presencia de diferencias significativas de los presuntos híbridos, respecto del resto
de las poblaciones, para los elementos foliares de registro directo ......................... 49
11. Coeficientes morfométricos en las poblaciones estudiadas........................................ 50
12. Presencia de diferencias significativas de los presuntos híbridos, respecto del resto
de las poblaciones, para los coeficientes morfométricos ......................................... 52
13. Rasgos cualitativos observados en las poblaciones estudiadas.................................. 55
14. Características incluidas en el índice de hibridación y sus puntajes.......................... 57
15. Índices de Hibridación calculado para cada individuo ............................................... 59
16. Correlación de cada coeficiente morfométrico foliar con cada factor obtenido por el
análisis de componentes principales.......................................................................... 66
17. Compuestos detectados en las poblaciones analizadas por cromatografía................ 68
18. Compuestos detectados en los individuos analizados y valores de Rf (TBA) ......... 69
19. Parámetros de variación genética en las poblaciones en estudio, considerando las
frecuencias alélicas de los 18 loci isoenzimáticos.................................................... 72
20.
Matriz de coeficientes de similaridad genética de Rogers (1972) entre las
poblaciones en estudio................................................................................................ 75
21. Matriz de valores de identidad genética insesgada según Nei (1978) entre las
poblaciones en estudio................................................................................................ 76
22. Representación del número de días observados con presencia de flores maduras en
L. philippiana y L. sempervirens, para las temporadas 1996 a 1998....................... 81
INDICE DE FIGURAS
1. Rango latitudinal de distribución de L. sempervirens y L. philippiana ....................... 20
2. Localización de las poblaciones estudiadas................................................................... 25
3. Representación gráfica de los rasgos cuantitativos de la morfología foliar ............... 30
4. Gráfico de dispersión según ángulo del ápice de la lámina (ang a) y número medio de
dientes por lámina (as) .............................................................................................. 47
5. Gráfico de dispersión según número medio de nervaduras secundarias por lámina (n)
y ángulo de la base de la lámina (ang b) .................................................................. 48
6. Gráfico de dispersión según proporción l/n y proporción l/s ........................................ 51
7. Gráfico de dispersión según proporción l/p, y proporción da/a.................................... 53
8. Gráfico de dispersión según proporción da/p, y proporción l/T.................................... 54
9. Histograma de frecuencia para los valores de Indice de Hibridación en Laurelia
sempervirens, L. philippiana e híbridos presuntos ................................................... 60
10. Diagrama de Dispersión de Anderson para los ejemplares estudiados de Laurelia
sempervirens, L. philippiana y presuntos híbridos. ................................................. 62
11. Dendrograma del Análisis de Clusters de los individuos, agrupados según vínculo
completo y distancias euclidianas entre coeficientes de morfología foliar............. 64
12. Gráfico del análisis factorial por componentes principales según características de
morfología foliar ........................................................................................................ 67
13. Dendrograma de grupos de pares insesgados a partir de la distancia genética
insesgada modificada de Rogers, según Wright (1978) .......................................... 77
14. Dendrograma de grupos de pares insesgados a partir de los coeficientes de identidad
genética insesgada según Nei (1978) ........................................................................ 78
1. INTRODUCCIÓN
La conservación de los bosques nativos depende, entre otros aspectos, de los
aportes en información aplicable acerca de las especies que los conforman, en especial
respecto de las especies arbóreas que son la base de su estructura. Dentro de esta
información, es necesario considerar la variabilidad de las especies forestales a la hora
de realizar acciones que permitan su utilización productiva y aseguren la conservación
de éstas.
El fenómeno de hibridación entre especies vegetales evolutivamente próximas es
frecuente en la naturaleza, constituye una fuente potencial de aumento en la variabilidad
del acervo genético de las especies, y es considerada una herramienta que puede
determinar el desarrollo o la incorporación de características eventualmente útiles en
programas de mejoramiento genético con fines productivos.
Detectar evidencias de procesos de hibridación natural interespecífica, es una
labor que requiere un completo conocimiento de las especies involucradas, en cuanto a
sus características de morfología, fenología y hábitat. Es así que se han descubierto
diversos casos de híbridos en la naturaleza, gracias a una acertada observación por parte
de especialistas, quienes han encontrado en terreno, individuos con rasgos intermedios
entre dos especies diferentes.
Las especies laurel y tepa son de importancia económica en el ámbito forestal, y
su participación en los bosques nativos chilenos es notable en varios tipos forestales. Se
trata de especies genéticamente cercanas, consideradas taxonómicamente pertenecientes
a una misma familia y pese a que durante mucho tiempo se las trató dentro del mismo
género Laurelia, hoy la especie tepa es postulada como el género monoespecífico
Laureliopsis.
3
Si bien ambas especies comparten una parte importante de sus rangos de
distribución geográfica, ellas crecen generalmente en sitios excluyentes, existiendo, sin
embargo, áreas de encuentro de estas especies, en las cuales se ha evidenciado la
presencia de individuos con aparentes características intermedias, dando origen entonces
a la hipótesis de hibridación natural entre éstas, según Donoso (1993).
La existencia de individuos híbridos naturales entre laurel y tepa representaría un
hecho de importancia, al abrir expectativas para su empleo, por las ventajas que significa
una mayor variabilidad genética eventualmente utilizable en el mejoramiento de alguna
o ambas especies, representando a la vez, un elemento de corroboración de su cercanía
evolutiva y genética.
El objetivo principal de esta tesis es responder a la hipótesis mencionada, por
medio de analizar la identidad de un grupo de individuos presuntamente híbridos debido
a que muestran características intermedias entre las especies y coexisten en un área
donde se superponen sus rangos de distribución natural. Este análisis considera
comparar dichos individuos con poblaciones de cada especie, contiguas a la posible zona
de hibridación, incluyéndose además, poblaciones de cada taxa de las cuales se tiene
certeza del aislamiento genético entre ambas, producto de su ubicación geográfica.
La comparación entre los grupos mencionados se realiza sobre la base de
elementos de anatomía y morfología foliar, presencia de compuestos secundarios en las
hojas y variación isoenzimática, todo lo cual permite determinar la relación entre las
poblaciones e inferir la identidad del grupo de individuos presumiblemente híbridos.
Dentro de los objetivos específicos de la presente investigación, se cuentan:
contribuir al conocimiento de las especies forestales laurel y tepa en relación con la
variabilidad que éstas presentan en la zona de estudio, aportar al entendimiento del
grado de relación filogenética entre ellas, y contribuir al conocimiento de las
características de la anatomía y morfología foliar de las especies en estudio, que
favorezcan su identificación.
4
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1
Hibridación: características y principios del fenómeno
Se entiende por hibridación el cruzamiento de tipos genéticamente diferentes
(Stebbins, 1950), como por ejemplo distintas poblaciones o razas geográficas dentro de
una misma especie, o bien subespecies o especies diferentes (Spurr y Barnes, 1980).
Dentro del contexto de las ciencias forestales, el término hibridación generalmente se
refiere a la cruza entre distintas especies, o hibridación interespecífica (Wright, 1964a;
Zobel y Talbert, 1994).
La hibridación corresponde a un fenómeno frecuente en poblaciones naturales de
muchos grupos de plantas leñosas (Spurr y Barnes, 1980). Para su ocurrencia, debe
existir compatibilidad genética entre las especies, y además, contigüidad o superposición
de sus áreas de distribución, superposición de los períodos de floración de ambas
especies y condiciones de sitio adecuadas para la progenie (Stebbins, 1950; Stern y
Roche, 1974; Donoso, 1993).
En relación a estos factores, la libre hibridación en poblaciones naturales se ve
obstaculizada, dado que especies genéticamente compatibles pese a que puedan
superponer sus rangos de distribución, usualmente ocupan distintos nichos ecológicos
producto de diferencias en su autoecología y sus requerimientos climáticos y edáficos,
determinando entonces que las condiciones favorables para el cruce de ellas y la
consecuente generación de híbridos viables, se presenten sólo en ciertas áreas del rango
de distribución (Stern y Roche, 1974).
Los híbridos son capaces de sobrevivir sólo en hábitats favorables, y
comúnmente donde crecen, también están presentes las especies parentales y demás
miembros de la comunidad forestal. De esta forma, muchos híbridos deben competir con
otras plantas seleccionadas por el medioambiente y probablemente mejor adaptadas que
ellos (Benson, 1962).
5
La hibridación natural sucede con mayor frecuencia en áreas perturbadas, donde
ocurren grandes cambios en el ambiente dentro de cortas distancias, permitiendo así la
proximidad necesaria de las especies compatibles y el origen de nichos nuevos,
favoreciendo el establecimiento de los híbridos formados (Zobel y Talbert, 1994). Estas
áreas alteradas pueden constituir un hábitat intermedio o hábitat híbrido, donde las
especies parentales no logran adaptarse bien, y la consecuente falta de competencia en
esas zonas brinda una buena condición para la sobrevivencia de la progenie híbrida
(Benson, 1962; Anderson, 1968; Spurr y Barnes, 1980). Eventualmente, algunos de los
híbridos podría presentar una combinación de características mejor adaptada a la nueva
mezcla de hábitats producida, que las especies parentales (Heywood, 1968).
Gran parte de los ejemplos de hibridación en el mundo vegetal, se relacionan a
hábitats alterados y áreas abiertas por la actividad humana. Un ejemplo de ello lo
constituye la hibridación natural entre Nothofagus obliqua y N. alpina, donde
alteraciones como incendios, tala de bosques, y abandono de tierras agrícolas o
ganaderas, permitieron la formación de renovales mixtos de ambas especies,
determinando un mayor contacto entre ellas y favoreciendo así procesos de hibridación
natural (Donoso et al., 1990; Donoso, 1993).
Cualquier tipo de alteración ambiental puede dar como resultado un hábitat
híbrido potencial (Zobel y Talbert, 1994). Es así como diversas perturbaciones de origen
natural, derivan en áreas con características medioambientales propicias para la
hibridación, dentro de las cuales se puede incluir deslizamientos de tierra, escoria o
nieve, erupciones volcánicas, incendios forestales naturales, solevantamientos o
hundimientos de tierras o islas, inundaciones o retiradas de glaciares (Donoso, 1993).
Algunos ejemplos para estas últimas situaciones corresponden a los híbridos descritos
Sophora macrocarpa x S. microphylla y Myrceugenia exsucca x M. lanceolata, en un
área de inundación periódica aledaña a la laguna Amargo, precordillera andina de
Linares, en la Región del Maule (Donoso, 1975; Landrum, 1975), o bien los híbridos
Nothofagus betuloides x N. nitida, en una zona alterada luego de una avalancha desde el
Ventisquero Queulat, en la Región de Aysén (Donoso y Atienza, 1984), y los híbridos
6
entre N. dombeyi y N. nitida, en un área de deslizamiento de tierra y rocas en Anticura,
Región de Los Lagos (Donoso y Atienza, 1983).
En términos generales, se puede decir que la frecuencia de hibridación y
ocurrencia de procesos de introgresión, es alta en lugares caracterizados por una
condición de insularidad, donde la creación de nuevos sitios ecológicos producidos ha
determinado en algunos casos la hibridación del hábitat (Anderson, 1968). Esta situación
explica en parte la gran cantidad de fenómenos de hibridación ante la señalada
condición, destacando en Tasmania el género Eucalyptus y en Nueva Zelandia los
híbridos de Nothofagus. La condición de aislamiento ecológico de los bosques de Chile
es un elemento que hace más entendible aún la ocurrencia de fenómenos de hibridación
entre algunas especies. Se han informado casos para los géneros Nothofagus (Donoso y
Landrum, 1979; Donoso y Atienza, 1983; 1984; Donoso et al., 1990; Premoli, 1996),
Sophora y Myrceugenia (Donoso, 1975; Landrum, 1975), sin embargo, es probable que
acontezca hibridación natural en otros géneros como Baccharis, Berberis, entre Fitzroya
cupressoides y Pilgerodendron uviferum, y entre Laurelia sempervirens y L. philippiana,
según observaciones en terreno (Donoso, 1993), así mismo en otros casos de la flora
nativa chilena.
La posibilidad de cruza entre especies o factibilidad de hibridación es mayor
mientras menor sea la diferenciación genética entre las especies afines o próximas. En
este ámbito, son numerosos los antecedentes sobre híbridos naturales entre especies
forestales de un mismo género, dentro de los que sobresalen los géneros Pinus
(Panetsos, 1975; Korol et al., 1995; Edwards-Burke et al., 1997), Abies (Jain, 1976),
Picea (Ernst et al., 1990; Krutowski y Bergmann, 1995), Larix (Carlson y Theroux,
1992), Acer, Populus (Whitham, 1989; Zhang et al., 1995), Betula, Quercus (Nason et
al., 1992; Rushton, 1993), Aesculus (De Pamphilis y Wyatt, 1990), Castanea, Fraxinus,
Ulmus (Machon et al., 1995), Psidium (Landrum et al., 1995), Juglans, Salix (Fritz et
al., 1994), Eucalyptus (Ashton y Sandiford, 1988; Whitham et al., 1994) y Nothofagus
(Donoso y Landrum 1979, Donoso y Atienza, 1983; Donoso et al., 1990; Premoli, 1996;
Gallo et al., 1997). No obstante, también es posible la hibridación natural entre especies
7
de géneros diferentes cercanos, como entre Cupressus y Chamaecyparis, o entre Tsuga y
Picea (Wright, 1964b; Zobel y Talbert, 1994).
En la naturaleza, sin embargo, existe una serie de mecanismos de aislamiento de
especies diferentes, que impiden un efectivo intercambio genético entre ellas. Estos
mecanismos pueden clasificarse de la siguiente manera (Stebbins, 1950; Benson, 1962;
Bell, 1968; Spurr y Barnes, 1980):
1. Mecanismos de Pre-fertilización o Precigóticos. Integrados por una serie de barreras
que impiden la formación del cigoto híbrido, dentro de las cuales se tiene:
a) Aislamiento geográfico: Existencia de las poblaciones de especies o tipos afines
en regiones geográficas diferentes (poblaciones alopátricas).
b) Separación ecológica: Las poblaciones viven en la misma región geográfica,
constituyendo poblaciones simpátricas, sin embargo ellas ocupan hábitats
distintos, con diferentes condiciones climáticas o edáficas. Dentro del rango de
distribución común entre las especies, las barreras de incompatibilidad que
ocurren en algunas partes del rango, pueden estar ausentes en otras partes (Stern
y Roche, 1974).
c) Aislamiento temporal o estacional: Las poblaciones de las especies compatibles
se desarrollan en la misma zona o región y pueden ocurrir en los mismos
hábitats, pero existen diferencias en los períodos de floración y polinización de
las poblaciones. Cuando se presenta esta barrera, puede ocurrir el desarrollo de
híbridos naturales entre las poblaciones pese a existir un intervalo de diferencia
entre los períodos de floración de las especies. Esto puede deberse a que en
determinados años pueden ocurrir fluctuaciones en los períodos de receptividad y
época de liberación del polen de ambas especies, debido a condiciones climáticas
extraordinarias, o ante ataques de insectos a las estructuras florales causando una
maduración temprana o muerte de los tejidos y una posterior regeneración tardía
8
de ellos, resultando en una coincidencia parcial de los períodos de floración de
las especies (Zobel y Talbert, 1994).
d) Separación etológica indirecta: Ocurre cuando la polinización sólo se hace
efectiva mediante agentes muy especializados y específicos, lo que dificulta o
imposibilita la llegada de polen de una especie a la flor de la otra especie. Este
mecanismo es propio de ciertas especies cuya polinización es mediada por
insectos u otros animales.
e) Aislamiento mecánico. Es particularmente efectivo en plantas con elaboradas
estructuras florales adaptadas a la polinización por insectos (por ejemplo en
especies de las familias Orchidaceae o Asclepiadaceae), ya sea por
características del polen, en cuanto a su tamaño o capacidad de agrupación, en
relación con las estructuras florales; o bien por una fuerte especialización de los
agentes polinizadores a flores con determinadas estructuras específicas.
f) Impedimento en la fertilización: Las barreras actúan en la fase reproductiva de
las especies parentales, ya sea por falla o inefectividad del crecimiento del tubo
polínico y falla en la fertilización, o diferencia en la velocidad de crecimiento del
tubo polínico en el ovario de una especie distinta.
g) Incompatibilidad gamética: La polinización puede ocurrir, pero los gametos son
incompatibles antes o en el momento de la fertilización.
2. Mecanismos de Post-Fertilización o Postcigóticos: La fertilización logra ocurrir,
formándose los cigotos híbridos, sin embargo ellos son inviables o dan lugar a
híbridos débiles o estériles. Si alguno de los mecanismos de aislamiento precigótico
resulta no ser efectivo, y llegaran a formarse cigotos híbridos verdaderos, varios
otros mecanismos de aislamiento pueden entrar en acción para impedir que el cruce
realizado se convierta en un efectivo enlace genético de las dos especies en cuestión
(Bell, 1968):
9
a) Inviabilidad: Impedimento en el desarrollo del híbrido F1 luego de la
fertilización, por la incapacidad del cigoto híbrido de crecer como embrión
normal bajo las condiciones de desarrollo de la semilla; por desajustes entre los
juegos de los cromosomas padres, o entre el embrión en desarrollo inicial y el
endosperma que lo rodea, haciendo imposible la germinación para el cigoto
formado.
b) Debilidad del híbrido: Se impide el crecimiento o reproducción de los híbridos
F1, lo cual puede manifestarse en cualquier etapa desde el comienzo del
desarrollo del cigoto híbrido, hasta la maduración de los genotipos que
constituirán la generación F2. El cigoto formado puede llegar a desarrollarse en
una semilla que germina; sin embargo, al establecerse, colapsa antes de formar
órganos reproductivos.
c) Esterilidad genética o cromosómica de los híbridos: Incapacidad o falla de los
híbridos para producir descendencia, producto de desajustes entre los
cromosomas parentales, que actúan en el desarrollo de los gametos o en la
meiosis; o un desarrollo anormal de los órganos reproductivos. Algunas causas
genéticas para la falla reproductora de los híbridos se pueden deber a diferencias
en los complejos genéticos coadaptados de las especies parentales, o esterilidad a
consecuencia de una estructura diferente en los cromosomas homólogos (Stern y
Roche, 1974). Es obvio que si dos especies difieren ampliamente en la fisiología
de sus procesos de desarrollo, muchas recombinaciones de los diferentes factores
genéticos que afectan estos procesos no se ajustarán, y producirán individuos no
adaptados al ambiente, o significarán deficiencias fatales en el cigoto (Stebbins,
1950).
d) Degeneración de la progenie híbrida: Los híbridos F1 son normales, y fértiles,
pero la generación F2, o posteriores a ésta, contienen individuos inviables o
estériles.
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Dado que los mecanismos de aislamiento no siempre son eficientes entre las
diferentes especies de plantas y árboles, sumado a la longevidad característica de las
especies arbóreas y a los eficientes métodos de reproducción sexual que ellos presentan,
se hace más fácil la ocurrencia de hibridación entre especies (Donoso, 1993).
Algunas veces la hibridación da lugar sólo a unos pocos tipos intermedios
aislados, en cambio en otras, se originan poblaciones conocidas como enjambres de
híbridos. Esta diferencia puede producirse debido a oportunidades limitadas para el
cruce, posible esterilidad de los híbridos, interviniendo también la intensidad o
naturaleza de la presión selectiva (Wright, 1964b). En estos enjambres híbridos se
presentan muchas combinaciones, derivadas del cruzamiento de dos especies, seguidas
del cruzamiento de los híbridos entre ellos, y con las poblaciones padres (Benson, 1962).
Es necesario considerar que el intercambio genético entre las especies se hace
efectivo sólo luego de producirse descendencia posterior al F2 (Stebbins, 1950). En la
mayor parte de los casos, la hibridación produce sólo uno o unos pocos árboles F1,
mientras que el grupo de híbridos puede subsistir por una generación, desapareciendo
posteriormente (Wright, 1964b).
Anderson (1968) denomina hibridación introgresiva o introgresión al proceso de
flujo genético a través de una barrera interespecífica incompleta por sobre las barreras de
aislamiento de las especies, con una incorporación de genes o complejos genéticos de
una especie al acervo genético de la otra, más allá de la ocurrencia ocasional de híbridos
espontáneos (Bell, 1968; Stern y Roche, 1974). En este proceso, el flujo limitado de
material genético de una especie a otra se produce por hibridación, seguido de
retrocruzamiento de los híbridos fértiles y su descendencia con individuos de una o
ambas especies progenitoras y posterior selección natural de tipos de cruces mejor
adaptados (Stebbins, 1950; Spurr y Barnes, 1980; Zobel y Talbert, 1994). Los híbridos
formados frecuentemente son incapaces de producir semillas viables, y en cambio, su
polen puede ser viable, siendo capaces de fertilizar individuos de especies parentales
(Heywood, 1968).
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La introgresión puede ocurrir sólo en la parte de la distribución geográfica de la
especie en la cual ocurre la superposición geográfica con la distribución natural de
especie cercanamente relacionada, y sólo cuando el hábitat provee un nicho ecológico
para el establecimiento de tipos introgresivos. Si el patrón de variación de una especie
está siendo alterado por hibridación introgresiva, este patrón debería contener más
variabilidad en regiones donde los rangos de las especies relacionadas superponen su
distribución, que en las regiones donde crecen separadas o aisladas una de otra. Del
mismo modo, esta variabilidad debiera ser mayor en áreas recientemente abiertas y
hábitats con mucha alteración, que en zonas más antiguas y estables (Stebbins, 1950).
La hibridación introgresiva sigue el principio de correlación entre características
diferentes. Si se tienen dos especies A y B, y existe hibridación y posterior introgresión
entre ellas, entonces el patrón de variación de la especie A debiera verse aumentada en
dirección hacia la especie B, en y cerca de las regiones donde A y B se encuentran
juntos, y donde sus hábitats se han alterado en períodos relativamente recientes. Más
aún, los individuos introgresantes de la especie A no debieran poseer características
diferentes de la especie B recombinadas al azar con aquellas de la especie A. Cada
individuo debería variar en la dirección de la especie B en algunas características que
distingan las dos especies; aunque obviamente sería expresada en diferentes grados en
diferentes individuos (Stebbins, 1950).
Si la hibridación ocurre entre dos especies cercanamente relacionadas, la
probabilidad de flujo genético es mayor cuando las especies hayan divergido
suficientemente como para tener acervos genéticos bien integrados, pero diferentes. Los
genes de una población se incorporan al acervo genético de la otra, si mejoran la
armonía bien integrada del acervo genético diferente. Si tienden a romper la armonía, su
frecuencia se reducirá; esto es meramente por selección natural (Spurr y Barnes, 1980).
12
En general, los procesos de hibridación interespecífica en la naturaleza, están
regidos por ciertos principios generales (Stebbins, 1950):
1. A pesar de que los individuos que componen la progenie F1 de un cruce
interespecífico son generalmente parecidos entre ellos, la descendencia en el
cruce F2 y generaciones posteriores son extremadamente variables, debido a la
segregación mendeliana de los factores genéticos responsables de las diferencias
interespecíficas.
2. Aunque la segregación en los F2 de un híbrido interespecífico produce un gran
número de tipos de recombinación, en ningún caso las características parentales
que presenten corresponden a una muestra al azar del total de combinaciones
posibles de características fenotípicas de los padres, ya que siempre existe algún
grado de correlación entre los grupos de características parentales.
3. Los híbridos interespecíficos naturales tienen más probabilidad de reproducirse a
partir del polen de las plantas de las especies parentales por su mayor
abundancia, que con el polen escaso y de pobre viabilidad de otro híbrido.
Debido a esto, la descendencia de la mayoría de los híbridos es más probable que
representen tipos intermedios que F2 verdaderos, situación que tenderá a
acentuarse cada vez más debido a la posterior selección natural, dando lugar a la
hibridación introgresiva o introgresión.
4. La hibridación depende directamente del ambiente en el cual ocurre. La
hibridación que ocurre entre especies bien establecidas y bien adaptadas a un
determinado ambiente, no será de trascendencia. En tanto que si la hibridación
ocurre bajo condiciones rápidamente cambiantes, o en una región que ofrece
nuevos hábitats a la descendencia formada, estos híbridos sobrevivirán y
contribuirán en mayor o menor grado al progreso evolutivo del grupo.
13
2.2
Consecuencias e importancia de la hibridación
Las consecuencias de los procesos de hibridación en la evolución, dependen en
general de las condiciones en las que ocurran. Si dos especies ocupan nichos ecológicos
a los cuales están muy adaptadas, entonces se producen nuevas combinaciones genéticas
probablemente menos adecuadas al ambiente; en cambio, si la hibridación tiene lugar en
hábitats inestables, con un medioambiente cambiante y con gran cantidad de híbridos
formados, entonces podrá ocurrir una mejor adaptación de algunos de ellos al ambiente
(Donoso, 1993).
La ruptura de los mecanismos interespecíficos de aislamiento, evidenciada por el
establecimiento de un puente genético entre especies que presentan la hibridación
introgresiva, puede llevar a un aumento de la variación total, y a una disminución de las
diferencias interespecíficas (Bell, 1968).
La hibridación puede considerarse de esta manera, como una de las fuentes de
variación en las plantas (Stebbins, 1950). La introgresión puede promover fuertes
ventajas selectivas a través del suministro de características adaptativas de una especie a
otra (Stutz y Thomas, 1964; citado por Donoso, 1993)
Sin embargo, la hibridación entre especies bien adaptadas, y en medioambientes
estables, no tendrá mayor significación para las especies, o incluso pudiese ser
perjudicial. En algunos casos la hibridación puede provocar alteraciones del desarrollo
vegetativo, por existir diferentes complejos genéticos coadaptados en especies arbóreas,
llegando a provocar anomalías como clorosis en híbridos, u otros tipos de debilidad
híbrida pronunciada. Un ejemplo de la primera situación son los híbridos entre Acacia
decurrens y A. molissima (Stern y Roche, 1974).
La hibridación introgresiva modifica y amplifica el patrón de variación de ciertas
especies, produciendo convergencias entre especies distintas, por lo que no corresponde
a una forma de producir nuevas características morfológicas o fisiológicas, ni con ella se
logra un progreso evolutivo. Sin embargo, existe evidencia que en algunos casos la
14
hibridación puede derivar en el origen de tipos de individuos nuevos, que pueden
representar varios grados de divergencia o diferencia de sus poblaciones parentales
(Stebbins, 1950; Potts y Reid, 1988).
En ciertos casos, a partir de la hibridación entre subespecies preexistentes,
pueden surgir razas o nuevas subespecies, dado un nuevo hábitat intermedio disponible
para ellos. Otra forma en la cual la hibridación puede derivar en un progreso evolutivo,
es a través de una estimulación en la tasa de mutación (Stebbins, 1950).
Dado que la hibridación puede implicar un aumento en los patrones de variación
en las poblaciones, puede llegar a dar origen a una superioridad de los híbridos formados
por sobre las especies padre, respecto de características de crecimiento en tamaño,
generalmente altura, o cualquier propiedad posible de ser medida en términos de, por
ejemplo, calidad de la madera, resistencia a temperaturas extremas, o capacidad de
resistencia frente a plagas o enfermedades. Esta superioridad se denomina vigor híbrido
o heterosis (Zobel y Talbert, 1994).
Se ha evidenciado casos de heterosis, dentro de los más diversos géneros
forestales. Algunos ejemplos de importancia corresponden a Larix decidua x leptolepis,
con crecimientos notoriamente superiores al de las especies parentales (Wright, 1964a),
al igual que Pinus caribaea var. hondurensis x elliotti; Pinus attenuata x radiata, que
presenta mayor resistencia a condiciones de bajas temperaturas, o Populus tremuloides x
tremula, que presenta mejor resistencia frente al ataque de royas del género Melampsora
(Zobel y Talbert, 1994).
Estos individuos pueden ser bastante sobresalientes en algunos aspectos y en
ocasiones las cruzas híbridas resultan en individuos raros que presentan características
ajenas a la gama de especies progenitoras (Zobel y Talbert, 1994). Estos nuevos
caracteres que pueden llegar a ser de utilidad, representan una valiosa fuente de
variación eventualmente posible de emplear en programas de mejoramiento genético de
especies forestales con diversos fines, tales como el logro de un mayor rendimiento en
15
crecimiento volumétrico, mejor calidad de la madera respecto de ciertas propiedades,
resistencia frente a factores abióticos o mejor capacidad de respuesta ante plagas o
enfermedades (Györfey, 1960; citado por Zobel y Talbert, 1994).
Otra forma por la cual la hibridación constituye una herramienta útil en el
mejoramiento genético, es el hecho que permite la combinación de rasgos favorables o
deseados pertenecientes a las especies (Wright, 1964a), o bien la incorporación de
caracteres favorables de una especie hacia la otra, a través de la transferencia de uno o
varios genes (Hadley y Openshaw, 1980).
Desde la perspectiva del estudio de las relaciones filogenéticas entre las especies
arbóreas, sin duda el estudio de la ocurrencia de procesos de hibridación representa un
valioso aporte a la taxonomía y clasificación de las mismas (Stern y Roche, 1974;
Hadley y Openshaw, 1980). Es así como el descubrimiento de la condición híbrida
natural de algunos taxones considerados anteriormente especies, ha contribuido a
determinar correctamente su categorización taxonómica, como por ejemplo Nothofagus
obliqua x glauca, considerada antes la especie N. leoni (Donoso y Landrum, 1979),
Myrceugenia exsucca x lanceolata, anteriormente considerada como M. bridgesii
(Landrum, 1975), o Populus tomentosa, que en realidad corresponde al híbrido P. alba x
davidiana (Zhang et al., 1995).
Asimismo, la ocurrencia de hibridación permite inferir un alto grado de relación
entre las especies que presentan dicho fenómeno, contribuyendo a aclarar su
clasificación y taxonomía. En este tema, la posibilidad de una hibridación natural entre
Laurelia sempervirens y L. philippiana, contribuiría a reafirmar el grado de relación
evolutiva de las especies, significando un aporte a la discusión de la clasificación
taxonómica de tepa, especie que ha sido propuesta como género monotípico separado de
Laurelia, es decir de L. philippiana Looser a Laureliopsis philippiana (Looser) Schodde
(Martínez-Laborde, 1983b).
16
2.3
Caracterización de Laurelia sempervirens y L. philippiana
2.3.1
Clasificación taxonómica
Laurelia sempervirens (R. et P.) Tul., conocida comúnmente como Laurel, Tihue
o Trihue y Laurelia philippiana Looser, o Laureliopsis philippiana (Looser) Schodde,
cuyos nombres comunes son Tepa, Laurela, Huahuán o Vauván; son dos especies de
árboles nativos de importancia forestal en Chile. Estas dos especies pertenecen a la
familia Monimiaceae, orden Laurales, subclase Magnoliidae, clase Magnoliopsida o
Dicotiledóneas, y división Magnoliophyta o Angiospermas, siguiendo la clasificación
taxonómica de Cronquist (Watson y Dallwitz, 1992).
2.3.2
Descripción de las especies
L. sempervirens y L. philippiana son árboles siempreverdes de gran similitud en
su aspecto general, sin embargo existen numerosos rasgos específicos que permiten
reconocerlas como especie. Estas características se presentan comparativamente en el
cuadro 1, según antecedentes de Donoso y Landrum (1973), Muñoz (1980), Donoso
(1981a), Martínez-Laborde (1983a), Rodríguez et al (1983), Donoso (1991) y
Hoffmann, (1991).
CUADRO 1. Comparación de las características de las especies Laurelia sempervirens y
L. philippiana (continúa en la página siguiente).
Característica
Dimensión
máxima
Ramas
Corteza
L. sempervirens
L. philippiana
Altura
40 m
30 m
D.A.P.
2m
1,4 m
Disposición
Generalmente ascendentes
Espesor
Generalmente gruesa (1,5 cm)
Ramas descendentes en sección inferior de
copa
Generalmente delgada (0,5 cm)
Color
Claro
Gris claro
Olor
Aromática
Suavemente aromática
Textura
Placas algo circulares con concavidades, que se
desprenden (en individuos adultos)
Lisa, no se desprende en forma natural
17
CUADRO 1 (continuación). Comparación de las características de las especies Laurelia
sempervirens y L. philippiana (continúa en la siguiente página).
Característica
Olor
Coriáceas
Lustrosas
Borde no revoluto
Muy aromáticas
Disposición
Opuestas, decusadas
Opuestas, decusadas
Dimensión
Largo 5 - 10 cm
Ancho 2,5 - 5 cm
Forma
Color
Largo 4 - 9 cm
Ancho 1,5 - 4 cm
Oblongas, elípticas a oval-lanceoladas,
Elíptico-ovadas, oblongas u oblongo-lanceoladas
atenuadas hacia la base
Verde brillante, envés más claro
Verde oscuro en el haz, envés más claro
Ápice
Dentado a suavemente aserrado hacia los dos
tercios superiores
Dientes poco notables con glándulas de aceites
aromáticos
Agudo, redondeado u obtuso a semiobtuso
Aserrado
Dientes notorios desiguales en tamaño
con glándulas de aceites aromáticos
Senos redondeados
Agudo a semiobtuso
Base
Cuneada
Cuneada
Borde o
Margen
Pubescencia
Pecíolo
Tipo
Generalmente glabras
Pelos simples en ambas caras
Generalmente tercio inferior del nervio medio
del envés pubescente
Largo 10 mm
Pubescentes, aplanados, ligeramente
canaliculados
Diclinomonoico (flores masculinas y femeninas)
Pelos simples en haz, malpighiáceos en
el envés
Largo 5 - 10 mm
Andromonoico (flores masculinas y
hermafroditas)
Pedúnculo
Inflorescencia en panículas o racimos axilares de
Racimos
5 a 20 flores
Vellosos
Vellosos
Largo: 4 a 28 mm
Largo: 2 a 3 mm
Flor masculina
Flor masculina
Corola
4 tépalos
Receptáculo
Asciatiforme, pubescente (pelos simples)
Disposición
Flores
L. philippiana
Coriáceas
Lustrosas
Borde generalmente revoluto
Muy aromáticas
Lámina
Hojas
L. sempervirens
Estambres
Anteras
6 - 12
Color rojizo, de 3 mm de largo
2 glándulas nectaríferas basales cada uno
Ovoides, de ápice agudo
Flor femenina
Perianto campanulado partido en 7 - 9
lóbulos
Pubescente (simples al interior,
malpighiáceos en el exterior )
4
de 1 a 1,5 mm de largo
2 glándulas nectaríferas basales cada uno
De ápice truncado
Flor hermafrodita
Gineceo
Numerosos pistilos con glándulas nectaríferas
basales
Numerosos carpelos (20-60)
Estambres
Numerosos estaminodios< 2 mm
Receptáculo
Cupuliforme, agranda al fructificar
18
7 a 11 carpelos
4 estambres verdaderos de 2 - 3 mm y
abundantes estaminodios
Cupuliforme a urceolado, agranda al
fructificar
CUADRO 1 (continuación). Comparación de las características de las especies Laurelia
sempervirens y L. philippiana.
Característica
Tipo
Aquenios libres
Tamaño
Contraído en la parte superior
Leñoso al madurar
Largo: 15 a 20 mm
Contraído en la parte superior
Leñoso al madurar
Largo: 7 a 9 mm
Receptáculo
Acrescente
Acrescente
Forma
Forma
Tamaño
2.3.3
L. philippiana
Aquenios libres
Fruto
Semilla
L. sempervirens
Oval-fusiformes
De estilo permanente
Cubiertas de pelos (de 5 - 6 mm de largo)
desparramados horizontalmente o hacia abajo
Largo: 14 a 20 mm
Ovoides
Densamente cubiertas de pelos
Largo: 9 a 10 mm
Distribución natural de L. sempervirens
Laurel es una especie cuya distribución natural se extiende por la Cordillera de
Los Andes, entre las Provincias de Colchagua (34º40' latitud sur) y Llanquihue (41º30'
latitud sur), en tanto que por la Cordillera de la Costa se presenta desde la localidad de
Tanumé en la Provincia Cardenal Caro (34º10' latitud sur) hacia el sur (Novoa, 1999),
siendo más abundante desde el río Itata (36º30' latitud sur) hasta la provincia de
Llanquihue, creciendo también en el valle central en el último tramo mencionado
(Donoso y Landrum, 1973; Donoso, 1991; Hoffmann, 1991). Ver figura 1.
Hacia 1902 se sostuvo también su presencia en Argentina, desmintiéndose
posteriormente por tratarse de un error de identificación (Correa, 1984). Se trata
entonces, de una especie endémica de Chile.
Hacia el norte de su distribución, la especie se restringe a sitios cercanos a cursos
de agua, en quebradas y áreas húmedas en bosques higrófitos, donde se asocia con roble,
coihue, olivillo, canelo, raulí, lingue, avellano, arrayán, mañío de hojas largas y algunas
especies esclerófilas, además de diversas especies de arbustos, siempre a altitudes
menores a 700 m.s.n.m. (Donoso, 1981a; Donoso, 1981b; Donoso, 1991; Novoa, 1999).
19
FIGURA 1. Rango latitudinal de distribución de Laurelia sempervirens y L. philippiana.
Avanzando hacia el sur en su área de desarrollo, laurel se encuentra en forma
natural en suelos húmedos más o menos profundos. Participa de preferencia junto a
roble y lingue en el llano central y está acompañado también en ciertos sectores por
ulmo, olivillo, coihue, mañío de hojas largas, avellano, raulí y otras especies arbóreas
menores y arbustivas en los faldeos de las cordilleras, a altitudes menores a 500
m.s.n.m., llegando incluso al nivel del mar (Donoso y Landrum, 1973; Donoso, 1991).
20
Laurel es una especie que siempre integra bosques mixtos, raras veces se le encuentra
formando grupos puros, los cuales son de corta extensión (Hoffmann, 1991).
2.3.4
Distribución natural de L. philippiana
La distribución natural de tepa por la Cordillera de Los Andes, abarca territorio
chileno entre las Provincias de Bío-Bío (37º30' latitud sur) hasta la Provincia Capitán
Prat (47º30' latitud sur) y una porción en sector argentino entre las provincias de
Neuquén (40º15' latitud sur) y Chubut (42º40' latitud sur), mientras que por la Cordillera
de la Costa, crece hacia el sur a partir de los faldeos de la Cordillera de Nahuelbuta, a los
38º de latitud sur (Donoso y Landrum 1973; Correa, 1984; Hoffmann, 1991, Donoso,
1993). Ver figura 1.
Tepa se desarrolla de preferencia en sectores de altitudes medias de la Cordillera
de Los Andes. Se presenta entre 650 y 1000 m.s.n.m. en el área de Laguna del Laja y
hacia el sur desciende levemente en altitud. Es así que en la Provincia de Valdivia crece
en forma natural entre los 500 y 900 m.s.n.m, con un óptimo ecológico entre 600 y 700
m.s.n.m. No obstante, en el área costera de este tramo, su presencia desciende hasta
altitudes menores a 300 m.s.n.m., e incluso en la vertiente occidental de la Cordillera de
la Costa llega a menos de 60 m.s.n.m. (Donoso, 1993).
Hacia la mitad meridional de su área de distribución, tepa desciende
progresivamente en altitud, creciendo entre los 200 y 500 m.s.n.m. en la Provincia de
Palena, mientras que en el extremo sur de su área de presencia natural, se encuentra en
sectores costeros de escasa altitud, en la zona litoral de la Región de Aysén, donde llega
a formar bosques puros de la especie (Innes, 1991; citado por Donoso, 1993).
El amplio rango latitudinal que abarca tepa, con diez grados de latitud, en
relación con la variación de los factores climáticos y edáficos, determinan que ésta se
asocie con diversas especies, de manera que hacia el norte participa principalmente junto
a coihue común y raulí conformando el Tipo Forestal Coihue-Raulí-Tepa acompañado
21
en ciertos sectores por trevo, tineo, mañío hembra, olivillo; mientras que hacia el sur, en
los bosques del Tipo Forestal Siempreverde comparte el sitio con una amplia gama de
especies como coihue común, ulmo, mañío de hojas punzantes, mañío hembra, trevo,
canelo, luma, melí, arrayán y lingue, en tanto que hacia el extremo sur del Tipo Forestal
Siempreverde, coexiste con coihue común, coihue de Chiloé, canelo y mañío de hojas
punzantes (Donoso, 1981b).
2.3.5
Antecedentes sobre la ecología de las especies
Con relación al gradiente de tolerancia a la sombra, y ligado a ello, los
requerimientos de humedad, tepa y laurel son especies tolerantes a la sombra. Tepa se
caracteriza por su marcada tolerancia, mientras que laurel es semitolerante o de
tolerancia intermedia (Donoso, 1981a).
Ambas especies poseen plántulas de germinación epígea (Donoso, 1981a). Laurel
y tepa son especies cuya polinización se produce por medio de entomofilia, dado que en
sus estructuras florales están equipadas con nectarios (Donoso, 1981a). La floración
generalmente se produce durante septiembre en tepa, mientras que laurel florece entre
octubre y noviembre (Donoso, 1991).
Además de la reproducción sexual, ambas se reproducen asexualmente mediante
rebrotes de raíz y tocón. La dispersión de las semillas de las dos especies ocurre por
anemocoría, gracias al vilano piloso que poseen sus frutos (Donoso, 1993).
Las dos especies presentan una tendencia a regenerar aprovechando claros de
extensión pequeña, ante los cuales reaccionan con relativa rapidez (Veblen et al., 1979;
citado por Donoso, 1993). Dentro de las diferentes situaciones de desarrollo de cada
especie, ambas son capaces de penetrar de manera gradual en los doseles superiores, los
que van ocupando a medida que los árboles de esos doseles caen, producto de
mortalidad o alteraciones exógenas naturales.
22
La cantidad de luz o sombra constituye en ambas especies un importante factor
para la sobrevivencia en rodales naturales. La acción del ganado doméstico actualmente
constituye un elemento importante en la mortalidad de la regeneración (Donoso, 1993).
2.3.6
Importancia de L. sempervirens y L. philippiana
Las especies en estudio corresponden a componentes importantes de los bosques
nativos de Chile, que a través de sus amplias distribuciones integran diferentes tipos de
bosques. Es así que laurel participa en comunidades forestales de los tipos Roble-Hualo,
Roble-Raulí-Coihue, y en sectores de baja altitud de bosques del tipo forestal
Siempreverde, con una importancia variable tanto en densidad como en área basal. Lo
mismo ocurre con tepa, que compone los tipos forestales Roble-Raulí-Coihue, CoihueRaulí-Tepa, y Siempreverde, llegando a ser de gran importancia en estos dos últimos, ya
que incluso llega a formar rodales puros de la especie hacia el límite sur de su
distribución (Donoso, 1981a).
La madera de ambas especies es de utilidad, siendo ambas muy apreciadas en la
carpintería, se les utiliza en revestimientos interiores, puertas interiores, ventanas, cielos,
molduras y encofrados. Su principal uso corresponde a la fabricación de tableros
contrachapados y chapas. Igualmente es muy apreciada en la construcción de viviendas
y fabricación de piezas y juguetes (Díaz-Vaz, 1988a; Díaz-Vaz 1988b).
La madera del laurel ha sido ampliamente explotada desde tiempos pasados,
hecho que ha determinado que las existencias de madera de esta especie se vean hoy
fuertemente mermadas, prácticamente eliminadas de las zonas del valle central hacia la
zona sur de su área de distribución. En el caso de la madera de tepa, ésta presenta
muchas veces un falso duramen, asociado a un olor persistente y desagradable producto
de colonias de bacterias del genero Pseudomonas (Poblete et al., 1991), principal razón
por la cual no se le utilizó en el pasado con igual intensidad que la madera de laurel,
pese a que el resto de sus características físicas son similares. No obstante, en la
actualidad ésta es utilizada en el mercado nacional y también para exportación, mediante
adecuadas técnicas de secado.
23
3. MATERIAL Y MÉTODO
3.1
Poblaciones en estudio
Para abordar la hipótesis de hibridación entre L. sempervirens y L. philippiana,
es necesario considerar un área donde se desarrollen poblaciones de ambas especies,
ocurra superposición de sus rangos de distribución, y en la cual se encuentren, además,
individuos con características aparentemente intermedias entre las dos especies,
presumiblemente híbridos.
Las zonas de contacto de poblaciones de laurel y tepa ocurren en sectores
relativamente puntuales, como en ciertos sectores de faldeos cordilleranos de los Andes
cercanos a riberas de lagos en la Provincia de Valdivia, Región de los Lagos; mientras
que en la Cordillera de la Costa, en algunas zonas de altitud cercana a los 300 m.s.n.m.,
en áreas de transición entre bosques del tipo forestal Roble-Raulí-Coihue y bosques del
tipo forestal Siempreverde.
Las poblaciones en estudio corresponden a un área dentro de esta última
situación, a 10 km al sureste de la ciudad de Valdivia en el Sector Llancahue (ver figura
2), comprendiendo los predios Llancahue y Senderos del Bosque. En este sector, se
individualizó en terreno, 29 individuos que presentan rasgos de la morfología foliar
aparentemente intermedios entre las especies, conformando el conjunto de presuntos
híbridos. En el mismo sector, además, se identificó una población de L. sempervirens en
un área de menor altitud en el predio Senderos del Bosque y una población de L.
philippiana en una de mayor altitud, en el predio Llancahue (ver cuadro 2).
Como patrón de comparación de las poblaciones puras de cada especie, y ante la
posibilidad de compatibilidad reproductiva de las especies y que los eventuales procesos
de hibridación introgresiva pudiesen afectar la naturaleza de las poblaciones puras, se
hizo necesario considerar un parámetro comparativo de dichas poblaciones. A raíz de
esto, se incluyó en este estudio, una población pura de cada especie. El calificativo de
24
pura, se refiere a que cada población está conformada por individuos cuya autenticidad
de especie es segura, dado el aislamiento geográfico con la otra, y por encontrarse en
sitios de crecimiento natural exclusivo para cada una, permitiendo suponer entonces, un
aislamiento genético de cada población respecto de la otra especie.
73º
A
40º
B
C
FIGURA 2. Localización de las poblaciones estudiadas. A corresponde al sector
Llancahue (comuna de Valdivia); B indica el predio Santa Isabel (comuna de Paillaco),
mientras que C muestra el sector Aguas Calientes (Parque Nacional Puyehue).
La población de L. sempervirens pura se ubica en el predio Santa Isabel, a 7 km
al oeste de Paillaco, Comuna de Paillaco, Provincia de Valdivia (ver figura 2), a una
25
altitud aproximada de 100 m.s.n.m, en el valle central. Corresponde a una población de
laurel que participa en un renoval de roble, del tipo forestal Roble-Raulí-Coihue. La
población pura de L. philippiana, en tanto, está incluida en un bosque del tipo forestal
Siempreverde, de la Cordillera de los Andes, a una altitud aproximada de 600 m.s.n.m.
en el sector Aguas Calientes del Parque Nacional Puyehue, en la Comuna de Puyehue,
Provincia de Osorno (figura 2). En esta situación, tepa se encuentra junto a coihue
común, tineo, ulmo, y mirtáceas como arrayán.
CUADRO 2. Número de individuos incluidos en la muestra, según población y sector,
incluyendo los códigos empleados en la identificación.
Sector
Llancahue
(Valdivia)
Paillaco
Aguas Calientes
Predio (código)
Población (código)
Número de
Individuos
Presuntos híbridos (N)
29
Los senderos del bosque
(1)
Llancahue
(2)
Los senderos del bosque
(1)
L. sempervirens
(S)
31
Llancahue
(2)
L. philippiana
(P)
29
Santa Isabel
(5)
L. sempervirens
(S)
31
Parque Nacional Puyehue
(6)
L. philippiana
(P)
31
Cada individuo fue etiquetado mediante una banda naranja con una identificación
que incluye el código del sector, el código de la población según especie (según los
indicados en el cuadro 2) y un número correlativo.
3.2
Estudio de características morfológicas y anatómicas
Para determinar si una población natural es de origen híbrido, es necesario
primero conocer completamente las características morfológicas y anatómicas presentes
en el fenotipo de cada especie parental, así como los límites de la variación de las
mismas (Zobel y Talbert, 1994). En los estudios para detectar procesos de hibridación,
26
por lo tanto, se requiere un completo espectro de los caracteres de cada individuo, según
la representación del número de individuos o poblaciones (Benson, 1962).
En la selección de los caracteres o rasgos a emplear, éstos deben ser atributos
manifiestos, susceptibles de ser evaluados en un organismo, y que presenten diferencias
entre las poblaciones (Bell, 1968). La comparación entre las poblaciones con la finalidad
de detectar híbridos puede ser hecha según alguna propiedad o rasgo distintivo referido a
alguna estructura, fisiología o comportamiento del organismo que se pueda contar, medir
o catalogar, comprendiendo datos de índole bioquímica, fisiológica, citológica y
morfológica tradicional. Una característica será útil cuando no esté sujeta a gran
variación por la acción de algún factor ambiental, y proceda de una base genética tal,
que haga improbable que cambie fácilmente (Heywood, 1968).
La hibridación se manifiesta según el reconocimiento de intermediación
morfológica (Rushton, 1993), dentro del cual, la morfología floral es de importancia ya
que no es alterada por factores del medioambiente, siendo importante también la
morfología del fruto y semilla. Las características vegetativas, referidas a las hojas, tales
como la forma, distribución, duración y venación de las hojas son también elementos de
valor al estudiar procesos de hibridación, al igual que la forma, textura, y modo de
fijación de las hojas. Asimismo, son útiles ciertas características relacionadas con el
ápice, margen y base de la hoja. La proporción de los tamaños, correlacionado a la
forma, resulta de más valor que los tamaños absolutos que pueden sufrir influencias por
el medio. En el caso de especies que carecen de pautas distintivas de variación floral, o
ausencia de ellas, las hojas a menudo brindan los principales medios de identificación
(Bell, 1968).
Las forma de las células, en general no es influida de manera apreciable por los
cambios del medio, siendo relativamente uniformes, a pesar de modificaciones
superficiales provocadas por el medio en tamaño, espesor de las paredes o espacio
intracelular. Los estomas presentan diversas variaciones que pueden ser usadas con fines
taxonómicos, tales como las formas de distribución de las células estomáticas y anexas.
27
Características epidérmicas como la forma de las células y pautas en el grosor de la
cutícula, pueden ser lo suficientemente distintivas como para contribuir en evaluaciones
taxonómicas (Bell, 1968).
Por otro lado, el tipo de pubescencia también representa una característica
posible de registrar, empleada en análisis de híbridos, y es un elemento que no estaría
influenciado por el ambiente (Bell, 1968).
L. sempervirens y L. philippiana son especies que poseen similitud en aspecto
general, con caracteres exteriores tan semejantes, que hacen difícil su diferenciación
(Urban, 1934). Sin embargo, existen caracteres distintivos con relación a la morfología
floral principalmente, y también en cuanto a la morfología foliar de ambas.
En una etapa preliminar de este estudio, se consideró la amplia gama de
elementos que distinguen las especies, con el fin de precisar algún patrón de
intermediación en los caracteres morfológicos para definir la población presuntamente
híbrida. El grupo de individuos detectados como posibles híbridos se definió en función
de caracteres morfológicos foliares. Los aspectos de la morfología floral, en tanto, no se
consideran en el presente estudio, debido a que ninguno de los individuos identificados
como híbridos presuntos, en función de las características foliares, ha florecido en las
temporadas 1997 y 1998.
Luego de la observación preliminar de las poblaciones incluidas en el estudio se
procedió a definir el conjunto de características útiles en la distinción de las especies.
Dentro del conjunto de rasgos considerados, algunos son medibles cuantitativamente,
mientras que otras características son de apreciación cualitativa. La nómina de
características cuantitativas a registrar a partir de las hojas, se muestra en el cuadro 3,
mientras que en la figura 3 se ilustra el detalle de caracteres de la morfología foliar.
28
CUADRO 3. Rasgos cuantitativos de la morfología foliar, y unidades de registro.
Rasgo
Notación
Unidad
a)
Largo total de la hoja.
T
mm
b)
Largo de la lámina.
l
mm
c)
Ancho de hoja en el punto medio de la lámina.
a
mm
d)
Ancho de hoja en el punto medio de la primera mitad de la
lámina.
a'
mm
e)
Ancho de hoja en el punto medio de la segunda mitad de la
lámina.
a''
mm
f)
Número de dientes a cada costado de la lámina.
s', s''
unidad
g)
Número de nervaduras secundarias principales(1) a cada
costado.
n', n''
unidad
h)
Distancia desde el comienzo superior de la lámina hasta el
primer par de dientes.
da
mm
i)
Distancia desde el comienzo inferior de la lámina hasta el
último par de dientes.
db
mm
j)
Ángulo del ápice. Formado por el primer diente del costado
izquierdo, el ápice de la hoja y el primer diente del costado
derecho.
αa
grados
k)
Ángulo de la base. Formado por el último diente del
costado izquierdo, el ápice de la hoja y el último diente del
costado derecho.
αb
grados
Los rasgos cualitativos se registraron a través de observación directa,
estableciendo categorías apuntadas por medio de puntajes, cuyos valores se presentan en
el cuadro 4.
(1)
Se entenderá como nervadura secundaria principal a toda nervadura que derive del nervio medio, sea
visible a simple vista y cruce la línea imaginaria que divide en partes iguales la superficie entre el nervio
medio y el costado de la lámina.
29
FIGURA 3. Representación gráfica de los rasgos cuantitativos de la morfología foliar,
según el cuadro 3.
CUADRO 4. Rasgos cualitativos de la morfología foliar, y valores según categorías de
registro.
Rasgo
Cualidades
§
§
§
§
Qas
Qep
Forma del diente del borde
de la lámina, con relación a
la posición de la glándula en
§
el diente.
§
Forma del borde de las
células epidérmicas del
envés de la hoja, a través de
corte tangencial de la lámina
bajo microscopio.
§
§
§
§
Qtp Tipo de pilosidad
Nivel de pilosidad en las
Qpy yemas foliares.
§
§
§
§
Curvo y poco agudo, aserrado suave.
Con la glándula próxima al seno del diente.
Aserrado algo marcado
Con la glándula a veces hacia fuera de la
lámina, otras próxima al seno del diente.
Pronunciado y agudo.
Con la glándula hacia fuera de la lámina,
alejada del seno redondeado del diente, y
situada en la punta del diente.
Borde recto a poco sinuoso, generalmente
sin lóbulos, o de un número menor a 5.
Borde algo sinuoso, con número de lóbulos
entre 5 y 8.
Borde muy sinuoso, con número de lóbulos
mayor de 8.
Sólo pelos simples en haz y envés de la
hoja.
Pelos simples en haz y pelos simples y/o
pelos malpighiáceos en el envés de la hoja.
Yemas glabras a escasamente pubescentes.
Yemas algo pubescentes a pubescentes.
Yemas muy pubescentes.
30
Valor
0
0.5
1
0
0.5
1
0
1
0
0.5
1
El proceso de registro de los rasgos morfológicos de las estructuras vegetativas
incluyó la extracción de ramillas, conservando su individualización de acuerdo a cada
etiqueta en terreno. Con el objeto de minimizar el efecto que pudieran eventualmente
ejercer las variables ambientales en los aspectos en estudio, se consideró extraer las
ramillas a partir del tercio inferior de la copa de cada árbol, cuidando que este follaje
correspondiera a una sección de la copa orientada hacia el oeste o hacia el este, evitando
aquellas expuestas hacia el norte o hacia el sur. Las ramas de cada individuo luego de ser
extraídas, fueron etiquetadas y almacenadas en bolsas plásticas individuales, para su
posterior herborizado.
Para cada individuo, se capturó la variabilidad individual de sus características a
considerar en el estudio, mediante la extracción de ramillas que sumaran al menos 16
hojas sanas y completamente desarrolladas, por cada individuo. Esta cantidad de hojas a
incluir por individuo, surgió a partir de un pre-muestreo realizado para la relación largoancho de la lámina y número de dientes por hoja, para un 5% de error, con un 95% de
confianza. Además, de cada individuo se conservó algunas hojas en un compuesto
fijador de tejido vegetal F.A.A., para la posterior visualización de sus caracteres
microscópicos considerados.
A partir de las características morfológicas registradas, la comparación del grupo
de individuos presuntamente híbridos con aquellos de las poblaciones puras de las
especies, se hizo en función de la relación existente entre las características observadas
en una misma hoja, a través de coeficientes de relaciones morfométricas y no según
valores absolutos de tamaño, ya que estos últimos podrían estar sujetos a variación por
efectos ambientales. Los coeficientes que representan cada ejemplar, listados en el
cuadro 5, se obtuvieron a partir del promedio de los valores de las 16 hojas registradas
por cada uno.
31
CUADRO 5. Coeficientes de relación morfométrica empleados en el análisis de
características de la morfología foliar.
Coeficiente
Notación
Fórmula
1) Ángulo del ápice de la lámina.
ang a
αa
2) Ángulo de la base de la lámina.
ang b
αb
3) Número de dientes en el margen de la lámina.
as
∑(s', s'')
4) Número de nervaduras secundarias en la lámina.
n
∑(n', n'')
5) Relación entre ancho medio de lámina y largo total de hoja.
a/T
(a/T)
6) Relación entre largo de la lámina y largo total de la hoja.
l/T
(l/T)
7) Relación entre el largo de la lámina y longitud del peciolo.
l/p
(l/(T-l))
8) Relación entre el largo de la lámina y número de nervaduras
secundarias principales.
l/n
(l/(∑
∑(n', n''))
9) Relación entre el largo de la lámina y número de dientes en
margen.
l/s
(l/(∑
∑(s', s''))
10) Relación entre distancia da y longitud del peciolo.
da/p
(da/(T-l))
11) Relación entre distancia db y longitud del peciolo.
db/p
(db/(T-l))
12) Relación entre distancia da y largo de la lámina.
da/l
(da/l)
13) Relación entre distancia db y largo de la lámina.
db/l
(db/l)
14) Relación entre distancia da y el ancho medio de la lámina.
da/a
(da/a)
15) Relación entre distancia db y el ancho medio de la lámina.
db/a
(db/a)
16) Relación entre el número de dientes en el margen y número
nervaduras secundarias en la lámina.
Ss/Sn
∑(s',s'')/∑
∑(n',n'')
17) Coeficiente de forma de lámina.
ka
(a-∑
∑(a', a''))/a
18) Tipo de aserrado.
Qas
-
19) Forma de células de la epidermis inferior.
Qep
-
20) Tipo de pilosidad foliar
Qtp
-
21) Nivel de pilosidad en yemas foliares.
Qpy
-
32
3.2.1
Análisis mediante Índice de Hibridación
Una vez generada la matriz de datos de coeficientes de morfología foliar, se
consideraron los coeficientes que más contrastan entre las especies puras, en la
confección del Índice de Identidad de Especies o Índice de Hibridación (IH), según
Anderson (1968).
Se asignó un puntaje con valor 0 para cada característica dentro del rango
representativo de L. sempervirens, mientras que se otorgó un puntaje con valor 1 para
cada característica que ajustó a L. philippiana. La sumatoria de los valores determinó el
valor del IH de cada individuo, con un valor 0 ó cercano a 0, para laurel y un valor
cercano a m para tepa (siendo m el número de variables a examinar en la confección del
IH). Siguiendo a Anderson (1968), el conjunto de individuos que posea valores de IH
intermedios entre 0 y m, pueden ser considerados híbridos.
3.2.2
Análisis mediante Diagrama de Dispersión
Otra forma de detección de los híbridos, empleada en este estudio, corresponde al
Diagrama de Dispersión de Anderson (1968). Para su confección fue necesario graficar
la dispersión del total de individuos en función del par de variables cuantitativas que
acentuaran de mejor forma las diferencias entre las especies típicas. Además, los
individuos representados como puntos, rombos o círculos en el gráfico, se ilustraron
mediante símbolos, líneas o apéndices, destacando así los eventuales híbridos incluidos
en la muestra.
3.2.3
Dendrograma a partir de análisis de cluster
El estudio también consideró un análisis de conglomerados o clusters, el cual
corresponde a un análisis multivariado, que permite identificar entidades o grupos de
acuerdo con las características que estos posean (Hair et al., 1992).
33
El análisis de clusters permite identificar y clasificar objetos de manera de
identificar elementos muy similares entre ellos en cada grupo, lo que se representa en un
dendrograma, en el cual cada rama reúne individuos, en este caso según la similaridad
de sus coeficientes morfométricos. Este tipo de análisis, ampliamente utilizado en
estudios taxonómicos, permite establecer grupos homogéneos dentro de cada rama y a la
vez heterogéneos entre las ramas resultantes del análisis, para un nivel o criterio
determinado (Hair et al., 1992).
Este análisis se efectuó a partir de la matriz de coeficientes morfométricos
relativizados a escalas de 0 a 100, para los rangos de mínimo y máximo de cada
coeficiente. La matriz resultante del procedimiento descrito, se procesó mediante el
software STATISTICA.
El procedimiento de agrupación jerárquica empleado fue por Vinculo Completo,
ante el supuesto que existían grupos diferentes dentro de la matriz de coeficientes
morfométricos relativizados (Dillon y Matthew, 1984), entre los cuales el programa
computacional midiera las distancias más lejanas entre los clusters formados por los
individuos similares según los coeficientes.
La unidad escogida de medición de las distancias entre conglomerados de
individuos formados fue la Distancia Euclidiana, unidad estándar de distancia entre
clusters. La elección se debe a que este tipo de distancias no requiere supuestos respecto
del nivel de correlación entre las variables empleadas, o coeficientes morfométricos en
este caso. Debido a las múltiples opciones de correlación interna entre los coeficientes
morfométricos, y a la incapacidad de determinar ponderaciones de pesos relativos para
cada coeficiente, es que se optó por esta, la medida más conservadora.
En el dendrograma resultante, en tanto, se esperó una división gráfica entre las
poblaciones de L. sempervirens y las de L. philippiana según la morfología foliar,
eventualmente haciendo posible la detección de individuos híbridos o grupos de ellos,
según el criterio de intermediación morfológica, los cuales han de mostrarse en un nivel
34
medio de división, luego de la segregación en el dendrograma, de las poblaciones de
especies puras.
3.2.4
Análisis factorial por componentes principales
El conjunto de coeficientes morfométricos relativizados se estudió mediante un
Análisis Factorial del tipo por Componentes Principales (PCA). La ventaja de este
análisis es que permite reducir y sintetizar las variables de estudio, en este caso los 21
coeficientes de morfología foliar considerados, con el objeto de observar el grado de
relación entre los individuos, según los coeficientes condensados en factores, que
determinan el grado de acercamiento de los individuos investigados frente al conjunto de
coeficientes.
A partir de los factores que explicaron mejor el grado de relación de los
individuos en función de su morfología foliar, se determinó cuales variables presentaron
mayor correlación con cada factor, es decir, se identificaron los coeficientes que
relacionan o segregan los individuos y por ende las poblaciones en estudio.
El análisis señalado se efectuó con la ayuda del software STATISTICA. Se
esperó que destacaran los grupos más disímiles de individuos según los coeficientes, es
decir los individuos de L. sempervirens en un extremo, y de L. philippiana en el otro,
mientras que de los eventuales individuos con características morfológicas intermedias,
se esperó su representación en el espacio gráfico entre los grupos más disímiles.
3.3
Estudio de compuestos secundarios de las hojas
Una técnica que ha demostrado ser de gran utilidad en la detección de híbridos
vegetales, es el estudio de caracteres químicos como la presencia de compuestos
secundarios en las hojas. Estos compuestos poseen un valor taxonómico notable, y a
través de ellos es posible realizar una distinción entre poblaciones. Esta técnica es
especialmente útil cuando es difícil interpretar las diferencias entre los caracteres
35
morfológicos de las especies involucradas y presuntos híbridos, llegando a ser de mayor
eficacia en los casos en que los híbridos tienen un parecido estrecho con alguna de las
especies parentales o cuando existe un elevado grado de retrocruzamiento, lo que
determina una mayor dificultad en la diferenciación de las poblaciones (Heywood,
1968).
Los compuestos químicos se pueden estudiar mediante técnicas de cromatografía
que separan los constituyentes de ciertos metabolitos vegetales, dentro de los cuales se
pueden considerar ciertos compuestos secundarios de bajo peso molecular, subproductos
de los principales procesos metabólicos, como por ejemplo los flavonoides (Heywood,
1968).
Los flavonoides son un gran grupo de pigmentos vegetales, generalmente dentro
de la gama del amarillo, de gran difusión en el reino vegetal, se encuentran en todos los
órganos de las plantas superiores, especialmente en las hojas y botones florales (Taiz y
Zeiger, 1991; Montes et al., 1992). Estos compuestos poseen carácter específico, de tal
forma que de las muestras extraídas de las plantas, es posible obtener un perfil
cromatográfico típico o cromatograma que caracterizará a cada población o especie.
Esta especificidad le brinda a estos compuestos un elevado valor taxonómico
para el análisis de híbridos si se obtienen desarrollos cromatográficos claramente
diferenciados para cada especie. Cada compuesto en particular tendrá una posición
característica en la serie de puntos o manchas coloreadas del cromatograma. Para
realizar la distinción, no es necesario averiguar cuáles son en particular los compuestos
que participan (Bell, 1968).
La técnica para la detección de los compuestos mencionados se denomina
cromatografía bidimensional en capa fina de celulosa y para su empleo en el presente
estudio, se consideró los siguientes pasos, según Domínguez (1975) y comunicación
personal de Rolando Martínez(2).
(2)
Rolando Martínez, Instituto de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Austral de Chile, Valdivia.
36
a) Extracción: Se extrajo una cantidad aproximada de 10 a 15 hojas por individuo, de la
misma sección del follaje de la cual se tomaron las ramillas para el estudio de
características morfológicas, guardándolas en sobres de papel para su posterior
secado, evitando así su descomposición. Para cada individuo se tomó la mencionada
cantidad estándar de biomasa de hojas y se realizó un extracto en metanol de acuerdo
a Heywood (1968), por un período de 48 horas dentro de un Erlenmeyer, para
disolver los compuestos de las hojas.
b) Concentrado: El extracto resultante de los compuestos vegetales, se trató en un
rotavapor al vacío hasta lograr un concentrado.
c) Sembrado de placas: Se depositó el concentrado en una cromatoplaca de capa fina de
celulosa de 20 por 20 cm, identificada con el código del individuo. La siembra se
realizó a una distancia de 2 a 3 cm desde el vértice inferior izquierdo de cada placa.
d) Corrida en TBA: La placa sembrada se expuso al primer solvente (TBA, o solución
de n-butanol, ácido acético glacial y agua destilada, en una relación en volumen de
3:1:1) al embeberla desde su arista inferior, dentro de una cámara cromatográfica. El
solvente al ascender por capilaridad disolvió arrastrando los compuestos del
concentrado sembrado. Debido a que cada compuesto fenólico se desplaza a
diferentes velocidades por el papel, los diversos compuestos quedan separados entre
sí en varios puntos a lo largo del eje en movimiento. Cuando la línea de saturación
del solvente llegó al borde superior de la placa, ésta se retiró de la cámara con la
solución y se puso a secar (Bell, 1968).
e) Corrida en HoAc: La placa se expone al segundo solvente (HoAc, o ácido acético
glacial al 15%) de igual forma dentro de la cámara cromatográfica, pero a diferencia
del paso anterior, esta vez se hizo correr en sentido perpendicular a la corrida con el
primer solvente, desde su arista izquierda, para favorecer una mayor separación de
los compuestos en dos dimensiones en la capa fina de celulosa, con un mayor grado
37
de subdivisión de manchas, según Bell (1968). Al igual que en el paso anterior, una
vez que el solvente ascendió totalmente, se extrajo la placa de la cámara, dejando
luego que el solvente evaporara por completo.
f) Detección de flavonoides: Los compuestos separados por el proceso se identificaron
bajo luz ultravioleta y con exposición de la placa a vapores amoniacales que
acentuasen la presencia de las manchas, permitiendo así diferenciar los compuestos
que pudiesen tener ubicación cercana (Bell, 1968).
De cada placa analizada se registró la información presente en el cuadro 6, y a
partir de los valores de distancia de migración del solvente y de migración de cada
compuesto, se obtuvo el valor de la relación de flujo (Rf) para cada mancha en cada
sistema de solvente, a través de la fórmula [1]. Esta relación posee la particularidad de
ser reproducible para cada compuesto (Domínguez, 1975).
CUADRO 6. Elementos a registrar a partir de cada mancha en los cromatogramas.
Elemento
Unidad de registro
1) Presencia del compuesto.
Letra correlativa
2) Color de cada mancha.
Notación de color
3) Migración del solvente.
dms (mm)
4) Migración de cada compuesto según solvente.
ds (mm)
Rf ( m, s ) = dms
ds
Rf ( m, s )
dms
ds
[1]
= Relación de flujo del compuesto m con el solvente s
= Distancia recorrida por el soluto m con el solvente s (mm)
= Distancia recorrida por el solvente s (mm)
Una vez detectados las Rf de los compuestos en cada individuo, fue posible
suponer la presencia de diferentes flavonoides según individuo, esperando compuestos
38
comunes para ambas especies, dada la cercanía filogenética entre ellas, y además
esperando la detección de compuestos específicos de cada especie. Son estos últimos los
que permiten la detección de los posibles híbridos, ya que debiesen incluir en su
contenido los compuestos comunes de ambas especies, y además, los compuestos
específicos de una y de otra especie, siendo ésta la prueba de su intermediación en
cuanto al contenido de estos químicos. Como resultado de la eventual interacción de
ambos acervos genéticos, y de la mayor variabilidad en los híbridos, se consideró
posible también la presencia de compuestos diferentes, o manchas híbridas, específicos
de los híbridos.
3.4
Estudio de variación isoenzimática
El transporte de ciertas partículas a través de un solvente, por acción de un
campo eléctrico, que permite la separación de mezclas heterogéneas de proteínas,
hidratos de carbono y ácidos nucleicos, se denomina electroforesis (Freifelder, 1982).
Esta técnica, aplicada exitosamente en muchas disciplinas botánicas, ha permitido
estudiar la variación hereditaria en disciplinas como genética, sistemática y biología de
poblaciones.
El procedimiento utilizado en el presente estudio para extraer y movilizar
enzimas a través de electroforesis, para su detección a través de tinciones histoquímicas
es el que a continuación se presenta, basado en Conkle et al (1982), Kephart (1990), y
comunicación personal de Andrea Premoli(3).
3.4.1
Extracción y almacenamiento de las muestras
Consta de la extracción de las enzimas presentes en los tejidos vegetales, proceso
que requiere gran atención al ambiente, el cual debe ser frío y en un buffer de extracción.
(3)
Andrea Premoli, Laboratorio Ecotono, Departamento de Biología, Universidad Nacional del Comahue,
Bariloche, Argentina.
39
La homogeneización del tejido se realizó mediante mortero, rompiendo la
compartimentalización celular, para liberar las proteínas. Para evitar la interacción entre
las proteínas y compuestos secundarios (fenoles, terpenos, pectinas, resinas, cumarinas,
o pigmentos carotenoides) y la formación de compuestos insolubles, fue necesario
utilizar aditivos en los buffers de extracción, como la Polivinilpirrolidona (PVP-40),
para así favorecer la detección de una mayor actividad enzimática.
Como material para los estudios electroforéticos relacionados con actividad
enzimática, se debe emplear tejido fresco y vivo, siendo posible utilizar cualquier
porción de la planta: brotes, yemas, flores, anteras, polen, semillas, hojas o raíces. En
este caso, se ocupó una porción de hojas nuevas de cada individuo, a partir de ramas de
unos 30 cm. La colecta de dichas ramillas se llevó a cabo cuidando de su mantención en
ambiente fresco, húmedo y refrigerado para favorecer la conservación de la actividad
enzimática. Se utilizó tejido joven, preferible por brindar una mayor actividad
enzimática, debido a su bajo contenido en compuestos fenólicos.
Luego de la homogeneización por extracción mecánica del tejido mediante
mortero de porcelana en frío, se mezcló con el buffer de extracción. Las muestras
extraídas debieron colocarse en placas con microtubos, mantenidas en frío,
ordenadamente etiquetadas y cuidando de que no haya contaminación entre las muestras.
Debió minimizarse el tiempo transcurrido entre el homogeneizado y la
electroforesis, empleando ultracongelación para evitar la degradación de las enzimas.
Por esto, los extractos se almacenaron en un congelador de ultrafrío a una temperatura
entre -70º y -80ºC. Antes de congelarlos se incluyeron mechas de papel filtrador o
secante dentro de los microtubos, para que éstas se impregnaran del extracto de cada
muestra.
40
3.4.2
Preparación del gel de almidón
El gel de almidón constituye una muy buena matriz de soporte para la migración
de los extractos de proteínas vegetales a través de la corrida electroforética. Sus
principales ventajas son que constituye una matriz no tóxica, con poros similares en
tamaño a las proteínas, creando así un filtro de moléculas que incrementa la resolución
de separación de las enzimas.
El gel debió elaborarse la tarde anterior a cada día de la corrida electroforética,
para favorecer una estructura adecuada y facilitar el rebanado horizontal para el
replicado de los geles y su tinción para diferentes enzimas a partir de un solo gel. Su
elaboración se realizó en la siguiente forma:
a) Se pesó 36 gramos de almidón de papa SIGMA, y se mezcló con 300 ml del buffer
de gel a temperatura ambiente en un Erlenmeyer, revolviéndose al aplicar
movimientos arremolinados vigorosos, hasta la disolución del almidón.
b) El Erlenmeyer se puso a calentar, aplicando siempre movimientos por algunos
minutos, hasta la aparición de burbujas en su base. El almidón tras este proceso se
volvió más delgado y se comenzó a formar un coloide, el cual se tornó menos
viscoso, al comenzar a hervir.
c) Se retiró del fuego y se dejó en un horno microondas por 4 minutos, revolviendo
vigorosamente a cada minuto, para soltar burbujas.
d) Se desgasificó usando una bomba de vacío por presión de agua, tras lo cual el gel se
tornó cristalino.
e) La solución se vertió en un molde horizontalmente nivelado, llenándolo hasta las
esquinas.
f) Cada gel se cubrió con una película plástica 20 minutos después, para evitar el
desecamiento de su superficie.
41
3.4.3
Corrida electroforética
Se empleó un sistema buffer en la preparación del gel y además un electrobuffer,
el cual corresponde a una solución ionizada que permite la conducción de la corriente
aplicada durante la corrida electroforética. Dado que las proteínas llevan carga eléctrica,
sean estas positivas producto de grupos amino ionizados, o negativas producto de grupos
carboxilo ionizados, éstos migran en un sentido determinado al aplicar la corriente
eléctrica.
Con relación a los sistemas buffer, se requiere de experiencia y pruebas previas
para conocer el comportamiento de las corridas y cuales sistemas buffer emplear en cada
enzima a estudiar de cada especie, al igual que la batería de tinciones a utilizar. Para el
caso del presente estudio, esta prueba fue realizada por la Dra. Andrea Premoli en el
Laboratorio Ecotono, de la Universidad Nacional del Comahue, Argentina, con muestras
de L. philippiana.
La preparación de los sistemas buffer debió realizarse de manera regulada con un
pH-ímetro. En el cuadro 7 aparecen los pH según sistema buffer, y en el cuadro 8 se
muestran las enzimas a estudiar.
CUADRO 7. Sistemas buffer empleados en las corridas electroforéticas.
Sistema Buffer
pH gel
pH electrobuffer
16
8.5
8.1
18
7.0
7.0
MC
7.5
7.5
Para el sembrado de los geles, éstos debieron cortarse luego de enfriarlos por 30
minutos antes del montaje, despegándolos de los bordes por medio de cortes rectos, y se
procedió a montar las mechas con un corte limpio y recto, hecho a unos 3 a 4 cm
paralelo a una arista y perpendicular a la base del gel. La siembra de las mechas
42
embebidas en los extractos se realizó con una separación de 2 a 3 mm entre mechas,
siguiendo el orden de las mechas para conservar su identificación. Para indicar la
velocidad de la corrida, se sembró también una mecha con Azul de Bromofenol.
El gel sembrado se posicionó encima y entre las bandejas llenas cada una con
350 ml del electrobuffer, cargadas con el ánodo (carga negativa) en el inicio de la
corrida, y el cátodo (positiva) hacia el final de la corrida. Se utilizó esponjas de celulosa
como puentes para la transmisión de la corriente eléctrica a través del electrobuffer
embebido en las esponjas desde las bandejas. Sobre las esponjas y para sostenerlas al
gel, se ubicó un vidrio sobre ellas, y dado que el proceso debe realizarse en condiciones
de frío, se depositó hielo seco sobre el vidrio. Se procedió finalmente a aplicar la
corriente eléctrica a partir de la fuente de poder, de 50 miliamperes por gel.
CUADRO 8. Enzimas de las cuales se analizó su variación mediante electroforesis y
sistema buffer requerido.
Enzima
Abreviación
Sistema Buffer
1) Ácido fosfatasa
ACPH
MC
2) Alcohol deshidrogenasa
ADH
16
3) Aldolasa
ALD
MC
4) Glutamato oxalacetato transaminasa
GOT
16
5) Isocitrato deshidrogenasa
IDH
MC
6) Malato deshidrogenasa
MDH
18
7) Enzima málica
ME
MC
8) Peroxidasa
PER
16
9) Fosfoglucoisomerasa
PGI
MC
10) Fosfoglucomutasa
PGM
18
11) Shikimato deshidrogenasa
SDH
18
6-PGD
18
12) 6-fosfoglutamato deshidrogenasa
43
3.4.4
Tinción del gel
Luego de la corrida electroforética, se rebanó cada gel con un hilo fino tenso,
obteniendo secciones para el uso de diversas tinciones sobre el mismo gel con las
mismas muestras. Cada rebanada se depositó sobre una bandeja etiquetada, y luego se
aplicó la tinción específica para cada enzima a estudiar.
Posterior a la tinción, los geles se incubaron a 37º C en un horno, tras lo cual
apareció el patrón de migrado de las enzimas por efecto de la electroforesis.
3.4.5
Registro e interpretación
El registro del patrón de migración de las enzimas se realizó para cada zona de
actividad o locus de cada enzima empleada. Por ejemplo, en el caso de la enzima ACPH,
ésta posee un solo locus o zona de actividad, dentro del cual, en las especies en estudio
pueden aparecer como una banda arriba solamente, con una banda abajo solamente, o
con ambas. Si aparece sólo una banda arriba o sólo una banda abajo, es indicio de un
homocigoto 2-2 ó 3-3, respectivamente, mientras que si aparecen ambas, esto quiere
decir que se trata de un heterocigoto, registrándose como 2-3.
Este sistema de registro constituye la matriz de datos requeridos por el software
BIOSYS. Este programa permite obtener la información requerida para el análisis y
comparación de la variación isoenzimática entre las poblaciones en estudio, obteniendo
los siguientes parámetros que brindan una importante ayuda para interpretar la relación
genética entre las poblaciones:
a) Frecuencias alélicas para cada población, según locus y total.
b) Porcentaje de loci polimórficos (según criterio del 95%) en cada población.
c) Número medio de alelos por locus en cada población.
d) Grado medio de heterocigocis observada en cada población.
e) Grado medio de heterocigocis esperada, según equilibrio de Hardy-Weinberg, para
cada población.
44
f) Valores de identidad genética insesgada según Nei (1978) entre poblaciones.
g) Valores de distancia genética modificada de Rogers entre las poblaciones, según el
método de Wright (1978), citado por De Pamphilis y Wyatt (1990).
A partir de los valores de identidad genética y distancia genética, se generaron
dendrogramas del tipo de pares de grupos insesgados (UPGMA), empleando la distancia
euclidiana. La utilidad de estos dendrogramas es la explicación gráfica de la similaridad
genética entre las poblaciones, segregándolas según parecido en variación alélica.
45
4. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS
4.1
Estudio de características morfológicas y anatómicas
Se presenta a continuación, la morfología foliar observada en las poblaciones
estudiadas a través de coeficientes morfométricos que permiten caracterizar los rasgos
de las hojas, de acuerdo a tres categorías: la primera referida a elementos foliares de
registro directo y relativamente invariables en el desarrollo foliar, otra conformada por
coeficientes de relación de forma de la hoja, originados a partir de dimensiones de
ciertas secciones de la hoja, pero que convertidos en proporciones de forma, pierde
importancia las dimensiones absolutas, permitiendo comparar los individuos y
poblaciones con un riesgo menor de incorporar el efecto ambiental en el fenotipo
observado. Finalmente, una tercera categoría integra rasgos de apreciación cualitativa,
pero transferidas a escala numérica para su comparación.
4.1.1
Caracterización según elementos foliares de registro directo
Al observar la forma del ápice y la base de la hoja, mediante los ángulos
registrados, se muestra que L. sempervirens posee ápices de forma obtusa, con ángulos
de ápice (ang a) superiores a 100º, en cambio L. philippiana muestra ángulos inferiores
de 65º o agudos, en sus dos poblaciones, como se puede apreciar en el cuadro 9,
corroborando lo señalado en la literatura respecto de la forma del ápice de la lámina
foliar (Muñoz, 1980; Rodríguez et al., 1983; Donoso, 1991).
CUADRO 9. Características foliares de registro directo en las poblaciones estudiadas.
Las cifras entre paréntesis corresponden a desviación estándar.
Característica
foliar
ang a (º)
L. sempervirens
(Paillaco)
L. sempervirens
(Llancahue)
109.32 (22.3) 118.06 (18.8)
L. philippiana
x sempervirens
(Llancahue)
L. philippiana
(Llancahue)
L. philippiana
(Puyehue)
82.52 (15.97) 63.95 (9.60)
62.18 (9.27)
ang b (º)
71.49 (11.9)
69.96 (11.4)
67.95 (7.27)
64.00 (9.24
57.76 (7.50)
as (número)
21.16 (2.13)
21.24 (3.62)
27.40 (4.24)
38.85 (4.41)
35.89 (5.79)
n (número)
13.99 (1.69)
13.24 (1.69)
17.83 (2.36)
23.88 (2.06)
21.56 (1.91)
46
Los individuos que integran el grupo de presuntos híbridos, en tanto, exhiben
una intermediación respecto del rasgo mencionado, con ápices de ángulo medio de
82.5º. Esta intermediación se aprecia también para la forma de la base de la hoja, en el
cual L. sempervirens registra ángulos de base de lámina (ang b) superiores a los de L.
philippiana, mientras que en los presuntos híbridos, esta característica se presenta
intermedia entre los valores de ang b de ambas especies (ver cuadro 9).
50
as (número por lámina)
45
40
35
30
25
20
15
40
60
80
100
120
140
160
ang a (grados)
L. philippiana [Puyehue]
L. sempervirens [Paillaco]
L. philippiana [Llancahue]
L. sempervirens [Llancahue]
Presuntos híbridos [Llancahue]
FIGURA 4. Gráfico de dispersión según ángulo del ápice de la lámina (ang a) y número
medio de dientes por lámina (as), para los 151 individuos de las poblaciones en estudio.
Al observar la dispersión de los datos registrados en los gráficos de las figuras 4
y 5, se aprecia que ang a es un carácter de gran utilidad en segregar ambas especies, y
47
permite positivamente destacar el carácter intermedio descubierto en los híbridos
putativos, de mejor manera que ang b, mostrando una variabilidad mayor entre las
especies que este último rasgo. De hecho, el grupo de los presuntos híbridos presenta
diferencias significativas en base a ang a con todas las otras poblaciones de ambas
especies, soportado por el análisis de varianza realizado con una confianza de 95%,
según Weinberg y Goldberg (1990). En tanto que según ang b, el grupo de presuntos
híbridos, pese a diferir significativamente con L. philippiana de Puyehue, no es
estadísticamente diferente de las poblaciones de L. sempervirens, ni de L. philippiana de
Llancahue, según se señala en el cuadro 10.
110
100
ang b (grados)
90
80
70
60
50
40
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
n (número por lámina)
L. philippiana [Puyehue]
L. sempervirens [Paillaco]
L. philippiana [Llancahue]
L. sempervirens [Llancahue]
Presuntos híbridos [Llancahue]
FIGURA 5. Gráfico de dispersión simple según número medio de nervaduras
secundarias por lámina (n) y ángulo de la base de la lámina (ang b), para los 151
individuos de las 5 poblaciones en estudio.
48
La cuenta de dientes en las hojas (as), así como el número de nervaduras
secundarias observadas (n), también corresponden a características que permiten
diferenciar las especies, donde L. philippiana muestra números superiores de ambos
elementos foliares, con entre 35 y 39 dientes en promedio para las dos poblaciones,
mientras que L. sempervirens presenta alrededor de 21 dientes. Los presuntos híbridos
mostraron alrededor de 27 dientes por lámina, señalando de igual forma intermediación
para este elemento de caracterización foliar. Para el número medio de nervaduras
secundarias, L. sempervirens mostró entre 23 y 21, y alrededor de 13 en L. philippiana.
El registro de un número de n cercano a 18 en los presuntos híbridos, hace que este
rasgo también destaque la intermediación que presentan estos últimos, entre las especies
parentales. Los valores registrados de cada coeficiente de morfología para cada
individuo se adjuntan en el apéndice 1.
CUADRO 10. Presencia de diferencias significativas que presenta la población de
presuntos híbridos, respecto del resto de las poblaciones, para los elementos foliares de
registro directo, según análisis de varianza, para un 95% de confianza.
Coeficiente
morfométrico
L. sempervirens
(Paillaco)
L. sempervirens
(Llancahue)
L. philippiana
(Llancahue)
L. philippiana
(Puyehue)
ang a
ang b
as
n
Si
No
Si
Si
Si
No
Si
Si
Si
No
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Las características foliares as y n, sin duda reflejan de mejor manera la
intermediación de los rasgos en los híbridos respecto de L. sempervirens y L.
philippiana, al tiempo que permiten diferenciar de mejor forma ambas taxa, como es
posible de ver en las figuras 4 y 5, donde se aprecia la dispersión de los individuos
analizados en función de estos elementos foliares. El análisis de varianza efectuado a los
datos a nivel de individuos, corrobora el comportamiento de los presuntos híbridos como
grupo homogéneo que difiere de manera estadísticamente significativa (P <0.05) de las
poblaciones de ambas especies para las características señaladas, según se observa en el
cuadro 10.
49
4.1.2
Caracterización según coeficientes morfométricos
Los coeficientes morfométricos analizados, que reflejan la proporción en que
ocurren las dimensiones de las características de ancho de la hoja (a), longitud de lámina
(l), longitud de hoja (T), longitud de pecíolo (p), distancias da y db, y número de dientes
(s) y nervaduras secundarias (n) en las hojas; generan los coeficientes morfométricos de
a/T, l/T, l/p, l/n, l/s, da/p, db/p, da/l, db/l, da/a, db/a, Ss/Sn y ka, que se muestran en el
cuadro 11, para los valores medios de cada población.
CUADRO 11. Coeficientes morfométricos en las poblaciones estudiadas. Las cifras
entre paréntesis corresponden a desviación estándar.
Coeficiente
morfométrico
L. sempervirens
(Paillaco)
L. sempervirens
(Llancahue)
L. philippiana
x sempervirens
(Llancahue)
L. philippiana
(Llancahue)
L. philippiana
(Puyehue)
a/T
0.41 (0.05)
0.41 (0.04)
0.44 (0.04)
0.39 (0.04)
0.37 (0.04)
l/T
0.91 (0.01)
0.90 (0.02)
0.92 (0.01)
0.94 (0.00)
0.93 (0.01)
l/p
11.24 (1.93)
9.83 (1.88)
12.91 (2.22)
16.59 (1.60)
14.30 (2.30)
l/n
5.12 (0.76)
5.35 (0.53)
4.60 (0.55)
4.16 (0.40)
4.06 (0.50)
l/s
3.38 (0.52)
3.38 (0.56)
3.00 (0.36)
2.57 (0.31)
2.46 (0.29)
da/p
0.60 (0.18)
0.45 (0.11)
0.89 (0.21)
1.36 (0.24)
1.23 (0.21)
db/p
3.30 (0.50)
3.33 (0.70)
4.08 (0.61)
4.63 (0.66)
4.08 (0.69)
da/l
0.05 (0.01)
0.05 (0.01)
0.07 (0.01)
0.08 (0.01)
0.09 (0.01)
db/l
0.30 (0.03)
0.34 (0.04)
0.32 (0.04)
0.28 (0.04)
0.29 (0.05)
da/a
0.12 (0.03)
0.11 (0.02)
0.15 (0.03)
0.20 (0.03)
0.23 (0.05)
db/a
0.67 (0.11)
0.77 (0.15)
0.69 (0.12)
0.68 (0.10)
0.75 (0.16)
Ss/Sn
1.54 (0.18)
1.63 (0.26)
1.58 (0.28)
1.64 (0.17)
1.68 (0.26)
ka
0.19 (0.03)
0.19 (0.02)
0.22 (0.02)
0.18 (0.02)
0.16 (0.02)
A partir de los valores medios señalados en el cuadro 11, y de la información
graficada en las figuras 6, 7 y 8, que ilustran la dispersión de estos coeficientes para la
totalidad de los individuos analizados, se desprende que para algunos de estas
proporciones de forma estudiadas, los individuos que incluyen el grupo de posibles
híbridos presentan en efecto, un carácter intermedio entre los valores obtenidos en las
50
poblaciones de L. sempervirens y L. philippiana, tanto para las poblaciones cercanas en
Llancahue como para aquellas de carácter puro en Paillaco y Llancahue,
respectivamente. La situación mencionada se aprecia para los coeficientes l/T, l/p, l/n,
l/s, da/p, da/l y da/a, a través de los cuales es posible discriminar las poblaciones de L.
sempervirens de las de L. philippiana, y los valores medios de dichos coeficientes que
muestran los individuos híbridos presuntos, los ubican entre los de las especies
parentales, y a la vez se presentan como un grupo significativamente diferente de las
poblaciones de ambas especies (P <0.05), como se extrae del cuadro 12.
4.8
4.3
Coeficiente l/s
3.8
3.3
2.8
2.3
1.8
2.9
3.4
3.9
4.4
4.9
5.4
5.9
6.4
6.9
Coeficiente l/n
L. philippiana [Puyehue]
L. sempervirens [Paillaco]
L. philippiana [Llancahue]
L. sempervirens [Llancahue]
Presuntos híbridos [Llancahue]
FIGURA 6. Gráfico de dispersión simple según proporción entre longitud de la lámina y
número de nervaduras secundarias (l/n) y según proporción entre longitud de la lámina y
número de dientes (l/s), para los 151 individuos de las 5 poblaciones en estudio.
51
CUADRO 12. Presencia de diferencias significativas que presenta la población de
presuntos híbridos, respecto del resto de las poblaciones, para los coeficientes
morfométricos estudiados, según análisis de varianza, para un 95% de confianza.
Coeficiente
morfométrico
L. sempervirens
(Paillaco)
L. sempervirens
(Llancahue)
L. philippiana
(Llancahue)
L. philippiana
(Puyehue)
a/T
l/T
l/p
l/n
l/s
da/p
db/p
da/l
db/l
da/a
db/a
Ss/Sn
ka
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
No
No
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
No
Si
Si
No
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
No
No
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
No
Si
Si
Si
No
No
Si
Dos de los coeficientes estudiados, db/l y Ss/Sn, pese a separar las especies a
través de sus valores medios obtenidos en las poblaciones, ubican a los individuos
posibles híbridos, dentro del rango propio de L. sempervirens, haciendo denotar una
mayor similitud del grupo de híbridos hacia esta especie. En efecto, el grupo de híbridos
no presenta diferencias significativas (P <0.05) con L. sempervirens de Llancahue según
db/l. Por otro lado, de acuerdo al coeficiente Ss/Sn, el grupo de presuntos híbridos no es
significativamente diferente a las poblaciones de ambas especies, por lo que la tendencia
observada de similitud hacia L. sempervirens no es suficientemente importante en este
último coeficiente como para ser considerada, a diferencia de db/l, el cual sí manifiesta
cercanía de los híbridos hacia L. sempervirens.
La proporción db/p, es igualmente capaz de segregar ambas especies, pero según
este coeficiente, los individuos híbridos putativos presentan mayor similitud hacia L.
philippiana, quedando incluidos dentro del rango de variabilidad de ésta. En este
contexto, los valores de db/p en los híbridos no presentan diferencias significativas con
los de la población de L. philippiana de Puyehue (P <0.05), como señala el cuadro 12.
52
0.35
0.3
Coeficiente da/a
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
6
8
10
12
14
16
18
20
Coeficiente l/p
L. philippiana [Puyehue]
L. sempervirens [Paillaco]
L. philippiana [Llancahue]
L. sempervirens [Llancahue]
Presuntos híbridos [Llancahue]
FIGURA 7. Gráfico de dispersión simple según proporción entre longitud de la lámina y
longitud del pecíolo (l/p), y según proporción entre la distancia desde el ápice hasta el
primer diente del margen, y ancho de la hoja (da/a), para los 151 individuos de las 5
poblaciones en estudio.
Por su parte, los coeficientes de forma a/T y ka permiten positivamente
discriminar las especies. Sin embargo, los individuos presuntos híbridos muestran
coeficientes que difieren y superan significativamente los rangos de ambas especies para
estos parámetros, poniendo en evidencia que un cierto grado de variabilidad ampliada en
los híbridos, que no es propia de las poblaciones de las especies puras.
53
Respecto del coeficiente db/a, es necesario apuntar que no permite segregar las
especies, en consecuencia tampoco permite catalogar a los presuntos híbridos en su
carácter de intermedio o más afín a alguna de las taxa, aunque se puede señalar que sí se
encuentra dentro del rango de variabilidad observada en ambas especies. De hecho, el
análisis de varianza corrobora que no hay diferencias significativas (P <0.05) en base a
este parámetro en los posibles híbridos con las poblaciones puras de L. sempervirens en
Paillaco ni con las de L. philippiana en Puyehue o en Llancahue.
0.95
0.94
0.93
Coeficiente l/T
0.92
0.91
0.9
0.89
0.88
0.87
0.86
0.25
0.45
0.65
0.85
1.05
1.25
1.45
1.65
1.85
Coeficiente da/p
L. philippiana [Puyehue]
L. sempervirens [Paillaco]
L. philippiana [Llancahue]
L. sempervirens [Llancahue]
Presuntos híbridos [Llancahue]
FIGURA 8. Gráfico de dispersión simple según proporción entre la distancia desde el
ápice hasta el primer diente del margen, y longitud del pecíolo (da/p), y según
proporción entre longitud de la lámina y longitud de la hoja (l/T), para los 151
individuos de las 5 poblaciones en estudio.
54
4.1.3
Caracterización según rasgos de tipo cualitativo
Los rasgos de carácter cualitativo incluidos en el estudio muestran diferencias
discretas entre L. sempervirens y L. philippiana, permitiendo segregarlas en la
asignación de puntajes que representan estas características según el cuadro 13.
Para la forma del diente del borde de la lámina, observando la posición de la
glándula respecto del diente (Qas), L. sempervirens presenta el valor 0, que indica
dientes curvos a poco agudos, con aserrado suave y ubicación de glándula próxima al
seno del diente, en tanto que L. philippiana posee hojas con dientes pronunciados y
agudos y glándula preferentemente alejada del seno, orientado hacia fuera de la lámina,
según su valor 1, como se infiere del cuadro 13.
El grupo de presuntos híbridos mostró valor 0.5, es decir se trata de individuos
con aserrado algo marcado y glándulas de ubicación diversa en relación al seno,
incluyendo glándulas hacia fuera y otras veces próxima al seno del diente, que las
catalogan como intermedias para el rasgo morfológico Qas.
CUADRO 13. Rasgos cualitativos observados en las poblaciones estudiadas. Los valores
señalan la transcripción numérica de los rasgos, según en cuadro 4. La cifra entre
paréntesis corresponde a desviación estándar.
Características L. sempervirens
cualitativas
(Paillaco)
L. sempervirens
(Llancahue)
L. philippiana
x sempervirens L. philippiana L. philippiana
(Llancahue)
(Puyehue)
(Llancahue)
Qas
0
0
0.5
1
1
Qep
0
0
0.5
1
1
Qtp
0
0
0
1
1
Qpy
0
0
0.45 (0.15)
1
1
55
La forma de las células epidérmicas del envés de las láminas (Qep), también
aparece como un rasgo que diferencia L. sempervirens de L. philippiana. En esta primera
especie la totalidad de los individuos en sus dos poblaciones observadas, muestran
células epidérmicas del envés de la hoja con bordes relativamente rectos y en general
carentes de lóbulos evidentes, con un puntaje 0. En contraste se observa los individuos
de L. philippiana con células de epidermis del envés foliar con bordes de manifiesta
sinuosidad, caracterizadas por un número elevado de lóbulos, muy superior a ocho,
correspondiendo al valor 1.
La intermediación de este rasgo relativo a la forma de las unidades del tejido
epidérmico inferior, es sorprendentemente notorio en los individuos híbridos, cuyas
células son claramente intermedias respecto de L. sempervirens y L. philippiana, con
bordes sinuosos, y un número de lóbulos por lo general entre 5 y 8, indicando un valor
de Qep de 0.5.
El tipo de pilosidad observado (Qtp), muestra que los híbridos putativos
presentan sólo pelos simples en ambas caras de las hojas, al igual que L. sempervirens,
por esto su valor es 0 en ellos. Opuesta es la situación detectada en L. philippiana, con
valor de puntaje 1, lo que implica presencia de pelos simples en el haz y pelos simples y
malpighiáceos en el envés de la hoja, tal como describe Martínez-Laborde (1983a).
El nivel de pilosidad en yemas foliares según apreciación visual (Qpy), cataloga
con valor 0 a los individuos estudiados de L. sempervirens, al observarse en ellos yemas
foliares glabras a escasamente pubescentes, en tanto que L. philippiana presenta yemas
muy pubescentes, con valor 0. El conjunto de individuos híbridos presuntos exhibió en
su gran mayoría un valor 0.5, es decir un nivel intermedio de abundancia de pelos en las
yemas foliares, no obstante en algunos de ellos se presenció yemas glabras, similares a
las de L. sempervirens.
56
4.1.4
Índice de Hibridación de Anderson
Se consideraron los diez rasgos que mejor reflejaran las diferencias entre las
especies L. philippiana y L. sempervirens, para la confección del índice de identidad de
especies, o Indice de Hibridación de Anderson. La selección se hizo en función de los
rasgos en los cuales efectivamente ocurre un rango de variabilidad definido para las
especies, ya que del resto de las otras características, si bien se observó una clara
tendencia de su utilidad en separar las poblaciones de las especies típicas, ellas presentan
un grado de sobreposición en la dispersión de su variabilidad en ambas especies.
Se usaron entonces las características que permitieran dar rangos inherentes a
cada especie, los que se muestran en el cuadro 14. Luego de la suma de los puntajes
obtenidos para dichas características (puntajes que se adjuntan en el apéndice 2), se llegó
a un valor de IH para cada individuo. Estos valores se muestran en el cuadro 15.
CUADRO 14. Características incluidas en el índice de hibridación y los puntajes según
rango.
Puntaje
Rasgo
ang a
as
n
l/T
da/p
da/a
Qas
Qep
Qtp
Qpy
0
(rango propios de
L. sempervirens)
> 83º
< 28
< 17
< 0.924
< 0.9
< 0.15
0.5
1
(rango propios de
L. philippiana)
17-19
Según cuadro 4
57
≤ 83º
≥ 28
> 19
≥ 0.924
≥ 0.9
≥ 0.15
Al examinar el gráfico de frecuencias de individuos según cada rango de puntaje
de IH, en la figura 9, se observa que los individuos de L. sempervirens presentaron
puntajes 0, o cercanos a este valor, mientras que en el extremo opuesto, los individuos
identificados como L. philippiana, arrojaron puntajes de IH de valor 10, o cercanos a 10.
En tanto, los individuos híbridos presuntos se presentan con puntajes intermedios
en su mayoría entre 2 y 7, destacando como intermedios entre las especies. Se observa
una mayor frecuencia de los individuos híbridos según su IH, con valores más cercanos
a L. sempervirens, que a L. philippiana (ver figura 9).
58
CUADRO 15. Índices de Hibridación (IH) calculado para cada individuo analizado de
las cinco poblaciones en estudio.
L. sempervirens
(Paillaco)
L. sempervirens
(Llancahue)
L. philippiana
x sempervirens
(Llancahue)
L. philippiana
(Llancahue)
L. philippiana
(Puyehue)
Árbol
IH
Árbol
IH
Árbol
IH
Árbol
IH
Árbol
IH
5S03
5S04
5S05
0
0
0
1S03
1S04
1S05
0
0
0
1N01
1N04
1N05
3.5
5.5
3.5
2P01
2P02
2P03
10
10
10
6P03
6P04
6P05
9
9
10
5S06
5S07
0
0
1S06
1S07
0
0
1N06
1N07
1.5
2.5
2P04
2P05
10
10
6P06
6P07
10
10
5S08
5S09
5S10
0
1
0
1S08
1S09
1S10
0
1
0
1N08
2N01
2N02
5.5
2.5
4.5
2P06
2P07
2P08
10
10
10
6P08
6P09
6P10
9.5
10
9
5S11
5S12
5S13
0.5
0
2
1S11
1S12
1S13
0
0
0
2N03
2N04
2N05
5
7
6.5
2P10
2P11
2P12
10
10
10
6P11
6P12
6P13
10
10
10
5S14
5S15
0
1
1S14
1S15
0
0
2N06
2N07
2.5
4.5
2P13
2P14
10
10
6P14
6P15
10
10
5S16
5S17
5S18
0
0
0
1S16
1S17
1S18
0
0
0
2N08
2N09
2N10
2.5
3
3
2P15
2P16
2P17
10
10
10
6P16
6P17
6P18
10
10
10
5S19
5S20
5S21
0
0
2
1S19
1S20
1S21
0
0
0
2N11
2N12
2N13
4.5
5.5
6
2P18
2P19
2P20
8
10
10
6P19
6P20
6P21
10
10
10
5S22
5S23
0
0
1S22
1S23
0
0
2N14
2N15
7
6.5
2P21
2P22
10
10
6P22
6P23
9
8
5S24
5S25
5S26
0
0
0
1S24
1S25
1S26
0
0
0
2N16
2N17
2N18
3
4.5
2
2P23
2P24
2P25
9
10
10
6P24
6P25
6P26
10
9
9
5S27
5S28
5S29
1
2
0
1S27
1S28
1S29
0
0
1
3N01
3N02
3N03
4.5
6.5
6.5
2P26
2P27
2P28
10
10
10
6P27
6P28
6P29
10
10
10
5S30
5S31
0
1
1S30
3S01
0
0
3N05
3N06
4.5
2.5
2P29
2P30
10
10
6P30
6P31
9
9
5S32
5S33
1
0
3S02
3S03
0
0
6P32
6P33
7
10
59
30
25
NUMERO
NUMERODE
DE INDIVIDUOS
INDIVIDUOS
20
15
10
L p - Puyehue
______
_
_
_
_
_________
__
_
__
__
_
_
_
_
_
_
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ L p - Llancahue
Presuntos híbridos
_______________________________________
_
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ L s - Llancahue
5
_
L s - Pa illaco
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
INDICE
HIBRIDACIÓN
INDICE
DEDEHIBRIDACIÓN
FIGURA 9. Histograma de frecuencia para los valores de Indice de Hibridación en Laurelia sempervirens (Ls), L. philippiana (Lp) e
híbridos presuntos
4.1.5
Diagrama de dispersión de Anderson
El diagrama de dispersión confeccionado según el método de Anderson (1968),
se presenta el la figura 10. Se empleó para su construcción el par de coeficientes que
permitieron diferenciar de mejor forma las poblaciones de L. sempervirens de las de L.
philippiana; estas fueron el número de dientes en la hoja (as) y el número de nervaduras
secundarias en la lámina (n).
Se complementó este diagrama con las características de tipo de aserrado (Qas),
borde de células del epidermis inferior (Qep), tipo de pilosidad (Qtp) y ángulo del ápice
de la hoja (ang a), ilustrados mediante apéndices a cada extremo superior, derecho,
izquierdo e inferior, respectivamente, de cada punto que representó cada individuo,
como se aprecia en el recuadro al interior del diagrama.
La mayoría de los individuos que componen el grupo de los presuntos híbridos,
aparece en el espacio ubicado entre las poblaciones de L. sempervirens de Paillaco y
Llancahue, y de L. philippiana de Puyehue y Llancahue, y presentan las cualidades
intermedias según los apéndices dibujados, destacando gracias a este diagrama su
condición de intermedios entre ambas especies, respecto de las características
estudiadas.
Pese a que algunos individuos del grupo de híbridos supuestos, se muestran
dentro del rango de L. sempervirens, y otros dentro del de L. philippiana, para el resto de
las características incluidas en el diagrama, presentan los rasgos intermedios de todas
formas, pudiendo por lo tanto considerarse como intermedios.
61
DIENTES EN MARGEN EN HOJA (Unidades)
Aserrado margen
lámina
Muy Pronunciado, diente
agudo con glándula hacia
fuera de seno
Marcado, diente curvo con
glándula hacia seno de
diente o hacia fuera
Suave, diente curvo con
glándula hacia interior
seno
Borde de células
epidérmicas de envés
Muy sinuoso
Más de 8 de lóbulos
Algo sinuoso
Entre 5 y 8 lóbulos
Recto a poco sinuoso
Entre 0 y 5 lóbulos
Pilosidad en yemas
foliares
Muy pubescentes
Algo pubescentes a
pubescentes
Glabras a escasamente
pubescentes
Ápice hoja
Recto a obtuso (83º-158º)
Agudo (45º-83º)
Población
Localidad
L. sempervirens
Paillaco
L. sempervirens
Llancahue
L. philippiana x sempervirens
Llancahue
L. philippiana
Llancahue
L. philippiana
Puyehue
NERVADURAS SECUNDARIAS EN HOJA (Unidades)
FIGURA 10. Diagrama de dispersión de Anderson (1968), de los ejemplares estudiados de Laurelia sempervirens, L.
philippiana y presuntos híbridos.
4.1.6
Análisis de Clusters para los coeficientes morfométricos
El dendrograma derivado del análisis de clusters, se presenta en la figura 11. Al
tomar en cuenta que esta determinación de conglomerados considera como base los 21
coeficientes de morfometría foliar, se infiere que la máxima diferenciación entre grupos
ocurre entre los individuos de L. philippiana y el conjunto de individuos de L.
sempervirens unidos a los presuntos híbridos; sin embargo, al considerar un 74% de la
relación de máxima diferenciación entre conglomerados existentes, se identificaron tres
grupos principales, correspondientes a una segregación de los individuos de L.
philippiana, de L. sempervirens y los presuntos híbridos L. philippiana x sempervirens,
los cuales aparecen como grupo intermedio.
Lo anterior implica que al considerar el nivel de 74% de la máxima distancia
euclidiana observada entre clusters, el total de los 151 individuos de la muestra se
segregan entonces en tres grupos de homogeneidad interna, pero heterogéneos en
relación con los otros clusters, correspondiendo a un primer grupo con individuos de L.
sempervirens, un segundo que incluye los individuos presuntos L. philippiana x
sempervirens, y un tercer grupo formado por los individuos de L. philippiana.
El conjunto de individuos presuntos híbridos, se observa entonces, como un
grupo homogéneo frente a los coeficientes morfológicos foliares registrados, y presenta
como conjunto, una mayor cercanía frente al conglomerado compuesto por los
individuos de L. sempervirens.
Al interior de los clusters de cada especie típica, se puede señalar en general, que
no se presentan separaciones internas que respondan a diferencias entre la población de
Llancahue y la población pura, tanto para L. philippiana como para L. sempervirens, y
los diversos clusters más pequeños de cada especie integran individuos tanto de las
poblaciones puras como de las de Llancahue, para ambas especies.
63
Relación del vínculo frente a la máxima distancia entre clusters (%)
0
20
40
60
80
100
5S03
1S04
5S09
5S23
1S18
1S07
1S15
1S09
1S05
1S13
1S19
5S21
5S28
5S04
1S20
5S12
5S20
5S24
5S06
1S12
1S16
5S07
1S21
5S16
5S18
3S03
5S17
3S02
1S10
1S17
5S33
1S26
1S27
1S28
1S11
1S23
1S24
1S22
5S05
1S03
L. sempervirens
1S25
1S14
1S29
5S08
1S30
5S14
5S11
5S30
5S31
1S08
5S27
5S32
5S22
5S25
5S26
5S10
5S13
5S15
1N01
2N04
2N05
1N04
3N02
3N03
1N08
2N01
2N15
2N14
2N07
3N05
2N13
2N09
2N16
2N11
3N01
2N17
2N03
2N08
3N06
2N06
2N10
2N18
1N05
1N06
1N07
2N12
2P01
L. philippiana x sempervirens
2P08
2P28
2P25
2P21
2P30
6P16
2P15
2P20
2P22
2P23
2P26
2P03
6P13
2P04
2P05
2P27
6P17
2P06
6P33
2P11
2P24
6P19
2P10
2P13
6P29
2P16
2P19
6P06
6P11
6P09
6P08
6P24
6P21
2P02
2P12
6P07
6P14
2P14
6P12
6P15
2P29
6P18
6P27
6P28
6P23
6P04
2P17
6P05
L. philippiana
6P25
6P20
6P26
6P22
6P32
6P30
6P31
FIGURA 11. Dendrograma del Análisis de Clusters para los 151 individuos de la muestra, agrupados según vínculo completo y
distancias euclidianas entre los coeficientes de morfología foliar relativizados.
4.1.7
Análisis Factorial por Componentes Principales
El gráfico bidimensional compuesto por los factores arrojados en el análisis
factorial por componentes principales, se entrega en la figura 12.
Al examinar el gráfico aludido, y dado que a cada extremo alejado del cero de
cada factor, se ubican los individuos con la mayor diferenciación según los 21
coeficientes morfológicos foliares, se observa que el factor 1 segrega claramente las
poblaciones de L. philippiana de las de L. sempervirens, mientras que se destaca en la
zona intermedia entre los grupos de especies parentales, a los individuos del grupo de
presuntos híbridos.
Lo anterior quiere decir que el conjunto de coeficientes de la morfología foliar de
correlación significativa con el factor 1, de Qas, Qep, Qpy, da/p, Qtp, n, as, ang a, da/a,
l/p, l/T, da/l, l/n, l/s y db/p, según importancia decreciente, explican con propiedad las
diferencias entre ambas especies, a la vez que resaltan el carácter intermedio de los
híbridos. Los valores absolutos de las correlaciones de las variables con cada factor,
aparecen en el cuadro 16.
Al considerar el factor 2, se observa que éste reúne características de menos
utilidad en la segregación de las especies parentales. Sin embargo, este factor permitió
identificar los coeficientes morfométricos para los cuales los individuos híbridos
muestran un comportamiento diferente, fuera del rango de variabilidad típica de las
especies padre, y que representan el conjunto de variabilidad propia de gran parte de los
híbridos. Estos coeficientes son db/a, db/l, ang b y Ss/Sn, nombrados en orden de
importancia decreciente respecto de la correlación observada con el factor 2, como se
muestra en el cuadro 16.
65
CUADRO 16. Correlación de cada coeficiente morfométrico foliar con cada factor
obtenido por el análisis de componentes principales. La presencia de asterisco señala al
coeficiente como estadísticamente significativo (P <0.01), según Feese (1984).
Coeficiente
morfométrico
ang a
ang b
as
n
a/T
l/T
l/p
l/n
l/s
da/p
db/p
da/l
db/l
da/a
db/a
Ss/Sn
ka
Qas
Qep
Qtp
Qpy
Correlación
con Factor 1
Correlación
con Factor 2
* 0.832
0.430
* 0.860
* 0.896
0.329
* 0.792
* 0.793
* 0.695
* 0.691
* 0.909
* 0.600
* 0.792
0.423
* 0.816
0.065
0.137
0.317
* 0.950
* 0.950
* 0.898
* 0.947
0.153
* 0.613
0.326
0.063
* 0.587
0.225
0.226
0.033
0.384
0.001
0.245
0.197
* 0.702
0.342
* 0.929
* 0.563
0.119
0.039
0.039
0.071
0.033
66
1
N302
N303
N108
N204
N211
N217
N301
N208
0.8
N203
N201
N214
FACTOR 2 [db/a; db/l; ang b; a/T; s/n]
N207
N202
N216
N104
N215
N209
N306
N205
N210
N213
0.6
N206
N101
N305
N105
N218
0.4
L. philippiana
[Llancahue]
L. philippiana x sempervirens
[Llancahue]
P215
N106
L. sempervirens
[Paillaco]
N212
S518 S511
S108 S514
N107
S520
S507
0.2
S509
S510
S512
S503 S508
S504
S106
S506S524
S112
S116
S526
L. philippiana
[Puyehue]
S505
S118
S103 S104
S107
S126
0
S114
P201
P221
P223
P208P219
P206
P616
P612
P225
P213
P203
P205 P210
P611
P608
P202 P607
P604 P609
P217
P211
P605
P614
P603
P620
P622
L. sempervirens
[Llancahue]
S522
S122
S105
-0.2
S111
-0.4
-1
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
FACTOR 1 [Qas; Qep; Qpy; da/p; Qtp; n; as; ang a; da/a; l/p; l/T; da/l; l/n; l/s; db/p]
FIGURA 12. Gráfico resultante del análisis factorial por componentes principales según morfología foliar. Se señalan los
coeficientes de correlación significativa con cada factor.
4.2
Estudio de compuestos secundarios de las hojas
Tras revelar las placas luego de la corrida cromatográfica, se detectaron ocho
compuestos fenólicos mostrando distintos colores a la luz UV, que se presentan en el
cuadro 17. La separación de los compuestos para su diferenciación se realizó a través del
solvente TBA, mientras que la migración de los flavonoides en el solvente HoAc no fue
significativa.
CUADRO 17. Compuestos detectados en las poblaciones analizadas por cromatografía
Compuesto
Color
Rango Rf (TBA)
A
Amarillo opaco
0.980 - 0.993
B
Púrpura
0.938 - 0.972
C
Púrpura
0.887 - 0.932
D
Amarillo opaco
0.848 - 0.894
E
Amarillo a pardo
0.787 - 0.883
F
Amarillo a pardo
0.770 - 0.772
G
Amarillo brillante
0.709 - 0.725
H
Pardo
0.523
Luego de examinar los cromatogramas resultantes, los cuales se incluyen en el
apéndice 3), se constató la existencia de flavonoides comunes para L. sempervirens y L.
philippiana como era predecible producto de la cercanía filogenética entre las especies.
Aquellos compuestos presentes en ambas, como se aprecia en el cuadro 18, son A, B y
D, de los cuales el primero se encuentra en todos los individuos de ambas especies y
también en los presuntos híbridos. Para el segundo compuesto en tanto, se detectó su
presencia sólo en algunos árboles de las poblaciones ubicadas en Llancahue, de L.
sempervirens, L. philippiana e híbridos.
Los cromatogramas también revelaron compuestos característicos de cada especie,
como C, que se halla sólo en L. philippiana y en algunos híbridos; mientras que hay
68
otros compuestos presentes de manera exclusiva en L. sempervirens y algunos híbridos,
estando ausentes en L. philippiana (compuestos E, F y G). Además se detectó un
compuesto peculiar (H) en uno de los híbridos analizados (ver cuadro 18).
CUADRO 18. Compuestos detectados en los individuos analizados por cromatografía y
sus valores de Rf (TBA).
Población
L. sempervirens
(Llancahue)
L. sempervirens
(Paillaco)
L. philippiana
(Llancahue)
L. philippiana
(Puyehue)
L. philippiana x
sempervirens
(Llancahue)
Árbol
Valor de Rf (TBA) según compuesto
A
B
1S06
1S07
0.980
0.986
0.941
0.972
1S21
5S04
0.980
0.980
0.947
5S16
5S29
0.987
0.980
2P04
2P12
0.986
0.987
0.953
2P24
6P08
0.993
0.980
0.951
6P25
6P27
0.987
0.986
2N07
2N09
0.987
0.986
2N10
2N11
0.980
0.986
2N12
2N13
2N14
2N15
C
D
E
0.855
0.822
F
G
0.770
0.709
0.772
0.725
H
0.833
0.867
0.919
0.907
0.914
0.898
0.860
0.857
0.787
0.823
0.938
0.890
0.863
0.812
0.829
0.987
0.993
0.848
0.815
0.957
0.887
0.929
0.987
0.986
0.947
0.959
0.921
0.932
0.894
0.801
0.523
De lo anterior se desprende que las poblaciones de L. sempervirens y L.
philippiana analizadas poseen composición fenólica similar respecto de algunos
compuestos (A, B, D). Resulta lógico producto de su parentesco, que compartan tipos de
compuestos químicos. Sin embargo, cada una posee compuestos específicos que la
69
diferencian de la otra, como C que es característico de L. philippiana, mientras que E, F
y G son propios de L. sempervirens, y que al parecer corresponderían a químicos con el
carácter de "marcador" de cada especie.
Los presuntos híbridos mostraron las manchas comunes a ambas especies, pero
además se presenta una combinación en la composición de la mayoría de ellos, respecto
de los flavonoides exclusivos de cada una de las especies parentales. Es así que los
híbridos 2N09, 2N11, 2N12 y 2N14 incluyen en su composición la mancha C típica de
la población pura de L. philippiana, y el flavonoide E, único de la población pura de L.
sempervirens. Por otra parte, el híbrido 2N10 mostró el compuesto H diferente, que no
se observó en ningún árbol de las poblaciones parentales.
Se hace patente la intermediación de los híbridos a juzgar por su composición
fenólica, a la vez que ellos presentan un grado de variabilidad mayor al de las
poblaciones puras de L. sempervirens y L. philippiana, al contener rasgos químicos de
ambas, e incluso eventualmente generar compuestos diferentes.
La situación observada es posible de explicar producto de la recombinación de los
caracteres de ambas especies mediante la hibridación, de la misma manera como se ha
manifestado en experiencias de hibridación natural entre otras especies, en las que los
híbridos presentan componentes de una y de otra especie parental, y además,
componentes específicos de los híbridos o manchas híbridas.
Si bien es cierto, en este caso no se logró observar gran cantidad de manchas que
favorecieran una mayor diferenciación de las especies padre, como ha ocurrido en los
estudios de Nothofagus alpina x obliqua (Morales, 1987; Donoso et al., 1990) o
Nothofagus betuloides x dombeyi (Atienza, 1982; Donoso y Atienza, 1983) que ayuden
a documentar el fenómeno de hibridación, se debe mencionar que las especies de
Laurelia de este estudio poseen numerosos flavonoides, según lo detectado en una
prueba inicial realizada con muestras de follaje tomadas en otoño, de algunos
individuos. Lamentablemente en la cromatografía final, cuyas muestras fueron tomadas
70
al iniciar la primavera, los individuos mostraron concentraciones menores de la mayoría
de los compuestos, producto de un aparente cambio estacional no esperado.
Lo anterior se reflejó en un menor número de componentes fenólicos detectados
que permitieran discriminar en mejor forma las especies L. sempervirens y L.
philippiana y por cierto destacar el carácter intermedio en la composición de este tipo de
compuestos fenólicos en los híbridos. No obstante, y pese a la situación mencionada, se
logró registrar un número de fenoles mínimo necesario para la identificación y
discriminación de las especies.
La presencia de flavonoides específicos de los híbridos, o manchas híbridas, al
parecer no es un fenómeno generalizado en los individuos analizados (compuesto H en
el híbrido 2N10), como ha ocurrido en otros fenómenos de hibridación estudiados
mediante esta técnica. Sin embargo, la cromatografía ha sido útil, ya que ha destacado
un mínimo de rasgos propios de cada especie, y en los individuos presuntos híbridos ha
dado prueba de la combinación en la composición de estos químicos, revelando así su
carácter intermedio entre las especies estudiadas, apoyando la hipótesis de ocurrencia de
individuos híbridos naturales entre L. sempervirens y L. philippiana.
4.3
Variación isoenzimática en las poblaciones en estudio
Los parámetros genéticos calculados a partir de las frecuencias alélicas de los 18
loci analizados para las poblaciones estudiadas, se presentan en el cuadro 19. El número
medio de alelos por locus (A) alcanzó un valor de 1,3 en la población pura de L.
sempervirens de Paillaco, mientras que este valor en la población de Llancahue de la
misma especie es similar, con un valor de 1,2. Las poblaciones de L. philippiana
mostraron poseer valores de número medio de alelos por locus de 1,7 para la población
pura de Puyehue y 1,5 en la población de esta especie en Llancahue.
El grupo de individuos presuntos híbridos L. philippiana x sempervirens, en
tanto, presentó un valor estimado del mencionado parámetro genético de 1,4; intermedio
71
entre las poblaciones cercanas de la misma zona de Llancahue, e igualmente intermedio
entre las poblaciones de L. sempervirens y L. philippiana puras. Esta situación se ha
presentado en otros casos de hibridación natural en plantas, como el estudio de
Gallagher et al. (1997) en híbridos del género Carpobrotus, y la situación es explicable
producto de la combinación de los acervos genéticos de ambas especies, que haría
posible la presencia de alelos de ambas especies en los híbridos, traduciéndose en un
número medio de ellos en ciertos locus.
Respecto del parámetro P% o porcentaje de loci polimórfico según el criterio de
frecuencia de alelo más común menor a 95%, ambas poblaciones de L. sempervirens
(pura y cercana a la zona de hibridación) presentaron 11.1% de loci polimórfico.
Superiores fueron los valores registrados para las poblaciones de L. philippiana, tanto la
pura de Puyehue, como la de Llancahue, alcanzando valores para P% de 22.2%, como se
muestra en el cuadro 19.
CUADRO 19. Parámetros de variación genética en las poblaciones en estudio,
considerando las frecuencias alélicas de los 18 loci isoenzimáticos. Los valores entre
paréntesis corresponden a errores estándar.
Población
(Localidad)
Tamaño
medio de la
muestra por
locus
Número
medio de
alelos por
locus (A)
Porcentaje
de loci
polimórficos
(P%)
Directa (Hd)
Esperada (He)
L. sempervirens
(Paillaco)
30.6 (0.3)
1.3 (0.2)
11.1
0.022 (0.017)
0.038 (0.026)
L. sempervirens
(Llancahue)
27.7 (1.7)
1.2 (0.1)
11.1
0.020 (0.013)
0.034 (0.024)
L. philippiana x
sempervirens
(Llancahue)
25.1 (1.4)
1.4 (0.1)
27.8
0.048 (0.026)
0.089 (0.038)
L. philippiana
(Llancahue)
26.0 (1.6)
1.5 (0.2)
22.2
0.062 (0.036)
0.117 (0.059)
L. philippiana
(Puyehue)
30.3 (0.4)
1.7 (0.2)
22.2
0.104 (0.045)
0.137 (0.055)
72
Heterocigocis Media
La población de presuntos L. philippiana x sempervirens, por su parte, mostró
un valor para este parámetro de 27.8%, significativamente superior a las poblaciones de
las especies parentales, lo que se interpreta como una variabilidad mayor en su acervo
genético.
La heterocigocis media calculada directamente a partir de las frecuencias alélicas
de los 18 loci en estudio (Hd), arrojaron valores de 0.022 y 0.020 para L. sempervirens
en Paillaco y Llancahue respectivamente, mientras que los valores calculados para L.
philippiana fueron 0.062 en Llancahue y 0.104 para la población de Puyehue. El grupo
de individuos presuntos híbridos, mostraron un valor de Hd de 0.048, intermedio tanto
entre las poblaciones cercanas (Llancahue), como entre las poblaciones de carácter puro
(L. sempervirens en Paillaco y L. philippiana en Puyehue).
Coherente con los valores registrados para Hd, el parámetro de estimación
insesgada como es la heterocigocis media esperada según el equilibrio poblacional de
Hardy-Weinberg (He), mostró ser de 0.038 y 0.034 en las poblaciones de L.
sempervirens pura y cercana respectivamente, en tanto que para las muestras de L.
philippiana se obtuvieron valores de He de 0.117 para la población cercana y 0.137 para
la pura de esta especie; para luego observar que el conjunto de híbridos putativos mostró
un valor de He de 0.089, intermedio para los pares de grupos de especies parentales. Las
diferencias entre la heterocigocis media esperada y la observada pueden deberse a las
restricciones del tamaño de la muestra empleada en el estudio, la que tal vez es
insuficiente para representar el equilibrio de Hardy-Weinberg.
Pese a que los valores de heterocigocis media Hd y He presentan desviaciones
estándares considerables y que el valor de la heterocigocis es el reflejo de la variabilidad
genética de las poblaciones, era esperable para la población híbrida valores de He
superiores al de las especies padre, sin embargo, los resultados señalan valores
intermedios entre las especies para el parámetro mencionado, probablemente por la
ocurrencia de procesos de hibridación introgresiva pasados que atenuarían la gama
potencial de variabilidad mayor de los híbridos. No obstante lo anterior, lo importante es
73
notar la naturaleza intermedia de la población híbrida respecto de la variabilidad
genética registrada en las especies de L. sempervirens y L. philippiana. Al igual que en
otros eventos de hibridación descritos en especies vegetales, como el de Gallagher et al
(1997), ocurre en este caso un comportamiento intermedio en los valores de
heterocigocis media en el grupo de híbridos probables.
El parámetro P% destaca la mayor variabilidad genética presente en el conjunto
de híbridos, en tanto que A y los valores de Hd y He, señalan una clara tendencia a la
intermediación de estos parámetros descritos de variabilidad genética a escala
poblacional.
Los coeficientes de similaridad genética de Rogers (1972) obtenidos para los
pares de poblaciones en estudio se entregan en el cuadro 20, y junto con el dendrograma
resultante de grupos de pares insesgados (UPGMA) en base a la distancia genética
insesgada modificada de Rogers, según Wright (1978) entre las poblaciones estudiadas,
que se aprecia en la figura 13, destacaron la alta similaridad entre las poblaciones de L.
sempervirens según su componente genético considerando las frecuencias alélicas para
los loci estudiados, con un coeficiente de similaridad genética de 0.977, presentándose
la misma situación entre las poblaciones de L. philippiana, con un coeficiente de 0.917.
La población presunta híbrida mostró una similaridad genética alta con las
poblaciones de L. sempervirens, a través de los coeficientes 0.938 con la población pura
de Paillaco y 0.937 con aquella de Llancahue, en tanto que al compararla con las
poblaciones de L. philippiana mostró menor similaridad genética hacia ellas, mediante
coeficientes de 0.442 frente a la población de Llancahue, y 0.475 con la población pura
de Puyehue de esta última especie, todo lo cual se refleja en el dendrograma de la figura
13, el cual exhibe la señalada similaridad genética mayor del grupo de híbridos
presuntos, con las poblaciones de L. sempervirens.
74
L. sempervirens
(Llancahue)
0.977
1.000
L. philippiana x
sempervirens
(Llancahue)
0.938
0.937
1.000
L. philippiana
(Llancahue)
0.393
0.394
0.442
1.000
L. philippiana
(Puyehue)
0.425
0.429
0.475
0.917
L. philippiana
(Puyehue)
1.000
L. philippiana
(Llancahue)
L. sempervirens
(Paillaco)
L. philippiana
x sempervirens
(Llancahue)
L. sempervirens
(Llancahue)
Población
(Localidad)
L. sempervirens
(Paillaco)
CUADRO 20. Matriz de coeficientes de similaridad genética de Rogers (1972) entre las
poblaciones en estudio.
1.000
Igual patrón se percibe al observar los valores de identidad genética insesgada
según el método de cálculo de Nei (1978), presentados en el cuadro 21, y el
dendrograma de la figura 14, que deriva de estos coeficientes de identidad genética. Se
aprecia que las poblaciones de L. philippiana se hallan cercanamente asociadas entre sí
como era posible de esperar, al igual que entre las de L. sempervirens, con valores de
identidad de 0.969 y 0.997, respectivamente. Los presuntos híbridos mostraron
nuevamente un notorio acercamiento hacia las poblaciones de L. sempervirens, con
valores de identidad de 0.973 para la población pura de Paillaco y 0.974 al compararla
con la población cercana de esta especie, en Llancahue.
75
L. sempervirens
(Llancahue)
0.997
1.000
L. philippiana x
sempervirens
(Llancahue)
0.973
0.974
1.000
L. philippiana
(Llancahue)
0.396
0.404
0.461
1.000
L. philippiana
(Puyehue)
0.430
0.433
0.490
0.969
L. philippiana
(Puyehue)
1.000
L. philippiana
(Llancahue)
L. sempervirens
(Paillaco)
L. philippiana
x sempervirens
(Llancahue)
L. sempervirens
(Llancahue)
Población
L. sempervirens
(Paillaco)
CUADRO 21. Matriz de valores de identidad genética insesgada según Nei (1978) entre
las poblaciones en estudio.
1.000
La información generada a partir de los coeficientes calculados de identidad y
similaridad genética entre las poblaciones, permitiría aventurar que el conjunto de
presuntos híbridos podría tratarse de una población de L. sempervirens. Si esto fuese así,
entonces lo lógico habría sido encontrar que el grupo de posibles híbridos presentara
una identidad y similaridad genética mayores con la población cercana de esta especie
en Llancahue, producto de su proximidad geográfica y ecológica. Sin embargo, es
interesante observar que la población de L. sempervirens de Llancahue es más símil con
aquella de carácter puro del valle central en Paillaco, que frente al grupo de probables
híbridos.
76
Distancia genética modificada de Rogers (Wright, 1978)
L. sempervirens
(Paillaco)
L. sempervirens
(Llancahue)
L. philippiana x
sempervirens
(Llancahue)
L. philippiana
(Llancahue)
L. philippiana
(Puyehue)
FIGURA 13. Dendrograma de grupos de pares insesgados (UPGMA), generado a partir de la distancia genética modificada de
Rogers, según Wright (1978), entre las poblaciones estudiadas.
Índice de Similaridad Genética
L. sempervirens
(Paillaco)
L. sempervirens
(Llancahue)
L. philippiana x
sempervirens
(Llancahue)
L. philippiana
(Llancahue)
L. philippiana
(Puyehue)
FIGURA 14. Dendrograma de grupos de pares insesgados (UPGMA), generado a partir de los coeficientes de identidad
genética insesgada según Nei (1978), entre las poblaciones estudiadas.
Al mismo tiempo, la diferencia que este grupo de posibles híbridos muestra
respecto de las poblaciones de L. sempervirens, se traduce en una proximidad genética
hacia L. philippiana. Las poblaciones de esta última presenta mayor similaridad
genética con la población de presuntos híbridos, que con ambas poblaciones de L.
sempervirens, repitiéndose la tendencia si se considera los coeficientes de identidad
genética insesgada, según Nei (1978).
El conjunto de resultados del análisis de variación isoenzimática, a partir del
cual se infiere su información genética, indican que la población compuesta por los
individuos postulados como híbridos, presenta valores intermedios respecto de los
parámetros de variación genética estudiados (A, Hd, He) y una mayor variabilidad
genética deducible de un porcentaje mayor de loci polimórfico en relación con las
poblaciones de L. sempervirens y L. philippiana. Todo lo anterior apoya la hipótesis de
hibridación natural entre las especies, ya que concuerda el principio de intermediación
de los caracteres. Sin embargo, este grupo de supuesta naturaleza híbrida posee una
marcada similaridad genética con las poblaciones de L. sempervirens, superior a la
observada con las poblaciones de L. philippiana, evidenciando así un posible proceso de
introgresión hacia L. sempervirens, dada la mayor cercanía genética hacia esta especie y
teniendo presente que la diferencia del grupo de híbridos frente a las poblaciones de L.
sempervirens, es en dirección hacia L. philippiana. Todo apunta hacia el hecho que este
conjunto de individuos se trataría efectivamente de híbridos naturales L philippiana x
sempervirens, sin embargo, no corresponderían a híbridos de primera generación F1,
sino más bien a un grupo de individuos introgresantes hacia L. sempervirens, al poseer
un acervo genético más similar a ésta.
79
4.4
Elementos de coherencia con los principios de hibridación.
A razón de las abundantes evidencias de la condición de intermedios entre L.
sempervirens y L. philippiana, que manifiestan los individuos presuntos híbridos, se
deduce que el grupo en cuestión estaría comprobando la hipótesis de hibridación entre
las especies, ya que el principio de intermediación se cumple a cabalidad en la mayoría
de los individuos para los análisis de morfología foliar, mediante los métodos gráficos
(pares de coeficientes, diagramas de dispersión), métodos numéricos (índice de
hibridación), métodos de análisis estadístico (de clusters y factorial por componentes
principales). Asimismo, el estudio de compuestos químicos secundarios foliares, detecta
la misma tendencia en términos de intermediación de los híbridos. Por último, respecto
de los parámetros de variación genética calculados, los valores de heterocigocis no
hacen otra cosa que corroborar la condición intermedia del grupo de híbridos y
corroboran el mayor grado de variabilidad que éstos presentan, probablemente producto
de la interacción de los acervos genéticos de ambas especies.
Pese al cúmulo de pruebas de intermediación en estos híbridos, es necesario
recordar algunos de los requisitos necesarios para la ocurrencia de la hibridación. Se
observa que este grupo correspondería a un ejemplo de quiebre en los mecanismos de
aislamiento precigóticos entre las especies en cuestión, ya que, como se ha mencionado,
ellas comparten un área importante de sus distribuciones geográficas, sin embargo,
ocurren en forma natural en sitios generalmente disyuntos. El área de Llancahue sería un
ejemplo en el cual confluyen o se encuentran los requerimientos altitudinales de ambas
especies, al conformar una situación de altitudes medias de la Cordillera de la Costa en
la Provincia de Valdivia, lo cual implica que el aislamiento geográfico y ecológico entre
ambas especies se vería vulnerado, favoreciendo el contacto.
Respecto de las eventuales barreras producto de diferencias en los agentes
polinizadores, y ante la inexistencia de mayores antecedentes al respecto, es posible
aventurar que ambas especies poseen un grupo común de agentes polinizadores
buscadores de néctar, ya que las glándulas que sustentan dicho recurso se hallan
presentes en las dos especies.
80
Por otro lado, la separación o aislamiento temporal que habría entre las especies,
dado por diferencias en los períodos de floración es relativo, según observaciones del
autor al respecto, presentadas en el cuadro 22. Mientras que durante el año 1997 no se
registró una sincronía conspicua en los períodos de floración, ésta si se logró observar en
las temporadas 1996 y 1998. El suficiente número de días en los cuales se presentaron
flores de ambas especies en sus diferentes estados de madurez en 1998, hace suponer
que esta barrera de aislamiento precigótico no es absoluta, y probablemente se dé como
respuesta a una conjugación de factores climáticos inusuales, determinando que en
algunas temporadas exista un suficiente número de días hábiles para la ocurrencia de una
polinización entre las especies en cuestión.
CUADRO 22. Representación del número de días observados con presencia de flores
maduras en L. philippiana (en gris oscuro) y L. sempervirens (en gris claro), para las
temporadas 1996 a 1998 en el área de Valdivia.
Año
1996
1997
1998
Agosto
Septiembre
Octubre
21
Días
Noviembre comunes
3
23
3
8
29
11
0
6
7
25
8
18
Los requerimientos de sitio para la progenie híbrida, en el área de estudio,
pudieron verse favorecidos por los diversos niveles de alteración del área, ya existiendo
antecedentes de uso con perturbación de las comunidades forestales del área,
probablemente desde los primeros años de la ciudad de Valdivia, en consideración a la
cercanía del área en cuestión con este centro urbano. Actualmente la zona se presenta
como un verdadero mosaico vegetacional en diferentes estados de desarrollo, hecho que
demuestra alteraciones en el pasado.
81
Todos estos antecedentes indicados, en conjunto con las evidencias de
intermediación morfológica presentadas en este estudio, apuntan al hecho de que el
conjunto de individuos con características intermedias entre L. sempervirens y L.
philippiana, representa efectivamente híbridos naturales entre las especies, es decir, L.
philippiana x sempervirens.
En ellos se pone de manifiesto una mayor variabilidad morfológica, química y
genética según el conjunto de resultados, advirtiéndose, además, ocurrencia de cierta
variación diferente, propia de los híbridos para ciertas características analizadas de
morfología y composición química foliares.
Todo indica que la naturaleza de estos híbridos no correspondería a un grupo de
individuos de primera generación, o F1, sino más bien las evidencias apuntan a que se
trataría de un grupo resultante tras hibridación introgresiva hacia L. sempervirens, como
señalan las múltiples pruebas de una mayor cercanía relativa hacia esta especie.
82
5. CONCLUSIONES
Existen características que permiten diferenciar las especies L. sempervirens y L.
philippiana, en función de la morfología foliar, composición química y variación
isoenzimática.
En consideración a las características presentadas por las especies en Llancahue,
las poblaciones de L. sempervirens y L. philippiana de esta área no presentan diferencias
substanciales con respecto a las poblaciones de ambas especies en las áreas de
crecimiento exclusivo de cada una en Paillaco y Puyehue, respectivamente.
Existe un grupo de individuos con características de morfología foliar, químicos
y variación genética que los indican como intermedios entre L. sempervirens y L.
philippiana.
Las características foliares de mayor utilidad en la segregación de las especies
estudiadas, y que a la vez permiten detectar individuos con características intermedias
son la forma del aserrado, la forma de las células de la epidermis inferior de las hojas, la
pilosidad de las yemas foliares, el número de nervaduras secundarias de la lámina, el
número de dientes del margen de la lámina y la forma del ápice de la hoja.
Los individuos de características morfológicas intermedias presentaron una
variabilidad genética mayor al de las especies padre, a juzgar por el porcentaje de loci
polimórficos observado, en tanto que mostraron intermediación en los parámetros de
variación genética de número medio de alelos por locus y grado medio de heterocigocis,
al compararlos con los valores de las poblaciones de especies puras a nivel poblacional.
El grupo de individuos intermedios corresponden a híbridos entre las especies
estudiadas, en función de las evidencias morfológicas, químicas y genéticas, y las
condiciones ecológicas del área donde ellas se desarrollan, comprobándose la hipótesis
de la presente tesis.
83
El conjunto de híbridos L. philippiana x sempervirens, a la luz de los
antecedentes arrojados por el estudio, estaría conformado por individuos resultantes de
un proceso de hibridación introgresiva hacia L. sempervirens.
84
6. RESUMEN
Con el objeto de investigar la hipótesis de hibridación natural entre las especies
arbóreas nativas laurel (Laurelia sempervirens [R.
ET
P.] TUL.) y tepa (L. philippiana
LOOSER o Laureliopsis philippiana [LOOSER] SCHODDE), se estudió una población de
individuos presumiblemente híbridos, una población de laurel y otra de tepa, las tres
ubicadas contiguamente en un área al sureste de la ciudad de Valdivia. Se incluyó en el
estudio una población natural aislada de laurel, ubicada en la comuna de Paillaco y otra
de tepa, en el Parque Nacional Puyehue. Para cada población, conformada en promedio
por 30 individuos, se analizó la variación isoenzimática mediante electroforesis de gel de
almidón, considerando 18 loci isoenzimáticos; la variación de compuestos secundarios
de las hojas mediante cromatografía en placa fina de celulosa, y la variación de 21
características foliares anatómicas y morfológicas estudiadas a partir de observación
directa. Los resultados concluyen en la ocurrencia de hibridación natural entre estas
especies, probablemente con procesos de introgresión hacia L. sempervirens.
SUMMARY
An assessment for hypothesis of natural hybridization between Chilean native
tree species laurel (Laurelia sempervirens [R.
ET
P.] TUL.) and tepa (L. philippiana
LOOSER or Laureliopsis philippiana [LOOSER ] SCHODDE) was carried out through a
research of natural populations of laurel, tepa and a supposedly hybrid one, located close
to each other, in an area at southeast from Valdivia city. It also was included a
genetically isolated natural population of laurel species at Paillaco, and other one from
tepa species, at Puyehue National Park. For each population, constituted by 30
individuals as average, its isozyme variation was analyzed by means of starch gel
electrophoresis considering 18 isozyme loci. Its leaf secondary compounds were
investigated through thin-layer cellulose chromatography and the leaf morphology
variation was studied from 21 leaf anatomy and morphological traits. Results concludes
in the occurrence of natural hybridization between studied species, probably with
introgressive processes towards L. sempervirens.
85
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93
APÉNDICES
APÉNDICE 1
COEFICIENTES MEDIOS DE MORFOLOGÍA FOLIAR
POR INDIVIDUO
1) Coeficientes medios de morfología foliar en población de L. sempervirens de Llancahue.
Árbol
1S03
1S04
1S05
1S06
1S07
1S08
1S09
1S10
1S11
1S12
1S13
1S14
1S15
1S16
1S17
1S18
1S19
1S20
1S21
1S22
1S23
1S24
1S25
1S26
1S27
1S28
1S29
1S30
3S01
3S02
3S03
ang a ang b
127.50 80.94
110.31 61.25
101.88 58.13
123.75 91.25
136.25 65.31
106.88 82.50
118.75 61.25
111.88 70.31
127.81 66.88
110.63 70.63
101.88 59.38
143.13 71.88
127.50 65.00
128.13 71.00
99.06 59.06
124.38 52.50
100.63 56.25
126.25 71.88
129.38 78.75
126.56 68.44
104.38 60.63
116.88 66.88
123.75 91.25
93.75 75.00
93.75 62.19
130.63 66.88
157.50 96.25
152.50 72.81
123.13 76.88
85.63 69.38
95.63 68.13
as
23.06
24.31
16.75
19.13
20.94
20.75
22.06
21.50
16.19
20.25
16.75
27.63
23.69
18.81
21.25
21.19
20.06
23.75
19.25
15.19
18.00
19.13
19.13
25.94
24.94
23.81
29.31
23.13
21.94
17.88
22.81
n
12.13
11.81
12.50
10.81
13.50
14.38
14.75
13.63
11.38
12.44
12.50
12.38
15.13
11.88
12.81
10.50
13.44
13.69
12.63
12.06
13.25
13.88
10.81
16.06
13.56
13.50
14.94
14.31
16.75
12.63
16.31
a/T
0.41
0.39
0.33
0.46
0.39
0.43
0.41
0.40
0.39
0.43
0.33
0.38
0.40
0.43
0.38
0.39
0.37
0.42
0.46
0.37
0.40
0.42
0.46
0.39
0.38
0.44
0.45
0.44
0.44
0.37
0.42
l/T
0.90
0.90
0.89
0.90
0.91
0.92
0.93
0.91
0.87
0.91
0.90
0.90
0.92
0.91
0.90
0.92
0.92
0.91
0.90
0.90
0.88
0.87
0.90
0.88
0.89
0.87
0.89
0.89
0.91
0.91
0.92
l/p
8.83
9.80
8.94
9.34
10.69
13.06
14.30
9.96
6.73
10.71
9.28
10.02
12.62
10.38
9.95
11.78
11.37
10.49
9.48
9.20
7.91
7.24
9.34
8.14
8.50
7.10
8.93
8.62
10.35
10.55
11.25
l/n
5.18
6.37
6.20
5.19
5.42
4.82
5.07
5.33
5.04
5.92
6.26
5.73
5.35
5.72
5.72
6.07
6.30
5.32
5.25
5.09
4.93
4.82
5.19
5.00
5.22
5.09
5.23
4.56
4.77
4.89
4.82
l/s
2.73
3.11
4.64
2.92
3.52
3.33
3.41
3.41
3.53
3.67
4.68
2.57
3.42
3.60
3.45
3.00
4.23
3.03
3.43
4.01
3.62
3.48
2.92
3.10
2.84
2.88
2.66
2.84
3.63
3.51
3.50
da/p
0.40
0.30
0.40
0.48
0.38
0.68
0.64
0.49
0.41
0.54
0.41
0.29
0.37
0.45
0.50
0.51
0.43
0.70
0.47
0.50
0.42
0.41
0.48
0.36
0.44
0.37
0.29
0.41
0.45
0.62
0.48
db/p
2.82
3.37
3.52
3.28
3.83
3.99
4.99
3.73
2.60
3.69
3.61
2.68
3.88
3.61
3.53
4.47
4.14
2.88
3.36
3.57
2.87
2.78
3.28
2.61
2.74
2.36
2.21
2.49
3.29
3.59
3.57
da/l
0.04
0.03
0.04
0.05
0.04
0.05
0.05
0.05
0.06
0.05
0.04
0.03
0.03
0.04
0.05
0.04
0.04
0.06
0.05
0.05
0.05
0.06
0.05
0.04
0.05
0.05
0.03
0.05
0.04
0.06
0.04
db/l
0.32
0.35
0.39
0.34
0.36
0.31
0.35
0.38
0.38
0.35
0.39
0.27
0.31
0.35
0.36
0.39
0.36
0.28
0.35
0.40
0.37
0.38
0.34
0.32
0.32
0.33
0.25
0.29
0.32
0.34
0.32
da/a
0.10
0.07
0.12
0.10
0.09
0.11
0.10
0.11
0.14
0.11
0.12
0.07
0.07
0.10
0.12
0.11
0.10
0.13
0.10
0.13
0.12
0.12
0.10
0.10
0.12
0.11
0.06
0.10
0.09
0.14
0.09
db/a Ss/Sn
0.71 1.93
0.80 2.07
1.08 1.35
0.67 1.79
0.85 1.57
0.67 1.45
0.80 1.51
0.86 1.58
0.87 1.44
0.75 1.63
1.08 1.35
0.65 2.24
0.71 1.58
0.75 1.61
0.85 1.67
0.95 2.04
0.91 1.50
0.60 1.76
0.69 1.55
0.96 1.27
0.83 1.37
0.80 1.40
0.67 1.79
0.72 1.62
0.75 1.85
0.66 1.78
0.50 1.97
0.59 1.62
0.66 1.32
0.82 1.43
0.70 1.40
ka Qas Qep Qtp Qpy
0.20
0
0
0
0
0.21
0
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0
0
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0
0
0
0
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0
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0
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0
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0
0.18
0
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0
0
0.21
0
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0
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0
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0
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0
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0
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0
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0
0
0.16
0
0
0
0
0.18
0
0
0
0
2) Coeficientes medios de morfología foliar en población de L. sempervirens de Paillaco.
Árbol
5S03
5S04
5S05
5S06
5S07
5S08
5S09
5S10
5S11
5S12
5S13
5S14
5S15
5S16
5S17
5S18
5S19
5S20
5S21
5S22
5S23
5S24
5S25
5S26
5S27
5S28
5S29
5S30
5S31
5S32
5S33
ang a ang b
96.88 63.13
123.44 79.38
104.38 107.50
109.69 75.31
120.63 83.44
133.75 74.38
74.06 63.13
106.25 74.38
123.13 68.75
114.69 67.50
86.25 87.50
143.75 83.13
98.13 80.31
123.13 76.88
83.13 69.38
95.63 68.13
83.13 67.50
111.25 70.94
81.25 60.00
125.63 63.75
141.88 57.81
128.44 58.44
131.25 65.31
141.25 76.56
85.31 67.19
82.81 58.13
146.88 60.00
111.88 71.88
99.69 74.06
83.44 72.19
98.13 70.31
as
20.50
21.75
22.44
20.25
20.38
23.19
23.19
16.50
22.56
23.06
20.00
22.69
24.44
21.94
17.88
22.81
19.50
20.63
19.00
18.44
21.38
23.00
19.19
23.69
22.88
18.38
22.19
19.56
22.88
22.00
19.56
n
12.00
13.69
12.00
10.88
13.75
14.75
13.00
13.13
17.13
13.75
15.00
15.44
15.25
16.75
12.50
16.31
13.44
13.56
12.69
11.56
12.63
14.19
12.31
15.38
15.31
14.56
15.69
15.25
14.81
14.69
12.38
a/T
0.43
0.43
0.38
0.45
0.44
0.45
0.39
0.44
0.41
0.42
0.44
0.51
0.49
0.44
0.37
0.42
0.36
0.42
0.31
0.35
0.40
0.39
0.36
0.37
0.39
0.36
0.37
0.43
0.42
0.40
0.40
l/T
0.90
0.90
0.92
0.90
0.91
0.90
0.92
0.92
0.92
0.90
0.94
0.90
0.93
0.91
0.91
0.92
0.90
0.91
0.89
0.91
0.90
0.91
0.92
0.92
0.92
0.91
0.92
0.92
0.93
0.93
0.91
l/p
9.17
9.69
11.94
9.59
11.63
9.41
11.13
12.59
11.99
9.88
16.01
9.46
15.29
10.35
10.55
11.25
8.99
10.48
8.78
10.18
9.99
9.92
11.01
11.98
12.58
10.92
11.62
12.45
13.96
13.43
12.19
l/n
5.93
5.07
5.52
5.89
4.74
4.98
7.07
5.98
4.83
5.13
5.08
4.52
5.31
4.77
4.95
4.82
6.38
4.39
5.23
5.53
4.48
4.69
5.14
4.71
4.42
5.20
3.78
4.74
4.52
5.06
5.82
l/s
3.46
3.19
2.97
3.16
3.18
3.19
3.97
4.68
3.65
3.04
3.83
3.06
3.30
3.63
3.51
3.50
4.36
2.83
3.50
3.52
2.63
2.90
3.35
3.01
2.97
4.09
2.66
3.65
2.93
3.38
3.70
da/p
0.32
0.51
0.46
0.44
0.52
0.44
0.50
0.87
0.55
0.52
1.02
0.50
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0.60
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0.54
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0.65
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0.71
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0.85
0.76
0.86
0.74
db/p
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2.75
3.40
3.18
3.42
2.40
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3.57
3.20
3.15
4.09
2.66
4.34
3.29
3.59
3.57
3.01
3.32
2.82
3.03
3.51
2.91
3.01
2.75
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3.80
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3.63
3.97
3.43
4.07
da/l
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0.05
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0.06
db/l
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da/a
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db/a Ss/Sn
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0.77 1.74
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0.58 1.50
0.87 1.27
0.73 1.43
0.62 1.31
0.63 1.55
0.59 1.51
0.77 1.60
ka Qas Qep Qtp Qpy
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3) Coeficientes medios de morfología foliar en población de L. philippiana de Llancahue.
Árbol
2P01
2P02
2P03
2P04
2P05
2P06
2P07
2P08
2P10
2P11
2P12
2P13
2P14
2P15
2P16
2P17
2P18
2P19
2P20
2P21
2P22
2P23
2P24
2P25
2P26
2P27
2P28
2P29
2P30
ang a ang b
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45.31 47.19
69.06 66.25
73.44 61.56
79.38 61.88
64.69 45.00
66.56 66.88
59.06 66.88
57.19 64.69
58.75 49.69
45.31 47.19
65.94 74.06
58.13 69.69
62.19 68.13
57.81 65.63
51.25 55.31
88.75 78.75
59.06 57.19
66.25 70.00
53.75 62.50
69.38 75.00
63.13 82.50
65.31 56.56
67.50 59.38
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76.88 62.50
55.94 67.50
62.50 67.19
72.81 65.00
as
40.00
45.31
31.69
39.44
35.19
28.75
40.00
42.75
36.81
33.00
45.31
35.19
47.50
41.25
34.81
36.50
36.25
37.13
42.50
37.50
41.50
44.56
36.06
42.69
43.19
36.38
40.81
38.44
36.25
n
25.56
22.56
24.50
24.13
24.69
20.69
25.56
25.75
24.63
19.63
22.56
25.31
24.88
26.38
20.25
26.00
22.25
23.56
24.69
21.88
25.31
26.63
22.88
25.63
26.75
23.88
24.56
20.88
20.69
a/T
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0.39
0.38
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0.30
0.43
0.41
0.43
0.40
0.35
0.47
0.37
0.41
0.39
0.40
0.40
0.37
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0.46
0.40
0.39
0.36
0.43
l/T
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0.94
0.93
0.94
0.94
0.94
0.95
0.95
0.94
0.93
0.94
0.94
0.94
0.94
0.94
0.94
0.93
0.94
0.94
0.95
0.94
0.94
0.94
0.94
0.94
0.94
0.94
0.94
0.95
l/p
20.62
16.96
14.24
15.85
16.38
18.52
20.62
18.88
16.78
15.20
16.96
15.27
15.40
16.00
15.38
15.07
14.80
16.09
14.74
17.75
15.29
16.60
16.74
17.14
16.81
15.73
17.75
15.75
17.80
l/n
3.95
4.18
4.20
4.47
3.77
4.20
3.95
4.46
4.62
4.89
4.18
3.77
4.20
3.90
3.87
3.81
3.80
3.34
4.17
4.60
3.62
3.72
4.60
4.47
3.84
4.12
4.43
4.91
4.69
l/s
2.48
2.06
3.24
2.76
2.64
3.00
2.48
2.69
3.07
2.91
2.06
2.72
2.18
2.51
2.23
2.71
2.36
2.14
2.42
2.71
2.23
2.21
2.91
2.68
2.40
2.72
2.69
2.66
2.68
da/p
1.81
1.24
1.23
1.01
1.13
1.65
1.81
1.45
1.81
1.28
1.24
1.80
1.17
1.24
1.72
1.40
1.08
1.38
1.14
1.40
1.23
1.01
1.28
1.39
1.33
1.18
1.37
1.14
1.47
db/p
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3.11
4.67
4.63
5.10
6.28
4.94
5.29
4.93
4.86
3.11
4.53
4.14
4.44
4.56
4.84
4.94
4.55
3.80
5.21
4.25
4.06
5.64
4.83
3.95
4.98
4.67
4.16
5.00
da/l
0.09
0.07
0.09
0.06
0.07
0.09
0.09
0.08
0.11
0.09
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0.08
0.08
0.11
0.09
0.07
0.08
0.08
0.08
0.08
0.06
0.08
0.08
0.08
0.07
0.08
0.07
0.08
db/l
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0.19
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0.32
0.33
0.25
0.28
0.30
0.32
0.19
0.30
0.27
0.29
0.30
0.32
0.34
0.28
0.26
0.29
0.28
0.25
0.34
0.28
0.23
0.32
0.27
0.27
0.28
da/a
0.20
0.23
0.20
0.16
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0.22
0.20
0.19
0.27
0.24
0.23
0.26
0.18
0.17
0.27
0.25
0.14
0.21
0.18
0.19
0.19
0.15
0.20
0.21
0.16
0.17
0.19
0.19
0.18
db/a Ss/Sn
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0.59 2.03
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0.56 1.60
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0.59 2.03
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0.62 1.57
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0.88 1.41
0.66 1.63
0.72 1.59
0.59 1.73
0.70 1.72
0.66 1.66
0.58 1.68
0.88 1.58
0.70 1.67
0.48 1.62
0.75 1.53
0.65 1.66
0.69 1.85
0.63 1.75
ka Qas Qep Qtp Qpy
0.17
1
1
1
1
0.19
1
1
1
1
0.14
1
1
1
1
0.14
1
1
1
1
0.15
1
1
1
1
0.23
1
1
1
1
0.17
1
1
1
1
0.17
1
1
1
1
0.18
1
1
1
1
0.20
1
1
1
1
0.19
1
1
1
1
0.16
1
1
1
1
0.20
1
1
1
1
0.20
1
1
1
1
0.17
1
1
1
1
0.16
1
1
1
1
0.16
1
1
1
1
0.20
1
1
1
1
0.17
1
1
1
1
0.20
1
1
1
1
0.17
1
1
1
1
0.17
1
1
1
1
0.19
1
1
1
1
0.17
1
1
1
1
0.19
1
1
1
1
0.14
1
1
1
1
0.18
1
1
1
1
0.16
1
1
1
1
0.20
1
1
1
1
4) Coeficientes medios de morfología foliar en población de L. philippiana de Puyehue.
Árbol
6P03
6P04
6P05
6P06
6P07
6P08
6P09
6P10
6P11
6P12
6P13
6P14
6P15
6P16
6P17
6P18
6P19
6P20
6P21
6P22
6P23
6P24
6P25
6P26
6P27
6P28
6P29
6P30
6P31
6P32
6P33
ang a ang b
47.50 50.63
70.94 73.13
57.50 52.50
55.31 58.75
60.63 53.13
61.25 61.56
62.50 54.38
66.25 57.19
55.63 58.44
64.38 63.75
72.50 61.56
44.69 53.44
64.38 63.75
57.19 54.69
82.50 68.75
61.25 62.19
55.00 44.69
62.81 61.88
52.50 52.19
74.06 58.75
69.69 57.19
61.88 61.56
61.88 53.75
48.13 46.88
65.31 68.75
61.25 66.56
54.69 71.56
71.88 52.19
69.06 49.06
83.13 53.75
51.88 44.06
as
35.38
38.44
35.56
34.56
44.75
30.81
33.69
36.75
34.81
47.81
33.13
39.25
47.81
39.50
29.81
37.00
35.19
31.19
34.25
30.44
40.69
34.44
29.13
36.56
44.19
47.19
35.56
28.56
27.56
29.94
28.69
n
26.19
24.31
24.25
22.06
25.25
18.63
21.19
20.63
22.06
22.19
22.81
21.94
22.19
20.56
19.88
20.38
20.44
20.81
19.88
20.19
22.88
19.44
23.56
22.19
19.50
21.38
24.25
20.25
19.56
19.31
20.25
a/T
0.31
0.40
0.36
0.39
0.33
0.40
0.34
0.39
0.36
0.40
0.41
0.32
0.40
0.38
0.46
0.36
0.32
0.36
0.35
0.34
0.36
0.40
0.34
0.30
0.39
0.40
0.37
0.32
0.34
0.38
0.37
l/T
0.92
0.91
0.93
0.94
0.94
0.93
0.93
0.92
0.93
0.94
0.94
0.93
0.94
0.95
0.93
0.93
0.95
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0.93
0.92
0.91
0.94
0.93
0.93
0.92
0.93
0.91
0.94
l/p
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11.42
13.15
15.54
16.17
13.67
13.19
12.60
14.29
17.61
15.98
14.39
17.61
18.67
13.06
13.75
18.49
12.76
14.12
11.74
16.61
13.05
11.85
11.03
16.41
14.81
14.86
12.15
13.03
10.33
18.20
l/n
3.84
2.94
3.52
3.88
3.64
3.91
3.87
3.74
3.74
4.67
3.57
4.17
4.67
4.42
4.05
4.61
4.65
4.60
4.08
4.13
4.09
4.31
3.60
3.98
4.71
5.42
4.15
3.34
3.63
3.65
4.24
l/s
2.83
1.85
2.39
2.48
2.06
2.37
2.44
2.09
2.34
2.17
2.49
2.35
2.17
2.30
2.72
2.55
2.70
3.11
2.44
2.75
2.30
2.45
2.89
2.41
2.08
2.46
2.85
2.38
2.60
2.38
2.98
da/p
1.18
1.01
1.44
1.26
1.19
1.34
1.04
1.20
1.31
1.36
1.33
1.26
1.36
1.50
1.13
1.14
1.36
1.52
1.40
0.93
0.75
1.37
1.05
1.16
1.24
1.20
1.75
1.05
1.14
0.84
1.38
db/p
3.86
2.57
4.23
3.95
4.18
3.96
4.11
3.63
3.73
4.33
4.41
3.62
4.33
4.66
4.34
3.40
5.23
4.00
3.81
3.80
4.43
3.82
3.70
3.05
3.33
3.57
4.08
4.84
5.24
3.91
6.28
da/l
0.09
0.09
0.11
0.08
0.07
0.10
0.08
0.10
0.09
0.08
0.08
0.09
0.08
0.07
0.09
0.08
0.07
0.12
0.10
0.08
0.04
0.10
0.09
0.11
0.08
0.08
0.12
0.09
0.09
0.08
0.07
db/l
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0.23
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0.26
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0.25
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0.32
0.27
0.30
0.31
0.28
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0.40
0.38
0.34
da/a
0.28
0.20
0.29
0.20
0.21
0.23
0.21
0.23
0.24
0.19
0.19
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0.19
0.19
0.18
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0.22
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0.33
0.18
0.19
0.30
0.26
0.24
0.20
0.19
db/a Ss/Sn
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0.69 1.59
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0.62 1.46
0.76 1.79
0.59 2.18
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0.68 1.50
0.65 1.82
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0.81 1.50
0.74 1.73
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0.71 1.78
0.69 1.77
0.85 1.26
0.87 1.66
0.49 2.27
0.57 2.22
0.70 1.47
1.16 1.42
1.11 1.42
0.93 1.56
0.88 1.43
ka Qas Qep Qtp Qpy
0.16
1
1
1
1
0.14
1
1
1
1
0.17
1
1
1
1
0.18
1
1
1
1
0.16
1
1
1
1
0.16
1
1
1
1
0.19
1
1
1
1
0.18
1
1
1
1
0.18
1
1
1
1
0.17
1
1
1
1
0.14
1
1
1
1
0.16
1
1
1
1
0.17
1
1
1
1
0.17
1
1
1
1
0.15
1
1
1
1
0.17
1
1
1
1
0.16
1
1
1
1
0.14
1
1
1
1
0.20
1
1
1
1
0.14
1
1
1
1
0.14
1
1
1
1
0.16
1
1
1
1
0.14
1
1
1
1
0.14
1
1
1
1
0.15
1
1
1
1
0.16
1
1
1
1
0.17
1
1
1
1
0.14
1
1
1
1
0.14
1
1
1
1
0.12
1
1
1
1
0.16
1
1
1
1
5) Coeficientes medios de morfología foliar en grupo de L. philippiana x sempervirens de Llancahue.
Árbol
1N01
1N04
1N05
1N06
1N07
1N08
2N01
2N02
2N03
2N04
2N05
2N06
2N07
2N08
2N09
2N10
2N11
2N12
2N13
2N14
2N15
2N16
2N17
2N18
3N01
3N02
3N03
3N05
3N06
ang a ang b
112.19 77.19
55.63 69.69
91.25 74.06
107.19 58.13
89.38 55.63
85.63 73.13
100.31 73.44
105.94 71.88
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69.38 68.75
69.38 77.81
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110.63 70.94
78.13 70.00
82.19 74.69
60.00 60.63
50.31 52.50
65.63 71.25
81.56 72.50
103.13 72.81
85.31 69.38
83.75 52.19
80.94 72.81
69.69 65.63
74.06 61.88
77.50 57.19
85.00 67.81
as
37.69
29.19
18.44
21.25
19.88
26.81
26.94
28.13
32.25
28.75
34.06
23.31
27.88
26.38
28.13
26.75
30.88
23.25
25.81
28.31
21.06
28.88
30.63
24.00
28.94
30.88
25.75
30.44
30.00
n
16.38
22.50
14.13
15.75
13.38
19.63
20.44
19.63
18.31
18.63
15.63
17.25
15.44
16.63
17.38
16.63
19.50
19.38
17.31
18.06
19.13
17.13
19.44
14.38
21.50
22.19
19.63
16.06
15.75
a/T
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0.39
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0.39
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0.47
0.44
0.45
0.50
0.50
0.43
0.43
0.47
0.46
0.44
0.47
0.37
0.39
0.42
0.47
0.46
0.43
0.36
0.43
0.43
0.42
0.41
0.45
l/T
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0.92
0.90
0.90
0.89
0.93
0.92
0.93
0.93
0.94
0.93
0.92
0.94
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0.91
0.92
0.92
0.91
0.94
0.94
0.94
0.92
0.92
0.93
0.92
0.93
0.93
0.94
0.92
l/p
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11.97
9.54
9.54
8.02
14.62
12.02
13.13
12.88
15.07
13.53
11.73
17.71
12.40
11.04
12.68
12.74
10.73
16.50
15.47
15.16
11.44
11.23
13.87
11.58
14.37
13.46
16.56
12.06
l/n
4.82
4.29
4.65
4.25
4.69
4.13
3.92
4.60
5.27
4.02
5.17
4.81
5.01
4.77
4.81
4.98
3.85
3.73
4.97
4.38
4.15
4.84
4.44
5.32
3.65
4.49
4.04
5.93
5.39
l/s
2.08
3.30
3.52
3.15
3.13
3.01
3.02
3.18
2.99
2.60
2.34
3.53
2.79
3.00
2.98
3.09
2.38
3.15
3.33
2.82
3.78
2.86
2.79
3.15
2.71
3.16
3.10
3.16
2.85
da/p
0.65
0.85
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0.66
0.56
1.17
0.89
0.59
0.88
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1.13
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1.25
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0.73
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0.79
1.12
1.19
1.21
1.27
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0.89
0.76
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0.95
0.94
0.83
0.74
db/p
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3.93
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4.20
3.28
4.43
4.04
4.01
3.60
3.88
3.40
4.01
5.07
3.81
3.17
4.21
4.21
4.26
5.69
3.94
5.12
3.72
3.31
4.39
3.55
4.22
4.21
5.38
4.05
da/l
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0.07
0.10
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0.07
0.08
0.07
0.05
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0.08
0.08
0.07
0.07
0.07
0.07
0.06
0.06
0.10
0.07
0.08
0.09
0.05
0.08
0.05
0.06
0.07
0.07
0.05
0.06
db/l
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0.36
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0.41
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0.31
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0.34
0.29
0.31
0.29
0.34
0.33
0.39
0.35
0.25
0.34
0.33
0.29
0.31
0.31
0.30
0.32
0.32
0.34
da/a
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0.16
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0.13
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0.17
0.17
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0.17
0.14
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0.15
0.15
0.12
0.13
db/a Ss/Sn
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0.78 1.32
0.70 1.32
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0.92 1.51
0.64 1.38
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0.50 1.56
0.47 2.20
0.72 1.38
0.64 1.84
0.62 1.61
0.59 1.63
0.71 1.63
0.65 1.62
0.97 1.21
0.84 1.50
0.57 1.58
0.68 1.11
0.65 1.70
0.63 1.62
0.81 1.70
0.66 1.36
0.67 1.44
0.70 1.32
0.75 1.90
0.70 1.98
ka Qas Qep Qtp Qpy
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0 0.5
0.25 0.5 0.5
0 0.5
0.23 0.5 0.5
0 0.5
0.25 0.5 0.5
0 0.5
0.23 0.5 0.5
0 0.5
0.22 0.5 0.5
0 0.5
0.23 0.5 0.5
0 0.5
0.19 0.5 0.5
0 0.5
0.23 0.5 0.5
0 0.5
0.27 0.5 0.5
0 0.5
0.25 0.5 0.5
0 0.5
0.25 0.5 0.5
0
0
0.23 0.5 0.5
0 0.5
0.24 0.5 0.5
0 0.5
0.20 0.5 0.5
0 0.5
0.22 0.5 0.5
0 0.0
0.20 0.5 0.5
0 0.5
0.22 0.5 0.5
0 0.5
0.24 0.5 0.5
0 0.5
0.17 0.5 0.5
0 0.5
0.22 0.5 0.5
0 0.5
0.22 0.5 0.5
0 0.5
0.20 0.5 0.5
0 0.5
0.21 0.5 0.5
0
0
0.19 0.5 0.5
0 0.5
0.25 0.5 0.5
0 0.5
0.22 0.5 0.5
0 0.5
0.19 0.5 0.5
0 0.5
0.23 0.5 0.5
0 0.5
APÉNDICE 2
CÁLCULO DEL ÍNDICE DE HIBRIDACIÓN
1) Puntajes de Índice de Hibridación en población de L. sempervirens de Llancahue.
Árbol
ang a
as
n
l/T
da/p
da/a
Qas
Qep
Qtp
IH
1S03
1S04
1S05
1S06
1S07
1S08
1S09
1S10
1S11
1S12
1S13
1S14
1S15
1S16
1S17
1S18
1S19
1S20
1S21
1S22
1S23
1S24
1S25
1S26
1S27
1S28
1S29
1S30
3S01
3S02
3S03
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2) Puntajes de Índice de Hibridación en población de L. sempervirens de Paillaco.
Árbol
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3) Puntajes de Índice de Hibridación en población de L. philippiana de Llancahue.
Árbol
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n
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da/a
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Qep
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IH
2P01
2P02
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10
4) Puntajes de Índice de Hibridación en población de L. philippiana de Puyehue.
Árbol
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10
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10
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7
10
5) Puntajes de Índice de Hibridación en grupo de híbridos L. philippiana x sempervirens
de Llancahue.
Árbol
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2N11
2N12
2N13
2N14
2N15
2N16
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0.5
0.5
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0.5
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3
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6
7
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3
5
2
5
7
7
5
3
APÉNDICE 3
CROMATOGRAMAS DE FLAVONOIDES
1) Cromatogramas de L. sempervirens de Llancahue.
a) 1S06
c) 1S21
b) 1S07
2) Cromatogramas de L. sempervirens de Paillaco.
a) 5S04
c) 5S29
b) 5S16
3) Cromatogramas de L. philippiana de Llancahue.
a) 2P04
c) 2P24
b) 2P12
4) Cromatogramas de L. philippiana de Puyehue.
a) 6P08
c) 6P27
b) 6P25
5) Cromatogramas de los presuntos híbridos L. philippiana x sempervirens (continúa).
a) 2N07
b) 2N09
c) 2N10
d) 2N11
5) Cromatogramas de los presuntos híbridos L. philippiana x sempervirens
(continuación)
e) 2N12
f) 2N13
g) 2N14
h) 2N15