Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de

INFORME FINAL:
“PRUEBAS BIOLÓGICAS PARA LA
EVALUACIÓN ECOTOXICOLOGICA
DE SUSTANCIAS QUIMICAS”
elaborado por:
La Universidad Autónoma Metropolitana y el
Instituto Nacional de Ecología
Octubre, 2005
1
I.- INTRODUCCIÓN
Antecedentes
Debido a la urgente necesidad de determinar el impacto que están ocasionando
los contaminantes en el ambiente, actualmente en México existe un interés
creciente por el desarrollo de un procedimiento estandarizado para la evaluación
ecotoxicológica de las sustancias. Esto exige el desarrollo de una serie de pruebas
biológicas (batería de bioensayos) para medir directamente los efectos tóxicos en
los organismos y en los ecosistemas.
Estos procedimientos han sido ampliamente utilizados desde hace varios años en
otros países, donde forman parte de su normatividad ambiental y su uso ha
significando avances importantes para la protección del ambiente. Contar con
estos procedimientos traería los mismos beneficios para México; sin embargo,
estas pruebas no pueden aplicarse tal cual se hace en esos países, ya que es
indispensable tomar en cuenta las características propias de nuestro país,
eligiendo a las especies más útiles de acuerdo a su representatividad ecológica y
considerando la infraestructura existente, así como los recursos humanos y
económicos que existen en México.
Justificación
El registro de nuevos plaguicidas, la aplicación de nuevas sustancias, la
caracterización de los residuos industriales, la evaluación de la contaminación por
emisiones, fugas, derrames y descargas, son ejemplos de las muchas actividades
que requieren de procedimientos estandarizados para medir los impactos que
ocasionan sobre los organismos y los ecosistemas. Actualmente dichas
actividades se regulan únicamente con análisis fisicoquímicos, que no son
capaces de medir los efectos biológicos. Por tal motivo, es importante
complementar dichos análisis con bioensayos de toxicidad para determinar los
efectos sobre los individuos, que puedan afectar a las poblaciones y los
ecosistemas en general. Con la realización de ambos tipos de pruebas se contará
2
con una visión más completa de los efectos adversos que se ocasionan sobre los
componentes bióticos y abióticos de los ecosistemas y se podrán tomar medidas
integrales para proteger el ambiente.
II. OBJETIVOS
Objetivo general
Formular una batería de pruebas biológicas de laboratorio para la evaluación
ecotoxicológica de las sustancias que sea aplicable en México.
Objetivos particulares
1) Llevar a cabo un censo a nivel nacional, a través de la aplicación de un
cuestionario, para la identificación de profesionales y laboratorios con
experiencia en el desarrollo de pruebas biológicas para la evaluación
ecotoxicológica de sustancias químicas.
2) Realizar una búsqueda amplia en la regulación ambiental de varios países
para identificar los bioensayos más empleados y las características que
debe reunir con relación a su representatividad ecológica (especies, niveles
tróficos
y
compartimentos
ambientales
considerados,
sensibilidad,
respuesta crítica para el ecosistema, etc.) e implementación en laboratorio
(cultivo y mantenimiento de organismos, desarrollo de la prueba, análisis de
resultados, control de calidad, costos, etc.). Así mismo, reunir la información
de la experiencia que se tenga en México a este respecto.
3) Establecer los criterios de selección de las pruebas. Estos deben incluir:
sensibilidad complementaria, evitar la redundancia entre las pruebas, tipos
de sustancias que pueden detectar, aceptación entre los sectores
involucrados en el cuidado del medio ambiente (gubernamental, industrial,
académico, etc.), limitaciones de tipo económico y de infraestructura para
su aplicación, etc.
3
4) Aplicando los criterios mencionados en el objetivo anterior, seleccionar las
pruebas que formarán parte de la Batería de Pruebas.
5) Establecer los criterios de interpretación de las pruebas seleccionadas.
III.- MATERIALES Y MÉTODO
Para la identificación de expertos en bioensayos a nivel nacional, primero
se diseñó una encuesta en la que además de los datos de contacto del
investigador, se solicitó información respecto a su experiencia en la realización de
bioensayos y otras técnicas asociadas a la realización de este tipo de estudios,
como son la determinación de contaminantes en diversas matrices ambientales y
la experiencia en el uso de biomarcadores de exposición y efecto. También se
preguntó acerca de la infraestructura de la que disponen en sus respectivas
instituciones, así como su disponibilidad para dar cursos de capacitación (ver
Anexo 1).
Esta encuesta fue distribuida a todos los socios de la Asociación
Mesoamericana de Ecotoxicología y Química Ambiental, A.C., (AMEQA) y a los
miembros de la lista de discusión ECOTOX. Asimismo, se les envío a los
investigadores que previamente habían asistido a alguna actividad organizada por
el INE o respondido a otra encuesta, de la misma institución, para expertos en
COPs. Posteriormente y aprovechando algunas actividades organizadas por el
INE, como el Foro Nacional de Investigación sobre Contaminantes Orgánicos
Persistentes, se distribuyó la encuesta más ampliamente. Algunos expertos se
incorporaron al proyecto ya en una etapa avanzada, al ser invitados por alguno de
los participantes.
Simultáneamente, se llevó a cabo un par de reuniones con aquellos
expertos que ya se tenían identificados, por su participación en el 1er Congreso de
la AMEQA. En estas reuniones se hizo una breve presentación del proyecto y los
expertos hablaron de su experiencia en el área de bioensayos; asimismo se
elaboró una primera lista de criterios de selección de pruebas que se distribuyó
4
por correo electrónico y que posteriormente se consideró para la propuesta de los
bioensayos.
Se llevó a cabo un Primer Taller de Expertos para la discusión de los
criterios de selección de bioensayos, así como para estudiar propuestas de
pruebas que coincidieran con estos criterios. Este taller tuvo verificativo el 30 de
Junio y 1º de Julio, en las instalaciones del Centro de Capacitación del Instituto
Mexicano de Tecnología del Agua (IMTA), en Jiutepec, Morelos. Los participantes
discutieron en grupo, las generalidades de los protocolos así como las especies
susceptibles de ser usadas; posteriormente se organizaron en tres grupos:
Ambientes Terrestres (suelo), Ambientes Dulceacuícolas (agua y sedimento) y
Ambientes Salobres y Marinos (agua y sedimento) y en cada uno se escogió un
coordinador, quien fue el encargado de organizar el avance y trabajo que se
presentaría en la siguiente reunión.
Un Segundo Taller de Expertos fue organizado el 28 y 29 de septiembre, en
la misma sede que el anterior, en el que se presentaron las primeras propuestas
de protocolos para bioensayos. Asimismo, se discutieron las fortalezas y
debilidades de lo alcanzado por el grupo hasta ese momento y se discutieron las
acciones necesarias para avanzar en la estandarización de una batería de
bioensayos para México. Por último, se planearon de manera general las
estrategias que deberán seguirse el próximo año para avanzar en la
estandarización.
IV.- ANÁLISIS DE RESULTADOS
Se
recibieron 30 cuestionarios con información de profesionistas de
distintas partes del país. De estos, dos fueron eliminados ya que se trataba de
personas cuya especialidad es la química ambiental, y no tenían experiencia en el
manejo de organismos en bioensayos (Anexo 2). Cabe destacar que la mayor
parte de los que respondieron a la encuesta colaboraron con este proyecto, así
como sus grupos de trabajo; adicionalmente colegas mexicanos y extranjeros
contribuyeron en los protocolos que se detallan más adelante.
5
Se llevaron a cabo dos reuniones preparatorias (enero y mayo) a las cuales
asistieron expertos en bioensayos identificados, ya sea por la información que se
recabo en los cuestionarios, o por su anterior participación en eventos de la
AMEQA, también asistió personal de CENICA y del INE. En estas reuniones se
explicó brevemente el presente proyecto haciendo énfasis en las necesidades que
tiene el sector gubernamental (SEMARNAT, INE, CNA) con respecto a
información ecotoxicológica. La M. en C. Yolanda Pica expuso la experiencia del
IMTA y otros laboratorios latinoamericanos en el proyecto WATERTOX, que como
resultado publicó el Manual “Ensayos toxicológicos y métodos de evaluación de
calidad de aguas”.
Posteriormente, las discusiones que se llevaron a cabo, se centraron en
tener bien claras las necesidades a las que la batería de bioensayos debería
responder, al requisito de identificar un mayor número de expertos y a enlistar los
Criterios de Selección de los Bioensayos (Anexo 3), los cuales fueron discutidos
en el Primer Taller.
Adicionalmente, se propuso recabar la información ecotoxicológica que se
ha generado en México, con sus organismos y sus condiciones ambientales,
haciendo particular énfasis en todo aquello que se ha publicado en la literatura gris
(informes de proyecto, tesis, etc.) y que es de difícil acceso. Para ello se trabajó en
la elaboración de un cuestionario (Anexo 4) pero, posteriormente se decidió dejar
este punto como un proyecto futuro que generará una base de datos de acceso
público que podría estar en la página de internet del INE y/o la AMEQA.
En el Primer Taller, los 22 expertos que estuvieron presentes discutieron
ampliamente los Criterios de Selección de los Bioensayos, lo que resultó en la lista
presentada en el anexo 3 la cual refleja la experiencia del grupo con respecto a lo
que hace que un bioensayo o una batería de estos sean técnicamente factibles y
científicamente válidos. Estos criterios fueron consideraros en la siguiente etapa
para la propuesta de todos y cada uno de los protocolos.
A continuación el grupo enlisto las especies o pruebas con las que a la
fecha ha trabajado de manera rutinaria y exitosa, así como aquellas que por su
importancia ecológica o por ser especies estándar en otros países pudieran
6
utilizarse en México, esto dió como resultado tres listas (una por cada ambiente)
de especies o pruebas candidatas. La lista de agua dulce incluyó 6 especies
fitoplanctónicas, 18 especies de zooplancton, 10 especies nectónicas, 15 especies
de hábitos bentónicos, 10 especies de plantas superiores y 2 especies bacterianas
(Anexo 5). La de ambientes marinos y salobres comprendió 5 especies
fitoplanctónicas, 8 especies de zooplancton, 4 especies nectónicas, 20 especies
de hábitos bentónicos y Vibrio fischeri (Anexo 6). El listado de ambientes terrestres
abarcó 5 pruebas de metabolismo microbiano, 5 especies o grupos de mesofauna,
11 especies de mono y dicotiledonias y 7 otras especies/pruebas microbianas
(Anexo 7).
Los listados pasaron por una segunda etapa de análisis en la que los
participantes acotaron el número de especies o pruebas aplicando los criterios
desarrollados con anterioridad, asimismo se acordó elaborar una guía para la
elaboración de los protocolos, de tal manera que todos incluyeran los mismos
puntos. Una vez elaborada, esta guía fue distribuida de manera electrónica.
En el segundo taller se presentaron los avances que a la fecha se tenía en
el desarrollo de los protocolos, con lo cual se pudo identificar aquellas áreas en las
que no se cuenta con experiencia dentro del grupo. Para subsanar esta debilidad
se sugirió que en un futuro se consiguiera la asesoría de expertos de otros países.
Asimismo, se reconoció que algunas especies/pruebas presentan potencial para
ser utilizadas no solamente en pruebas agudas, si no también en pruebas
subletales, por lo que se incluyen en este informe algunos de estos protocolos,
además se planteó que en un futuro sería adecuado invertir en el desarrollo de
éstas pruebas, así como de biomarcadores de exposición y efecto para especies
mexicanas.
A la fecha se tienen protocolos preliminares para ensayos de toxicidad
aguda con cladóceros y algas de agua dulce, así como con lombriz de tierra
(Anexo 8), que han sido desarrollados por distintos grupos de expertos; estos
tienen puntos en común, por lo que se plantea que será necesario trabajar en la
integración de estas propuestas para obtener un protocolo unificado para cada
7
grupo de organismos. Esto requerirá de trabajo de gabinete, pero también de
algunas pruebas prácticas, previo a la fase de estandarización.
Otros protocolos que se presentan en el anexo 8 de este informe incluyen:
•
Ensayo de toxicidad aguda con Allium cepa L., mediante la evaluación
de la inhibición del crecimiento promedio de raíces de cebolla.
•
Ensayo de toxicidad aguda (efectos letales y subletales) con Hydra
attenuata.
•
Ensayo de toxicidad aguda con semillas de lechuga (Lactuca sativa L.)
•
Prueba de
toxicidad aguda con Vibrio fischeri (Photobacterium
phosphoreum).
•
Ensayo de toxicidad con el nematodo Panagrellus redivivus.
•
Prueba de citotoxicidad aguda con celomocitos de lombriz de tierra
(Eisenia foetida)
•
Prueba de Germinación de semillas
•
Prueba de Ames por el método de microfluctuación modificado para
determinar genotoxicidad en compuestos químicos puros y muestras
ambientales
•
Bioensayo de la Actividad Deshidrogenasa
•
Bioensayo de Trifosfato de Adenosina (ATP)
•
Bioensayo de la Tasa de Mineralización del Nitrógeno
•
Prueba para evaluar los efectos de contaminantes en almeja Catarina
Argopecten ventricosus.
•
Bioensayos de toxicidad en camarones Peneidos
Debido a que se pretende tener como un producto final de este esfuerzo un
Manual de Pruebas Biológicas, se discutió que esto requerirá no solamente de
tiempo si no también de amplios recursos financieros, pues los materiales y
talleres que deben ser organizados para este fin pueden resultar costosos.
Asimismo, se adelantó en la definición de algunas secciones que el futuro Manual
deberá contener y que son comunes para todas las pruebas, como el lavado de
8
material, extracción de muestras, etc., y se acordó un mecanismo para su
desarrollo. En este informe se incluye el procedimiento para la generación de
extractos orgánicos y elutriados de suelos y sedimentos para su análisis en
pruebas de toxicidad (ver anexo 9).
V.- Conclusiones
1. La existencia de un cepario donde se mantenga y produzca organismos
de calidad conocida, es de importancia para asegurar que los
laboratorios puedan obtener especimenes en cualquier momento.
2. En México existe un número importante de especialistas en bioensayos
para ambientes dulceacuícolas.
3. En el caso de especies para las que se cuenta con más de un protocolo,
será necesario integrar las propuestas.
4. Hace falta comparar la sensibilidad de los peces de agua dulce
(Poecilidos) para los que ya se tienen protocolos con alguna(s)
especie(s) de importancia económica (Cichlidos nativos).
5. Las pruebas para suelo con enzimas de la microflora requieren ser
perfeccionadas.
6. Hace falta el desarrollo de protocolos con peces marinos.
7. Hace falta el desarrollo de protocolos con insectos, entre ellos los
polinizadores como las abejas.
8. Algunos grupos como los nematodos, cladoceros, oligoquetos etc.,
presentan un gran potencial para determinaciones subletales, por lo que
hace falta el desarrollo de estas pruebas (enzimas y biomarcadores).
9. La elaboración del Manual de pruebas biológicas para la evaluación
ecotoxicologica de sustancias químicas y muestras ambientales,
requiere de tiempo y amplios recursos financieros.
10. Debido a la limitada experiencia que se tiene en las pruebas de
genotoxicidad, así como en el manejo de suelos/sedimentos artificiales
es necesario conseguir la asesoría de expertos en el tema.
9
11. La información ecotoxicológica existente para México necesita ser
recopilada y analizada, para posteriormente armar una base de datos de
acceso público.
VI.- Recomendaciones
1. Apoyar adecuadamente la siguiente etapa de este proyecto, que es
la estandarización de el mayor número posible de protocolos
2. Conseguir las asesorías necesarias para subsanar las debilidades
identificadas.
3. Promover la existencia de un cepario donde se mantenga y produzca
organismos de calidad conocida.
4. Apoyar
el
desarrollo
de
pruebas
subletales,
así
como
de
biomarcadores de exposición y efecto.
5. Generar una base de datos de acceso público con la información
ecotoxicológica que se ha generado en México, con organismos
estándar y del país, así como en las condiciones ambientales
características del mismo.
10
ANEXO 1.
Formato para el Censo de
Expertos en Bioensayos
11
CUESTIONARIO
DATOS GENERALES
Nombre del investigador:
Institución
actualmente):
(donde
labora
Dependencia de adscripción:
Área o departamento:
Grupo de investigación:
Puesto del Investigador:
Dirección de la institución:
Teléfono:
Fax:
Dirección electrónica:
FORMACIÓN PROFESIONAL
Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
12
PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1.
2.
3.
4.
5.
PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1.
2.
3.
4.
5.
CAPACIDAD ANALÍTICA
Matrices ambientales que analiza:
Agua dulce
Agua Marina
Sedimentos
Suelos
Otros
Tipos de contaminantes que analiza:
Metales:
Plaguicidas:
Compuestos orgánicos:
Otros:
Pruebas biológicas que realiza:
Bioensayos con:
Biomarcadores en:
13
Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia):
Infraestructura con la que cuenta:
Equipo de laboratorio
Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no)
Compuestos de referencia certificados
Personal disponible
Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que
realiza
Nota: Favor de enviar el cuestionario debidamente llenado a la
Dra. Ania Mendoza Cantú
Jefe del Departamento de Desarrollo de Programas para el Manejo de Riesgos
Instituto Nacional de Ecología
A la cuenta de correo electrónico:
[email protected]
14
ANEXO 2.
Cuestionarios Contestados
15
1. Alba Martínez
2. Baqueiro Cárdenas
3. Barrera Escorcia
4. Betancourt Lozano
5. Corona Vadillo
6. Cueva Diaz
7. García Rico
8. Gold Bouchot
9. Guzmán García
10. Hansen Anne
11. Heyer Rodríguez
12. Madrigal Santillan
13. Martínez Jerónimo
14. Nandini Sarma
15. Nava Vera
16. Núñez Nogueira
17. Pica Granados
18. Ramírez Romero
19. Rendón von Osten
20. Robles Mendoza
21. Rodríguez Vazquez
22. Rubio León
23. Salazar Coria
24. Sarma S.
25. Sobrino Figueroa
26. Uribe Hernández
27. Vanegas
28. Zapata Pérez
16
CUESTIONARIO
DATOS GENERALES
Nombre del investigador:
Alejandro Federico Alva Martínez
Institución (donde labora actualmente): FES-Iztacala UNAM y UAM-Xochimilco
Dependencia de adscripción:
Área o departamento:
Zoología Acuática, UNAM
Ecología Microbiana UAM-X
Grupo de investigación:
Puesto del Investigador:
Estudiante de Doctorado
Dirección de la institución:
Teléfono:
56 23 11 25 UNAM
Fax:
55 49 55 92
Dirección electrónica:
[email protected]
[email protected]
FORMACIÓN PROFESIONAL
Licenciatura en Biología (enfoque hidrobiologico) UAM-X
Maestría en Ciencias (Biología de sistemas y recursos acuáticos) UNAM
Actualmente en curso
Doctorado en Ciencias Biológicas (Biomanipulación acuática) UAM falta tesis
Estudiante Licenciatura en Economía (2 semestre) SUA-UNAM
Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
En el IPN del 2000 al 2002 (Nivel vocacional) Cursos de Estrategias de solución
problemática ambiental y problemática ambiental, Carrera de Técnico en Ecología
En la UNAM
2003, 2004 (Nivel posgrado) Curso de limnología aplicada y
Biomanipulacion aplicada, Maestría en Ciencias.
Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
17
PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Biomanipulación
2.Eutroficación acuática efectos sobre la cadena trofica
3.
4.
5.
PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Alejandro Federico Alva-Martínez, S.S.S. Sarma & S. Nandini. Population
dynamics of rotifers (Rotifera) on mixed diets: a case study using Microcystis
aeruginosa Hidrobiologica. en prensa
2. Alejandro Federico Alva-Martínez, S.S.S. Sarma & S. Nandini. 2004. Population Growth
of Daphnia Pulex (Cladocera) on a Mixed Diet (Microcystis Aeruginosa with Chlorella or
Scenedesmus). Crustaceana 77(8): 973-988
3. Alejandro Federico Alva-Martínez, S.S.S. Sarma & S. Nandini. 2001. Comparative
population dynamics of three species of cladocera in relation to different levels of chlorella
vulgaris and microcystis aeruginosa Crustaceana 74(8): 749-764
4.
5.
CAPACIDAD ANALÍTICA
Matrices ambientales que analiza:
Agua dulce
Agua Marina
Sedimentos
Suelos
Otros
Tipos de contaminantes que analiza:
Metales:
Plaguicidas:
Compuestos orgánicos:
Microcystis spp
Otros:
Pruebas biológicas que realiza:
18
Bioensayos con:
rotíferos
Cladóceros
Algas
Anélidos
Biomarcadores en:
Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia):
Infraestructura con la que cuenta:
Equipo de laboratorio
Se cuenta con todo lo necesario para realizar ecotoxicologia
Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no)
Algas
Scenedesmus acutus certificada
Chlorella vulgaris
certificada
Cladóceros
6 especies
Rotíferos
5 especies
Anélidos
1 especie
Compuestos de referencia certificados
Personal disponible
Servidores sociales
Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza
Se puede capacitar siempre dependiendo de los tiempos disponibles de nuestra
parte
19
CUESTIONARIO
DATOS GENERALES
Nombre del investigador:
Dr. Erick Raúl Baqueiro Cárdenas
Institución (donde labora actualmente):
CICATA-IPN, Altamira
Dependencia de adscripción:
Instituto Politécnico Nacional
Área o departamento:
Recursos Bióticos
sustentable
y
Desarrollo
Grupo de investigación:
Puesto del Investigador:
Titular
Dirección de la institución:
Teléfono:
Km 14.5 Carr. Tampico
Industrial Altamira
833 264 9302
Fax:
833 260 0124
Dirección electrónica:
[email protected]
–
Pto.
FORMACIÓN PROFESIONAL
Licenciatura, en Biología Fac. Ciencias UNAM
Maestría Biología Fac. Ciencias UNAM
Doctorado Oceanografía Biológica Pesquera ICML, UNAM (No graduado)
Doctorado Ciencias Marinas CINVESTAV, Unidad Mérida (Graduado)
Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Laboratorio de Ecología experimental del CRIP, La Paz, Baja California, 1976 –
1986
Laboratorio de estudios básicos para Acuacultura CRIP, Lerma, Campeche,
1986 – 1999
CICATA-IPN, Altamira, tutor de tesis Maestria: Metales pesados en sedimentos
de las laguna costeras de Tamaulipas”, “Metales pesados en organismos de las
lagunas costeras de tamaulipas” y
Doctorado “Bioacumulación y
biomagnificación de organoclorados persistentes en el Ostión Crassostrea
virginica”
Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Participación en el programa internacional de calibración de Artemia salina
1979.
Bioensayos sobre tolerancia a diferente factores ambientales en moluscos
diversos de Baja California.y Península de Yucatán.
20
PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1.Bioacumulación y biomagnificación de organoclorados en el ostión
Crassostrea virginica
2.Metales pesados en organismos acuaticos y su biomagnificación en la
cadena trófica
3.
4.
5.
PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1.
2.
3.
4.
5.
CAPACIDAD ANALÍTICA
Matrices ambientales que analiza:
Agua dulce
Agua Marina
Pesticidas, orgánicos persistentes, metales pesados
Sedimentos
Pesticidas, orgánicos persistentes, metales pesados
Suelos
Organismos
Pesticidas, orgánicos persistentes, metales pesados
Tipos de contaminantes que analiza:
Metales:
Plomo, Cadmio, Níquel, Mercurio y Plata
Plaguicidas:
Aldrin, dieldrin, endrin, clordano, DDT, Heptacloro
toxafeno
Acrilonitrilo, benceno
Compuestos orgánicos:
Otros:
Pruebas biológicas que realiza:
Bioensayos con:
Daños histológicos en organismos marinos e impacto en el desarrollo gonádico
Biomarcadores en:
21
Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia):
Infraestructura con la que cuenta:
Equipo de laboratorio
Cromatografo de Gases Perkin Elmer con Detector de Captura de Elelectrones
(ECD) y Ionización de Flama (FID)
Cromatografo de Gases Hullet Packard (CG-HP)
Cromatografo de liquidos (CL-PE)
Espectometro de Emisión de Plansma (ICP-AES)
Analizador de Carbon orgánico total
Espectro fotómetro de luz infrarroja (Ir-sp)
Espectro fotómetro de luz ultra violeta (UV-sp)
Especrtro fotómetro de absorción atómica (AA-Hp)
Calorímetro diferencial
Campana Bacteriológica
Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no)
Compuestos de referencia certificados
Personal disponible
Estudiantes de posgrado
Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza
Pueden implementarse cursos, seminarios y prácticas según necesidades.
22
CUESTIONARIO
DATOS GENERALES
Nombre del investigador:
Guadalupe Barrera Escorcia
Institución (donde labora actualmente):
Universidad Autónoma Metropolitana
Dependencia de adscripción:
Iztapalapa
Área o departamento:
Grupo de investigación:
Área
Producción
Acuática,
Departamento Hidrobiología, División
CBS.
Ecotoxicología
Puesto del Investigador:
Profesor Titular C de tiempo completo
Dirección de la institución:
Teléfono:
Av. San rafael Atlixco 186, Col.
Vicentina, C.P. 09340, Iztapalapa,
D.F.
58 04 64 74
Fax:
58 04 47 38
Dirección electrónica:
[email protected]
FORMACIÓN PROFESIONAL
Biología, Fac. de Ciencias, UNAM.
Maestría en Ciencias Biológicas, Fac. de Ciencias, UNAM, con enfoque en
contaminación, tesis sobre calidad sanitaria en la Laguna de Tamiahua, Ver.
Actualmente terminando estudios de Doctorado en Ciencias Biológicas, UAM-I,
con tesis sobre efectos de metales (Cd y Cr) en ostión.
Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Profesora titular de la asignatura Alteración de Ecosistemas en la carrera de
Hidrobiología, anteriormente vinculada a cursos de Impacto Ambiental.
Actualmente involucrada en cursos de Biología General y Evolución.
Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Responsable en el proyecto: Toxicidad de cromo y cadmio en ostión
Crassostrea virginica de la laguna de Mandinga, Veracruz. Proyecto con apoyo
CONACYT de 1996 a 1999. Apoyo UAM de 1996 a 2002.
Actualmente colaboradora en el proyecto “Biomarcadores en organismos
acuáticos mexicanos para el monitoreo ambiental” y colaboradora en el
proyecto “Determinación del riesgo ecológico de un ambiente acuático.”
Proyecto Recientemente aprobado a través del programa PROMEP
23
PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Metales tóxicos, cadmio y cromo en ostión.
2. Efectos fisiológicos en ostión.
3. Biomarcadores (metalotioneinas y lipoperoxidación).
4. Bacterias con actividad toxigénica de importancia epidemiológica (Vibrio
cholerae).
5. Calidad sanitaria (coliformes, estreptococos, patógenos).
PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Barrera-Escorcia, G. e I. Wong-Chang. Mean lethal body concentration of
Cadmiun in Crassostrea virginica from a Mexican Tropical Coastal Lagoon.
Revista Internacional de Contaminación Ambiental. 21 (2) En prensa
2. Otras publicaciones anteriores están vinculadas a investigación sobre
calidad sanitaria y Vibrio cholerae
Barrera-Escorcia, G. y P. E. Namihira-Santillán. Contaminación microbiológica
en la zona costera de Akumal, Q. Roo, México. Hidrobiologica 14 (1): 27-35
3. Capítulos del libro: “Golfo de México: Contaminación e Impacto Ambiental.
Diagnóstico y tendencias.” Serie Científica 5. Universidad Autónoma de
Campeche, Centro EPOMEX:
1. Barrera, E.G. y CH.I. Wong. Contaminación por microorganismos en zonas
costeras.
2. Wong, CH,I. y E.G. Barrera. Implicaciones ecológicas de la contaminación
microbiológica en la zona costero marina.
3. Wong, CH.I. y E.G. Barrera. Niveles de contaminación microbiológica en el
Golfo de México.
4. Barrera E.G. y CH.I. Wong. Contaminación microbiológica en el Golfo de
México: Diagnóstico.
5. Guzmán G.X., E.G., Barrera y Ch.I. Wong. Efecto del almacenamiento en la
calidad sanitaria del ostión Crassostrea virginica (Gmelin) de la laguna de
Tamiahua, Veracruz.
4. Barrera-Escorcia, G. e I. Wong-Chang. Eutrofización y calidad del agua. En:
Arredondo-Figueroa J.L.: Limnología de Presas Mexicanas, en prensa a
editarse por la UAM-I.
5.
CAPACIDAD ANALÍTICA
Matrices ambientales que analiza:
Agua dulce
Agua Marina
Parámetros
fisicoquímicos,
contaminantes,
organismos
indicadores de referencia (cladóceros, bacterias).
Parámetros
fisicoquímicos,
contaminantes,
organismos
indicadores de referencia y del ambiente natural (moluscos,
bacterias).
Sedimentos
24
Suelos
Otros
Tipos de contaminantes que analiza:
Metales:
Cd Cr
Plaguicidas:
Compuestos orgánicos:
Otros:
Pruebas biológicas que realiza:
Bioensayos con:
Daphina magna, Crassostrea virginica
Biomarcadores en:
Crassostrea virginica
de tipo bioquímico: metalotioneinas, proteinas,
lipoperoxidación.
Respuestas de tipo fisiológico: integraciones simples: tasa de filtración, tasa
metabólica, radio O:N, asimilación, eficiencia de asimilación; respuestas
simples (consumo de alimento, exceción fecal, nitrogenada, respiración,
morfometría) e integraciones complejas (campo de crecimiento).
Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia):
Infraestructura con la que cuenta:
Equipo de laboratorio
Acuarios para mantenimiento de organismos en laboratorio en condiciones
controladas. Horno de microondas para digestión de muestras diversas,
procesador de tejidos desde inclusión hasta teñido, equipo diverso que incluye
autoclaves, campana de flujo laminar, campanas de extracción, centrífuga,
microcentrífuga,
centrífuga
refrigerada,
homogenizador
de
tejidos,
microscopios, analizador de oxígeno, salinómetro, laboratorio de campo Hach,
cámara de electroforesis, balanzas, y otros equipos menores.
Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no)
Durante algunos años se mantuvo la cepa toxigénica de Vibrio cholerae O1
peruana, ya que el proyecto entonces vigente evaluó la presencia de esta cepa,
tanto toxigénica como no toxigénica a través de métodos de cultivo
tradicionales y por anticuerpos fluorescentes.
Compuestos de referencia certificados
Personal disponible
25
El laboratorio cuenta actualmente con un ayudante cuya plaza tendrá solo
duración de un año. Solo puede obtenerse apoyo a través de proyectos que
involucren estudiantes que desarrollen tesis a nivel licenciatura y posgrado.
Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza
26
CUESTIONARIO
DATOS GENERALES
Nombre del investigador:
Institución
(donde
actualmente):
Dr. Miguel Betancourt Lozano
labora Centro de Investigación en Alimentación y
Desarrollo
Dependencia de adscripción:
Área o departamento:
Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo
Ambiental
Manejo Ambiental
Grupo de investigación:
Ecotoxicología
Puesto del Investigador:
Investigador Titular
Dirección de la institución:
Teléfono:
Av. Sábalo Cerritos, Estero del Yugo 82010,
Mazatlán, Sinaloa, México
669-9898700 ext.240
Fax:
669-9898701
Dirección electrónica:
[email protected]
FORMACIÓN PROFESIONAL
1988 – Licenciatura en Biología Marina – UABCS
1992 – Maestría en Ecología – CICIMAR, IPN
2000 – Doctor en Filosofía (ecotoxicología) – University of Stirling, Escocia, GB
Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Organización y participación de cursos-talleres:
2001 – Field methods in water and sediment ecotoxicology – theory and
practice.
2001 – Molecular tools in ecotoxicological research and environmental
impact assessment.
2003 – Numerical methods in ecotoxicology.
Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
1996-1998: Interactive effects between malathion and propiconazole in the
marine shrimp Penaeus vannamei, and its sublethal responses.
International Foundation for Science (IFS), Estocolmo, Suecia.
1998-2000: Susceptibilidad de Penaeus vannamei al efecto interactivo
27
entre plaguicidas e infecciones bacterianas y su relación con
componentes del sistema de defensa. CONACyT.
2001-2004: Efecto de la exposición a plaguicidas organofosforados en la
susceptibilidad de Litopenaeus vannamei a la infección experimental con
Vibrio parahaemolyticus. Una extrapolación al campo. CONACyT.
2001-2004: Evaluación ecotoxicológica de la contaminación por
plaguicidas y metales pesados en lagunas costeras de Sinaloa. CONACyT
PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Diseño e implementación de bioensayos para evaluar toxicidad de efluentes
y sedimentos estuarinos y marinos.
2. Utilización de biomarcadores fisiológicos y conductuales para evaluar efectos
de contaminantes en organismos estuarinos y marinos.
3. En colaboración con otros investigadores, utilización de biomarcadores
moleculares y bioquímicos para evaluar efectos de contaminantes en
organismos estuarinos y marinos.
4. Efecto interactivo entre procesos infecciosos patogénicos y contaminantes
ambientales en organismos cultivados.
5.
PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Roque A., D.J. S. Abad, M. Betancourt-Lozano, C. Chavez, B. Gomez-Gil,
A.L. Guerra-Flores, y F. Vargas-Albores. 2002. Evaluation of the susceptibility
of the shrimp Litopenaeus vannamei to vibriosis when exposed to agricultural
pesticides. Diseases in Asian Aquaculture IV
2. En prensa: Chemosphere: Roque A., Abad S., Garcia de la Parra L.M., Baird
D., Guerra-Flores AL, Gomez-Gil B., Betancourt-Lozano M. Evaluation of the
susceptibility of the cultured shrimp Litopenaeus vannamei to vibriosis when
orally exposed to methyl parathion .
3. Aceptada: Ecotoxicology and Environmental Safety: Comoglio, L., O. Amin,
A. Roque, M. Betancourt-Lozano, D. Anguas, and M. Haro. Evaluation of
sublethal biomarkers in Litopenaeus vannamei on foodborne exposure to
methyl parathion.
4. Enviada: Vitellogenin transcription and reproductive cycle in the white mullet
(Mugil curema) from two estuaries in Northwest Mexico. García-Gasca, A., J.
Ríos, R. Hernández, P. Estañol, H. Plascencia, L.M. García de la Parra, and M.
Betancourt-Lozano.
5. Enviada: Induction of morphological deformities in Litopenaeus vannamei
juveniles exposed to a triazole-derivative fungicide. Betancourt-Lozano M., D.J.
Baird, R. Sangha and F. González-Farias.
CAPACIDAD ANALÍTICA
Matrices ambientales que analiza:
28
Agua dulce
Plaguicidas y compuestos clorados
Agua Marina
Plaguicidas y compuestos clorados
Sedimentos
Plaguicidas y compuestos clorados
Suelos
Otros:
Organismos
Plaguicidas y compuestos clorados
Tipos de contaminantes que analiza:
Metales:
Plaguicidas:
Organofosforados y organoclorados
Compuestos orgánicos:
PCBs
Otros:
Pruebas biológicas que realiza:
Bioensayos con:
Crustáceos: Tisbe sp., Uca princeps y Litopenaeus vannamei
Moluscos: Mytella strigata y Crassostrea palmula
Biomarcadores en:
Genotoxicidad, GST, AChE, proteínas de estrés, vitelogenina, alteraciones
histológicas y morfológicas, crecimiento, tasa de alimentación y
respuestas conductuales
Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia):
Infraestructura con la que cuenta:
Equipo de laboratorio
Liofilizadora, cromatógrafos (ECD, FID, NPD), RapidVap, Soxhlet, bomba
peristáltica, cuarto refrigerado, refrigeradores, ultracongeladores,
centrífugas, lector de placas, microscopios y equipo de video.
Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no)
2 cuartos experimentales con agua de mar y dulce, aireación, fotoperiodo
y temperatura controlada.
Compuestos de referencia certificados
29
Personal disponible
1 técnico de cromatografía
Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza
Si hay disposición, aunque, como se puede apreciar, el apoyo técnico es
muy limitado, por lo cual el desarrollo de los bioensayos normalmente se
acopla a trabajos de tesis de estudiantes.
30
CUESTIONARIO
DATOS GENERALES
Diana Corona Vadillo
Universidad Nacional Autónoma de México
Institución (donde labora actualmente):
(UNAM)
Dependencia de adscripción: Instituto de Geografía
Laboratorio de Análisis Físicos y Químicos
Área o departamento:
del Ambiente
Cromatografía y Ecotoxicología terrestre.
Grupo de investigación:
---Puesto del Investigador:
2ª Circuito Exterior, Ciudad Universitaria,
A.P. 20-850 Coyoacán, México, D.F. C.P.
Dirección de la institución:
04510
56-22-30-22; 56-22-43-36
Teléfono:
56-22-43-52
Fax:
[email protected];
[email protected]
Dirección electrónica:
Nombre del investigador:
FORMACIÓN PROFESIONAL
-
Licenciatura en Bióloga, Fac. de Ciencias, UNAM.
Maestría en Ciencias en Manejo Ambiental con especialidad en
Ecotoxicología marina, Centro de Investigación en Alimentación y
Desarrollo, A. C.-Unidad Mazatlán.
Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
-Estudio de biomarcadores a nivel molecular, bioquímico y nivel de organismo
en cangrejo violinista Uca princeps (Smith 1870) expuestos a sedimentos
contaminados en Mazatlán , Sinaloa.
- Estudio de genotoxicidad en células sanguíneas de lombriz Eisenia fetida
expuestas a suelos contaminados con hidrocarburos provenientes de Tabasco.
Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
-Estudio de biomarcadores a nivel molecular, bioquímico y nivel de organismo
en cangrejo violinista Uca princeps (Smith 1870) expuestos a sedimentos
contaminados en Mazatlán , Sinaloa.
- Estudio de genotoxicidad en células sanguíneas de lombriz Eisenia fetida
expuestas a suelos contaminados con hidrocarburos provenientes de Tabasco.
PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Estudio de biomarcadores en cangrejo violinista Uca princeps y realización
31
de bioensayos con ellos.
2. Estudio de genotoxicidad (Ensayo cometa) en células sanguíneas de lombriz
compostera Eisenia fetida expuestas a suelos contaminados con hidrocarburos
y realización de bioensayos.
3.
4.
5.
PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. ---2.
3.
4.
5.
CAPACIDAD ANALÍTICA
Matrices ambientales que analiza:
Agua dulce
Agua Marina
Sedimentos
Suelos
Otros
X
X
Tipos de contaminantes que analiza:
Metales:
Plaguicidas:
Compuestos orgánicos:
Otros:
-
Pruebas biológicas que realiza:
Bioensayos con:
- Cangrejo violinista (Uca princeps)..
- Lombriz compostera (Eisenia fetida)
Biomarcadores en:
- A nivel molecular: Ensayo cometa (genotoxicidad)
32
A nivel bioquímico: activación de la enzima Glutatión-S-Tansferasa.
A nivel de organismo: Factor de condición múltiple; Índice
Hepatosomático y Gonadosomático y mortalidad.
Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia):
-------
Infraestructura con la que cuenta:
Equipo de laboratorio
Mismo material del que dispone la Dra. Silke Cram en el Laboratorio de Análisis
Físicos y Químicos del Ambiente en el Instituto de Geografía, UNAM. Dado
que me encuentro temporalmente trabajando con ella, esta parte corresponde
al material del que ella dispone.
Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no)
- Mantenimiento de cangrejo violinista Uca princeps.
- Mantenimiento de lombriz compostera. Eisenia fetida.
Compuestos de referencia certificados
------Personal disponible
---Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza
- Buena.
33
CUESTIONARIO
DATOS GENERALES
Nombre del investigador:
María del Carmen Cuevas Díaz
Institución (donde labora actualmente):
Universidad Veracruzana
Dependencia de adscripción:
Área o departamento:
Fac.
Ciencias
Coatzacoalcos
Ärea Técnica
Grupo de investigación:
Energia y medio ambiente
Puesto del Investigador:
Dirección de la institución:
Mtro de Tiempo Completo. Coordinador de
Laboratorio
Av. Universidad Km 7.5 Coatzacoalcos, Ver.
Teléfono:
01(921)21-1-57-00 ext 2
Fax:
01(921)21-1-57-00 ext 2
Dirección electrónica:
[email protected]
[email protected]
Químicas
Campus
FORMACIÓN PROFESIONAL
Licenciatura: Químico Farmacéutico Biólogo
Maestría: Ingeniería Ambiental
Estudios de doctorado en Biotecnología Ambiental 7° cuatrimestre CINVESTAV-IPN
Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Toxicología ambiental a nivel medio superior
Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Actualmente como parte de la tesis doctoral
PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1.Medio ambiente: suelo. Ecotoxicología de suelo
2. Medio ambiente: suelo. Suelos contaminados con hidrocarburos
3.
4.
34
5.
PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1.
2.
3.
4.
5.
CAPACIDAD ANALÍTICA
Matrices ambientales que analiza:
Agua dulce
Agua Marina
Sedimentos
Suelos
Contaminados con hidrocarburos
Otros
Tipos de contaminantes que analiza:
Metales:
Plaguicidas:
Compuestos orgánicos:
TPH, HAP´s
Otros:
Pruebas biológicas que realiza:
Bioensayos con:
Lombrices, plantas y se está por iniciar con enzimas para suelo así como con
Pseudomona putida
Biomarcadores en:
Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia):
35
Infraestructura con la que cuenta:
Equipo de laboratorio
Vortex, espectrofotómetro, refrigerador, estufa, balanza analítica, potenciómetro,
centrífuga, bomba de vacío, cromatógrafo de gases
Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no)
Eisenia andrei, semillas de Lactuca sativa, Triticum aestivum
Compuestos de referencia certificados
Personal disponible
Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza
Bioensayo con Eisenia andrei para suelo
36
CUESTIONARIO
DATOS GENERALES
Nombre del investigador:
M.C. Leticia García Rico
Institución (donde labora actualmente): Centro de Investigación en Alimentación y
Desarrollo, A.C
Dependencia de adscripción:
Área o departamento:
Ciencia de los Alimentos
Grupo de investigación:
Toxicología
Puesto del Investigador:
Investigador Titular
Dirección de la institución:
Teléfono:
Km 0.5 Carretera a la Victoria, Hermosillo,
Sonora
(662)2892400
Fax:
(662) 2800058
Dirección electrónica:
[email protected]
FORMACIÓN PROFESIONAL
Profesional: Licenciatura en Química, Universidad Autónoma de Baja California
Escuela de Ciencias Químicas (Julio 1977-Junio 1982).
Posgrado:
Maestro en Ciencias con Especialidad en Nutrición y Alimentos, CIAD,
A.C. (Septiembre 1983-Septiembre de 1985).
Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Impartición de los cursos: Tópicos de toxicología de los alimentos, Técnicas de
detección de residuos tóxicos en el programa de posgrado del CIAD, A.C.
Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
• Detección de metales pesados en áreas de cultivos ostrícolas (sedimento, agua y
ostión Crassostrea gigas) localizados en el estado de Sonora. 1998. SIMAC.
• Biodisponibilidad de metales pesados en sedimentos marinos superficiales de los
centros ostrícolas del estado de Sonora. 2000-2002. SIMAC.
• Caracterización de las fracciones de metales potencialmente biodisponibles en
sedimento marino y su bioacumulación en ostión de la zona ostrícola de
Bacochibampo, Sonora. CIAD-UNISON. 2004.
• Evaluación de los niveles de concentración de metales pesados (disueltos y
37
suspendidos) en agua superficial, su bioacumulación y potencial tóxico en ostión
(Crassostrea gigas). Sagarpa-conacyt 2004.
PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Química Ambiental
2.Ecotoxicología de sedimentos
3. Concentración, destino, transporte de contaminantes metálicos
4.
5.
PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Leticia García-Rico, María Sonia Soto-Cruz, Martín E. Jara-Marini, Agustín
Gómez- Álvarez. (2004) Fracciones geoquímicas de Cd, Cu y Pb en sedimentos
marinos superficiales de zonas ostrícolas del estado de Sonora, México. Rev. Int.
Contam. Amb. 3(20).
2. Jaqueline García-Hernández, Leticia García-Rico, Martin E. Jara-Marini, Ramón
Barraza-Guardado, Amy Hudson Weaver. (2004) Concentrations of trace metals
during a harmful algal bloom (hab) in the KUN KAAK BAY, SONORA, MEXICO
3. L. García-Rico, Mercedes Valenzuela Rodríguez, Jara-Marini M (enviado 2004).
Mercury distribution in sediments from the Sonoran Coast, Mexico. Environmental
Pollution
4. L. García-Rico and M.E. Jara-Marini (enviado 2005). Distribution of arsenic in
three geochemical fractions of surface sediments from coastal areas of Sonora,
Mexico (Gulf of California). . Bull. Environ. Contam.
5. L. García-Rico, S. Wilson-Cruz, M.C. Frasquillo-Félix, M.E. Jara-Marini. (enviado
2003). Total
Metals in Intertidal Surface Sediment of oyster culture areas in
Sonora, Mexico. Bull. Environ. Contam. 70(6):1235-1241
CAPACIDAD ANALÍTICA
Matrices ambientales que analiza:
Agua dulce
Agua Marina
√
Sedimentos
√
Suelos
Otros
Organismos
Tipos de contaminantes que analiza:
Metales:
Cadmio, cobre, plomo, zinc, cromo, mercurio, arsénico
38
Plaguicidas:
Compuestos orgánicos:
Otros:
parámetros fisicoquímicos
Pruebas biológicas que realiza:
Bioensayos con:
Biomarcadores en: sistemas marinos
Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia):
Detección de metales en alimentos- EMA (3 años)
Infraestructura con la que cuenta:
Laboratorio equipado para llevar a cabo la determinación de parámetros
fisicoquímicos y la detección de metales pesados en sistemas marinos.
Equipo mayor: espectrofotómetro de absorción atómica (flama, horno de grafito,
generador de vapor e hidruros), horno de microondas, balanza analítica,
congelador, refrigerador, sistema de computo, etc.
Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no)
Compuestos de referencia certificados
Soluciones estándar de metales certificadas
Material de referencia certificado (NIST, CNRC)
Personal disponible
2 investigadores
2 técnicos
Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza
Se pueden organizar cursos de capacitación
39
CUESTIONARIO
DATOS GENERALES
Nombre del investigador:
Gerardo Gold Bouchot
Institución (donde labora actualmente):
CINVESTAV
Dependencia de adscripción:
Unidad Mérida
Área o departamento:
Departamento de Recursos del Mar
Grupo de investigación:
Impacto y salud Ambiental
Puesto del Investigador:
Investigador Titular
Dirección de la institución:
Teléfono:
Km 6 Antigua Carretera a Progreso
Mérida, Yucatán 97310
(999) 981 2960 Ext. 523
Fax:
(999) 981 2334
Dirección electrónica:
[email protected]
FORMACIÓN PROFESIONAL
Oceanólogo químico por la UABC. 1979.
Maestría en Química, University of the Paciific. 1985.
Doctorado en Ciencias, en Ciencias Marinas. Cinvestav, 1991.
Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Profesor del curso de “Contaminación Marina”, Cinvestav Mérida, por 20 años.
Profesor del diplomado “Contaminación e Impacto Ambiental”, Universidad Autónoma
de Campeche. Durante cuatro años.
Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Caracterización ambiental del sistema lacustre San Miguel, municipio de Reforma,
Chiapas.
Diagnóstico del recurso camarón en el sur del Golfo de México.
Diagnóstico de la mortalidad de ostiones (Crassostrea virginica) en Tabasco.
Contaminación y biomarcadores en el Bagre Maya Ariopsis assimilis de la Bahía de
Chetumal.
PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Determinación analítica de sustancias tóxicas en muestras acuáticas.
2. Desarrollo y validación de biomarcadores en organismos acuáticos.
40
3. Relación, mediante técnicas estadísticas multivariadas, entre las concentraciones de
sustancias tóxicas en organismos y los niveles de biomarcadores en los mismos
organismos.
PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Gold-Bouchot G., Zapata-Perez O., Rodriguez-Fuentes G., Ceja-Moreno V., del RíoGarcia M. In Press. Biomarkers and Pollutants in the Nile Tilapia, Oreochromis
niloticus, in Four Lakes from San Miguel, Chiapas, Mexico. International Journal of
Environment and Pollution.
2. Zapata-Pérez O., Del-Río M., Domínguez J., Chan R., Ceja V. and Gold-Bouchot G.
In Press. Preliminary studies of biochemical changes (ethoxycoumarin O-deethylase
activities and vitellogenin induction) in two species of shrimp (Farfantapeneaus
duorarum and Litopenaeus setiferus) from the Gulf of Mexico. Ecotoxicology and
Environmental Safety.
3. Rodríguez-Fuentes G. and Gold-Bouchot G. 2004. Characterization of
Cholinesterase Activity from Different Tissues of Nile Tilapia (Oreochromis niloticus).
Marine Environmental Research 58: 505-509.
4. Leaños-Castañeda O., Gold-Bouchot G., Van der Kraak G., Lister A., Ceja-Moreno
V., and Simá-Álvarez R. 2004. An Aromatase Inhibitor and Tamoxifen Decrease
Plasma Levels of o,p’-DDT and its Metabolites in Nile Tilapia (Oreochromis niloticus).
Marine Environmental Research 58: 337-342.
5. Noreña-Barroso E., Simá-Alvarez R., Gold-Bouchot G. and Zapata-Perez O. 2004.
Persistent Organic Pollutants and Histological Lesions in Mayan Catfish Ariopsis
assimilis from the Bay of Chetumal, Mexico. Marine Pollution Bulletin 48: 263-269.
CAPACIDAD ANALÍTICA
Matrices ambientales que analiza:
Agua dulce
Agua, organismos.
Agua Marina Agua, organismos.
Sedimentos Sedimentos, material extraíble, fases sedimentológicas.
Suelos
Sedimentos, material extraíble, fases sedimentológicas.
Otros
Tipos de contaminantes que analiza:
Metales:
Cd, Cu, Zn, Hg, Cr, Pb, V, Ni,
Plaguicidas:
Aldrín, Endrín, Dieldrín, DDT, Endosulfán I y II, Metoxicloro,
Triclorobenceno, Pentaclorobenceno, Hexaclorobenceno,
hexaclorociclohexanos, Mirex, Pentacloroanisol.
41
Compuestos orgánicos:
Hidrocarburos policíclicos aromáticos (PAHs).
Otros:
Bifenilos policlorados (PCBs).
Pruebas biológicas que realiza:
Bioensayos con:
Tilapia nilótica (Oreochromis niloticus)
Bagres (Ariopsis assimilis y A. felis)
Camarón (Farfantapenaeus spp.)
Biomarcadores en:
Peces, crustáceos, moluscos.
Microalgas
Pastos Marinos
Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia):
Ninguna.
Solo hemos participado en ejercicios internacionales de intercalibración, organizados
por el laboratorio de Mónaco de la AIEA.
Infraestructura con la que cuenta:
Equipo de laboratorio
Dos cromatógrafos de gases.
Dos HPLC.
Un equipo de absorción atómica.
Centrífuga.
Espetrofluorómetro.
Espectrofotómetro.
Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no)
Cultivos de microalgas.
Cultivos de microalgas
Tilapia nilótica
Langostinos
Compuestos de referencia certificados
Materiales certificados de referencia para distintas matrices y analitos.
Personal disponible
De planta un auxiliar de laboratorio en mi laboratorio.
42
Varios técnicos en cultivos, en distintos laboratorios.
Técnicos en histología, en otros laboratorios.
Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza
Tenemos disposición absoluta para capacitar a otros usuarios. Hemos capacitado a
personal de la Armada de México, a participantes del Proyecto del Sistema Arrecifal
Mesoamericano de México, Belice, Honduras y Guatemala.
43
CUESTIONARIO
DATOS GENERALES
Nombre del investigador:
Institución
(donde
actualmente):
Xochitl Guzmán García
labora UAM-I. Universidad Autónoma Metropolitana
Dependencia de adscripción:
División de Ciencias de la Salud
Área o departamento:
Hidrobiología
Grupo de investigación:
Ecotoxicología
Puesto del Investigador:
Profesor Titular
Dirección de la institución:
Teléfono:
Av. San Rafael Atlixco No.186 col Vicentina.
Delegación Iztapalapa
58 04 64 74
Fax:
58 04 47 38
Dirección electrónica:
[email protected]
FORMACIÓN PROFESIONAL
Licenciatura en Biología; Maestría en Biología Experimental; Doctorado en
Biología Experimental (Estudiante)
Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Análisis bacteriológico en agua, sedimento y ostión de lagunas costeras.
Curso de Ecotoxicología
Seminarios de investigación determinación de metales, histopatología, cinéticas
de acumulación y eliminación de substancias tóxicas.
Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Determinación de la calidad de agua, sedimentos y especies de interes
comercial.
Determinación de especies patógenas y vibrio Cholera en ostión, agua y
plancton.
Efectos de Cadmio y Cromo en Ostión Crassostrea virginica.
Biomarcadores en organismos acuáticos para monitoreo ambiental
Histopatología en especies indicadoras de Contaminación
44
PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Biomonitoreo con Ostión Crassostrea virginica.
2. Efectos histopatológicos en organismos acuáticos
3. Determinación y efecto de metales tóxicos
4. Bioensayos subletales y letales con organismos acuáticos
5. Aplicación de biomarcadores en especies acuaticas
PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Calidad Sanitaria del ostión de la laguna de Tamiahua, Ver.
2.
3.
4.
5.
CAPACIDAD ANALÍTICA
Matrices ambientales que analiza:
Agua dulce
X
Agua Marina
x
Sedimentos
x
Suelos
Otros
Organismos acuáticos
Tipos de contaminantes que analiza:
Metales:
x
Plaguicidas:
Compuestos orgánicos:
Otros:
Efectos en los organismos con biomarcadores
Pruebas biológicas que realiza:
Bioensayos con:
Bivalvos
Biomarcadores en:
45
Bivalvos
Peces
Invertebrados
Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia):
Infraestructura con la que cuenta:
Equipo de laboratorio
Procesador de tejidos, microtomo, sistema de transferencia de tejidos, Centro
de inclusión de tejidos, tren de Tinción, afiladora de cuchillas, Horno de
Digestión CEM, Centrifugas, Homogenizador de tejidos Ultraturrax,
Microscopios, equipo de cristaleria, campana de extracción y flujo laminar,
incubadoras, quipo para la determinación de la calidad de agua, sistema de
maduración de agua marina.
Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no)
Compuestos de referencia certificados
Personal disponible
Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza
si
46
CUESTIONARIO DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
DATOS GENERALES
Nombre del investigador:
Institución (donde labora actualmente):
Dependencia de adscripción:
Área o departamento:
Grupo de investigación:
Puesto del Investigador:
Dirección de la institución:
Teléfono:
Fax:
Dirección electrónica:
FORMACIÓN PROFESIONAL
Anne Hansen
Instituto Mexicano de Tecnología del Agua
Coordinación de Tecnología Hidrológica
Hidrogeoquímica
Especialista Titular “B”
Paseo Cuanhnáhuac #
Jiutepec, Morelos
(777) 32-93-600 Ext. 610
(777) 32-93-682
[email protected]
8532,
62530,
Licenciatura en química
Maestría y doctorado en Ciencias del Mar (Oceanografía química)
Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Modelación ambiental
Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Biorreactor para la producción de cepas biodegradadoras
Experimentos de biodegradación mediante dilución isotópica
PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Biodegradación de COP’s
2. Bioacumulación de COP’s
3. Producción de cepas en biorreactor
4.
5.
PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1.
47
2.
3.
4.
5.
CAPACIDAD ANALÍTICA
Matrices ambientales que analiza:
Agua dulce
Agua Marina
Sedimentos
Suelos
Otros
X
X
X
Tipos de contaminantes que analiza:
Metales:
Plaguicidas:
Compuestos orgánicos:
Otros:
X
X
X
Pruebas biológicas que realiza:
Bioensayos con:
Crecimiento de cepas
Biodegradacipon de COP’s
Bioacumulación de metales
Biomarcadores en:
Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia):
Infraestructura con la que cuenta:
Equipo de laboratorio
Laboratorio para investigación con fuentes radioactivas abiertas
Contador gamma
Contador de centelleo líquido
Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no)
48
Cultivo de hongos y bacterias (no certificados)
Compuestos de referencia certificados
Isótopos radioactivos 210Pb, 14C, 134Cs, 109Cd, Zn, 2,4-D, atrazina
Personal disponible
2 Investigadores titulares
4 Investigadores asociados
1 Estudiante de doctorado, 2 de maestría y 1 de licenciatura
Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza
Sí, pero se requiere usar seguridad radiológica para trabajar con fuentes
abiertas de radiación.
49
CUESTIONARIO
DATOS GENERALES
Nombre del investigador:
Institución (donde labora actualmente):
Dependencia de adscripción:
Área o departamento:
Grupo de investigación:
Puesto del Investigador:
Dirección de la institución:
Teléfono:
Fax:
Dirección electrónica:
FORMACIÓN PROFESIONAL
Lorenzo Heyer Rodríguez
Universidad Autónoma de Tamaulipas
UAM Agronomía y Ciencias
Laboratorio de Toxicología Acuática
Química y Toxicología Ambiental
Titular
Centro Universitario Victoria, Ciudad Victoria,
Tamaulipas
(834) 31-81-718
(834) 31-81-718
[email protected]
Químico Clínico Biólogo.
Doctorado en Ciencias. Especialidad en Salud Ambiental
Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Estudios ecotoxicológicos de HCB y HCBD en pantanos de Lousiana, EUA.
Estudios biogeoquímicos de COP (SAGARPA-CONACyT)
PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Biomarcadores de Contaminación
2. Toxicología de plaguicidas
3.
4.
5.
PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1.
2.
3.
4.
5.
50
CAPACIDAD ANALÍTICA
Matrices ambientales que analiza:
Agua dulce
Agua Marina
Sedimentos
Suelos
Otros
X
X
X
Tipos de contaminantes que analiza:
Metales:
Plaguicidas:
Compuestos
orgánicos:
X
X
Otros:
Pruebas biológicas que realiza:
Bioensayos con:
Brachidanio danio, dosis letales y bioacumulación
Biomarcadores en:
Peces y organismos bénticos
Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia):
Infraestructura con la que cuenta:
Equipo de laboratorio
Cromatografía de gases con detectores de ECD, FID, NPD
Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no)
Compuestos de referencia certificados
Personal disponible
2 Investigadores
2 Becarios de pregrado
Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza
Si
51
52
CUESTIONARIO
DATOS GENERALES
Nombre del investigador:
Eduardo Osiris Madrigal Santillán
Institución (donde labora actualmente): Instituto de Ciencias de la Salud.
Universidad Autónoma del Estado de
Hidalgo.
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
IPN
Dependencia de adscripción:
Escuela de Medicina ICSA-UAEH
Área o departamento:
Grupo de investigación:
Puesto del Investigador:
Dirección de la institución:
Laboratorio de Farmacología y Toxicología
ICSA-UAEH.
Laboratorio de Genética ENCB-IPN
Actualmente soy el líder del cuerpo
académico de toxicología clínica en la UAE
Jefe del Laboratorio de Farmacología
Teléfono:
Abasolo 600 cp 42000 Col.
Pachuca Hgo.
01 771 71 720 00 ext 5107 0 5117
Fax:
Mismo telefono ext 5111
Dirección electrónica:
[email protected]
[email protected]
Centro
FORMACIÓN PROFESIONAL
Licenciatura en Químico Bacteriólogo Parasitólogo
Maestría en Ciencias Químicobiologicas con especialidad en Genética Toxicológica
Doctorado en Ciencias Químicobiologicas con especialidad en Genética
Toxicológica
Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Desde 1999 estoy adscrito al área académica de Medicina en la UAE en donde
participo activamente en el curso teórico y práctico de Farmacología y Toxicología.
Además, participo continuamente en la Maestría de Ciencias Químicobiologicas de
la ENCB-IPN.
Y mi s actividades de docente iniciaron en el año de 1992.
Actualmente soy asesor de tesis de licenciatura y posgrado.
Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Estos son los proyectos en los que he participado:
1.- Estudio histopatológico en hígado de ratas expuestas al metil terbutil éter y
plomo.
53
2.- Efecto genotóxico del maíz contaminado con AFB1 y su inhibición mediante la
adición de Saccharomyces cerevisiae.
3.- Evaluación subcrónica de la capacidad de la imipramina y desipramina para
inducir micronúcleos in vivo.
4.- Antigenotoxicidad del jugo de toronja y la naringina contra la ifosfamida y el metil
metano sulfonato.
5.- Efecto genotóxico producido por Cadmio y zinc en Daphnia pulex
6.- Capacidad antigenotóxica y antioxidante del aceite esencial de manzanilla.
7.- Antigenotoxicidad del manano, glucano y glucomanano contra el daño producido
por la AFB1.
8.- Efecto de sedimentos en hígado de ratas y metalotionenina sobre la
genotoxicidad del zinc en Dugesia dorotocephala.
PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Genética Toxicológica en mamíferos (Intercambios de Cromátides Hermanas,
Micronúcleos, Lipoperoxidación y Ensayo Cometa)
2. Genética Toxicológica en peces (Intercambios de Cromátides Hermanas,
Micronúcleos, Lipoperoxidación y Ensayo Cometa)
3. Toxicología preclínica (Ensayos agudos, subcrónicos y crónicos, evaluación
toxicológica y farmacológica)
4.
5.
PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Madrigal BE, Madrigal SE, Cassani M, Leyva S. (2004) Efecto genotóxico del
asbesto comercial en cultivo de linfocitos humanos. Revista Mexicana de Ciencias
Farmacéuticas. 35: 20-24
2. Madrigal S,E Madrigal BE, Cassani M, Leyva S, Piña A. (2002) Efecto genotóxico
de la crocidolita en cultivo de linfocitos humanos. Bioquimia. 27: 7-11
3. Madrigal-Bujaidar E, Márquez-Márquez R, Reyes A, Madrigal-Santillán E. (2005)
Antigenotoxic effect of Saccharomyces cerevisiae on the damage produced in mice
fed with aflatoxin B1contaminated corn. International Journal of Food Sciences and
Nutrition. En prensa
4. Madrigal-Bujaidar E, Madrigal-Santillán E, Pages N, Grigorij K, Chamorro G.
(2002) Etude de L´antigénotoxicité de diferentes substances pour réduire la toxicité
de´l aflatoxine B1 chez la souris. Toxines et recherches biomedicales. France
Elsevier. 123-132
5. Madrigal-Bujaidar E, Madrigal-Santillán E, Vera CA (2004) Antigenotoxic effect of
glucan against the damage produced by aflatoxin B1 in mouse
hepatocytes.Toxicology and applied Pharmacology 197 (3):261
54
CAPACIDAD ANALÍTICA
Matrices ambientales que analiza:
Agua dulce
Agua Marina
Sedimentos
Suelos
Otros
Tejidos
Tipos de contaminantes que analiza:
Metales:
Plaguicidas:
Malation, paration
Compuestos orgánicos:
Otros:
Compuestos carcinogénicos y genotóxicos
Pruebas biológicas que realiza:
Bioensayos con:
1.- Roedores (ICH, MN, Lipoperoxidación, Ensayo Cometa)
2.- Peces (MN, Ensayo Cometa)
3.- Prueba de Ames
Biomarcadores en:
Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia):
Infraestructura con la que cuenta:
Equipo de laboratorio
Se cuenta con el material y equipo indispensable para realizar las pruebas antes
mencionadas.
Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no)
Compuestos de referencia certificados
Personal disponible
55
Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza
Estamos en toda la disposición.
Estaremos muy contentos de recibir nuevos colegas y participar con otras
instituciones.
56
CUESTIONARIO
DATOS GENERALES
Nombre del investigador:
Dr. Fernando Martínez Jerónimo
Institución (donde labora actualmente):
Instituto Politécnico Nacional
Dependencia de adscripción:
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
Área o departamento:
Departamento de Zoología
Grupo de investigación:
Lab. de Hidrobiología Experimental y
Ecotoxicología
Presidente de Academia
Puesto del Investigador:
Dirección de la institución:
Teléfono:
Carpio esq. Plan de Aayala S/N, Col. Sto.
Tomás. Del. Miguel Hidalgo. México D. F.
11340.
(55) 5729-6000 ext. 62424 y 62517
Fax:
(55) 5396-3503
Dirección electrónica:
[email protected]
FORMACIÓN PROFESIONAL
Licenciatura en Biología
Maestría en Ciencias con Especialidad en Ecología
Doctorado en Ciencias con Especialidad en Ecología
Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Ecología y Contaminación Ambiental (Licenciatura, carrera de Ingeniero en Sistemas
Ambientales
Contaminación Acuática y Toxicología (Licenciatura, Carrera de Biólogo)
Ecotoxicología Acuática y Contaminación (Posgrado, Maestría y Doctorado en
Ecología)
Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Aprox. 10 Proyectos Institucionales
2 proyectos Vinculados
I Proyecto Conacyt
PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Ecotoxicología con Cladóceros dulceacuícolas
2.Ecotoxicología con microalgas y otras especies de invertebrados y vertebrados
57
dulceacuícolas
3.Hidrobiología Experimental de especies de agua dulce
4.Toxinas y sustancias bioactivas de Cianobacterias
5.
PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Ver anexo.
2.
3.
4.
5.
CAPACIDAD ANALÍTICA
Matrices ambientales que analiza:
Agua dulce
Principalmente sistemas dulceacuícolas
Agua Marina
Sedimentos
Suelos
Otros
Tipos de contaminantes que analiza:
Metales:
Metales Pesados
Plaguicidas:
Compuestos orgánicos: Petróleo e hidrocarburos
Otros:
Pruebas biológicas que realiza:
Bioensayos con:
Daphnia magna, Selenastrum capricornutum (Raphidocelis subcapitata), Pomacea
patula, Cyprinus carpio, Onchorhynchus mikis
Biomarcadores en:
Pomacea patula y P. flagelata
58
Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia):
Daphnia magna, Selenastrum capricornutum y Poecilia reticulata (en proceso de
certificación)
Infraestructura con la que cuenta:
Equipo de laboratorio
Cámaras bioclimáticas, equipo e infraestructura para trabajo en condiciones de
esterilidad, bombas de vacío, centrífugas, equipos digitales para cuantificación de
oxígeno disuelto, salinidad, conductividad, pH. Equipo Hach poara determinaciones
químicas, equipo óptico, etc.
Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no)
Cepario de microalgas y cianobacterias
Cepario de Cladoceros
Compuestos de referencia certificados
Cromo hexavalente
Personal disponible
2 Profesores de tiempo completo
2 Profesores de ¾ de iempo
I Técnico Docente
Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza
Constante, principalmente por vía institucional
Relación de publicaciones
a) REVISTAS NACIONALES CON JURADO
1. Martínez-Jerónimo, F, 1986. Aislamiento y cultivo preliminar de dos especies
de rotíferos eurihalinos. Zoología Informa, 6:22-27.
2. Martínez-Jerónimo, F., R. Ramírez G., R. Villaseñor C., G. Rios B. y
F.Espinosa Ch., 1988. Cultivos de apoyo para acuacultura: producción de
alimento vivo. Acuavisión, 14: 18-24.
3. Martínez-Jerónimo, F., 1990. Contaminación acuática y toxicología. Parte I.
Zoología Informa, 17-18: 32-49.
4. Martínez-Jerónimo, F., 1990. Contaminación acuática y toxicología. Parte II.
Zoología Informa, 19-20: 3-20.
5. Martínez-Jerónimo, F., 1991. Contaminación acuática y toxicología. Parte III.
Zoología Informa, 21: 1-17.
59
6. Martínez-Jerónimo, F., 1991. La importancia de los bioensayos en la
evaluación de la toxicidad acuática. Universidad: Ciencia y Tecnología, 1(4):3744.
7. Espinosa-Chávez, F., F. Martínez-Jerónimo y R. Ramírez-Granados, 1992.
Tasa de filtración y cultivo de Moina macrocopa (Crustacea: Cladocera)
alimentada con Scenedesmus incrassatulus (Chlorophyceae) y estiércol
vacuno digerido. An. Inst. Cienc. del Mar y Limnol. Univ. Nal. Autón. México,
19(2):137-142.
8. Espinosa.Chávez, F. y F. Martínez-Jerónimo, 1993. El cultivo de protozoarios
de vida libre como una forma de apoyo a la docencia. Zoología Informa, 25: 4548.
9. Martínez-Jerónimo, F. 1993. Piscicultura: La biotecnología para la producción
de peces. Caminos Abiertos, Universidad Pedagógica Nacional, 27: 26-28.
10. Martínez-Jerónimo, F., R. Villaseñor, F. Espinosa & G. Rios, (1997).
Metodología para la producción de neonatos de Daphnia magna (Anomopoda:
Daphnidae), como organismo de prueba en toxicología acuática. Zoología
Informa, 36-37: 59-81.
11. Villaseñor Córdova, R., G. Rios, F. Martínez-Jerónimo, y R. Ramírez G.,
(1997). Desarrollo de un cultivo de Chironomus plumosus (Diptera:
Chironomidae), a escala de laboratorio. Zoología Informa, 36-37: 45-58.
12. Espinosa-Chávez, F., F. Martínez-Jerónimo y R. Ramírez-Granados, (1997).
Cultivo intensivo de Moina macrocopa (Anomopoda: Moinidae). Zoología
Informa, 36-37: 27-43.
13. Martínez-Jerónimo, F., (2003). Effect of photoperiod and temperature on the
somatic growth of Daphnia magna (Branchiopoda: Anomopoda). Scientia
Naturae, 6(1): 15-22.
14. Ruiz-Ramírez R., F. Espinosa-Chávez & F. Martínez-Jerónimo (en prensa).
El género Pomacea (Caenogastropoda: Ampullaridae). Importancia social,
económica, biológica y pesquera. Zoología Informa.
b) REVISTAS INTERNACIONALES Y PADRÓN CONACYT
1.
Martínez-Jerónimo, F. y F. Espinosa-Chávez, 1991. Efecto de la salinidad,
cantidad de inóculo y volúmen de cosecha en el crecimiento poblacional de
Dunaliella tertiolecta (Chlorophyceae: Volvocales). Rev. Lat-amer. Microbiol.,
33: 181-189.
2.
Martínez-Jerónimo, F. & A. Gutierrez Valdivia. 1991. Fecundity,
reproduction, and growth of Moina macrocopa fed different algae.
Hydrobiologia, 222: 49-55.
3.
Espinosa-Chávez, F., F. Martínez-Jerónimo y T. Gutiérrez-Castrejón,
1992. Eficiencia comparativa de la capacidad nitrificante de filtros biológicos
60
construidos con grava de sílice o tezontle. Rev. Lat-amer. Microbiol., 34:333337.
4.
Martínez-Jerónimo, F., R. Villaseñor, F. Espinosa y G. Ríos, 1993. The use
of life-tables and application factors for evaluating the chronic toxicity of Kraft
mill wastes to Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 50:377-384.
5.
Martínez-Jerónimo, F., R. Villaseñor, G. Rios & F. Espinosa, 1994. Effect
of food type and concentration on the survival, longevity, and reproduction of
Daphnia magna. Hydrobiologia. 287: 207-214.
6.
Martínez-Jerónimo. F. y F. Espinosa-Chávez, 1994. A laboratory-scale
system for mass culture of freshwater microalgae in polyethylene bags: J Appl.
Phycol. 6: 423-425.
7.
Martínez-Jerónimo. F. y R. García-González, (1994/1995). Effect of food
concentration on the chronic toxicity of Sodium Dodecyl Sulfate to Daphnia
magna. J. Aquatic Ecosystem Health 3: 247-253.
8.
Martínez-Jerónimo, F., F. Espinosa, R. Villaseñor & G. Rios, (1997).
Primer registro de Moina hutchinsoni (Daphniiformes: Moinidae) en México.
Revista de Biología Tropical, 45(3): 1268-1269.
9.
Ramírez-Olvera, R., M. Coria-Cedillo, R. O. Cañizares-Villanueva, F.
Martínez-Jerónimo, T. Ponce-Noyola & E. Rios-Leal, (2000). Growth
evaluation and bioproducts characterization of Calothrix sp. Bioresource
Technology, 72: 121-124.
10.
Cañizares-Villanueva, R. O., F. Martínez-Jerónimo & F. Espinosa-Chávez,
(2000). Acute Toxicity to Daphnia magna of effluents containing Cd, Zn, and a
mixture Cd-Zn, after metal removal by Chlorella vulgaris. Environmental
Toxicology, 15(3): 160-164.
11.
Martínez-Jerónimo, F., F. Espinosa-Chávez & R. Villaseñor-Córdova,
(2000). Effect of culture volume and adult density on the neonate production of
Daphnia magna, as test organisms for aquatic toxicity tests. Environmental
Toxicology, 15(3): 155-159.
12.
Rodríguez-Estrada, J., R. Villaseñor-Córdova & F. Martínez-Jerónimo
(2003). Efecto de la temperatura y tipo de alimento en el cultivo de Moina
micrura (Kurz, 1874) (Anomopoda: Moinidae) en condiciones de laboratorio.
Hidrobiológica, 13: 239-245.
13.
Carreón-Palau L., E. Uria-Galicia, F. Espinosa-Chávez & F. MartínezJerónimo (2003). Desarrollo morfológico e histológico del sistema reproductor
de Pomacea patula catemacensis (Baker, 1922) (Mollusca, Caenogastropoda:
Ampullariidae. Revista Chilena de Historia Natural, 76:665-680.
14.
Domínguez-Bocanegra, A. R., Guerrero Legarreta, I., F. Martinez
Jerónimo, & A. Tomasini Campocosio, (2004). Influence of environmental and
nutritional factors in the production of astaxanthin from Haematococcus
pluvialis. Bioresource Technology, 92:209-214.
61
15.
Peña-Castro, J. M., F. Martínez-Jerónimo, F. Esparza-García & R. O.
Cañizares-Villanueva, (2004). Heavy metals removal by the microalga
Scenedesmus incrassatulus in continuous cultures. Bioresource Technology,
94(2): 219-222.
16.
Martínez-Jerónimo, F., M. Elías-Gutiérrez & E. Suárez-Morales, (2004) A
redescription of Moina hutchinsoni Brehm, a rare cladoceran (Branchiopoda:
Anomopoda) found in remnants of a Mexican saline lake, with notes on its life
history. Journal of Crustacean Biology, 24: 232-245.
17.
Olvera-Hernández, E., L. Martínez-Tabche & F. Martínez-Jerónimo,
(2004). Bioavailability and Effects of Malathion in Artificial Sediments on
Simocephalus vetulus (Cladocera: Daphniidae). Bulletin of Environmental
Contamination and Toxicology. 73: 197-204.
18.
Peña-Castro J. M., F. Martínez-Jerónimo, F. Esparza-García & R. O.
Cañizares-Villanueva, (2004). Phenotypic plasticity in Scenedesmus
incrassatulus (Chlorophyceae) in response to heavy metals stress.
Chemosphere, 57: 1629-1636.
19.
Espinosa-Chávez F. & F. Martínez-Jerónimo, (2004). Growth and fecundity
of Pomacea patula (Caenogastropoda: Ampullariidae) when fed on gel diets of
Scenedesmus incrassatulus (Chlorophyceae). The Veliger (en prensa).
20.
Martínez-Jerónimo, F. & F. Espinosa-Chávez, (2004). Notes on the
reproduction and survival of Moina hutchinsoni Brehm, 1937 (Moinidae:
Anomopoda) grown in media of varying salinity. Aquatic Ecology. (in press).
21.
Martínez-Jerónimo, F., F. Espinosa, R. Villaseñor & G. Ríos. Chronic
toxicity of crude oil to Daphnia magna (Crustacea: Anomopoda). Archives of
Environmental Contamination and Toxicology (In press).
22.
Ruiz-Ramírez R., F. Espinosa-Chávez & F. Martínez-Jerónimo. Growth
and reproduction of Pomacea patula catemacensis Baker, 1922 (Gastropoda:
Ampullariidae) when fed Calothrix sp. (Cyanobacteria). Journal of the World
Aquaculture Society (Aceptado)
Manuscritos enviados.
Un total de 3 manuscritos enviados y actualmente en la etapa de revisión en
diferentes revistas internacionales.
Martínez-Jerónimo, F. Demographic study of maximum salinity tolerance of
Daphnia magna (Cladocera). Sometido a Journal of Plankton Research (enviado)
Martínez-Jerónimo F., L. Martínez-Jerónimo & F. Espinosa-Chávez. Efecto de las
condiciones de cultivo y edad de los reproductores sobre la toxicidad del Cromo en
neonatos de Daphnia magna Straus 1820 (Cladocera). Sometido a Hidrobiológica
(enviado).
62
Espinosa-Chávez, F., L. Victoria-Ramírez & F. Martínez-Jerónimo. Toxicidad de
muestras de petróleo crudo sobre Dunaliella tertiolecta Butcher, 1959
(Chlorophyceae). Sometido a Hidrobiológica (enviado).
63
CUESTIONARIO
DATOS GENERALES
Nombre del investigador:
Dra.Nandini Sarma
Institución (donde labora actualmente): UNAM
Dependencia de adscripción:
Iztacala
Área o departamento:
Posgrado
Grupo de investigación:
Ecologia y Ecotoxicologia de Zooplancton
Puesto del Investigador:
Prof. Tit. “A”, TC. Def.
Dirección de la institución:
Teléfono:
Av. Los Barrios, FES Iztacala, AP 314, CP
54090, Los Reyes, Iztacala, Tlalnepantla,
Edo. de Mexico
56231125
Fax:
5231256
Dirección electrónica:
[email protected]
FORMACIÓN PROFESIONAL
Doctor en Ciencias Zoológicas (Desde 1995);
Sistema Nacional de Investigadores (SNI) Nivel - I
Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de
bioensayos
Tutor principal de Maestría y Doctorado (UNAM)
Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
CONACyT y PAPIIT (UNAM): proyectos relacionados de ecotoxicologia de
zooplancton
64
PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Cultivo y uso de rotiferos como organismos de bioensayo
2. Cultivo y uso de cladoceros como organismos de bioensayo
3. Cultivo y uso de ostracodos como organismos de bioensayo
4. Cultivo y uso Chlorella como organismos de bioensayo
5. Cultivo y uso de Scenedesmus como organismos de bioensayo
PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Nandini S, Mayeli SM & Sarma SSS 2004 Effect of stress on the life table
demography of Moina macrocopa. Hydrobiologia 526: 245-254
2. García-García G, Nandini S & Sarma SSS 2004 The effect of cadmium on the
population dynamics of Moina macrocopa and Macrothrix triserialis (Cladocera).
Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology 72(4): 717-724 (SpringerVerlag, USA).
3. Sarma SSS, Núñez-Cruz HF & Nandini S 2005 Effects on the population
dynamics of Brachionus rubens (Rotifera) caused by mercury and cadmium
administered through medium and algal food (Chlorella vulgaris). Acta Zoologica
Sinica 51(1): 46-52
4. Ramírez-Pérez T, Sarma SSS & Nandini S 2004. Effects of mercury on the life
table demography of the rotifer Brachionus calyciflorus Pallas (Rotifera).
Ecotoxicology 13: 535-544
5. Gama-Flores JL, Sarma SSS & Nandini S 2004 Acute and chronic toxicity of the
pesticide methyl parathion to the rotifer Brachionus angularis (Rotifera) at different
algal (Chlorella vulgaris) food densities. Aquatic Ecology 38: 27-36
CAPACIDAD ANALÍTICA
Matrices ambientales que analiza:
Agua dulce
X
Agua Marina
Sedimentos
Suelos
Otros
Tipos de contaminantes que analiza:
Metales:
X
Plaguicidas:
X
Compuestos orgánicos: X
65
Otros:
Microcystis
Pruebas biológicas que realiza:
Bioensayos con:
Alga, Zooplancton, Larva de Pez
Biomarcadores en:
Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia):
Infraestructura con la que cuenta:
Varios Equipos de laboratorio
Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no)
Cepas de varias especies de alga y zooplancton
Compuestos de referencia certificados
Personal disponible
Dra Nandini Sarma
Dr. SSS Sarma
Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza
66
CUESTIONARIO
DATOS GENERALES
Nombre del investigador:
Dra. Ing. Carmen Zenia Nava Vera
Institución (donde labora actualmente):
Universidad Autónoma de Tamaulipas
Dependencia de adscripción:
Fac. de Ing. Arturo Narro Siller
Área o departamento:
Centro de Transferencia de tecnología
Grupo de investigación:
Puesto del Investigador:
CAEF Medio Ambiente y Desarrollo
sustentable
Líder de CA
Dirección de la institución:
Centro Universitario Tampico-Madero
Teléfono:
833 2 41 2042
Fax:
833 241 2042
Dirección electrónica:
[email protected]
FORMACIÓN PROFESIONAL
Dra por la Universidad de Sevilla. En Formación e investigación en medio
ambiente.
Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de
bioensayos
Ninguna
Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Propuesta para aplicar bioensayos en la caracterización ambiental de lixiviados de
residuos de construcción y demolición de obras. En proceso
67
PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Caracterización ambiental de residuos de construcción
2.
3.
4.
5.
PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. En revisión. Caracterización ambiental de residuos de construcción
2.
3.
4.
5.
CAPACIDAD ANALÍTICA
Matrices ambientales que analiza:
Agua dulce
xxx
Agua Marina
xxx
Sedimentos
Suelos
xxx
Otros
Tipos de contaminantes que analiza:
Metales:
xxx
Plaguicidas:
68
Compuestos orgánicos: xxx
Otros:
Compuestos inorgánicos de contaminación básica
Pruebas biológicas que realiza:
Bioensayos con:
Están en proceso de definirse cuales serían las más adecuadas. Es un proyecto
que Inicia en septiembre 2004.
Biomarcadores en:
No
Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia):
Infraestructura con la que cuenta:
Equipo de laboratorio
En instalación laboratorio.
El proyecto se apoya con el equipo e instalaciones del IMTA
Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no)
Compuestos de referencia certificados
Personal disponible
69
Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que
realiza
70
CUESTIONARIO
DATOS GENERALES
Nombre del investigador:
Institución (donde labora actualmente):
Dependencia de adscripción:
Área o departamento:
Grupo de investigación:
Gabriel Nuñez Nogueira
Instituto de Ciencias del Mar y LimnologíaUNAM
UNAM-CU
Laboratorio de Contaminación Marina
Contaminantes Inorgánicos (metales) y
orgánicos metálicos
Puesto del Investigador:
Dirección de la institución:
Teléfono:
Fax:
Dirección electrónica:
FORMACIÓN PROFESIONAL
Ciudad Universitaria. Circuito Exterior S/N.
C.P. 04510
56-22-57-65
[email protected]
Licenciatura en Biología (Facultad de Ciencias-UNAM)
Doctorado en Biología (Queen Mary Collage, Universidad de Londres, GB)
Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Cursos de contaminación por metales pesados y traza
Curso sobre AAS.
Experiencia en uso de marcadores radiactivos
Microanálisis de rayos X y polarogarfía de pulso diferencial
Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Cinética y acumulación de Cd y Zn en camarones
Regulación de metales en camarones
Compartamentalización de metales en células de hepatopancreas y branquias
PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Acumulación y regulación
2. Mecanismos de destoxificación
3. Eficiencia de asimilación
4.
71
5.
PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Nunez-Nogueira & Rainbow. (2005). Marine Biology. (On line)
2. Nunez-Nogueira & Rainbow (2005). Mar. Environ. Res. 60
3. Nunez-Noguiera (2005). EPOMEX. En impresión.
4.
5.
CAPACIDAD ANALÍTICA
Matrices ambientales que analiza:
Agua dulce
Agua Marina
Sedimentos
Suelos
Otros
X
X
X
Organismos
Tipos de contaminantes que analiza:
Cd, Cu, Cr, Fe, Zn, V, Ni
Metales:
Plaguicidas:
Compuestos orgánicos:
Otros:
Pruebas biológicas que realiza:
Bioensayos con:
Radioisótopos, metaloproteínas (MT’s)
Biomarcadores en:
Metalotioninas o proteínas tipo metalotioneínas
Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia):
Se ha participado con IAEA para metales en sedimentos (aún no se certifica)
Infraestructura con la que cuenta:
Equipo de laboratorio
72
AAS
Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no)
Mantenimiento para postlarva-juveniles de camarón
Compuestos de referencia certificados
Ninguno
Personal disponible
Biol. Susana Villanueva
M. en C. Guadalupe Ponce
Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza
Medio tiempo
73
CUESTIONARIO
DATOS GENERALES
Nombre del investigador:
M.C YOLANDA PICA GRANADOS
Institución (donde labora actualmente): Instituto Mexicano de Tecnología del Agua.
IMTA
Dependencia de adscripción:
Coordinación de Tratamiento y Calidad del
Agua
Área o departamento:
Subcoordinación de Hidrobiología y
Evaluación Ambiental
Grupo de investigación:
Toxicología Acuática
Puesto del Investigador:
Investigador Titular A
Dirección de la institución:
Teléfono:
Paseo Cuauhnahuac 8532 Col .Progreso,
Jiutepec, Mor. México C.P. 62550
017773293665
Fax:
017773293665
Dirección electrónica:
[email protected]
FORMACIÓN PROFESIONAL
ACADÉMICA
Licenciatura:
Maestría:
Biología . Facultad de Ciencias (FC), Universidad
Nacional Autónoma de México UNAM. 1988.
En Ciencias (Biología) F.C., UNAM. 1994.
EXPERIENCIA
Técnico Académico por contrato . ICMyL, UNAM
Jefe del laboratorio. Instituto Mexicano del Petróleo.
Investigador Numerario I. Instituto Mexicano del Petróleo
Investigador Numerario II. Instituto Mexicano del Petróleo
Especialista en Hidráulica IV-A (III). IMTA.
Especialista en Hidráulica Titular A (IV). IMTA.
Consultor para el International Development Research
Center, Canadá.
México D.F. 1985-1993
México D.F. 1990-1995
México D.F. 1992-1994
México D.F. 1994-1995
Jiutepec. Mor. 1995-2001
Jiutepec. Mor. 2001-a la fecha
Jiutepec. Mor. 2000-a la fecha
Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Cursos especializados
rInternacionales
Instructor y Docente: del Taller de Transferencia de Tecnología de Bioensayos a Municipalidades de
América Latina. IDRC-CIMA-UNLP, Por invitación del Interntional Development Research Centre (Otawa,
Canadá- Uruguay)
Lugar: Centro de Investigaciones de Medio Ambiente (CIMA), Universidad Nacional de La Plata (UNLP), Buenos
Aires, Argentina.
74
Fecha: 14-20 de mayo del 2000 (60 h).
Nacionales
Instructor y Docente: del “Taller de Transferencia Tecnológica “Métodos biológicos para la detección de
toxicidad por contaminantes químicos en aguas residuales y naturales” (14-18 de agosto 2000).
Patrocinado por la CNA
Lugar: Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Jiutepec, Morelos,.
Fecha: 14-18 de mayo del 2000 (50h).
Instructor del “Tercer Modulo “Restauración de acuíferos contaminados por hidrocarburos” del
Diplomado Restauración de suelos y aguas subterráneas contaminadas por hidrocarburos de la Universidad
Autónoma del Estado de Morelos.
Lugar: Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Jiutepec, Morelos,.
Fecha: 11-15 de noviembre de 2002.
Personal formado.
Tesis dirigidas.
“Evaluación toxicológica del herbicida Glifosato” para obtener el grado de Licenciado en Biología
(Hidrobiología) en la Universidad Autónoma de Morelos. Septiembre del 2000.
“Instrumentación de la metodología de evaluación e identificación de la toxicidad en aguas residuales y
naturales a través de pruebas biológicas”. Para obtener el grado de Maestría en Ingeniería Ambiental.
Facultad de Ingeniería. DEPFI, Campus Morelos.
Tutorías o asesorías a estudiantes
Internacionales
Asesoría de 12 especialistas, personal de las Municipalidades del Cono Sur, de los países de Colombia, Chile,
Brasil, Uruguay y Argentina, en el uso de una batería de biensayos de toxicidad para evaluación de la
calidad del agua intercalibrada por los laboratorios participantes en la Red Internacional Watertox.
Proyecto de transferencia tecnológica del International Development Research Centre (IDRC) OtawaUruguay.
Fecha: de mayo del 2000 a la fecha
Nacionales
Asesoría de 14 especialistas, personal de siete laboratorios regionales de la CNA provenientes de los estados
de Coahuila, Sonora, Monterrey, Tamaulipas, Morelos, D.F. y Chiapas y de la Universidad Autónoma de
Querétaro, en el uso de una batería de biensayos de toxicidad para evaluación de la calidad del agua.
Proyecto de transferencia tecnológica para la Comisión Nacional del Agua.
Fecha: de agosto del 2000 agosto 2002
Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
1."CONTROL INTEGRAL DEL LIRIO ACUATICO E IMPLICACIONES TOXICOLÓGICAS EN EL LAGO DE
CHAPALA" . Proyecto CONACyT Fecha: marzo de 1996 a mayo 1998.
Instrumentación y de los protocolos de evaluación relacionados a pruebas de toxicidad, para el desarrollo del Método de
Evaluación e Identificación de Tóxicos (TIE, EPA, 1989).
2."SEGUIMIENTO TOXICOLOGICO DE UN POCESO EXPERIMENTAL DE BIOREMEDIACION DE SUSTRATOS
CONTAMINADOS POR PETROLEO, CON ENFASIS EN EL MONITOREO DE METABOLITOS GENOTOXICOS". En
colaboración con el Instituto de Biotecnología de la UNAM. Campus Morelos.
Fecha: 1996-1997
Investigación encaminada a evaluar la utilidad y alcances del uso de la prueba de toxicidad aguda con Vibrio fischeri y la
prueba de AMES para la detección de mutágenos, como dos métodos de biomonitoreo de hidrocarburos aromáticos
policíclicos, HAP y sus metabolitos encontrados en substratos afectados por derrame de petróleo.
3. "INDICADORES BIOLOGICOS. ESTABLECIMIENTO E INTERCALIBRACION DE UNA BATERIA DE PRUEBAS
DE TOXICIDAD”Fecha: 1997
Instrumentación y estandarización de una batería de siete pruebas de toxicidad, de aplicación en evaluaciones
75
ambientales de riesgo y de calidad del agua. Pruebas: Daphnia magna, Selenastrum capricornutum, Lactuca sativa,.
Panagrellus redivivus, Hydra attenuata, Allium sp., pruebas de genotoxicidad y daño cromosómico con la bacteria
Salmonella typhimurium y Allium sp,
4. “INTEGRATED APPROACHES TO SAFE DRINKING WATER (GLOBAL) ”
Proyecto: International Development Research Centre Fecha: septiembre de 1997 a noviembre 1998.
Desarrollo del programa de intercalibración de la batería de seis pruebas de toxicidad
5. “EVALUACION DE LA SENSIBILIDAD DE ORGANISMOS PARA PRUEBAS DE TOXICIDAD A TRAVÉZ DE UN
PROGRAMA DE INTERCALIBRACIÓN INTERNACIONAL” Fecha: 1998. IMTA
Variación de la respuesta de los organismos de prueba a los distintos grupos de compuestos para definir sus ámbitos de
sensibilidad.
6. “EVALUACION DE LAS DESCARGAS DE LA REFINERIA ANTONIO DOVALI JAIME Y DE LA ZONA LITORAL
DE LA BAHIA LA VENTOSA, ASOCIADA AL AREA DE IMPACTO DE LOS EMISORES SUBMARINOS” Proyecto
Contratado PEMEX-Refinación. echa: 1998
Estudio de caracterización de las aguas residuales de la Refinería y su comparación con resultados de modelos
biológicos a través de pruebas biológicas de toxicidad crónica (desarrollo larvario de erizos, crecimiento de anfípodos
marinos, Vibrio fischeri y Artemia sp).
7.“ANÁISIS DE LA SENSIBILIDAD DE LA MICROALGA Selenastrum capricornutum. Fecha: 1999
Determinar los ámbitos de su sensibilidad para tóxicos específicos que afectan principalmente metabolismos vegetales
8. “COMMUNITY AND ECOSYSTEM STRATEGIES FOR WATER QUALITY MONITORING IN MUNICIPALITIES OF
LATIN AMERICA” Proyecto de colaboración internacional, México-Canadá-Uruguay. International Development
Research Center (IDRC) Fecha: julio de 1999 a octubre 2001.
Desarrollo del programa de intercalibración del método de concentración de muestras ambientales para el análisis de
toxicidad con la batería de pruebas intercalibradas, Se experimentó su aplicación en el manejo de muestras ambientales
provenientes.
9. “MÉTODOS BIOLÓGICOS PARA EL MONITOREO DE LA CALIDAD DEL AGUA EN LAB. REGIONALES DE LA
CNA. Capacitación e Intercalibración. Proyecto:, CNA Fecha: 2000
Proyecto de capacitación e intercalibración dirigido a los laboratorios regionales de la CNA para el manejo de métodos
de evaluación biológica considerando el apoyo y asesoría para seguimiento a las actividades de establecimiento de
cultivos, calibración interna de los métodos y apoyo para circunscribir dichos métodos dentro de un marco de
aseguramiento y garantía de calidad.
10. “ECOTOXICIDAD DE AGUAS Y SEDIMENTOS DEL RÍO CUAUTLA, Y DESCARGAS ASOCIADAS,
EMPLEANDO UNA BATERÍA MULTITRÓFICA DE BIOENSAYOS” Fecha: 2002
Determinar el potencial tóxico del sistema Río Cuautla y de las descargas asociadas a través de la detección in vitro
de efectos a nivel multitrófico. (toxicidad aguda y crónica) en agua y sedimentos y la detección de actividad
estrogénica empleando el ensayo con levaduras recombinantes (Saccharomyces cereviciae).
11. “ESTUDIO DE PRETRATABILIDAD DE LAS AGUAS RESIDUALES DE PETROQUÍMIA PAJARITOS S.A. DE
C.V. EN LOS COMPLEJOS PETROQUÍMICOS DE CANGREJERA Y MORELOS”Proyecto PEMEX Petroquímica.
Fecha: 2002
Determinar las eficiencias de los sistemas experimentales para la remoción de carga tóxica a través del empleo de
tres organismos de prueba Daphnia magna, P. subcapitata (Selenastrum capricornutum) y Vibrio fischeri. Se efectuaron
comparaciones de tendencias de respuesta y se aplicaron principios de la metodología de Identificación y Evaluación de
Tóxicos (TIE) para determinar los principales grupos funcionales responsables de la toxicidad registrada.
12. “EVALUACIÓN TOXICOLÓGICA DE AGUAS DE CINCO EMBALSES DE LA REGION BALSAS”. Proyecto CNA.
Fecha: 2002
Análisis de la calidad del agua y caracterización toxicológica de cinco embalses de la Región Balsas. Aplicación de
batería de pruebas e identificación de contaminantes orgánicos , metálicos y ficotoxinas.
13. “CARACTERIZACIÓN DE LOS EEFLUENTES ACUOSOS DE LA PETROQUÍMICA PAJARITOS , S. A DE C. V. E
INGENIERÍA CONCEPTUAL DE SU TRATAMIENTO”. Proyecto PEMEX Petroquímica. Fecha: 2003-2004
Determinar las eficiencias de los sistemas experimentales para la remoción de carga tóxica a través del empleo de
tres organismos de prueba Daphnia magna, P. subcapitata (Selenastrum capricornutum) y Vibrio fischeri. Se efectuaron
comparaciones de tendencias de respuesta y se aplicaron principios de la metodología de Identificación y Evaluación de
Tóxicos (TIE) para determinar los principales grupos funcionales responsables de la toxicidad registrada.
14. “ESTIMACION TOXICOLOGICA DEL POSIBLE EFECTO DE LA DESCARGA DE LA EMPRESA BASF
MEXICANA EN EL AREA COSTERA DEL ESTADO DE TAMAULIPAS”.Proyecto BASF MEXICANA, S.A. Fecha:
2003 - 2004
Análisis de la calidad del agua de la descarga de la empresa Basf Mexicana, con base en los esquemas normativos
vigentes, a evaluación química de contaminantes y el desarrollo de pruebas biológicas de toxicidad aguda y crónica (D.
magna, P. subcapitata, Artemia sp, V. fischeri y Litopenaeus psetiferus) y aplicación de modelos de dispersión de
contaminantes.
76
PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Ecotoxicología acuática (ambientes epicontinentales y/o costeros),
Desarrollo de bioensayos en agua y sedimentos, para detección de efectos, agudos, crónicos y
mutagénicos..
Uso de biosensores para determinación de optimización y evaluación de funcionamiento de
plantas de tratamiento.
Aplicación de bioensayos para determinación de fracciones tóxicas en muestras ambientales o
aguas residuales (Identificación y Evaluación de Tóxicos , TIE por sus siglas en ingles)
Detección química de contaminantes en agua, sedimento y organismos (con énfasis en HAP, BPC
y Plaguicidas Organoclorados)
Control de calidad de pruebas biológicas.
Aplicación de modelos de dispersión para determinar dirección y transporte de agentes tóxicos
PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
LIBROS
Nacionales
1.
Pica-Granados Y. 2002. Serie Autodidáctica de Medición de la Calidad del Agua, Segunda Parte.
Análisis de Toxicidad en el Agua. Ed. Comisión Nacional del Agua- Instituto Mexicano de
Tecnología del Agua.. ISBN 968-55-36-21-X. P. 41
Intenacionales
2. Pica-Granados Y. y Díaz Báez C. 2000. “MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA LA EJECUCIÓN
DE BIOENSAYOS DE TOXICIDAD AGUDA. International Developent Research Center (IDRC).
Documento para publicación en hoja web http://www.idrc.ca/lacro/bioensayos. Para el proyecto “
ESTRATÉGIAS COMUNITARIAS Y ECOSISTÉMICAS DE EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DEL
AGUA, EN MUNICIPIOS DE AMÉRICA LATINA.
3.
Castillo, G., Díaz–Báez M.C., Pica-Granados Y.., Ronco, A ., Sánchez-Bain, A, 2001.. ..Red Watertox:
Toxicidad en Aguas Ambientales de Argentina, Chile, Colombia y México. Society
of
Environmental Toxicology and Chemistry (SETAC)”, Capítulo Latinoamérica. Buenos Aires, Argentina.
Distribución Internacional
4.
Ensayos toxicológicos y métodos de evaluación de calidad de aguas. Estandarización,
Intercalibración,2004.. Internacional Development Research Centre (IDRC) -IMTA. Ed. G.Castillo, 1ª
Ed. pp 198. ISBN-968 5536.
ARTICULOS
Internacionales
5. - F. J. Marquez-Rocha, Y. Pica-Granados, A. M. Sandoval-Villasana,R. Vázquez-Duhalt. 1998.
Determination of Genotoxicity Using a Choloperoxidase-Mediated Model of PAH-CNA Adduc
Formation. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 59:788-795.
6. .- Y Pica-Granados, D.G. Trujillo & Hernández S. H. 2000. Bioassay standarization for water
quality minitoring in Mexico.. In: Special Issue: Publication for Watertox Network, John Wiley &
Sons, Environm. Toxicol. 15: 322-330.
7. .- G. Forget, A. Sanchez-Bain, V. Arkhipchuk, T. Beaurregard, C. Blaise, G. Castillo, L.E. Castillo, M.C.
77
Díaz-Baez, Y Pica-Granados, A. Ronco, R.C. Sirvastava & Dutka B.J. 2000. Preliminary data of a
single-blind multicountry trial of six bioassays for water toxicity monitoring. In: Special Issue
9th Internatonal Symposium on Toxicity Assessment., John Wiley & Sons, Environm. Toxicol. 15:
362-369.
8.
.- M.C. Diaz-Baez, W.A. Sánchez, B.J. Dutka, A. Ronco, G. Castillo Y. Pica-Granados, L.E. Castillo,
J.Ridal, V. Arkhipchuk, and R.C. Srivastava. INTERNATIONAL ECOTOXICOLOGICAL EVALUATION
OF DRINKING WATER SUPPLIES USING A BATTERY OF BIOASSAYS . In: Special Issue 10th
Internatonal Symposium on Toxicity Assessment., John Wiley & Sons, Environm. Toxicol. Vol.17 (3):
232-240
9. .- Ronco, Gagnon P., M.C. Diaz-Baez, V. Arkhipchuk, G. Castillo, L.E. Castillo, B.J. Dutka, Y. PicaGranados, J. Ridal, R.C. Srivastava, A. Sánchez. OVERVIEW OF STATISTICAL RESULTS FROM
THE WATERTOX INTERCALIBRATION AND ENVIRONMENTAL TESTING PHASE II PROGRAM
In: Special Issue 10th Internatonal Symposium on Toxicity Assessment., John Wiley & Sons,
Environm. Toxicol Vol.17 (3): 241-249
10. Morales R , Pica-Granados Y., Rodríguez C., Goméz E., Escalante M., Izurieta J. 2004. Modelación de
la dispersión de la descarga de un emisor submarino en la zona costera del Golfo de México .
Mem. XXI Congreso Latinoamericano de Hidráulica
Nacionales
11. Pica-Granados, Y. Botello, A. V. Y Villanueva, F.S. 1998.Contaminación por hidrocaburos
aromáticos policíclicos en sedimentos y organismos del Puerto de Salina Cuz, Oaxaca,
México. Rev. Internal. de Contam. Amb. 11(1).21-30.
12. Pica – Granados Y, y Huerto-Delgadillo R. 2004. Evidencias de Agentes de disfunción endocrina
en sistemas acuáticos de México, un problema que demanda atención . Mem. XVIII Congreso
Nacional de Hidráulica . 1027-1034.pag
Artículos en revistas No arbitradas
Internacionales
13. .- Pica-Granados Y., Huerto D. R. I., Gutiérrez L. E y Bandala E. 1998. “ Sediment testing.
rd
Toxicological characterization of Lake Chapala. In: Proceedings of the 23 . Annual Aquatic
Toxicity Workshop. Canadian Technical Report of Fisheries and Aquatic Sciences No.2144. Alberta,
Canada.
Nacionales
14. .Pica-Granados Y., Trujillo, D.G., Hernández S.H. y R Huerto-Delgadillo. 2001. PRUEBAS DE
TOXICIDAD: Biotecnologías para el análisis integral de la calidad del agua, al alcance de países
en vías de desarrollo. Anuario del Instituto Mexicano de Tecnología del Agua.
CAPACIDAD ANALÍTICA
Matrices ambientales que analiza:
Agua dulce
Agua y sedimento, acumulación en tejidos. Desarrollo de (pruebas de
toxicidad y genotoxicidad diversas, caracterización fisicoquímica,
análisis químico de contaminantes orgánicos e inorgánicos (AA-HG,
GI, CG-Masas, HPLC, polarográfía) microbiológía y virología, entre
otros
Agua Marina Agua y sedimento, acumulación en tejidos. Desarrollo de pruebas de
toxicidad y genotoxicidad diversas, caracterización fisicoquímica,
análisis químico de contaminantes tanto orgánicos como inorgánicos
(AA-HG, GI, CG-Masas, HPLC,
polarografía) microbiología y
78
virología , entre otros
Sedimentos
Suelos
Otros
Ambientes de agua dulce y costeros. Desarrollo de pruebas de
toxicidad y genotoxicidad diversas, caracterización fisicoquímica,
análisis químico de contaminantes orgánicos e inorgánicos (AA-HG,
GI, CG-Masas, HPLC, polarografía), Microbiología y Virología, entre
otros
Caracterización física, pruebas de toxicidad diversas enfocadas a
mejoramiento de suelos, biorrememdiación y disposición de lodos
residuales,
análisis químico de contaminantes orgánicos e
inorgánicos (AA-HG, GI, CG-Masas, HPLC, polarografía), entre
otros, biorremediación y seguimiento de procesos de mejoramiento.
EL IMTA cuenta con diversos laboratorios acreditados ante EMA
para los diversos métodos que comprenden la capacidad analítica de
la institución, además cuenta con muy diversas
líneas de
investigación asociadas a diversas áreas como son :tratamiento de
aguas residuales, lodos residuales, biorremediación, hidrobiología y
evaluación ambiental, hidrología , hidráulica, riego y drenaje, entre
muchos otros, y de cada una de ellas pueden hacerse mención a
una larga lista adicional de capacidades analíticas. Por el momento
solo se han puesto algunas que se asocian al tema y objetivo de
este cuestionario.
Tipos de contaminantes que analiza:
Metales:
Plaguicidas:
Por AA, Horno de Grafito y Generador de Hidruros (Cd,
Cu, Co, Cr, Pb As, Hg, Zn, Ni, V, Se, , Fe, Mn, Mg, entre
otros)
Organoclorados, Organofosforados
Compuestos orgánicos: HAP, Nonilfenoles, ftalatos, COV, BTEX, BPC,
Trihalometanos, Heroicidad (GLifosato, 2,4 D), Microcistina
o Ácido domóico, Bases y Neutros ,, Carbarilos, Atrazina,
Fenoles,
Otros:
Barridos
de identificación de metabolitos y tóxicos
diversos no enmarcados en los grupos enlistados a través
de barridos cromatográficos e identificación por CG- Masas
Pruebas biológicas que realiza:
Bioensayos con:
Daphnia magna (aguda y crónica), Vibrio fischeri, Selenastrum capricornutum,
Hydra attenuata (Prueba aguda y teratogenicidad) , L. sativa, Penagrelles redivivus,
Allium sp (prueba aguda y genotoxicidad), Hyalella azteca , Chironomus riparius.
AMES, SOS, Cromotest, Microfluctuación.
Biomarcadores en:
NO
79
Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia):
Algunas de ellas se encuentran acreditadas por la Entidad Mexicana de acreditación
Certificado No . AG-177-032/04.
Las pruebas acreditadas son toxicidad aguda con Daphjnia magna y Vibrio fischeri,
y de genotoxicicdad AMES. El resto de las pruebas se realiza en apego a los
procedimientos de control descritos en los procedimientos del sistema de
Aseguramiento de la Calidad del laboratorio de pruebas.
Infraestructura con la que cuenta:
Equipo de laboratorio.
Todo el equipo se encuentra dentro de un programa de mantenimiento, calibrado o
verificado, según sea, con estándares o materiales de referencia certificados ,
validados o valorados (también según sea el caso)
Con fines de pruebas biológicas se cuenta con:
Balanza
analítica de doble escala, centrifuga, liofilizador, controladores de
temperatura, microscopios ópticos y estereoscópicos, invertido, sistema s de
extracción soxhlet, microondas, baños ultrasónicos, campanas de flujo laminar,
lector de microplacas, mufla, hornos, incubadoras con luz y temperatura controlada,
refrigeradores, ultracongeladores, cámaras frías, sistema de purificación de agua
Milli-Q, Microtox (2), Microtomo, Epectrómetro, Fluorómetro, oxímetros,
potenciómetros de campo y laboratorio, conductímetros, censores de amonio,
Redox, planchas de agitación y calentamiento, bombas peristálticas, pantallas de
iluminación, entre otros y equipo diverso de monitoreo en campo.
El laboratorio de toxicología cuenta con alrededor de 220 m2 con espacios
climatizados de acuerdo a las necesidades de los cultivos y de las pruebas. En
estas áreas se cuenta con control automático de (timers) de horas de luz y
oscuridad,. En esta área también se cuenta con corriente continua de energía
eléctrica para los sistemas que así lo requieran. El área se distribuye en dos
cuartos de cultivo de
organismos
para microensayos (algas, cladóceros,
nematodos, hydra entre otros etc), un espacio de observación y medición que
cuenta con equipos acordes a esta función como son microscopios, espectrómetros,
lectores de muicroplaca (colorimetros y espectrómetro), Microtox, incubadoras,
cámaras de iluminación incubación para pruebas agudas. Cuenta con un cuarto de
lavado y de preparación de medios, una área para ensayos y cultivos de peces,
una áreas de cuarentena y un cuarto para pruebas crónicas y de flujo continuo
donde también se mantienen especies para análisis de sedimento (Hyalella azteca y
C riparius). Esta habitación cuenta con instalación de sistemas hidráulico para flujo
en continuo y dosificación. También se cuenta con un cuarto refrigerado y una área
húmeda donde se produce agua de calidad Milli-Q para las distintas necesidades
de abasto.
80
En un área adicional, aislada de laboratorio de pruebas biológicas, se cuenta con
30 m2 más para procesamiento y manejo de muestras, donde se efectúa filtración,
preparación de soluciones, extracción orgánica y demás procesos de manejo
químicos de las muestras, cuando así es necesario.
Las pruebas de Ames, se realizan en otro espacio adicional de 30 m2 cuadrados
mas donde se cuenta con un cuarto de aislamiento con campana de flujo laminar,
contadores de colonia, incubadoras, y un equipo de Bioscreen para fines de la
técnica de microfluctuación
Infraestructura en General
El laboratorio de calidad del agua, cuenta con áreas aisladas para análisis
fisicoquímico, Química analítica que comprende Absorción atómica con la AA,
plasma y polarografía además de áreas de digestión de muestras, Cromatografía
de Gases con equipos acoplados a Masas, a Purga y trampa y Head Space con
detectores diversos, en esta áreas también se incluye un apartado para extracción y
manejo de muestras. Anexo se encuentra el área s de Cromatografía de líquidos y
espectrometría así como de balanzas.
El IMTA cuenta con un área de análisis de microbiología y virología de 250 m
cuadrado donde se cuenta con microscopía de epifluorescencia, microscopía
electrónica, lector de PCR, sistemas de electroforesis, autoclaves, campañas y
equipo de aislamiento y proliferación de microorganismos, entre otros.
El laboratorio de análisis de suelos donde se realizan pruebas físico-químicas
generales así como análisis de isotopía para determinación migración de
contaminantes, se emplean también técnicas de espectroscopia de fluorescencia y
espectrómetro de radiación beta por centelleo líquido.
Se cuenta con un área de invernadero con estanques secos para el cultivo de
Eisenia faetida para tratamiento de lodos de plantas de tratamiento y composteo
Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no)
Áreas y especies antes mencionadas. Las cepas carecen de certificado, solo se
cuenta con la carta de donación y el aval de la identificación con base a claves
taxonómicas
Respecto a C ripariun en este momento no se cuenta con la cepa
Compuestos de referencia certificados
Para fines de pruebas biológicas se emplean controles positivos elaborados con
sales grado reactivo analítico de l 99% de pureza que presente certificado del
productor como es el caso de Fulka, sin embargo este certificado no basta para el
81
CENAM (Centro Nacional de Metrología), quienes finalmente deberán proveer a los
laboratorios acreditados de los materiales y sustancias de referencia, sin embargo
en este momento el CENAM no esta en capacidad de abastecer las sales de Cr, Cu
y cristales de Fenol que se emplean como referencia de estas pruebas así que
extendió su autorización al IMTA para el uso del certificado de la compañía
productora
Este será el procedimiento que se tendrá que seguir en caso de una acreditación de
pruebas biológicas y de no existir la sustancia en los catálogos de CENAM.
Para el caso de las determinaciones químicas del área fisicoquímica, analítica y
microbiología CENAM ha abastecido algunos materiales de referencia.
Personal disponible
Para el manejo de pruebas biológicas se cuenta con Un responsable de área de
prueba de toxicidad y otro mas de prueba de AMES,. En cuanto a las primeras se
cuenta con dos técnicos especializados con 8 años de experiencia y dos
estudiantes. En genotoxicidad se cuenta con un técnico con 3 años de experiencia
y tres estudiantes. Los técnicos no forman parte del personal contratado por la
institución sus servicios se mantienen por pago de honorarios por proyecto.
Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza
Se tiene no solo la disposición sino la experiencia de impartir cursos teóricoprácticos para la transferencia tecnológica para el manejo de bioensayos. Los
talleres de entrenamiento fueron llevados a cabo en México, para capacitar
personal de los laboratorios Regionales de la Comisión Nacional del Agua y en
Argentina (La Plata), para Laboratorios pertenecientes a las municipalidades de
países del Cono Sur (Argentina, Uruguay, Colombia, Chile y Brasil).
El IMTA cuenta con un centro de capacitación con espacios de alojamiento y aulas
dentro de su infraestructura, la cual es muy adecuada para cualquier clase de
evento o taller.
82
CUESTIONARIO
DATOS GENERALES
Nombre del investigador:
PATRICIA RAMÍREZ ROMERO
Institución (donde labora actualmente):
UNIVERSIDAD AUTONOMA
METROPOLITANA
Dependencia de adscripción:
Área o departamento:
DEPTO. DE HIDROBIOLOGÍA
Grupo de investigación:
ECOTOXICOLOGÍA
Puesto del Investigador:
TITULAR “C” DE T.C.
Dirección de la institución:
Teléfono:
AV. SAN RAFAEL ATLIXCO # 186,
COL. VICENTINA,
MÉXICO, D. F. 09340
55-5804-6493
Fax:
55-5804-4738
Dirección electrónica:
[email protected]
FORMACIÓN PROFESIONAL
Licenciatura: Hidrobiología,
(1988)
Universidad
Autónoma
Metropolitana-Iztapalapa
Maestría : Biología Experimental, Universidad Autónoma MetropolitanaIztapalapa (1992)
Doctorado: Philosophy Doctor (Toxicología acuática), Miami University, USA,
(1997)
Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
He trabajado en el desarrollo de proyectos de investigación relacionados con los
efectos de los contaminantes (metales, HAPs) en los organismos acuáticos
(crustáceos) desde 1988 A partir de 1990 comencé a asesorar alumnos de
licenciatura en sus proyectos terminales y de servicio social. Actualmente también
asesoro estudiantes a nivel de maestría y doctorado, en diversas instituciones de
educación superior.
Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Biomarcadores en organismos acuáticos mexicanos para monitoreo ambiental.
Comparación de la toxicidad del cadmio, cromo y zinc en poblaciones silvestres
mexicanas de Hyalella azteca.
83
Evaluation of the acute and chronic toxcicity of fluoranthene-spiked sediments in
the presence of UV light using the amphipod Hyalella azteca.
Efectos de concentraciones subletales de cadmio sobre algunos parámetros
fisiológicos de Machrobrachium rosenbergii
Comportamiento de algunos contaminantes en la laguna de Tamiahua y capacidad
de autodepuración del sistema.
Evaluación de la calidad sanitaria del agua, sedimento y algunas especies de
interés comercial en la zona sur de la laguna de Tamiahua, Ver.
Efectos del cadmio y cromo en la sobrevivencia y respiración de Callinectes similis.
PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Fotoquímica y toxicidad de hidrocarburos policíclicos aromáticos
2. Toxicidad aguda y crónica de metales en invertebrados acuáticos.
3. Bioenergética como indicador del estrés causado por contaminación
4. Papel de la toxicología acuática en los estudios de Impacto Ambiental y en la
Evaluación del Riesgo Ambiental.
5. Calidad del agua y Educación Ambiental en áreas turísticas.
PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Evans, J., Fernández-Bremauntz F., Gavilán-García A., Ize-Lema I., Martínez-Cordero M.A.,
Ramírez-Romero P. y Zuk M. 2003. Introducción al Análisis de Riesgos Ambientales.
SEMARNAT-INE. México. 123 pp.
2. Ramírez-Romero, P., Ducoing-Chahó,E. y M. Castillo-González. 2003. Calidad Ambiental de las
Playas de la Rivera Maya, Municipio de Solidaridad, Q. Roo, México. Estrategia para la
Certificación de las Playas Limpias. Memorias en extenso. MarCuba 2003, VI Congreso de
Ciencias del Mar.La Habana, Cuba. 1-5 diciembre.
3. Ramírez-Romero, P. Bioacumulación, biodisponibilidad y efectos de los contaminantes sobre
los organismos acuáticos. En: Arredondo Figueroa, J.L. (ed.) Limnología de presas
mexicanas.UAM, UAEM. 605-617 (774p)
4. A. John Bailer, Bahjat Qaqish, James T. Oris and P. Ramírez-Romero. Accounting for possible
chamber effects via correlated binary data analysis methods. Env. Toxicol. Chem. (en prensa)
5. Ramírez, P., and J.T. Oris. Acute phototoxicty of sediments spiked with fluoranthene to the
amphipod Hyalella azteca. Environ. Contam. Toxicol. (en prensa)
6. Ramírez, P., and J.T. Oris. Chronic toxicity of fluoranthene spiked sediments in the presence of
ultraviolet radiation. Implications for the present SQC. Aquat. Toxicol. (en prensa)
CAPACIDAD ANALÍTICA
Matrices ambientales que analiza:
Agua dulce
X
84
Agua Marina
X
Sedimentos
X
Suelos
Otros
Organismos
Tipos de contaminantes que analiza:
Metales:
X
Plaguicidas:
Compuestos orgánicos:
HAPs
Otros:
Pruebas biológicas que realiza:
Bioensayos con:
Callinectes sapidus
Machrobrachium rosenbergii
Hyalella azteca
Artemia salina
Strombus gigas
Biomarcadores en:
Hyalella azteca (lipoperoxidación)
Artemia salina (ensayo cometa, lipoperoxidación)
Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia):
Infraestructura con la que cuenta:
Equipo de laboratorio
Acuarios para mantenimiento de organismos en laboratorio en condiciones
controladas. Horno de microondas para digestión de muestras diversas,
procesador de tejidos desde inclusión hasta teñido, equipo diverso que incluye
autoclaves, campana de flujo laminar, campanas de extracción, centrífuga,
microcentrífuga, centrífuga refrigerada, homogenizador de tejidos, microscopios,
analizador de oxígeno, salinómetro, laboratorio de campo Hach, cámara de
electroforesis, balanzas, y otros equipos menores.
85
Compuestos de referencia certificados
Personal disponible
En el laboratorio trabajamos 5 profesores de tiempo completo y un ayudante de
profesor de medio tiempo.
También contamos con el apoyo de estudiantes que realizan estancias
profesionales, servicio social, tesis de licenciatura y posgrado.
Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza
Si
86
CUESTIONARIO
DATOS GENERALES
Nombre del investigador:
Institución
actualmente):
(donde
Dependencia de adscripción:
Jaime Rendón von Osten
labora Universidad Autónoma de Campeche
Área o departamento:
Centro de Ecología, Pesquerías y
Oceanografía del Golfo de México
(EPOMEX)
Contaminación e Impacto Ambiental
Grupo de investigación:
Laboratorio de Ecotoxicología
Puesto del Investigador:
Profesor Investigador Tiempo Completo
Dirección de la institución:
Teléfono:
Av. Agustín Melgar entre Juan de la
Barrera y Calle 20
Colonia Buenavista
01 981 8119800 Ext 62305
Fax:
01 981 8119800 Ext 62399
Dirección electrónica:
[email protected]
FORMACIÓN PROFESIONAL
Doctor en Ciencias, Biología. Universidad de Aveiro, Portugal.
Maestría en Ciencias en Manejo de Recursos Naturales. El Colegio de la
Frontera Sur.
Químico Farmacéutico Biólogo. Universidad Veracruzana
Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Catedrático de la Asignatura de “Ecotoxicología” en el séptimo semestre de la
Carrera de Ingeniería Bioquímica Ambiental, Universidad Autónoma de
Campeche, desde 2000 a la fecha.
Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
1. Tropical and subtropical cost effective tools for an integrated risk assessment
of wetlands. Financiado por la Comunidad Europea.
2. Impactos antropogénicos sobre el recurso camarón en la Sonda de
Campeche. Financiado por RMNE-GSIPA-PEMEX.
87
3. Evaluación económica ambiental del impacto a la salud humana del uso de
agroquímicos en el sureste de México. Financiado por CONACYT-Sisierra
PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Evaluación de efectos adversos de plaguicidas en organismos acuáticos
utilizando biomarcadores
2. Efectos adversos en trabajadores agrícolas expuestos a plaguicidas
3. Residuos de compuestos orgánicos persistentes en substratos ambientales
4.
5.
PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. J. Rendón-von Osten, A. Ortiz-Arana, L. Guilhermino and A.M.V.M. Soares.
2005. In vivo evaluation of three biomarkers in the mosquitofish (Gambusia
yucatana) exposed to pesticides. Chemosphere 58(5):627-636.
2. J. Rendón-von Osten, A. Soares and L. Guilhermino. 2005. Black-bellied
whistling duck (Dendrocygna autumnalis) brain cholinesterase
characterization and diagnosis of anticholinesterase pesticide exposure in
wild populations from the Palizada river basin, Mexico. Environmental
Toxicology and Chemistry 24(2):313-317.
3. J. Rendón-von Osten, R. Tinoco-Ojanguren, A.M.V.M. Soares and L.
Guilhermino. Exposure to Pesticides and Acetylcholinesterase in
Campesinos from Campeche, Mexico. Archives of Environmental Health
(En prensa).
4. M. Moreira-Santos, A.L. Fonseca, S.M. Moreira, J. Rendón-von Osten, E.M.
Da Silva, A.M.V.M. Soares, L. Guilhermino and R. Ribeiro. Short-term
sublethal (sediment and aquatic roots of floating macrophytes) assays with
a tropical chironomid based on postexposure feeding and biomarkers.
Environmental Toxicology and Chemistry (En prensa)
5. Rendón-von Osten J, Memije-Canepa M, Ortíz-Arana A y F. González. 2004.
Residuos de plaguicidas en suelos de la zona agrícola de Chiná,
Campeche y evaluación de su toxicidad mediante biomarcadores. 1er
Congreso Asociación Mesoamericana de Ecotoxicología y Química
Ambiental A. C.
CAPACIDAD ANALÍTICA
Matrices ambientales que analiza:
Agua dulce
Contaminantes orgánicos persistentes
Agua Marina
Contaminantes orgánicos persistentes
Sedimentos
Contaminantes orgánicos persistentes y metales pesados
88
Suelos
Evaluación toxicológica y contaminantes orgánicos persistentes
Otros
Biomarcadores y contaminantes orgánicos persistentes en
tejidos (músculo y sangre), leche materna.
Tipos de contaminantes que analiza:
Metales:
Plomo, cadmio, zinc, cromo y cobre
Plaguicidas:
Organoclorados: DDTs (DDT, DDE y DDD), aldrín,
endrin, clordano, mirex, metoxicloro
Organofosforados: clorpirifos, malation, paration
Congeneros de Policlorobifenilos (PCBs)
Compuestos orgánicos:
Otros:
Pruebas biológicas que realiza:
Bioensayos con:
Gambusia (Gambusia yucatana)
Biomarcadores en:
Determinación de los biomarcadores:
Acetilcolinesterasa (AChE)
En músculo, cerebro y sangre
Glutation S-transferasa (GST)
En hígado y branquias
Lactato Deshidrogenasa (LDH)
En músculo
Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia):
Infraestructura con la que cuenta:
Cromatógrafo Varian 3800, con detectores de Ionizacion de Flama (FID) y
Captura de Electrones (ECD)
Cromatografo Fisson 8000, con detectores de Ionizacion de Flama (FID) y
Nitrógeno-Fósforo (NPD)
Lector de Microplaca EX LabSystem
Fluoroskan FL LabSystem
89
Absorción Atómica GBC 932AA
Equipo básico de laboratorio
Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no)
Cultivo de gambusias (Gambusia yucatana)
Compuestos de referencia certificados
Personal disponible
Dos técnicos con licenciatura en Químico Farmacéutico Biólogo.
Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que
realiza
Existe la disposición.
90
CUESTIONARIO
DATOS GENERALES
Nombre del investigador:
Dra. Cecilia Robles Mendoza
Institución (donde labora actualmente):
UNAM
Dependencia de adscripción:
Facultad de Ciencias
Área o departamento:
Dep. Ecología y Recursos Naturales
Grupo de investigación:
Ecofisiología
Puesto del Investigador:
Posdoctorado
Dirección de la institución:
Teléfono:
Circuito Exterior,
04510
Coyoacán D. F.
56224829
Fax:
56224828
Dirección electrónica:
[email protected]
Ciudad
Universitaria
FORMACIÓN PROFESIONAL
Licenciatura: En Biología, Facultad de Ciencias, UNAM. Promedio: 9.23. Tesis:
“Alteraciones ambientales de postlarvas y juveniles del camarón blanco Penaeus
setiferus (Crustacea: Decapoda) por efecto del amoniaco.” Obtención del título: 27
Noviembre de 1997.
Maestría: Postgrado en Biología de Sistemas y Recursos Acuáticos. Instituto de
Ciencias del Mar y Limnología, UNAM. Promedio 9.55. Tesis: “Efecto subletal del
amonio sobre juveniles de Litopenaeus setiferus (Crustacea: Decapoda)”. Obtención
del grado: 5 Junio de 2001.
Mención honorífica por ser una de las Mejores Tesis de Maestría en el Postgrado
del ICMyL-UNAM, año 2002.
Doctorado: Escuela de Doctorado en Ciencia y Tecnología Aplicada al Ambiente.
Universidad de Siena, Italia. Departamento de Ciencias Ambientales, Unidad
Ecotoxicología. Inicio Octubre 2001. Tesis: “Efecto de xantatos en organismos de
agua dulce: evaluación de riesgo y modo de acción tóxica”. Obtención del grado: 14
Marzo de 2005.
Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
1. Tutor de Servicios Sociales. Estudiante: Susana Alejandre Grimaldo Programa:
“Ecotoxicología de Crustáceos Acuáticos” Periodo: Octubre 1999 - Marzo 2000.
2. Actividad Docente. Profesor de Asignatura, Categoría: A. “Ecofisiología Animal”:
Materia Optativa de la Licenciatura de Biología. Facultad de Ciencias, UNAM. Donde
se realizaron biensayos de toxicidad aguda. Período de 3 semestres: 3 Abril 2000 – 18
91
Julio 2001.
3. Sínodal en exámenes profesionales.
a) “Evaluación del contenido de metales pesados en Tilapia (Oreohromis nilocutis”) de
la presa hidroeléctrica Zimapan”. Presentado por Jorge Alberto Valdiviezo Rodríguez.
14 Agosto 1998.
b) “Efecto del amonio en la osmoregulación de juveniles de Litopenaeus setiferus
(Crustacea, Decapoda)”. Presentado por Héctor Eduardo Ríos Torres. 27 Febrero
2001.
Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Participación en Proyectos de Investigación.
a) “Evaluación del efecto de compuestos nitrogenados y niveles limitantes de oxígeno
disuelto en la producción de postlarvas de camarones peneidos”. PAPIIT, IN 204295.
Agosto 1995 – Julio 1998.
b) “Efectos subletales del amonio en juveniles de Penaeus setiferus (Crustacea,
Decapoda)”. PAPIIT, IN 221998. Agosto 1998 – Julio 1999.
c) “Efectos subletales del amonio en juveniles de Litopenaeus setiferus (Crustacea,
Decapoda): metabolismo y actividad”. PAPIIT, IN 217999. Agosto 1999 – Julio 2001.
d) “Diagnosis del efecto biológico en el ambiente marino por la actividad de la industria
pretrolera en la Sonda de Campeche, México”. IMP-PEMEX No. IMP F.37062. Marzo –
Septiembre 2001.
e) “Ecotoxicología de xantatos”. Realizado con el grupo de trabajo de Ecotoxicología
del Departamento de Ciencias Ambientales, Universidad de Siena, Italia. Octubre
2001-Marzo 2005.
f) “Efecto del chlorpyrifos en el desarrollo de la rana Xenopus leavis”. Realizado con el
grupo de trabajo de Ecotoxicología y Biología del Desarrollo del Departamento de
Ciencias del Ambiente y del Territorio, Universidad de Milán-Bicocca, Italia. EneroMarzo 2005.
g) “Riesgo ecológico de la zona lacustre de Xochimilco por el uso de agroquímicos:
vulnerabilidad de la población del ajolote Ambystoma mexicanum” Laboratorio de
Ecofisiología de la Facultad de Ciencias, UNAM. Proceso de inicio.
PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Ecotoxicología de Compuestos nitrogenados. Aplicación de bioensayos:
a) Toxicidad aguda de amonio y nitrito y con la acción conjunta de niveles limitantes de
oxígeno disuelto. Endpoint: sobrevivencia.
b) Toxicidad crónica de amonio. Endpoint: crecimiento, campo de crecimiento y
sobreviviencia.
2. Ecotoxicología de xantatos. Aplicación de biensayos:
a) Toxicidad aguda sobre Vibrio fishery (endpoint: bioluminiscencia), Selenastrum
capricornutum (endpoint: reproducción), Lemna minor (endpoint: crecimiento), Daphnia
magna (endpoint: movilidad), renacuajo del sapo Bufo bufo (endpoint: sobrevivencia),
huevo, larva y juvenil (endpoint: sobrevivencia) de la trucha Oncorrynchus mykiss.
b) Toxicidad crónica sobre Daphnia magna (endpoint: eficiencia reproductiva) y
juveniles de O. mykiss (endpoint: histopatología de tejido branquial).
3. Ecotoxicología de Plaguicidas. Aplicación de bioensayos.
92
a) Toxicidad crónica sobre la rana Xenopus leavis. Endpoint: sobrevivencia y
teratogénesis.
b) Toxicidad aguda de agroquímicos sobre el ajolote A. mexicanum. Endpoint:
teratogénesis y sobrevivenvia.
c) Toxicidad crónica de agroquímicos sobre el ajolote A. mexicanum. Endpoint:
regeneración caudal.
PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Robles Cecilia and Vanegas Cecilia. Short-term effect of ammonia to Litopenaeus
setiferus juveniles: oxygen consumption, nitrogen excretion and ammonia and urea
accumulation. En preparación.
2. Robles Cecilia and Vanegas Cecilia. Chronic toxicity of ammonia to juveniles
Litopenaeus setiferus: scope for growth. En preparación.
3. Rios Eduardo, Vanegas Cecilia and Robles Cecilia. Osmoregulatory behavior of
Litopenaeus setiferus juveniles exposed to subletal levels of ammonia. En preparación.
4. Robles, C. e C. Gaggi. Valutazione Preliminare del Pericolo Potenziale degli Xantati
su Ecosistemi di Acqua Dolce. Atti del XIII Congresso Nazionale della Società Italiana
di Ecologia. Como, Italia.
5. Robles, C. and C. Gaggi. “Risk assessment of xanthates on freshwater
ecosystems”. En preparación.
6. Robles, C., C. Sensini, S. Focardi and C. Gaggi. “Histopathological action of
xanthates on gill tissue of Oncorhynchus mykis”. (Enviado: Chemosphere).
7. Robles, C., C. Gaggi, V. Croce and S. Galassi. “Chronic effect of xanthates:
Reproductive efficiency of Daphnia magna”. (Enviado, Aquatic Toxicology).
CAPACIDAD ANALÍTICA
Matrices ambientales que analiza:
Agua dulce
Si
Agua Marina Si
Sedimentos Monitoreo de niveles de metales pesados
Suelos
No
Otros
Tejido animal
Tipos de contaminantes que analiza:
Metales:
Mercurio
Plaguicidas:
Clorphyrifos
Se iniciará con el análisis de Organoclorados
Compuestos orgánicos:
Otros:
Amonio, nitrito y xantatos
Pruebas biológicas que realiza:
Bioensayos con:
93
Microalga (S. capricornutum), planta acuática (L. minor), crustáceos (D. magna,
Litopenaeus setiferus) anfibios (sapos y A. mexicanum) y peces (Brachydanio rerio,
Xiphophorus helleri, O. mykiss).
Biomarcadores en:
Crecimiento y campo de crecimiento (camarones peneidos)
Histopatología (peces)
Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia):
Infraestructura con la que cuenta:
Equipo de laboratorio:
1. Sistema respirométrico para camarones, peces y anfibios.
2. Oxímetros YSI
3. Espectrofotómetro de luz visible
4. Balanza Analítica Sartorious
5. Multianalizador de pH y conductividad Corning
6. Refractómetro Atago para medición de salinidad
7. Estufa BlumeM
8. Mufla para la combustión de muestras Thermolyne 1500
9. Microscopio estereoscópico Olympus
10. Microcentrífuga Eppendorf
11. Multianalizador de iones (Na+, Cl- y K+) Easy Lyte Plus
12. Sistema digestor de tejido
13. Multilector de placas Bio-Rad
14. Micro-osmómetro The Advanced 3300
15. Sistema para la determinación de la capacidad de nado de peces
16. Sistema para la preparación de muestras en laboratorio y su posterior evaluación
de metales pesados
17. Espectro de absorción atómica de flama y horno de grafito
Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no)
1. Área de mantenimiento de organismos acuáticos (camarones, peces y anfibios)
2. Área de ensayos toxicológicos con sistemas controlados de aireación y fotoperíodo
3. Acuarios para mantenimiento de organismos de agua dulce y salada
4. Sistemas de filtración mecánica, UV y biológica
Los organismos de prueba son mantenidos previamente en el laboratorio (bajo los
parámetros fisicoquímicos del ambiente y régimen de alimentación adecuados para
cada especie), el tiempo suficiente para garantizar su adecuado estado fisiológico al
inicio de los bioensayos de toxicidad.
Compuestos de referencia certificados
94
Personal disponible
Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza
Si de acuerdo a la disposición de tiempo.
95
CUESTIONARIO
DATOS GENERALES
Nombre del investigador:
Institución (donde labora actualmente):
Dependencia de adscripción:
Área o departamento:
Grupo de investigación:
Puesto del Investigador:
Dirección de la institución:
Teléfono:
Fax:
Dirección electrónica:
FORMACIÓN PROFESIONAL
LUCIA SALAZAR CORIA
INSTITUTO MEXICANO DEL PETROLEO
DIRECCION EJECUTIVA DE MEDIO AMBIENTE
Y SEGURIDAD
PROTECCION AMBIENTAL
EVALUACION INTEGRAL AMBIENTAL
ESPECIALISTA D
EJE CENTRAL LAZARO CARDENAS NO. 152.
COL SAN BARATOLO ATEPEHUACAN. CP.
07730
9175-8500
9175-8484
[email protected]
Licenciatura en Biología. FESC-Iztacala. UNAM
Maestría en Toxicología. ENCB-IPN
Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
ƒ
1993-1995. Evaluación del efecto de la temperatura de la descarga 2 refinería “General
Lázaro Cárdenas Minatitlán, Ver.
ƒ
1995. EOE-8017. Diagnóstico ambiental de la Laguna Lagarto y el medio circundante a
la estación 2 de rebombeo Loma Bonita, Oax
ƒ
1996. DOC-8081. Evaluación del impacto del río Pánuco , debido a la influencia de la
refinería y terminal marítima de Cd. Madero, Tamps. Informe Técnico integral de la
temporada de lluvias (segunda etapa).
ƒ
1996.DOC-8084. Evaluación del Impacto del río Coatzacoalcos, debido a la influencia
de la refinería de Minatitlán, Ver”. Informe Técnico Integral de la temporada de lluvias
(segunda etapa). Agosto, 1996
ƒ
1996. DOC-8151. Caracterización fisicoquímica y biológica de la bahía y estero la
Ventosa y las lagunas superior e inferior, Salina Cruz, Oax. Diagnóstico ambiental del
estero La ventosa. (Dictamen Final).
ƒ
1996. .EOE-8084 Evaluación del impacto del río Coatzacoalcos debido a la influencia
de la refinería de Minatitlán, Ver. Informe Técnico Integral Final (Ciclo Anual)
ƒ
1997. EOE-8085. Evaluación del impacto del río Pánuco debido a la influencia de la
refinería y terminal marítima de Cd. Madero, Tamps. Informe Técnico Integral Final
ƒ
1996. DOC-0002. Descripción del escenario ambiental de la región de mayor incidencia
96
ƒ
ƒ
ƒ
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ƒ
de la especie Penaeus setiferus. Cruceros oceanográficos Perfotox I-II
1997. DOC-8059. Bioacumulación y seguimiento de contaminantes en el río Pánuco y
sus principales influentes (Canal de Chijol y Varadero).
1997. DOC-8060. Bioacumulación y seguimiento de contaminantes en la Cuenca Baja
del río Coatzacoalcos y sus principales influentes (Calzadas Arroyo Teapa)
1997. DOC-6200. Evaluación del grado de afectación
por las emisiones de
dibenzodioxinas y dibenzofuranos en el ambiente circundante al CPQ Pajaritos.
1997. DOC-8062. Creación de marcos de referencia ambientales para los dragados de
mantenimiento en terminales marítimas de Pemex Refinación (terminal marítima de
Madero) junio 1997
1997. DOC-8063. Creación de marcos de referencia ambientales para los dragados de
mantenimiento en terminales marítimas de Pemex Refinación (terminal marítima de
Pajaritos)
1998. DOC-8075. Caracterización del grado de toxicidad de las descargas en las
refinerías “Gral. Lázaro Cárdenas del río de Minatitlán, Ver. Y “Francisco I. Madero de
Cd. Madero, Tamps.
1998. Diagnóstico ambiental del arroyo San Francisco
1998. Diagnóstico ambiental de la Laguna Limón, pantano y arroyo los monos en
relación al complejo procesador de gas de Ciudad Pemex.
1998. Evaluación ambiental del pantano Santa Alejandrina y Arroyo San Francisco.
1998. DOC-8106. Identificación de posibles compuestos tóxicos en las aguas
residuales vertidas al río de los remedios en la zona de San Juan Ixhuatepec.
1998. P.00644. Circulación y transporte en la cuenca baja del río Panuco como base
para evaluar la sensibilidad y riesgo ecológico del sistema.
1998. DOC-8106. Monitoreo de aguas residuales en Sn. Juan Ixhuatepec"
1999. DOC-8041. Creación de marcos de referencia ambientales para los dragados de
mantenimiento en terminales marítimas de PEMEX-Refinación"
1999. DOC-7217. Evaluación del sistema acuático superficial y subterráneo del CPG
Cd. de PEMEX"
1999. DOC-7205. Estudio ambiental integral de la región de Salina Cruz, Oax.
1999. DOC-7221. Estudio y evaluación de las aguas residuales de instalaciones de
distribución de PEMEX-Refinación"
1999. P.00473. Investigación sobre el origen y dispersión de las emisiones naturales y
antropogénicas de las actividades costa afuera de petróleos mexicanos.
1999. P.011 96F-48-VI. Biodegradación de compuestos recalcitrantes
1999. P.01350. Evaluación ambiental del derrame provocado por la toma clandestina
del poliducto Minatitlán-Salina Cruz, Oax. en el arroyo Igú y Laguna Superior, Oax.
2000. F.00291. Evaluación del efluente de la refinería e Cadereyta y el cuerpo receptor
asociado.
2000. F.00244. "Diagnóstico de la contaminación por hidrocarburos en el subsuelo de
la terminal de almacenamiento y distribución de Pachuca, Hgo."
2000. F.00009. Desarrollo y evaluación de prueba de campo para la biorremediación
del pantano Santa Alejandrina, Minatitlán, Ver.
2001 F.27035. Análisis de efluentes en Pajaritos, Ver.
2001. F.00291. Evaluación del efluente de la refinería de Cadereyta
2001 F.01421. Estudio para e control de corrosión interior en ductos para el transporte
de hidrocarburos de la región marina noreste.
2001. D.00888. Desarrollo de combustibles de bajo impacto ambiental.
2001 D.00017. Investigación sobre evaluación ambiental de procesos de refinación del
petróleo.
2001 D.00015. Evaluación de las actividades costa afuera e instalaciones costeras
97
ƒ
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ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
asociadas en el ambiente marino de la Sonda de Campeche.
2002 F.21016. Estudio de seguimiento del proyecto ambiental integral de la región de
Salina Cruz, Oax.
2002. F.20764. Evaluación ambiental del derrame provocado por la toma clandestina
del poliducto minatitlán-salina Cruz, Oax. en el arroyo Sn. Pedro, estero Xadani y
laguna superior
2002 K.00513. Implantación de modelos biológicos para la evaluación ecotóxica de
sistemas acuáticos influidos por actividades de la industria petrolera.
2002 F.00009. Desarrollo y evaluación de prueba de campo para la biorremediación del
pantano Santa Alejandrina, Minatitlán, Ver.
2002. F.37062. Evaluación de los efectos de las actividades petroleras Costa afuera e
instalaciones costeras asociadas en el ambiente marino de la sonda de Campeche".
Fase I.
2002. F.20700. Programa de Seguimiento del proyecto ambiental de Salina Cruz, Oax.
(recursos acuáticos).
2003. F.20713. Restauración del Pantano Santa Alejandrina, Minatitlán, Ver.
2003. F. 52678. Evaluación de los efectos de las actividades petroleras costa afuera e
instalaciones costeras asociadas en el ambiente marino de la Sonda de Campeche.
Fase II. Evaluación prospectiva.
2004. F.21176. Diagnóstico de la contaminación en el DDV Villahermosa-Minatitlán
2004. F.30348. Estudios para la evaluación de corrosión
2005. F.52678 Evaluación de los efectos de las actividades petroleras costa afuera e
instalaciones costeras asociadas en el ambiente marino de la Sonda de Campeche.
Fase II. Evaluación final.
PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Evaluación de efectos tóxicos en sistemas acuáticos marinos y continentales
por contaminación con productos del petróleo.
2. Evaluación de toxicidad de agua y sedimentos.
2. Evaluación de toxicidad de inhibidores de corrosión y lodos y recortes de
perforación y productos químicos.
3. Evaluación de toxicidad de emisiones vehiculares
5. Monitoreo de bioacumulación/biodisponibilidad de contaminantes en sistemas
acuáticos
PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. 2004. Ecotoxicología de la Sonda de Campeche. Capitulo del libro PEMEX y la salud
ambiental en la Sonda de Campeche.
2. 2005. Sediment acute toxicity and its relation with nickel and vanadium levels. Articulo en
revista Bull. Environ. & Toxicol. En prensa.
98
CAPACIDAD ANALÍTICA
Matrices ambientales que analiza:
Agua dulce
Agua Marina
Sedimentos
Suelos
Otros
X
x
x
x
Lodos y recortes de perforación, inhibidores de corrosión, descargas,
emisiones vehiculares (gases y particulas totales), petroleo crudo,
productos químicos
Tipos de contaminantes que analiza:
Metales:
Plaguicidas:
Compuestos orgánicos:
Ni, V, Ba, Cu, Zn, Hg, Pb, Cd, As, Fe.
Hidrocarburos poliaromáticos, Hidrocarburos totales del
petróleo, hidrocarburos aromáticos totales.
Otros:
Pruebas biológicas que realiza:
Bioensayos con:
Vibrio fischerii (Photobacterium phosphoreum)
Artemia franciscana
Daphnia magna
Panagrellus redivivus
Cyrpidpsis vidua
Hyalella azteca
Limnodrillus hoffmeisteri
Ankistrodesmus falcatus
Selenastrum capricornutum
Biomarcadores en:
EROD en higado, branquias y gónadas de peces
Acetil colinesterasa en peces, crustáceos y oligoquetos
Proteinas totales
Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia):
Infraestructura con la que cuenta:
Equipo de laboratorio
Cámara ambiental, microscopios óptico y estereoscopico, centrifuga, microcentrifuga
de refrigeración, macerador de tejidos, estufas, incubadora, refrigerador, congelador,
espectrofotometro de UV, espectrofotómetro de fluorescencia, balanza analítica,
balanza semianalítica, medidor de parámetros de agua (pH, OD, salinidad, Redox),
turbidímetro, destiladora, desionizador, sistema de acuarios, laboratorio móvil de
99
monitoreo de aguas.
Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no)
Artemia franciscana
Daphnia magna
Panagrellus redivivus
Cyrpidpsis vidua
Hyalella azteca
Limnodrillus hoffmeisteri
Ankistrodesmus falcatus
Selenastrum capricornutum
Chlorella vulgaris
Dunaliella sp.
Compuestos de referencia certificados
Personal disponible
3 técnicos
Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza
100
CUESTIONARIO
DATOS GENERALES
Nombre del investigador:
Dr. S.S.S. Sarma
Institución (donde labora actualmente):
UNAM
Dependencia de adscripción:
Iztacala
Área o departamento:
Posgrado
Grupo de investigación:
Ecologia y Ecotoxicologia de Zooplancton
Puesto del Investigador:
Prof. Tit. “C”, TC. Def.
Dirección de la institución:
Teléfono:
Av. Los Barrios, FES Iztacala, AP 314,
CP 54090, Los Reyes, Iztacala,
Tlalnepantla, Edo. de Mexico
56231125
Fax:
5231256
Dirección electrónica:
[email protected]
FORMACIÓN PROFESIONAL
Doctor en Ciencias Zoologicas (Desde 1988);
Sistema Nacional de Investigadores (SNI) Nivel II
Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Tutor principal de Maestria y Doctorado (UAM, UNAM y IPN)
Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
CONACyT y PAPIIT (UNAM): proyectos relacionados de ecotoxicologia de
zooplancton
PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1.Cultivo y uso de rotiferos como organismos de bioensayo
2.Cultivo y uso de cladoceros como organismos de bioensayo
3.Cultivo y uso de ostracodos como organismos de bioensayo
4.Cultivo y uso Chlorella como organismos de bioensayo
5.Cultivo y uso de Scenedesmus como organismos de bioensayo
101
PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Sarma SSS, Núñez-Cruz HF & Nandini S 2005 Effects on the population
dynamics of Brachionus rubens (Rotifera) caused by mercury and cadmium
administered through medium and algal food (Chlorella vulgaris). Acta Zoologica
Sinica 51(1): 46-52
2. Ramírez-Pérez T, Sarma SSS & Nandini S 2004. Effects of mercury on the life
table demography of the rotifer Brachionus calyciflorus Pallas (Rotifera).
Ecotoxicology 13: 535-544
3. García-García G, Nandini S & Sarma SSS 2004 The effect of cadmium on the
population dynamics of Moina macrocopa and Macrothrix triserialis (Cladocera).
Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology 72(4): 717-724 (SpringerVerlag, USA).
4. Gama-Flores JL, Sarma SSS & Nandini S 2004 Acute and chronic toxicity of the
pesticide methyl parathion to the rotifer Brachionus angularis (Rotifera) at different
algal (Chlorella vulgaris) food densities. Aquatic Ecology 38: 27-36
5. Nandini S, Mayeli SM & Sarma SSS 2004 Effect of stress on the life table
demography of Moina macrocopa. Hydrobiologia 526: 245-254
CAPACIDAD ANALÍTICA
Matrices ambientales que analiza:
Agua dulce
X
Agua Marina
Sedimentos
Suelos
Otros
Tipos de contaminantes que analiza:
Metales:
Plaguicidas:
X
X
Compuestos orgánicos:
X
Otros:
Microcystis
Pruebas biológicas que realiza:
Bioensayos con:
Alga, Zooplancton, Larva de Pez
Biomarcadores en:
102
Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia):
Infraestructura con la que cuenta:
Varios Equipos de laboratorio
Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no)
Sepas de varias especies de alga y zooplancton
Compuestos de referencia certificados
Personal disponible
Dr SSS Sarma
Dra Nandini Sarma
Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza
103
CUESTIONARIO
DATOS GENERALES
Nombre del investigador:
REFUGIO RODRÍGUEZ VAZQUEZ
Institución (donde labora actualmente):
CINVESTAV-IPN
Dependencia de adscripción:
Área o departamento:
DEPTO.
DE
BIOTECNOLOGÍA
BIOINGENIERIA
BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL
Grupo de investigación:
XENOBIOTICOS
Puesto del Investigador:
CINVESTAV 3C (TITULAR)
Dirección de la institución:
Teléfono:
AV. IPN 2508,
MÉXICO D.F.
50613316
Fax:
50613313
Dirección electrónica:
[email protected]
[email protected]
COL.
Y
ZACATENCO,
,
FORMACIÓN PROFESIONAL
ING. QUIM.IND., ESIQIE-IPN
M. C. QUÍMICA ORGANICA, CINVESTAV-IPN
DR. C. EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LA MADERA, UNIVERSIDAD ESTATAL DE
COLORADO
Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
-CURSO DE BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL (SECCION DE BIOENSAYOS),
CINVESTAV-IPN
- CONFERENCIAS OFRECIDAS EN FOROS NACIONALES E INTERNACIONALES
POR INVITACIÓN (BIORREMEDIACION-BIOENSAYOS ECOTOXICOLOGICOS)
Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
BANCO MUNDIAL-INE
PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. BIORREMEDIACION DE SUELOS POR BIOESTIMULACION Y PRUEBAS
ECOTOXICOLOGICAS
104
2.
BIORREMEDIACION
DE
SUELOS
POR
BIOPILAS
Y
PRUEBAS
ECOTOXICOLOGICAS
3.
4.
5.
PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1.
2.
3.
4.
5.
CAPACIDAD ANALÍTICA
Matrices ambientales que analiza:
Agua dulce
Agua Marina
Sedimentos
Suelos
DIGESTOR PARA DETERMINACIÓN DE N; CENTRÍFUGA
REFRIGERADA (DETERMINACIÓN DE COPs); MICROSPOPIOS;
CAMPANAS
DE
FLUJO
MALINAR
(DETERMINACIÓN
MICROBIANA); INCUBADORAS AGITADORAS E INCUBADORAS
ESTATICAS (CULTIVO DE MICROORGANISMOS); EQUIPO DE
EXTRACCIÓN
DE
COPs
(SONICADOR,
SOXHLET,
ROTOEVAPORADOR, ETC).
Otros
Tipos de contaminantes que analiza:
Metales:
ADSORCION ATOMICA CON HORNO DE GRAFITO
(DETERMINACIÓN
DE
METALES);
ADSORCION
ATOMICA (DETERMINACIÓN DE METALES);
Plaguicidas:
CROMATOGRAFÍA DE GASES/MS (DETERMINACIÓN DE
COPs);
Compuestos orgánicos: CROMATOGRAFÍA DE GASES/MS (DETERMINACIÓN DE
COPs);
Otros:
UV-VISIBLE
(DETERMINACIÓN
DE
ACTIVIDADES
DE
GASES
ENZIMATICAS);
CROMATOGRAFÍA
(RESPIRACIÓN MICROBIANA) ;
Luminómetro; electroforesis, etc.
Pruebas biológicas que realiza:
Bioensayos con:
Pseudomonas putida
Lombrices
105
Germinación de semillas
Actividades enzimáticas
Biomarcadores en:
Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia):
Infraestructura con la que cuenta:
Equipo de laboratorio
Mismo que el antes mencionado
Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no)
EL DEL CINVESTAV-IPN
Compuestos de referencia certificados
Personal disponible
1 AUXILIAR (IBQ)
1 AUXILIAR (DR. EN CIENCIAS)
1 TECNICO
Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza
SI SE TIENE DISPOSICIÓN E INFRAESTRUCTURA
106
CUESTIONARIO
DATOS GENERALES
Nombre del investigador:
Institución
actualmente):
(donde
Alma Socorro Sobrino Figueroa
labora Universidad
Iztapalapa
Autonoma
Metropolitana-
Dependencia de adscripción:
División C.B.S.
Área o departamento:
Hidrobiología
Grupo de investigación:
Ecotoxicología
Puesto del Investigador:
Profesor Titula “C” Tiempo Completo
Dirección de la institución:
Av. San Rafael Atlixco # 186 C.P. 09340 Col. Vicentina
Iztapalapa D.F. México
Teléfono:
58-04-64-74
Fax:
58-04-47-38
Dirección electrónica:
[email protected]
FORMACIÓN PROFESIONAL
Licenciatura: Biología con área de concentración en Hidrobiología UAMI
Maestria: Maestria en Ciencias (Biología) Facultad de Ciencias UNAM
Doctorado: Doctorado en Ciencias Marinas. CICIMAR-IPN
Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Imparto actualmente la parte práctica (laboratorio) de la UEA (Unidad de EnseñanzaAprendizaje) de “Alteración de Ecosistemas” perteneciente a la licenciatura de
Hidrobiología.
Se han propuesto las siguientes materias optativas:
Ecotoxicología I y II
Técnicas de análisis de contaminantes I y II
Y se ha impartido un curso especial denominado:
“Evaluación de la calidad del agua de efluentes”.
Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
107
He participado como responsable o colaborador en los siguientes proyectos:
1. Evaluación geoquímica ambiental y diagnosis de la zona costera de
Veracruz: lagunas de Tamiahua, Pueblo Viejo y Tampamachoco. Clave 3232T
CONACYT 1994-1995. (Colaborador)
2. Efectos de genotoxicos detectados en agua y sedimento de la laguna de
Tamiahua, Ver. Sobre larvas de Crassostrea virginica.
UAMI 1996-1997,
(Responsable)
3. Origen, naturaleza y evaluación de fuentes contaminantes en Bahía de la
Paz, B.C.S., y su impacto en la biota. CICIMAR-IPN, 1996. (Colaborador)
4. Hidrocarburos y Metales tóxicos en cuerpos acuáticos y su bioacumulación
(Evaluación de la Toxicidad de sedimentos). Laboratorio de Contaminación Marina
Instituto de Ciencias del Mar y Limnologia UNAM y Gerencia de Seguridad Industrial
y Protección Ambiental de PEMEX Exploración y Producción en la Región Sur. 2001
(F50003). (Colaborador)
5. Biomarcadores en organismos acuáticos mexicanos para monitoreo ambiental
UAMI 2002-2005. (Responsable)
6. Monitoreo Ambiental Integral de los impactos de la actividad petrolera en la
Laguna Yucateco, Tabasco, México. Laboratorio de Contaminación Marina
Instituto de Ciencias del Mar y Limnología UNAM y Instituto Mexicano del
Petróleo, 2003-2004. (Colaborador).
7. Determinación del riesgo ecológico de un ambiente acuático. UAMI- IIO UABCS.
(Colaborador)
PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1.Evaluación del efecto de metales tóxicos (cadmio, plomo y cromo) en organismos
marinos (Almeja catarina, Artemia franciscana, ostión), y de agua dulce (Daphnia,
ostracodos)
2.Evaluación del efecto tóxico y genotóxico de sedimentos
3.Evaluación de biomarcadores en organismos expuestos a estresores.
(Lipoperoxidación, daño genético por ensayo cometa, determinación de
acetilcolinesterasa, de actividad de EROD)
4.Bioacumulacion de metales en almejas (Argopectan ventricosus)
5.
PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Sobrino-Figueroa, A. 2004. Indicadores biológicos. In: Arredondo Figueroa, J.L.
(Ed.). Limnología de presas mexicanas. U. A. M., México (en prensa).
2. Sobrino-Figueroa, A., Villanueva S. Y A.V. Botello. 2004. Efecto de genotóxicos en
sistemas costeros de Veracruz. In: A.V. Botello, (Eds.). Golfo de México: Contaminación e
Impacto Ambiental. Diagnóstico y tendencias. 2ª Ed. SEP, UAC, EPOMEX, Serie Científica,
5, (en prensa).
3. A. Sobrino-Figueroa C. Cáceres-Martínez A.V. Botello. 2005 Effects of
Cadmium, Chromium, Lead and its mixtures on juveniles of the Catarina
108
Clam Argopecten ventricosus (Sowerby II, 1842). (En preparación)
4.
5.
CAPACIDAD ANALÍTICA
Matrices ambientales que analiza:
Agua dulce
Efecto tóxico por medio de bioensayos agudos con Daphnia magna y
ostrácodos. Evaluación de presencia de genotóxicos por el método de
Chromotest.
Agua Marina Efecto tóxico por medio de bioensayos agudos con Artemia
franciscana. Evaluación de presencia de genotóxicos por el método de
Chromotest.
Sedimentos Determinación de metales por la técnica de Absorción Atómica.
Suelos
Otros
Tipos de contaminantes que analiza:
Metales:
Cadmio, plomo y cromo
Plaguicidas:
Compuestos orgánicos:
Otros:
Sustancias con efecto genotóxico
Pruebas biológicas que realiza:
Bioensayos con:
Chlorella vulgaris, Tetraselmis sp.
Daphnia magna, Artemia franciscana, ostracodos (Cypris).
Larvas de ostión y almeja (Argopecten ventricosus).
Adultos de ostión y almeja
Peces (Atherinidos) (Se están montando las técnicas para trabajar con estos
organismos).
Biomarcadores en:
Efecto radicales libres (Lipoperoxidación), Daño genético (Ensayo cometa,
Chromotest), inhibición de acetilcolinesterasa, actividad de EROD, histología,
variación en concentración de proteínas lípidos y carbohidratos de la glándula
digestiva de moluscos.
Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia):
109
Infraestructura con la que cuenta:
Equipo de laboratorio
Todo lo necesario para la ejecución de bioensayos.
Para digestión de muestras ambientales (por microondas).
Equipo para la determinación de los biomarcadores.
Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no)
Cepas de Clorella vulgaris, Tetraselmis sp. Daphnia magna, Quistes de Artemia
franciscana, cepa de ostracodos (Cypris)
Compuestos de referencia certificados
Personal disponible
En el laboratorio de Ecotoxicología se encuentran adscritas:
M. en C. Guadalupe Barrera Escorcia,
M. en C. Xochitl Guzmán Garcia
Dra. Patricia Ramírez Romero y
Dra. Alma S. Sobrino F.
Se tiene un ayudante academico y estudiantes realizando seminarios de investigación
o servicios sociales.
Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza
Estoy en la mejor disposición de realizar pruebas biológicas como servicio a otras
instituciones e impartir cursos sobre bioensayos y tópicos afines.
110
CUESTIONARIO
DATOS GENERALES
Nombre del investigador:
Institución
(donde
labora
actualmente):
Dependencia
de
adscripción:
Área o departamento:
Grupo de investigación:
Puesto del Investigador:
Dirección de la institución:
Teléfono:
Fax:
Dirección electrónica:
FORMACIÓN PROFESIONAL
M en C RAUL URIBE HERNANDEZ
INSTITUTO MEXICANO DEL PETROLEO
MEDIO AMBIENTE Y SEGURIDAD
RESTAURACION
RESTAURACION
ESPECIALISTA
L. Cárdenas 152,
Atepehuacan
9175 8404
9175 8000
[email protected]
Col.
San
Bartolo
Biólogo, UNAM
M en C especialidad Toxicología, IPN
Candidato a Dr. con especialidad Ciencias Químico- Biológicas-IPN
Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de
bioensayos
Pruebas especiales en Hematología ENCB-IPN
Cultivo de tejidos animales y pruebas de citotoxicidad ENCB-IPN
Patología Humana ENCB-IPN
Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
Evaluación ecotoxica de suelo contaminado con hidrocarburos en Ver.
Evaluación de la toxicidad emisiones de gasolina y diesel
Evaluación ecotoxica de suelo bioremediado en Tabasco y Ver.
Evaluación ecológica de un ecosistema tropical impactado con hidrocarburos
o
PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Pruebas de fitotoxicidad de suelos contaminados con hidrocarburos
2. Pruebas de Toxicidad con Lombriz de tierra en suelo contaminado
con hidrocarburos
3. Pruebas de toxicidad in vitro de matrices ambientales contaminadas
4.
111
5.
PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. PEREZ ZAPATA A.J., VEGA BARRITA M..L. Y URIBE HERNANDEZ R.,
1998, ESTUDIO IN VITRO DEL EFECTO TOXICO DEL PLOMO EN LA
BIOSINTESIS DE PORFIRINAS . ANALES DE LA ESC. NAC. DE CIENC.
BIOL.-IPN.6:51-63.
2. URIBE HERNANDEZ R., MARTINEZ-MARTINEZ V.E. AND AVELINOZAPATA G.E., 2000. EVALUATION OF THE BIOREMEDIATION
TECHNOLOGY FOR DRILLING OF OIL WASTE WELLS IN TABASCO.
PROCEEDINGS OF FIRST INTERNATIONAL CONFERENCE ON
PETROELUM BIOTECHNOLOGY;MEXICO CITY, 207-210 pp.
3. URIBE-HERNÁNDEZ R., AVELINO Y ZAPATA G.E., MONTES DE OCA-GARCÍA
M.A., ZERMEÑO-EGUÍALIZ J.A., ORTIZ-CORNEJO N. L., SALAZAR-CORIA L.,
CASTRO ORTÍZ L., MARTÍNEZ–MARTÍNEZ V.E., 2004. ECOTOXICIDAD DE
HIDROCARBUROS DEL PETROLEO EN RELACION A LA DESORCION Y
DEGRADACION EN SUELO CONTAMINADO DEL SURESTE MEXICANO
4. ZERMEÑO E.L., URIBE H.R., SALAZAR C.L., CAMACHO R.A., ET AL, 2000.
FEASIBILITY STUDIES AND TOXICITY TESTS FOR PHYTOREMEDIATION
OF SOILS CONTAMINTED WITH HYDROCARBONS. PROCEEDINGS OF
FIRST
INTERNATIONAL
CONFERENCE
ON
PETROELUM
BIOTECHNOLOGY; MÉXICO CITY,235-239 pp.
5. URIBE H.ERNANDEZ R. , PEREZ Z.APATA A.J., 2002. GENOTOXICITY
MECHANISM OF THE PAHS THROUGH OF FREE RADICAL OXYGEN IN
HUMAN BLOOD CELLS. TOXICOLOGY LETTERS, 123 (SUPPL. 1):122.
CAPACIDAD ANALÍTICA
Matrices ambientales que analiza:
Agua dulce
Agua Marina
Sedimentos
Suelos
Otros
Tipos de contaminantes que analiza:
Metales:
Plaguicidas:
Compuestos orgánicos:
Otros:
Pesados y de transición
Petróleo y sus productos refinados
Pruebas biológicas que realiza:
Bioensayos con:
Especies vegetales como hortalizas y pastos
Lombriz de tierra
112
Líneas celulares de mamíferos y de peces
Biomarcadores en:
En vegetales son clorofilas y peroxidasas
El lombriz son hemoglobina y cloroperoxidasa
En cultivos celulares son porfirinas, ferroquelatasa, deshidratasa, radicales
libres de oxígeno, fragmentos de DNA.
Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia):
Infraestructura con la que cuenta:
Equipo de laboratorio
Centrifugas
Balanzas
Campana de flujo laminar
Autoclaves
Incubadoras
Espectro uv
HPLC
Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no)
Lombriz de tierra (No certificados)
Leucocitos humanos (No certificados)
Líneas celulares (Certificadas)
Compuestos de referencia certificados
HAP certificados
Personal disponible
Técnicos, Profesionistas, Maestros Ciencias y Doctores
Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza
Mediante convenio o solicitud de capacitación con estancias programadas.
113
CUESTIONARIO
DATOS GENERALES
Nombre del investigador:
Dra. Cecilia Vanegas
Institución (donde labora actualmente): Facultad de Ciencias, Universidad
Nacional Autónoma de México.
Dependencia de adscripción:
Laboratorio de Ecofisiología, Facultad de
Ciencias;
Universidad
Nacional
Autónoma de México.
Área o departamento:
Departamento de Ecología y Recursos
Naturales
Grupo de investigación:
Ecofisiología y Ecotoxicología Acuática
Puesto del Investigador:
Teléfono:
Profesor de Carrera Titular “A”, Tiempo
Completo
Ciudad Universitaria; Av. Universidad
3000; Col. Copilco el Bajo. C.P. 04510
56224829
Fax:
56224828
Dirección electrónica:
[email protected]
Dirección de la institución:
FORMACIÓN PROFESIONAL
Dra. en Ciencias (Biología). Obtención de Grado. 1996
Estancia Postdoctoral: Universidad de Plymouth, Inglaterra. 2002-2003
Area de especialidad: Ecofisiología y Ecotoxicología Acuática
Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de
bioensayos
1. Docencia
1.1.Nivel Licenciatura: 1986 a la fecha
1.1.1. Aspectos Ecotoxicológicos en Organismos Acuáticos.
1.1.2. Taller Terminal. Diagnósctico Ambiental y Evaluación de Riesgo Ecológico
1.2. Nivel Posgrado: 1995 a la fecha
1.2.1. Maestría en Ciencias (Facultad de Ciencias). Temas Selectos de Biología
Acuática. Alteraciones Ambientales: un enfoque biológico.
1.2.2. Posgrado en Ciencias del Mar y Limnología. Genética Ecotoxicológica.
2. Formación de Recursos Humanos. 1993 a la fecha
2.1. Servicio Social. Ecotoxicología de Crustáceos Acuáticos: 8
2.2. Tesis de Licenciatura: Recibidos 6; En proceso 2
2.3. Tesis de Maestría:
Recibidos 5; En proceso 2
2.4. Tesis de Doctorado: En proceso 1
114
Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
1. Estudio ecotoxicológico en los juveniles del camarón blanco Penaeus setiferus
(Crustacea, Decapoda) de la Laguna de Términos: alteraciones fisiológicas y
bioquímicas por efecto del cadmio, zinc y fenantreno. 1994 - 1996.
2. Efecto tóxico de compuestos nitrogenados (amonio y nitrito) y niveles limitantes
de oxígeno disuelto sobre postlarvas y juveniles del camarón blanco
Litopenaeus vannamei y Litopenaeus setiferus. 1996 a 2001.
3. Evaluación del efecto de fluídos de perforación en postlarvas de camarones
peneidos. Instituciones participantes: 1998 a 2000.
4. Diagnóstico del efecto biológico en el ambiente marino de las actividades
petroleras en la Sonda de Campeche. 2001.
5. Evaluación del efecto subletal de compuestos nitrogenados en
crustáceos decápodos: estudios in situ y experimentales. Department of Biological
Sciences. University of Plymouth, U.K. 2002 a 2003.
6. Evaluación del efecto biológico de la contaminación de los canales de
Xochimilco en el ajolote Ambystoma mexicanum. 2003 a 2005.
7. Diagnóstico Ambiental y Evaluación de Riesgo Ecológico en la Zona
Chinampera de Xochimilco, México. 2003 a 2005.
8. Evaluación del efecto biológico de la contaminación en invertebrados de
sistemas lagunares-estuarinos del Estado de Sinaloa mediante la propuesta
de biomarcadores múltiples. 2004-2005.
9. Hacia una enseñanza experimental de las Ciencias Ambientales en la
Licenciatura de Biología. 2005-2006.
PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Líneas de Investigación
1.1. Evaluación bajo condiciones controladas del efecto letal y subletal en
organismos acuáticos de:
1.1.1. Metales pesados
1.1.2. Fluidos de Perforación
1.1.3. Compuestos Nitrogenados
1.2. Evaluación in situ del efecto adverso de contaminantes en organismos
acuáticos (bivalvos, crustáceos, anfibios) en sistemas costeros y continentales
2. Aplicación de los estudios
2.1. Implementación de biomarcadores de exposición y efecto en organismos
acuáticos (bivalvos, crustáceos, peces y anfibios).
2.2. Determinación de sensibilidad de diversos estadios de vida de organismos
acuáticos a diversos tóxicos ambientales.
2.3. Establecimiento de relaciones de causalidad
115
PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. Alcaraz, G., C. Vanegas and X. Chiappa-Carrara. 2002. Metabolic rate of
Bathygobius ramosus upon a natural daytime tidal cycle. Series, Oceanography of
the Eastern Pacific. Vol II: 60-65.
2. Spanopoulos-Hernández M., C. Martínez-Palacios, C. Vanegas-Pérez, C.
Rosas and L. Ross. 2005. The combined effects of salinity and temperature on the
oxygen consumption of juvenile shrimps Litopenaeus stylirostris (Stimpson, 1874).
Aquaculture. 244:341-348.
3. Piña L., X. Chiappa, G. Alcaraz and C. Vanegas. Tolerance to ammonia, nitrite
and oxygen dissolved in Litopenaeus setiferus and Litopenaeus vannamei
postlarvae and juveniles. (Enviado; Aquatic Toxicology).
4. Zúñiga S., A. Bianchini, I. Rosas and C. Vanegas. Cadmium bioaccumulation in
Litopenaeus setiferus: relationship with methalothionein synthesis. (Enviado;
Aquatic Toxicology).
5. Vanegas, C., M. Depledge and T. Galloway. Are the neurotoxic biomarkers in
Carcinus maenas responses of specific or general toxic action? (En preparación).
CAPACIDAD ANALÍTICA
Matrices ambientales que analiza:
Agua dulce
Sí
Agua Marina
Sí
Sedimentos
Sí
Suelos
Sí
Tipos de contaminantes que analiza:
Metales:
V, Cr, Mn, Fe, Ni, Cu, Zn, Cd, As, Sr, Pb
Plaguicidas:
Organoclorados y Organofosforados
Compuestos orgánicos:
Compuestos nitrogenados (amonio, nitrito, nitrato)
Otros:
Pruebas biológicas que realiza:
Bioensayos con:
Bivalvos: Mytella strigata
Crustáceos: Camarón (Litopenaeus setiferus; L. vannamei; P. aztecus)
Jaiba
(Callinectes sapidus; C. rathbunae; C. similis)
Cangrejo (Carcinus maenas; Uca princeps)
Peces: Bathygobious ramosus
116
Anfibios: Ambystoma mexicanum (ajolote)
Biomarcadores en:
1. Nivel Sub-organismo. Bioquímico:
1.1. Biomarcadores de exposición (metalotioneínas; esterasas; actividad EROD)
1.2. Biomarcadores de efecto (proteínas; iones plasmáticos; actividades
enzimáticas; estrés oxidativo; contenido energético).
2. Nivel Organismo. Fisiológico.
2.1. Biomarcadores de efecto (osmoregulación; balance hídrico; campo de
crecimiento; crecimiento; contenido e integraciones energéticas)
Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia):
Infraestructura con la que cuenta:
1. Infraestructura para mantenimiento de organismos acuáticos
2. Infraestructura para bionesayos agudos y crónicos en laboratorio e in situ
3. Equipo para la evaluación de los biomarcadores de exposición y efecto
señalados
4. Equipo para la determinación de compuestos nitrogenados, metales y
plaguicidas (organoclorados y organofosforados)
Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no)
1. Crustáceos:
1.1. Artemia salina
1.2. Camarón (postlarvas y juveniles)
1.3. Cangrejos (juveniles y adultos)
2. Peces (especies y estadios diversos)
3. Anfibios (Ambystoma mexicanum: de huevo a juvenil)
Compuestos de referencia certificados
Personal disponible
2 Técnicos Académicos
Alumnos de Licenciatura y Posgrado
Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que
realiza
Disposición amplia.
Disponibillidad de horarios de acuerdo a las pruebas a realizar y a la calificación
del personal interesado
117
CUESTIONARIO
DATOS GENERALES
Nombre del investigador:
OMAR ZAPATA PEREZ
Institución (donde labora actualmente):
Área o departamento:
CENTRO DE INVESTIGACION Y DE
ESTUDIOS AVANZADOSDEL IPN.
UNIDAD MERIDA
CENTRO DE INVESTIGACION Y DE
ESTUDIOS AVANZADOSDEL IPN.
UNIDAD MERIDA
RECURSOS DEL MAR
Grupo de investigación:
ECOTOXICOLOGIA ACUATICA
Puesto del Investigador:
PROFESOR CINVESTAV 2C
Dirección de la institución:
Teléfono:
KM 6 ANTIGUA CARRETERA A
PROGRESO. COLONIA CORDEMEX.
MERIDA, YUCATÁN.
(999) 9812960 EXT 267
Fax:
(999) 9812334
Dirección electrónica:
[email protected]
Dependencia de adscripción:
FORMACIÓN PROFESIONAL
DOCTORADO EN TOXICOLOGIA
Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
CURSO A NIVEL DE POSGRADO “ECOTOXICOLOGIA ACUÁTICA”
CURSO A NIVEL LICENCIATURA “TOXICOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS”
IMPARTICIÓN DE CURSOS SOBRE EFECTOS DE COMPUESTOS
ORGÁNICOS EN PECES (CENTRO DE INVESTIGACIÓN
Y DE
CONTAMINACIÓN AMBIENTAL CICA Costa rica).
INSTRUCTOR EN LOS CURSOS DE CONTAMINACION MARINA PARA
EL PERSONAL NACIONA DE LA SECRETARIA DE MARINA.
INVITADO POR LA IUPAC COMO PONENTE SOBRE EFECTOS DE
PLAGUCICIDAS EN PECES Y ORGANISMOS ACUATICOS (SAN JOSE
DE COSTA RICA)
Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos
EL USO DEL CYP1A COMO HERRAMIENTA PARA EVALUAR EL IMPACTO
OCASIONADO POR HIDROCARBUROS EN TRES LAGOS DEL MUNICIPIO
SAN MIGUEL, REFORMA CHIAPAS.
118
APLICACIÓN DE TECNICAS BIOQUÍMICAS Y MOLECULARES PARA
EVALUAR EL IMPACTO ANTROPOGÉNICO SOBRE EL RECURSO
CAMARON.
PARTICIPACION EN EL PROYECTO DENOMINADO EVALUACION DEL
IMPACTO DE LOS PLAGUICIDAS ORGANOCLORADOS EN LOS PECES
ARIOPSIS ASIMILIS DE LA BAHIA DE CHETUMAL
PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. EXPRESION DE GENES PARA EVAUAR EFECTO DE COMPUESTOS
ORGÁNICOS.
2.ACTIVIDADES ENZIMATICAS FASE I Y FASE II COMO INDICADORES DE
EXPOSICION A CONTAMINANTES ORGÁNICOS
3.EXPRESION DE LAS METALOTIONEINAS
4.DETERMINACION DE PROTEINAS RELACIONADAS CON EL CYP450 Y
CON DISRUPCION ENDOCRINA (WESTERN BLOT)
5. CINÉTICAS EN SANGRE DE PECES PARA EVALUAR EL TIEMPO DE
ELIMINACION DE LOS COMPUESTOS ORGANICOS
PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA
Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS
1. O. Zapata-Pérez; Del-Río M.; Domínguez J.; Ceja V.; Chan Ricardo; GoldBouchot G. (in press). Preliminary Studies of Biochemical Changes (ECOD
Activities and Vitellogenin Induction) In Two Species Of Shrimp (F. Duorarum And
L Setiferus) From The Gulf Of Mexico. Ecotoxicology and Environmental Safety.
EUA.
2. Castorena-Torres F, Mendoza-Cantú A, de León Cisneros, Zapata-Pérez O,
López-Carrillo L, Salinas, Albores A. (In press). CYP1A2 phenotype and
genotype in a population from the carboniferous region of Coahuila, Mexico.
Toxicology Letters. Ireland Ltd.
3. Zapata-Pérez O, Gilberto Castañeda, Victor Ceja, Gerardo Gold-Bouchot,
Arnulfo Albores (2004). Toxicokinetics of Pyrene in Tilapias Oreochromis niloticus
Following and Intraperitoneal Administration. Bulletin of Environmental
Contamination and Toxicology. 72: 1253-1259
4. Noreña-Barroso E, Simá-Alvarez R, Gold-Bouchot G, Zapata-Pérez O (2004)
Persistent organic pollutants and histological lesions in Mayan catfish Ariopsis
assimilis from the Bay of Chetumal, México. Marine Pollution Bulletin. 48: 263269
5. Zapata-Pérez O, Gold-Bouchot G, Ortega A, López T, and Albores A. (2002).
Effect of Pyrene on Hepatic Cytochrome P450 1A (CYP1A) Expresión in Nile
Tilapia (Oreochromis niloticus). Archives of Environmental Contamination and
Toxicology. 42: 477-485
6. Zapata-Pérez O, Sima-Alvarez R. Noreña-Barroso E, Güemez J, Gold-
119
Bouchot G, Ortega A and Albores-Medina A (2000). Toxicity of the Sediment from
Bahía de Chetumal as assesed by Histophatology and EROD Induction in Tilapia
Oreochromis niloticus. Marine Enviromental Research. 50: 385 - 391.
CAPACIDAD ANALÍTICA
Matrices ambientales que analiza:
Agua dulce
Agua Marina
Sedimentos
Suelos
Otros
Tipos de contaminantes que analiza:
Metales:
Plaguicidas:
Compuestos orgánicos:
Otros:
Pruebas biológicas que realiza:
Bioensayos con: PECES (PLAGUICIDAS E HIDROCARBUROS AROMÁTICOS
POLICÍCLICOS (PAHS)
Biomarcadores en:
PECES
CAMNARONES
RATAS
Y POSIBLEMENTE EN DELFINES
Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia):
Infraestructura con la que cuenta:
Equipo de laboratorio
TERMOCICLADOR
CAMARAS DE ELECTROFORESIS
LAMPARA DE UV
MINICENTRÍFUGAS
120
Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no)
Compuestos de referencia certificados
Personal disponible
1 AUXILAIR DE INVESTIGACIÓN
Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que
realiza
COMPLETAMENTE
121
ANEX0 3.
CRITERIOS PARA LA SELECCIÓN DE
PRUEBAS BIOLÓGICAS EN
LABORATORIO PARA LA EVALUACIÓN
ECOTOXICOLÓGICA DE SUSTANCIAS
QUÍMICAS
122
CRITERIOS PARA LA SELECCIÓN DE PRUEBAS BIOLÓGICAS EN
LABORATORIO PARA LA EVALUACIÓN ECOTOXICOLÓGICA DE
SUSTANCIAS QUÍMICAS
1. Objetivos a alcanzar (¿para que queremos la batería de bioensayos? ¿Qué
necesidades queremos que cubra). Los proyectos de la SEMARNAT
pueden ser una base para iniciar la discusión.
2. Factibilidad
y Bajo costo
y Materiales y reactivos disponibles en la localidad
y Tiempo máximo de desarrollo, 5 días (¿efectos a corto o largo plazo?)
y Procedimiento de prueba simples
y Fácil lectura de resultados
3. De los organismos
y Fácil obtención (Cepario)
y Fácil mantenimiento
y Representatividad ecológica
o De un grupo funcional (productores primarios, descomponedores,
herbívoros, carnívoros, etc.)
o De un grupo taxonómico (bacterias, plancton, bentos, peces,
insectos, etc.)
o De una ruta de exposición (dérmica, ingestión, branquial,
combinadas, etc.)
o De un tipo de respuesta (alteración en metabolismo, crecimiento,
reproducción, mortalidad, daño genético, etc.)
y Estadio más sensible
y Respuesta relevante al tóxico(s)
y Sensibilidad a bajas concentraciones
y Sensibilidad a un amplio espectro de tóxicos
y Sensibilidad no redundante con otras especies
y Con información sobre su biología
y Con información sobre su sensibilidad a tóxicos (Base de datos)
y Distribución geográfica amplia
y Especies nativas de México
4. De la prueba
y Condiciones presentes en los ecosistemas mexicanos (temperatura,
salinidad, dureza, etc.)
y Concentraciones químicas reales (que se presenten en el medio)
y Técnicamente seguros y no contaminantes
y Posibilidad de ser estandarizada.
y Buena exactitud y precisión analíticas
y Aplicación universal (usos, ventajas y limitaciones)
y Significado ecológico de los resultados
123
y
Buenas practicas de laboratorio
a. Validación de la salud de los organismos de prueba
b. Requerimientos mínimos de sobreviviencia /reproducción en pruebas
y testigos
c. Edades o estadios de vida al inicio de la prueba
d. Comprobación de concentraciones nominales.
124
ANEXO 4.
FORMATO PARA LA BASE DE
DATOS TOXICOLOGICOS
DE MÉXICO
(en revisión)
125
FORMATO PARA PRUEBAS DE LABORATORIO
Tipo de prueba:
)
Estática ( )
Flujo continuo ( )
In situ
(
Estática con recambios ( ) cada _______ hrs.
Organismo utilizado:
Nombre
común
_____________________
_________________
Nombre
Estadio
(edad):
________________
___________________________
científico
Procedencia:
Otra(s)
________________________________________________
característica(s)
Período de Mantenimiento: _________________
De la prueba:
Duración de la prueba: ____________
_____________
Régimen de alimentación
___________________
de
los
Período de aclimatación:
organismos
durante
la
prueba:
_______________________________________________________________
_______
Tóxico(s)
___________________________________________________
Origen
de
la
____________________________________________________
Concentraciones
o
diluciones
________________________________________
Fase de la matriz utilizada: integra ( )
agua intersticial( )
utilizado(s):
muestra:
usadas:
extracto (
)
Tipo de extracto: acuoso ( )
orgánico ( )
Disolvente
___________________________________________________
utilizado:
126
Vehículo
de
_______________________________________________
Matriz
para
preparar
________________________________________
Número de replicas: ________
__________
Número
resuspensión:
las
de
diluciones:
organismos
por
réplica:
Volumen de la cámara de prueba: _________
Volumen o peso de la matriz contaminada: ________
Relación sedimento : agua _____________
Efecto(s)
medido(s)/Método
______________________________________
Criterio
de
aceptabilidad
_______________________________________
utililizado:
de
la
Control
________________________________________________________
Tóxico
de
_____________________________________________________
Limpieza de cámaras durante el experimento: si ( )
Aereación: si ( )
prueba:
positivo:
referencia:
no( )
no( )
Se comprobaron las concentraciones nominales: si ( )
no ( )
Factores ambientales controlados o determinados:
Temperatura: ___________
__________
Fotoperíodo __________
Calidad de la luz: _________ Humedad ________
_______
Salinidad: _________ Dureza:________
__________
Textura: ________
_____________
Intensidad luminosa:
O. D. ____________
Amonio: _________
Potencial Redox: _________
pH
Mat.Org: -
Cap. Inter. Catiónico:
127
Otro(s):____________________________________________________________
____
Análisis de las Muestras o Tóxico(s) utilizado(s):
(
Matriz en la que se encontraba el tóxico: agua ( )
)
aire ( )
sedimento (
alimento (
)
suelo
) organismos ( )
Método de Extracción: ___________________________
Método analítico: _______________________________
Resultado(s)
de
la
____________________________________________________
prueba:
__________________________________________________________________
_______
__________________________________________________________________
_______
__________________________________________________________________
_______
Comentarios:
______________________________________________________________
__________________________________________________________________
_______
__________________________________________________________________
_______
Publicado
o
reportado
____________________________________________________
en:
__________________________________________________________________
_______
128
BASE DE DATOS ECOTOXICOLOGICOS DE MÉXICO
FORMATO PARA PRUEBAS DE CAMPO
Organismo utilizado:
Nombre
común
_____________________
Estadio
(edad):
__________________
_________________
Nombre
________________
Otra(s)
característica(s)
Tóxico(s)
___________________________________________________
Se midió la(s) concentración(es) del tóxico: si ( )
Matriz en la que se encontraba el tóxico:
( )
Vía de incorporación al organismo: cutánea ( )
Gastrointestinal ( )
varias (
presente(s):
no ( )
agua ( )
aire ( )
científico
sedimento (
alimento (
)
suelo
)
respiratoria o branquial (
)
) cuales? ________________
Número de replicas: __________
Factores ambientales medidos: Temperatura:
__________
___________
Fotoperíodo
Intensidad luminosa: __________ Calidad de la luz: ______________ Humedad
________
Salinidad: _________
_____________ pH _______
Dureza:__________
Amonio:
Otro(s):
__________________________________________________________________
Efecto(s)
medido(s):
________________________________________________________
__________________________________________________________________
_______
129
Criterio
de
aceptabilidad
de
__________________________________________.
la
prueba:
Control
positivo:
___________________________________________________________
Resultado(s)
de
la
____________________________________________________
prueba:
__________________________________________________________________
_______
__________________________________________________________________
_______
__________________________________________________________________
_______
Comentarios:
______________________________________________________________
__________________________________________________________________
_______
__________________________________________________________________
_______
Publicado
o
reportado
____________________________________________________
en:
__________________________________________________________________
_______
130
ANEXO 5.
LISTADOS DE ESPECIES CANDIDATAS
DE AMBIENTES DULCEACUICOLAS
131
FITOPLANCTON
Selenastrum capricornutum
Scenedesmus quadricauda
Scenedesmus incrassatulus
Scenedesmus acutus
Chlorella vulgaris
Ankistrodesmus falcatus
ZOOPLANCTON
Daphnia exilis
Daphnia similis
Daphnia magna
Daphnia laevis
Daphnia pulex
Ceriodaphnia dubia
Moina macrocopa
Diaphanosoma birgei
Simocephalus vetulus
Brachionus angularis
Brachionus patulus
Brachionus calyciflorus
Brachionus havanaensis
Brachionus rubens
Asplanchna brightwelli
Asplanchna girodi
Asplanchna sieboldi
Eucyclops serrulatus
NECTON
Onchorhynchus mykiss
Poecilia reticulata
Poeciliopsis gracilis
Bufo occidentalis (larvas)
Xiphophorus sp.
Petenia splendida
Oreochromis sp.
Cyprinus carpio (juveniles)
Chirostoma sp.
Cichalosoma urophtalmus
BENTOS
Hyalella azteca
Chironomus tetans
Cypridopsis vidua
Machrobrachium rosenbergii
Ambystoma mexicanum/proteg.
Macrothrix triserialis
132
Simocephalus vetulus
Hydra attenuata
Cambarelus moctezumae
Pomacea flagellata
Limnodrillus hofmeisteri
Heterocypris incongruens
Cypris sp.
Panagrellus redivivus (especifico)
Caenorhabditis elegans
PLANTAS SUPERIORES (Monocotiledoneas y Dicotiledoneas)
Lemna minor
Lactuca sativa
Allium cepa
Glicine sp.
Hordeum sp.
Avena sativa
Lepidium sativum
Amaranthus hypochondriacus
Carthamus tinctorius
BACTERIAS
Vibrio fischeri
Spirillum volutans
133
ANEXO 6.
LISTADOS DE ESPECIES CANDIDATAS
DE AMBIENTES SALOBRES Y MARINOS
134
FITOPLANCTON
Tetraselmis suecica
Isochrisis galbana
Dunaliella tertiolecta
Chaetoceros mulleri
Spirulina platensis
ZOOPLANCTON
Brachionus plicatilis
Artemia franciscana
Calanus sp.
Litopenaeus setiferus (larvas)
Litopenaeus vannamei (larvas)
Larvas de erizo
Brachionus rotundiformis
Acartia tonsa
NECTON
Mugil sp.
Lutjanus gutatus
Sphoeroides annulatus
Paralabrax sp.
BENTOS
Mysidopsis bahia
Neanthes arenaceodentata
Tisbe sp.
Gamarus sp.
Litopenaeus setiferus
Litopenaeus vannamei
Uca sp.
Mytella sp.
Capitella sp.
Nereis sp.
Nephtys sp.
Farfantepenaeus duorarum
Crassostrea virginica
Argopecten ventricosus
Callinectes sp.
Leptocheirus plumulosus
Erizos
Haliotis sp.
Nemátodos
Crassostrea gigas (larvas)
BACTERIAS
Vibrio fischeri
135
ANEXO 7.
LISTADOS DE ESPECIES CANDIDATAS
DE AMBIENTES TERRESTRES
136
METABOLISMO MICROBIANO
Tasa Respiratoria
Lipasas
Deshidrogenasas
Tasa de mineralización de nitrógeno
Trifosfato de adenisina (ATP)
MESOFAUNA
Panagrellus redivivus
Caenorhabditis elegans
Eisenia andrei/foetida
Colembolos
Enchitreidos
Isopodos
PLANTAS SUPERIORES (Monocotiledoneas y Dicotiledonias)
Lactuca sativa
Allium cepa
Glycine soja
Hordeum vulgare
Avena sativa
Lepidium sativum
Amarantus hipochondriatus
Phaseolus sp.
Zea mays
Triticum aestivum
Carthamus tinctorius
BACTERIAS
Pseudomonas putida
Pseudomonas fluorescens
Vibrio fischeri
Bacillus cereus
Salmonella typhimurium (Microfluctuación)
Escherichia coli
137
ANEXO 8.
PROTOCOLOS DE PRUEBA PARA
AMBIENTES DULCEACUICOLAS, SALOBRES,
MARINOS Y TERRESTRES
138
LISTADO DE PRUEBAS
1. Bioensayo con Cladoceros. Martínez Jerónimo F.
2. Bioensayo de toxicidad aguda con Daphnia magna. Díaz Báez, M.C., Pica
Granados, Y., y A. Ronco.
3. Bioensayo de toxicidad crónica con Microalgas Clorofíceas. Martínez Jerónimo
F.
4. Ensayo
de
toxicidad
cronica
con
Selenastrum
capricornutum
(Pseudokirchneriella subcapitata) método de enumeración celular basado en el
uso de hemocitómetro neubauer. Pica Granados, Y. Ronco, A y M.C. Díaz
Báez.
5. Prueba de toxicidad aguda con lombriz (Eisenia) para suelos contaminados.
Cuevas Díaz, M. C, Ferrera Cerrato, R., Roldán Martín A., y R. Rodríguez
Vázquez.
6. Prueba de toxicidad aguda con lombriz de tierra (Eisenia foetida). Uribe
Hernández, R.
7. Ensayo de toxicidad aguda con Allium cepa L., mediante la evaluación de la
inhibición del crecimiento promedio de raíces de cebolla. Díaz Báez, M. C.,
Ronco, A., y Y. Pica Granados.
8. Ensayo de toxicidad aguda (efectos letales y subletales) con Hydra attenuata.
Pica Granados, Y., Ronco, A., y M. C. Díaz Báez.
9. Ensayo de toxicidad aguda con semillas de lechuga (Lactuca sativa L.)
Sobrero, M. C., y A. Ronco.
10. Prueba de toxicidad aguda con Vibrio fischeri (Photobacterium phosphoreum).
Pica Granados, Y., y G. Trujillo Domínguez.
11. Ensayo de toxicidad con el nematodo Panagrellus redivivus. Pica Granados,
Y.
12. Prueba de citotoxicidad aguda con celomocitos de lombriz de tierra (Eisenia
foetida). Uribe Hernández, R.
13. Prueba de Germinación de semillas. Uribe Hernández, R.
14. Prueba de Ames por el método microfluctuación modificado para determinar
genotoxicidad en compuestos químicos puros y muestras ambientales.
Sandoval Villasana, A. M.
15. Bioensayo de la Actividad Deshidrogenasa. Barajas Aceves, M.
16. Bioensayo de Trifosfato de Adenosina (ATP). Barajas Aceves, M.
17. Bioensayo de la Tasa de Mineralización del Nitrógeno. Barajas Aceves, M.
18. Prueba para evaluar los efectos de contaminantes en almeja Catarina
(Argopecten ventricosus). Sobrino Figueroa, A. S.
19. Bioensayos de toxicidad en camarones Peneidos. Vanegas C., Zúñiga S.,
Gaxiola G., Robles C. y Betancourt M.
139
BIOENSAYO CON CLADOCEROS
Autor: Fernando Martínez Jerónimo
Principio de la prueba
La prueba se basa en la determinación de efectos letales agudos (inmovilización o
mortalidad), observados en un tiempo de exposición de 48 horas, en especies
dulceacuícolas de cladóceros planctónicos
Este es un bioensayo que se puede aplicar con los cladóceros Daphnia exilis, D.
pulex, Ceriodaphnia dubia o Moina macrocopa, aunque es necesario que la identidad
específica sea determinada por un especialista, debiéndose proporcionar el origen de la
cepa utilizada, y cuando sea procedente, el número de catálogo.
Estas especies, conocidas genéricamente como “pulgas de agua”, son
componentes habituales del zooplancton, distribuyéndose de manera natural en cuerpos
de agua naturales, presas, bordos, charcas temporales y estanques con fertilización
orgánica, en diferentes partes del territorio nacional. Son especies que se reproducen
sexual y asexualmente, siendo esta última modalidad reproductiva una característica
importante en la implementación de cultivos controlados de laboratorio. Se tiene bien
documentado que la reproducción asexual, que se denomina partenogénesis, se presenta
principalmente cuando las condiciones de desarrollo son las adecuadas, produciéndose
entonces camadas exclusivamente de hembras, que pueden a su vez alcanzar la fase
reproductiva y continuar reproduciéndose de manera asexual mientras persistan
condiciones adecuadas de alimentación, densidad poblacional, principales factores
ambientales y de calidad química del agua. Cuando alguno o algunos de estos factores se
torna adverso, entonces parte de la progenie está constituida por machos que al crecer
pueden propicia la reproducción sexual al fecundar a s hembras, dando lugar a la
formación de una estructura de resistencia conocida como efipio, que contiene uno o dos
embriones (dependiendo de la especie) en estado latente, y que mantienen la diapausa
hasta que se propician condiciones ambientales adecuadas para que se reinicie el
desarrollo embrionario y emerjan juveniles que pueden dar inicio a un nuevo ciclo de
reproducción asexual. En la modalidad reproductiva partenogenética, el desarrollo
embrionario es directo y se lleva a efecto en la cámara incubatriz de la hembra, de la que
emergen juveniles que son liberados al medio. La fase de los juveniles es semejante a la
del adulto, aunque obviamente son de menor talla. Todas estas especies son filtradoras,
consumiendo una diversidad de partículas que incluyen diferentes especies de microalgas
así como materia orgánica en suspensión, por lo que se les considera componentes
importantes en los ecosistemas acuáticos al permitir el flujo energético entre los
productores primarios y ordenes superiores de consumidores en las tramas tróficas de los
sitios donde se distribuyen.
La prueba se realiza con los neonatos de estas especies, que son los juveniles con edad
menor a 24 horas contada a partir de su expulsión de la cámara incubatriz. La respuesta
que se evalúa es la inmovilización o la mortalidad de los organismos de prueba, a 24 y 48
horas de exposición a las soluciones tóxicas ensayadas.
140
El bioensayo consiste en exponer a los neonatos a diferentes concentraciones de los
materiales tóxicos, o diluciones porcentuales de efluentes y muestras de agua. Se
requiere la preparación de al menos cinco concentraciones o diluciones, mas una serie
control. Estas soluciones se preparan después de un ensayo preliminar para la definición
del intervalo, siguiéndose una serie geométrica base 2. Para cada solución se debe contar
con al menos tres réplicas, cada una de las cuales constará de al menos 10 neonatos.
Esta es una prueba relativamente rápida, que en un lapso de 48 h proporciona
información a partir de la cual es posible determinar la Concentración Letal Media (CL50).
La talla de los neonatos es adecuada para preparar el bioensayo y hacer las evaluaciones
de inmovilidad o mortalidad sin necesidad de emplear ningún equipo óptico.
La prueba es adecuada para la evaluación de los efectos tóxicos agudos (letales) de
efluentes con o sin tratamiento, muestras de agua de cuerpos de agua receptores de
descargas, sustancias químicas puras y en mezclas de composición conocida o
desconocida, principios activos y productos formulados comerciales. Es útil para la
clasificación de la toxicidad de compuestos químicos, en el monitoreo de ecosistemas
acuáticos y en la evaluación de la eficiencia de los sistemas de tratamiento de las aguas
residuales.
Material biológico
Los organismos que se utilicen para llevar a cabo esta evaluación deben ser obtenidos de
laboratorios que cuenten con cepas controladas. Se pueden obtener mediante compra en
distribuidores científicos que garanticen la identidad específica y calidad del material
biológico. Es posible obtenerlos mediante colecta, aunque en este caso se deberá
desarrollar el cultivo hasta una F2, además de conseguir un certificado de identidad
expedido por alguna institución acreditada, en la que se deberá depositar una muestra
fijada o viva para que le sea asignada una clave de catalogo o colección. No es permitida
la utilización de organismos comprados como alimento en tiendas de mascotas, pues no
se conoce la procedencia ni historia química.
Los laboratorios que realicen este tipo de bioensayos deberán contar con la cepa
adecuada, como ya se mencionó anteriormente, y lograr su estabilización siguiendo las
instrucciones específicas de mantenimiento que se detallan como parte de este protocolo.
Los lotes de reproductores deberán ser monitoreados continuamente, poniendo especial
énfasis en cualquier indicio que denote la reproducción sexual (detección de machos y/o
efipios o hembras efipiadas), pues esto es síntoma de un cultivo inadecuado en el que
hay factores que pueden afectar la calidad de respuesta de los organismos de prueba.
Todos los cultivos de reproductores deben ser iniciados con hembras partenogenéticas de
edad conocida, con alimentación controlada. Los neonatos para los bioensayos deberán
proceder de lotes estabilizados y controlados, para los cuales se establecerá una duración
máxima (dependiendo de la especie).
Infraestructura en el laboratorio.
Los laboratorios que se dediquen a este tipo de evaluaciones toxicológicas deberán
contar con cámaras bioclimáticas o cuartos con fotoperíodo y temperatura controlados.
141
Adicionalmente tendrán que disponer de la infraestructura mínima indispensable para
realizar el cultivo controlado de microalgas y el mantenimiento de la cepa de cladócero
que emplearán para las evaluaciones de toxicidad aguda, la cual se detalla en el protocolo
correspondiente.
Material de laboratorio
Los recipientes de cultivo para los reproductores deberán ser de vidrio borosilicatado, del
volumen adecuado, dependiendo del protocolo de producción que se implemente. Para
las pruebas de toxicidad aguda se emplearán preferentemente recipientes de vidrio
borosilicatado, los cuales deberán ser sometidos a la rutina de limpieza adecuada para
garantizar su uso libre de factores que pudieran modificar la toxicidad de las muestras
analizadas.
Para la realización de las evaluaciones se empleará la cristalería y equipos menores
adecuados y suficientes para garantizar procedimientos seguros y repetibles, tales como
pipetas automáticas calibradas, matraces aforados de la capacidad necesaria,
pesamuestras, espátulas de acero inoxidable, etc.
Reactivos
Se deberá contar con los reactivos necesarios para la preparación del agua de dilución y
de los medios de cultivo, tanto para los cladóceros como las microalgas. Los reactivos
deberán ser grado analítico y libres de impurezas, tales como metales pesados. Se
sugieren las marcas J. T. Baker, Aldrich y Sigma Chemical.
En todos los casos se sugiere la preparación de soluciones concentradas (stock o madre)
a partir de las cuales se puedan preparar los medios de cultivo y el agua de dilución. Se
deberá tener un control sobre los procedimientos para la preparación de soluciones patrón
y medios de cultivo y poner especial atención sobre la conservación de sustancias que
pudieran degradarse o contaminarse (como las soluciones de vitaminas); en todos los
casos se deberán aplicar las condiciones de mantenimiento que eviten la modificación de
la concentración o alteración química de las soluciones.
Equipos
Los equipos requeridos son los básicos de cualquier laboratorio de análisis biológicos, los
cuales incluyen balanza analítica, microscopio óptico, estereomicroscopio, autoclave,
campana de flujo laminar o área esterilizada para trabajo microbiológico, potenciómetro,
oxímetro, salinómetro/conductivímetro, autoclave, etc.
Cultivo y mantenimiento de los organismos de prueba
142
El cultivo se divide en dos fases: el mantenimiento de la cepa y el lote de reproductores
para la obtención de organismos de prueba. En el primer caso se emplearán los
recipientes que resulten adecuados para la conservación de la cepa, pudiendo ser
acuarios de volumen pequeño (menor a 5 litros) o vasos de precipitados de 1, 2 ó 3 litros,
preferentemente de vidrio borosilicato o Nalgene®. En todos los caso, como medio de
cultivo se deberá utilizar agua reconstituida de la dureza adecuada (dependiendo de la
especie), preparada según se detalla en el protocolo correspondiente. La temperatura
para ambos tipos de cultivo deberá ser de 20±2°C, y el fotoperiodo de 16:8 (luz:
obscuridad); la iluminación será la ambiental de laboratorio (ca. 1,000 luxes). Como
alimento se emplearán microalgas clorofíceas, preferentemente las especies
Ankistrodesmus falcatus, Raphidocelis subcapitata (antes Selenastrum capricornutum) o
Scenedesmus ssp. En cualquier caso, se deberá detallar cuál fue la especie empleada.
Para mayor detalle se deberá recurrir al protocolo correspondiente. Debido a la diferencia
en dimensiones de las especies de microalgas susceptibles de ser empleadas como
alimento, se sugiere suministrar como concentración alimentaría adecuada 12 mg/l en
peso seco. Los detalles adicionales para el cultivo del alimento, así como su separación
(“cosecha”), conservación, viabilidad, etc., se detallan en el anexo correspondiente.
La calidad de respuesta de los neonatos se deberá evaluar periódicamente mediante
bioensayos con tóxicos de referencia (controles positivos), preferentemente con cromo
hexavalente. Invariablemente se deberá contar con cartas de control que permitan realizar
el seguimiento del lote de reproductores, así como de del cultivo “stock”. Los valores de
control serán los establecidos en la las publicaciones científicas existentes
Preparación del material antes de la prueba
Se deberán seguir los lineamientos mínimos básicos para garantizar la calidad de la
respuesta de los organismos de prueba, evitando cualquier posible interacción o
alteración con probables residuos de materiales tóxicos remantes o persistentes en el
material (cristalería) empleada para la realización de los bioensayos.
Procedimiento de prueba
Este bioensayo es de tipo estático, sin renovación de la solución de prueba, con una
duración total de 48 horas, aunque es recomendable realizar observaciones preliminares
a las 3, 6 y 24 horas de inicio de la prueba. Se deberán evaluar la concentración de
oxígeno disuelto, el pH, la conductividad y salinidad, así como la dureza, al inicio y al
término de la prueba definitiva. Como agua de dilución se empleará agua reconstituida de
tipo semidura (80 a 100 mg/l como CaCO3, USEPA, 2002), ya que las tres especies
recomendadas se desarrollan satisfactoriamente en este tipo de agua. La forma de
preparar esta agua de dilución se muestra en la Tabla 1. En el caso de sustancias de baja
hidrosolubilidad, se podrán dispersar en el agua de dilución mediante sonicación, o bien
se utilizarán solventes de baja toxicidad como la acetona, etanol, metanol o dimetil
sulfóxido. Como ya fue mencionado, la evaluación toxicológica se realizará con los
neonatos de la especie seleccionada, los cuales serán obtenidos siguiendo el protocolo
correspondiente. En ningún caso se deberá suministrar alimento a los organismos de
prueba El resumen de las condiciones de prueba se muestra en la tabla 2.
143
Tabla 1. Composición del agua semidura reconstituida utilizada como medio de cultivo y
para la obtención de neonatos de cladóceros, así como agua de dilución para bioensayos
de toxicidad aguda.
Tipo de agua
Semidura
a
b
Reactivos grado analítico (mg l-1), en
agua destilada o desionizada
NaHCO3 CaSO4.2H2O MgSO4 KCl
96
60
60
4
Características finales
pHa
Durezab
7.4-7.8 80-100
Alcalinidad
60-70
Valor de equilibrio después de 24 horas de aireación.
expresado como mg l-1 de CaCO3.
Tabla 2. Resumen de las condiciones y requerimientos para la determinación de la
toxicidad aguda con cladóceros.
Tipo de prueba
Duración
Estática, sin renovación de la solución de prueba
48 horas (Prueba definitiva)
Intensidad luminosa
600-1,000 Luxes (ambiental de laboratorio)
Fotoperiodo
16:8 (luz:obscuridad)
Temperatura
20 ± 1 ºC
Aireación
No
Suministro de alimento
No
Volumen de los recipientes de prueba
Volumen de prueba
100 ml
80 ml
Edad de los organismos
Neonatos (Edad < 24 horas)
Concentraciones o diluciones ensayadas
Replicas por concentración
Organismos por réplica
Mínimo 5, más testigo
Mínimo 3
10
Agua de dilución
Reconstituída semidura (80-100 mg l-1 como
CaCO3)
Mortalidad o inmovilidad a 48 h, con
Respuesta evaluada
observaciones a 24 h.
Criterio de aceptación de la prueba
Inmovilidad o mortalidad en los testigos menor o
máximo de 10 %
Expresión de resultados
Con los valores de inmovilidad o mortalidad a 48 horas de deberá construir la tabla
resumen a partir de la cual se hará la estimación de la Concentración Letal Media (CL50).
144
Existen diversos programas de cómputo que permiten hacer este cálculo de manera
sencilla, incluyendo la determinación del intervalo de confianza. Los métodos para hacer
esta determinación puede ser cualquiera de los siguientes: Probit, Logit, Semilog y
Ángulos móviles promedio. En cualquier caso se requiere proporcionar la referencia del
método y del software empleado. Tratándose de sustancias puras o en mezclas,
principios activos y productos formulados, se deberá clasificar el grado de toxicidad que
se produce, de acuerdo a las tablas disponibles para este propósito.
Referencias (Métodos estandarizados: EPA, Environment Canada, OECD, ISO, ASTM,
etc.)
Este método de prueba es semejante a los protocolos de la Agencia para la Protección
Ambiental de los Estados Unidos de Norteamérica (USEPA, 2002; USEPA OPPTS
850.1010), y la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (Método
202)
Bibliografía.
U.S. Environmental Protection Agency, 2002 Methods for measuring the acute toxicity of
effluents and receiving waters to freshwater and marine organisms. 5th Edition. U.S.
EPA Office of Water, Washington, DC. EPA-821-R-02-012, viii+266 pp.
Anexo 1.
Descripción de las condiciones de mantenimiento de la cepa y condiciones de cultivo de
los reproductores para la producción de organismos de prueba (neonatos) de las especies
de cladóceros propuestas como para la evaluación de la toxicidad aguda en ambientes
dulceacuícolas.
En todos los casos se aplicarán las siguientes condiciones:
1)
Alimentos suministrados: Microalgas clorofíceas de las especies Ankistrodesmus
falcatus, Raphidocelis subcapitata o Scenedesmus acutus.
2)
Procedimientos para la preparación/obtención del alimento: Estas microalgas se
obtendrán mediante cultivo en condiciones controladas de laboratorio. Se deberá
mencionar la cepa utilizada (número de catálogo y origen) y detallar cualquier
modificación en el proceso de cultivo
a) Medio de cultivo. Se sugiere el Basal de Bold (Tabla 3), aunque es posible utilizar
otros; si este último fuera el caso, se deberá incluir la formulación empleada y
explicar las razones para utilizarlo. Invariablemente el medio de cultivo deberá ser
145
esterilizado por autoclave y todo el procedimiento del cultivo de microalgas se hará
en condiciones asépticas.
b) Recipientes de cultivo. Se sugiere que los cultivos se realicen en matraces de
2,000 ml, aunque esto dependerá de los requerimientos de cada laboratorio.
c) Condiciones de iluminación. Los cultivos de microalgas deberán ser incubados con
iluminación artificial continua y controlada de 4,500 luxes, proporcionada con
lámparas fluorescentes “luz de día”.
d) Temperatura. Deberá ubicarse en el intervalo de 25 a 28°C.
e) Aireación. Se deberá suministrar aire comprimido como fuente de carbono y para
evitar la sedimentación. El medio de cultivo sugerido carece de bicarbonato de
sodio, que funcionaría como el aporte de carbono para la fotosíntesis, por lo que
es absolutamente indispensable la aireación. En este caso se deberá tener
cuidado en que el aire se encuentre filtrado para evitar introducir al medio de
cultivo polvo o contaminantes biológicos, siendo preferentemente el empleo de
compresoras libres de aceite.
f)
Inóculos. Los inóculos deberán ser renovados periódicamente y deberán partir de
muestras mantenidas en medio de cultivo solidificado. Su manejo, al igual que en
la fase de producción, se realizará en condiciones asépticas. No se requiere de
cepas axénicas, aunque si es necesario evitar una carga bacteriana excesiva que
pudiera influir sobre la calidad del alimento para los cladóceros. Para la fase de
producción de las microalgas, se utilizarán inóculos líquidos en proporción
porcentual del 10 al 20 % del volumen de medio de cultivo fresco.
g) Tiempos de cosecha. Los cultivos serán “cosechados” en la fase de crecimiento
exponencial, a cual se presenta en un lapso de 7 a 10 días cuando se parte de un
inóculo del 10 %.
h) Forma de cosecha. La biomasa será separada por centrifugación ó filtración.
También se puede lograr una separación adecuada por sedimentación,
preferentemente en condiciones de oscuridad y a baja temperatura.
i)
3)
Forma y tiempo de conservación. La biomasa “cosechada” se debe conservar en
refrigeración y utilizarse por un periodo no mayor a dos semanas después de
haber sido separada.
Mantenimiento de cultivos “stock” o de reserva de cladóceros. Estos cultivos tienen
como propósito la conservación de la cepa y funcionan como reservorio para la
separación de juveniles o adultos a partir de los cuales se pueden implementar los
cultivos para la obtención de organismos de prueba.
a)
Medio de cultivo. Se empleará agua semidura reconstituida (ver Tabla 1)
b)
Recipientes de cultivo (tipo, volumen). Se utilizarán preferentemente
cristalizadores, vasos de precipitados o acuarios de entre uno y 5 litros, según las
necesidades y de acuerdo a la infraestructura disponible.
c)
Alimento y cantidad: Como son cultivos de reserva, se alimentan al menos una
vez por semana (preferentemente dos veces), con la suficiente cantidad de
alimento
d)
Condiciones generales de mantenimiento. Se recambiará aproximadamente el 50
% del medio de cultivo cada 10 días. Se deberá vigilar que la densidad
poblacional no se incremente excesivamente, pues esto propiciaría la aparición
146
de machos y la reproducción sexual; para evitar esta situación, periódicamente se
realizará una “cosecha” de cladóceros. Tampoco es deseable la acumulación de
metabolitos ni la proliferación de organismos saprobios en estos cultivos.
4)
Producción de neonatos. Este sistema de cultivo es el que permite la producción
controlada de los neonatos que se emplearán para las pruebas de toxicidad, por lo
que es importante que se implemente una rutina detallada que garantice la cantidad
adecuada para satisfacer los requerimientos en los tiempos programados, así como
la calidad de la respuesta de estos organismos de prueba.
a)
Medio de cultivo. Se empleará también agua semidura reconstituida.
b)
Recipientes de cultivo (tipo, volumen). Preferentemente vasos de precipitados de
vidrio, de 150 ml de volumen total.
c)
Volumen de cultivo. Se recomienda de 80 a100 ml como volumen de cultivo.
d)
Alimento y densidad. Preferentemente se empleará Ankistrodesmus falcatus en
concentración de 400,000 células/ ml. Si se utilizan otras especies de las aquí
sugeridas, la concentración de alimento será la equivalente a 8-10 mg/l en peso
seco.
e)
Densidad de reproductores. En los recipientes de cultivo sugeridos se dispondrán
individualmente a los organismos con que se iniciarán estos sistemas de
producción de neonatos.
f)
Periodicidad de recambio de alimento y medio de cultivo. El medio de cultivo y el
alimento deberán ser restituidos completamente tres veces por semana, en días
alternos.
g)
Temperatura. Deberá mantenerse controlada en un valor de 20-22°C.
h)
Intensidad luminosa y fotoperiodo. La iluminación deberá ser la ambiental de
laboratorio, proporcionada por lámparas fluorescentes “luz de día”. Si se prefiere
alimentación natural, ésta nunca deberá ser directa sobre los cultivos. El
fotoperiodo será de 16:8 (luz: oscuridad).
i)
Duración (vigencia) de los lotes de reproductores. Estos lotes se iniciarán a partir
de neonatos obtenidos de reproductores previamente separados de los lotes de
mantenimiento. A partir de su implementación, la duración máxima en
condiciones producción efectiva de neonatos será de 35 días para Daphnia pulex
y para D. pulex. En el caso de Ceriodaphnia dubia la duración será de 25 días y
para Moina macrocopa de 20 días. Después de tales plazos de vigencia, el lote
deberá ser desechado. Es necesario que se establezca un programa desfasado
de inicio y finalización de los lotes a fin de que en todo momento se pueda contar
con organismos de prueba de las características deseables
j)
Frecuencia y forma de separación (manejo) de la progenie. La progenie deberá
ser separada todos los días en el periodo hábil (lunes a viernes). Esto evita
efectos de sobrepoblación en los recipientes de producción y permite que se
puedan iniciar pruebas toxicológicas todos los días en ese periodo hábil.
Con las condiciones antes descritas, es posible garantizar la calidad del material biológico
y reducir significativamente la variabilidad en los resultados. De cualquier forma, con una
periodicidad no menor a 3 meses, se realizarán ensayos con el tóxico de referencia cromo
hexavalente (a partir de dicromato de potasio).
147
Elaboró:
Dr. Felipe Fernando Martínez-Jerónimo
Lab. de Hidrobiología Experimental
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, I. P. N.
148
4.2. BIOENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA CON
DAPHNIA MAGNA
MARIA CONSUELO DIAZ BAEZ
Unidad Académica de Ingeniería Ambiental, Facultad de Ingeniería, Universidad
Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia
YOLANDA PICA GRANADOS
Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Cuernavaca, Morelos, México
ALICIA RONCO
Centro de Investigaciones sobre el Medio Ambiente, CIMA, Universidad Nacional de
La Plata. Argentina
4.2.1.
4.2.2.
4.2.3.
4.2.4.
4.2.5.
Principio
Materiales, Reactivos y Equipos
Cultivo y Mantenimiento de los Organismos de Prueba
Procedimiento de la Prueba
Expresión de los Resultados
REFERENCIAS
4.2.1. Principio
Dentro del grupo de cladóceros, las especies del género Daphnia son las más
utilizadas como organismos de prueba o de referencia en pruebas de toxicidad. La
amplia distribución geográfica, el importante papel que cumplen al interior de la
comunidad zooplanctónica, la facilidad de cultivo en el laboratorio, la reproducción
partenogenética (lo cual asegura una uniformidad de respuesta), y el corto ciclo de
vida con la producción de un alto número de crías, han hecho de este grupo un
ideal para la evaluación de toxicidad, a nivel universal.
149
El género Daphnia se ubica dentro del orden Cladócera de la clase Crustacea, y
especies como Daphnia magna, Daphnia pulex, y Daphnia similis, son utilizadas
extensivamente en pruebas de toxicidad, por lo cual existe una extensa
información sobre las técnicas de cultivo, los requisitos de temperatura, luz y
nutrientes, así como su respuesta a muchos tóxicos. Específicamente, los
ensayos de toxicidad con Daphnia magna (Fig. 4.2.1), permiten determinar la
letalidad potencial de sustancias químicas puras, aguas residuales domésticas e
industriales, lixiviados, aguas superficiales o subterráneas, agua potable, y agua
de poro de sedimentos, entre otros.
Figura 4.2.1. Vista general de Daphnia magna
En las pruebas de toxicidad con D. magna, neonatos menores de 24 h de edad
son expuestos a la muestra o compuesto a probar, por un perÍodo de 48h, al
término del cual se cuantifica el número de organismos muertos. Con estos
resultados se establece la proporción o porcentaje de mortalidad producida.
4.2.2. Materiales, Reactivos y Equipos
Material Biológico
Las hembras partenogenéticas de D. magna pueden obtenerse directamente de
compañías proveedoras de materiales biológicos, quienes certifican la especie.
También pueden ser obtenidas de otras fuentes como laboratorios especializados
donde se llevan a cabo pruebas de toxicidad con este cladócero o por medio de su
recolección en campo; en estos casos la especie deberá ser taxonómicamente
identificada.
150
Materiales de laboratorio
Acuarios de 3 L de capacidad.
Vaso de precipitado de 2000, 1000 y 600 mL.
Pipetas volumétricas y graduadas de 1, 2, 5, 10 y 20 mL.
Matraz aforado de 100 mL.
Pipetas pasteur y bulbos de latex
Pipetas volumétricas de 1, 2, 5 y 10 mL, peras para pipetas
Pipetas automáticas de 250, 500 y 1000 μL; puntas para micropipetas.
Recipientes plásticos de 30, 50mL, 100 mL
Papel aluminio.
Garrafón o bidón de 20 litros
Manguera delgada para bombas de acuario.
Matraz Kitasato de 2 litros.
Platos para pesar reactivos.
Espátulas
Hielera y hielo o geles refrigerantes.
Papel parafilm
Tubos de ensayo
Reactivos
NaHCO3
MgSO4
KCl
CaSO4.•2H2O
Biotina
Tiamina
Vitamina B12
Na2SeO4
K2Cr2O7
Agua deionizada o destilada
Equipos
Microscopio Estereoscópico
Balanza Analítica
Plancha de Agitación con magneto.
Bombas para acuario
Controlador de temperatura ambiente (equipode aire acondicionado u otro).
Refrigerador (4 ± 2 °C)
Bomba de vacío
151
Mechero de Bunsen
Autoclave o equivalente
Medidor de oxígeno disuelto
Potenciómetro
Tituladores para dureza y alcalinidad.
Termómetro.
Sistema purificador de agua (deionizador, sistema Milli-Q) o una fuente de
abastecimiento de agua destilada.
Centrífuga
4.2.3. Cultivo y Mantenimiento de los Organismos de Prueba
Los cultivos de D. magna pueden mantenerse en recipientes de 1, 2 ó 3 litros, o
cualquier otro sistema que resulte funcional. Con el fin de mantener condiciones
óptimas para el crecimiento de los individuos, se recomienda mantener una
densidad poblacional de no mayor de 12 individuos /L
Los organismos se mantienen en agua reconstituida con una dureza entre 160 y
180 mg CaCO3 /L. El agua se prepara en el laboratorio (APHA,1998), y puede
suplementarse con una solución de vitaminas y selenio, cuando se detecten
problemas en la reproducción, o se presente una alta mortalidad entre los 14 y 21
días por malformación de las antenas (Fig. 4.2.2).
Ojo
Corazón
Antenas
Ovario y
Bolsa incubatriz
Intestino
Figura 4.2.2. Principales rasgos morfológicos de Daphnia magna
152
Los cultivos se mantienen a una temperatura de 21 ± 2ºC, un fotoperíodo
aproximado de 16 h luz /8 h oscuridad y una intensidad lumínica de alrededor de
800 lux (ver condiciones en Tabla 4.2.1.).
Agua dura reconstituida (APHA,1998):
Para su preparación se recomienda colocar en un garrafón: 19L de agua
deionizada o destilada, y adicionar 2.4 g de MgSO4, 3.84 g de NaHCO3 y 0.16 g de
KCl. Agitar hasta disolver completamente las sales. Paralelamente, disolver 2.4
g de CaSO4 •2H2O en 1L de agua deionizada o destilada. Es necesario tener en
cuenta que la disolución de esta sal puede requerir un período de tiempo
prolongado. Terminada la solubilización de la sal, incorporar la solución de
CaSO4•2H2O al garrafón, lo cual permitirá obtener 20L de agua dura reconstituida.
Tabla 4.2.1. Resumen de las Condiciones Recomendadas para el Mantenimiento
de Cultivos de Daphnia magna
Temperatura
Calidad de Luz
Intensidad Luminosa
Fotoperíodo
Recipientes de Mantenimiento
Alimentación
Dosis de Alimento
Suplemento Alimenticio
Densidad Poblacional
Limpieza
Recolección de Neonatos
21 ± 2oC
Fluorescente, blanco-frío
≤ 800 lux (luz blanca fría) en la superficie del liquido
16 horas luz - 8 oscuridad
Los cultivos se mantienen en recipientes de 2L de vidrio
transparentes, y deben permanecer tapados
Cultivos puros de Selenastrum capricornutum u otras algas
verdes unicelulares.
La cantidad de alimento suministrada se calcula de la
siguiente manera:
V= A x B / C
donde:
V= volumen a ser adicionado A= número de organismos
B= número de células por daphnia (1.5 x106 células por
daphnia /día)
C = densidad celular de la suspensión algal
El alimento es suministrado diariamente.
Los cultivos pueden suplementarse con las soluciones de
vitaminas y selenito.
No mayor de 12 individuos/L
Diariamente se debe retirar las exubias (mudas) y los restos
que se encuentren en el fondo de los recipientes. Cada
viernes se cambia el agua de los acuarios que deben lavarse
con una esponja o un paño de tela, enjuagar varias veces con
agua des-ionizada. No se debe emplear jabón ni otros
detergentes.
Diariamente se retiran los neonatos con una pipeta Pasteur de
plástico con una abertura lo suficientemente ancha para no
ocasionar daños a los neonatos.
153
Suplementos (adicionar solo en caso de un crecimiento deficiente del
cultivo):
Cuando se determine la necesidad de suplementar el agua dura, debe prepararse
por separado las soluciones de Biotina, Vitamina B12, Tiamina y Selenito de Sodio
(Na2SeO4 ) (Elendt y Bias (1990)) de la siguiente forma:
Solución de Biotina:
Solución de Vitamina B12:
Solución de Tiamina:
Selenito de Sodio (Na2SeO4):
0.0075 g/L
0.010 g/L
0.075 g/L
0.010 g/L
Las soluciones preparadas se deben mantener refrigeradas (4°C ± 2), y pueden
almacenarse por un período de hasta seis meses. Para un volumen de 20 L de
agua dura reconstituida, se adicionan los siguientes volúmenes de cada una de las
soluciones: Tiamina (20 mL), Vitamina B12 (4 mL), Biotina (2 mL), y Selenito de
Sodio (4 mL).
Una vez terminada la preparación del agua reconstituida, se mide el pH, el
cual deberá oscilar entre 7.6 y 8.0. Posteriormente, se airea el líquido de
forma permanente hasta el momento de su uso (mínimo 24 h). El aire
utilizado debe estar libre de grasas y aceites.
Se recomienda que antes de utilizar el agua se determine: 1) la
concentración de oxígeno (la cual debe estar por encima de 6 mg/L), y 2) y
la dureza (que debe encontrarse dentro del intervalo preestablecido de 160180 mg CaCO3/L). En caso de que alguno de los parámetros de control se
encuentre fuera de los intervalos mencionados, el agua deberá desecharse.
Igualmente, con cada lote de agua dura preparada, antes de su utilización, ya sea
como medio de cultivo y/o para la dilución de las muestras, se debe realizar un
bioensayo que permita comprobar que no se presenta ningún efecto sobre la
supervivencia de las daphnias. Para esta prueba, se colocan en tres recipientes un
volumen de 30 mL de agua y 10 neonatos/recipiente. Al cabo de las 48 h la
supervivencia deberá ser mayor del 90%, en caso contrario se debe descartar el
agua reconstituida.
Limpieza y mantenimiento
Para el mantenimiento del cultivo se sugiere aplicar un ciclo de renovación
definido a criterio del analista. El ciclo permite mantener un cultivo de
organismos en etapas
óptimas de reproducción. Algunos autores
(CETESB/L5.018, 1991) recomiendan mantener lotes de individuos separados
por edad, desde 0-1 semana hasta 4 ó 5 semanas de la siguiente forma:
Madurez sexual
Inicio de partos
154
0-24h
1 semana
2 semana
3 semana
4 semana
5 semana
Neonatos con los que se reinicia un nuevo cultivo
Hembras que se descartan
Figura 4.2.3. Cultivo de organismos—ciclo de renovación
Diariamente o cada tercer día dependiendo del desarrollo del cultivo, deben
retirarse los neonatos, los cuales pueden ser destinados al desarrollo de pruebas
o eliminados.
Con igual periodicidad se deberá efectuar la limpieza y el suministro de alimento.
Para la limpieza se emplea un sifón con el cual se remueve las exubias y los
restos de alimento depositados en el fondo de los recipientes. Al finalizar, se
recupera el volumen de agua en cada recipiente, adicionando y/o haciendo el
recambio de 1/3 del volumen con agua reconstituida fresca.
Una vez por semana (por ejemplo el viernes), después del retiro de los neonatos y
antes del suministro de alimento, se transfieren las hembras adultas a recipientes
limpios conteniendo partes iguales del agua antigua y agua de dilución fresca
Se recomienda desechar los organismos mayores a 4 o 5 semanas, y
reemplazarlos e iniciar un nuevo cultivo con los neonatos colectados ese día.
Cuando se van a realizar pruebas, el día previo se extraen los neonatos
presentes en el cultivo, para de esa forma garantizar que los neonatos
encontrados al día siguiente tengan menos de 24 h de nacidos.
Alimentación
Para la alimentación de los cultivos, se puede emplear suspensiones de diferentes
especies de algas (Selenastrum capricornutum, Ankistrodesmus falcatus, Chlorella
sp. Scenedesmus sp., etc.). Para el cultivo de los dos primeros géneros, se
recomienda utilizar medio AAP cuyos detalles de preparación se presenta en el
protocolo de prueba para S. capricornutum (USEPA 1991); para las restantes
especies se puede utilizar medio Bristol, cuya composición se detalla en la tabla
4.2.2 .
La alimentación con cultivos de S. capricornutum se realiza cada tercer día,
después de la limpieza. Para determinar la cantidad de alimento (cultivo algal) que
155
debe suministrarse a cada recipiente del cultivo, calcular el volumen
siguiente manera:
de la
V = (AxB)/C
donde
V = volumen del concentrado algal,
A= número de daphnias por acuario,
B = dosis óptima recomendada (1.5 x 106 células por daphnia / día)
C= concentración (Número de células/mL) de la suspensión de algas (para su
determinación se utiliza una cámara de Neubauer cuyo manejo se presenta en el
protocolo de prueba con Selenastrum capricornutum).
156
Tabla 4.2.2. Medio de Cultivo o Medio Bristol
Solución de Macronutrientes:
Compuesto
Solución No.
Solución Madre
(g/L)
1
2
3
4
5
6
8
25
2.5
7.5
7.5
2.5
17.5
3.1 g/100Ml
5.0 g/100mL
0.498 g/100mL
0.1 mL/L
1.142 g/100mL
NaNO3
CaCl2.H2O
MgSO4 . 7H2 O
K2HPO4
NaCl
KH2PO4
KOH
EDTA
FeSO4.7H2O
H2SO4
H3BO3
9
10
mL de la Solución
Madre por L de
solución
10
10
10
10
10
10
1
1
1
Solución de elementos traza:
Compuesto
1 mL/L
Solución Madre (g/100 mL)
ZnSO4 .7H2 O
MnCl2 . 4H2 O
MoO3
CuSO4 .5H2O
Co(NO3 )2 .6H2O
0.882
0.144
0.071
0.157
0.049
Control del Cultivo del Organismo de Prueba
Para establecer si los individuos del cultivo tienen las condiciones fisiológicas
óptimas para el desarrollo de pruebas de toxicidad, es necesario hacer un
seguimiento de la sensibilidad del cultivo empleando tóxicos de referencia, así
como evaluar alteraciones en el ciclo de vida. El control de estas características
permitirá mantener el correcto desarrollo del cultivo.
a. Prueba de sensibilidad
Los cambios en el estado fisiológico del cultivo pueden ser detectados mediante
la evaluación periódica de la respuesta de los individuos a un determinado tóxicos
de referencia. Aunque existen varios tóxicos recomendados, uno de los más
utilizados es el cromo (Cr IV) a partir de dicromato de potasio (K2Cr2O7). Para
determinar si la sensibilidad del cultivo es adecuada es necesario, previo a iniciar
157
las pruebas rutinarias, evaluar la respuesta de los organismos ante la exposición
al tóxico de referencia. La concentración en la cual se produce la muerte del 50%
de la población de neonatos (Concentración Letal Media o CL50 ) deberá
encontrase dentro del intervalo previamente establecido
Para definir este intervalo es necesario realizar por lo menos 5 pruebas con
el tóxico de referencia, con estos datos se inicia la construcción de la carta
control que deberá completarse con la información generada en nuevas
evaluaciones, las cuales se recomienda, se realicen de forma rutinaria una
vez por mes, hasta alcanzar un número de veinte. Esta carta se debe
mantener actualizada con los veinte datos más recientes (US EPA, 1991). A
partir de estos resultados, se determina la CL50 promedio para la sustancia,
así como la desviación estándar (σ) de la CL50. Los límites superior
(Promedio + 2σ) e inferior ( Promedio - 2σ), corresponderán al intervalo de
concentración en el cual varía la respuesta de los organismos al tóxico
seleccionado (Figura 4.2.4.).
Concentraci
Límite Superior (Promedio + 2σ)
CL50 Promedio (Σ (CL50 –1, CL50 –2, CL50 –3 ,CL50 –N) / N
Intervalo
de
concentra
Límite Inferior( Promedio
Prueba
Fig. 4.2.3. Modelo de construcción de la carta control para el tóxico de
referencia
Para estimaciones de punto como la CL50 con un nivel de probabilidad P0.05, se
espera que solo 1 de 20 pruebas esté fuera de los límites del intervalo por azar. Si
se produce más de un valor fuera de los límites de control, los resultados de las
pruebas de toxicidad llevadas a cabo durante el mes que se produjo el valor fuera
de los límites deberán considerarse provisionales y debe llevarse a cabo una
cuidadosa revisión. Estos valores por fuera del control estarían indicando
anomalías en la sensibilidad de los organismos de prueba.
En caso que se presenten variaciones anómalas de la sensibilidad, se debe
verificar las condiciones de cultivo y eliminar las posibles causas que están
alterando la respuesta de los individuos.
158
b. Desarrollo óptimo del cultivo.
En forma similar, se recomienda hacer regularmente un monitoreo del desarrollo
del cultivo, el cual puede llevarse a cabo mediante el seguimiento del ciclo de vida
de los individuos, estableciendo la edad de madurez sexual, la tasa reproductiva y
la longevidad.
Para el seguimiento del ciclo de vida, se coloca un número conocido de neonatos
(5 a 10) del mismo parto, cada uno en un recipiente y se anota la fecha de inicio
del proceso. Durante todo el período de monitoreo se deberá alimentar a los
organismos y mantener los patrones de limpieza rutinarios recomendados
anteriormente.
Madurez sexual
Durante la primera semana de seguimiento se harán observaciones del
crecimiento y maduración de los neonatos así como de la formación de los
huevos en su bolsa de incubación (Fig. 4.2.2.), este evento, así como el tiempo al
cual se produce el primer parto debe registrarse a fin de definir la edad en que se
alcanza la madurez sexual del cultivo
De acuerdo a datos reportados en la literatura (Lewis & Maki, 1981; Goulden et
al.,1982), los individuos de un cultivo sano alcanzan su madurez sexual entre los
8 y 12 días de edad En caso de que dicho período sea más prolongado o se
observe mortalidad, es necesario revisar las condiciones del mantenimiento del
cultivo o suplementar el agua reconstituida con vitaminas y selenio.
Tasa reproductiva
A partir del primer parto, se lleva a cabo un registro diario del número de crías que
se producen, removiéndolas de los recipientes de monitoreo. El registro debe
cubrir un tercio del ciclo de vida (21 días) o hasta cuando alguna de las hembras
adultas muera (lo que suceda primero). Con los resultados obtenidos, se establece
el número de crías promedio por hembra. Este valor puede oscilar entre 112 y
212 de acuerdo a algunos autores (Girling y Garforth, 1989; Klüttgen et al., 1994),
Longevidad
Para determinar la longevidad el seguimiento debe prolongarse hasta que queden
con vida por lo menos el 20% del número inicial de organismos bajo observación.
En el registro se debe anotar el tiempo al que se produce la muerte, valores que
permitirán establecer la longevidad promedio de los individuos del cultivo. De
acuerdo a Edley y Law (1988), Edley, M. T., y R. Law. 1988 Girling y Garforth
(1989), la longevidad de las daphnias provenientes de un cultivo sano puede variar
entre 40 y 60 días.
159
La detección de mortalidad en períodos más cortos, hará necesario la revisión de
las condiciones de mantenimiento del cultivo o incluso el manejo de suplementos
en el agua dura (vitaminas y selenio).
4.2.4. PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA
Para el desarrollo de pruebas de toxicidad aguda con D. magna se emplean
neonatos (< 24h nacidos) los que son expuestos a diferentes concentraciones de
una muestra o de un agente tóxico durante un periodo de 48 h. Como resultado de
dicha exposición, es posible determinar la concentración de la muestra o
compuesto problema, que produce la muerte al 50 % de la población de neonatos
expuestos (concentración letal media o CL50), con un nivel de confiabilidad del
95%.
También puede determinarse la concentración mínima donde aún se observa
efecto de mortalidad (Lower Observable Effect Concentration, LOEC) así como
aquella donde la muestra no produce la muerte de neonatos (No observable Effect
Concentration, NOEC).
Cuando no hay un conocimiento de la toxicidad de las muestras, es recomendable
llevar a cabo una prueba preliminar, en la cual se prepara un amplio número de
concentraciones sin réplicas (por ejemplo: 0.001, 0.01, 0.1, 1,10, y 100 %). Para la
prueba se coloca 30 mL de cada una de las diluciones en los vasos de prueba, se
transfieren 10 neonatos, y a las 24 h se registra el número de organismos
muertos. Con esta información podrá establecerse el intervalo de concentración
en el cual se puede esperar el 0 y el 100% de mortalidad. Este intervalo, se utiliza
como guía para la preparación de las diluciones en las pruebas definitivas.
Para la preparación de las diluciones de las muestras, se utiliza como medio de
dilución agua dura reconstituida (180 y 160 mg/L CaCO3-), sin ningún suplemento.
En la preparación del agua, se debe determinar los parámetros (Numeral 4.2.3)
señalados anteriormente (APHA, 1998).
Preparación de las soluciones de Prueba: muestras ambientales (efluentes y
aguas superficiales)
Para preparar la diluciones de la muestra se recomienda utilizar un factor de
dilución de 0.5 el cual permite cubrir un amplio intervalo de dilución (por ejemplo,
100, 50, 25, 12.5, 6.25% etc.). Si se observa un alto porcentaje de mortalidad
durante las primeras horas del bioensayo, es necesario realizar más diluciones de
a muestra y repetir el bioensayo.
Las pruebas definitivas, requieren por lo menos 5 diluciones, por lo que es
necesario preparar un mínimo de 100 mL por dilución. Este volumen será
suficiente para el llenado de las tres réplicas (25 ml en cada uno) de cada
concentración. Como recipientes se pueden emplear vasos de polietileno
desechables (Fig 4.2.5.) de 30 mL, o vasos de precipitado de vidrio de 50 mL .
160
Además de las diferentes concentraciones de la muestra, se debe preparar junto
con las respectivas réplicas, un control negativo con agua dura reconstituida sin
suplementos, y un control positivo con una solución del tóxico de referencia (Cr VI)
en la concentración que según la carta control previamente elaborada,
corresponda a la CL 50
Una vez preparadas cada una de las soluciones, se transfieren 10 neonatos de
menos de 24h de nacidos a cada uno de los recipientes. Para realizar este
procedimiento, se puede utilizar una pipeta despuntada. Terminada la
transferencia, se cubren los vasos con papel parafilm y se colocan bajo
condiciones controladas de iluminación y temperatura (Tabla 4.2.2.) por un
periodo de 48h.
Transcurrido el tiempo establecido, se revisan los vasos de prueba y se registra el
número de organismos muertos en cada uno. La muerte se reconoce, por la
carencia de movilidad o la ausencia de ritmo cardíaco. Antes de efectuar las
lecturas se agitan los recipientes en forma circular para reactivar su movimiento
de los organismos que se posan inmóviles en el fondo. Aquellos que no presenten
movilidad pueden observarse con un microscopio estereoscópico para confirmar la
ausencia de ritmo cardíaco.
En las Figuras 4.2.4. y 4.2.5 se presenta, un esquema del procedimiento de
prueba, así como el diagrama de flujo de las actividades seguidas durante la
elaboración de las pruebas de toxicidad con Daphnia magna.
161
Fig 4 2 4 Procedimiento de prueba
162
Cultivos de
Mantenimiento
Sustancias Tóxicas/
Muestra
Neonatos
24 h
Preparación de
Diluciones
No. de Diluciones (5)
No. de Réplicas (3)
Diseño Experimental
Bioensayo
Incubación
48h
Toma de
Datos
No. de Muertos
% de Mortalidad
Análisis Estadístico
(Probit)
CL 50-48h
Limites al 95%
Fig. 4.2.5 Diagrama de Flujo de las Actividades Vinculadas al Desarrollo del
Protocolo de Prueba de Daphnia magna
163
4.2.5. Expresión de los Resultados
Calculo de la CL50
Para el cálculo de la CL50 y sus respectivos límites de confianza al 95%, se utiliza
el método Probit, ya sea manualmente o con ayuda de paquetes estadísticos que
tengan este procedimiento.
El método de análisis PROBIT permite estimar la CE50 o CL50 ajustando los datos
de mortalidad mediante una técnica de probabilidad para estimar los valores que
siguen una distribución logarítmica de tolerancias. El porcentaje de organismos
afectados, o muertos por la acción tóxica de una sustancia, se transforma a
unidades probit. Esta transformación, permite el ajuste a una línea de regresión,
en la cual la concentración correspondiente al probit 0.5, corresponderá a la
cantidad de sustancia capaz de generar el efecto estudiado en la mitad de la
población.
Una de las restricciones del método es que para el cálculo de la CE50 o CL50
deben obtenerse valores intermedios entre 0 y 100% de mortalidad.
Aceptabilidad de los resultados
•
•
•
La mortalidad en el control negativo no debe exceder el 10%
La concentración final de oxígeno disuelto debe ser mayor de 2 mg/L.
La CL50 para el tóxico de referencia deberá estar dentro de los límites de
confianza preestablecidos en la carta control. En caso de emplear un control
positivo de concentración cercana a la CL50, los valores de mortalidad
obtenidos deberán encontrarse cercanos al 50%. Se puede considerar
aceptable el encontrar mortalidades entre el 33 y 57% .
REFERENCIAS
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Wastewater.20th Ed. American Public Health Association. Ap. 8010G.. Washington
D.C., pp. 8-20-8-23.
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Crustacea), Metodo de essaio. L5.018. Agosto 1991. CETESB.
Dutka B.J. 1989. Methods for Microbiological and Toxicological Analysis of Water,
Wastewaters and Sediments: National Water Research Institute (NWRI)
Environment Canada. Burlington Ontario
164
Edley, M. T., y R. Law. 1988. Evolution of life histories and yields in
experimental population of Daphnia magna. Biol. J. Limn. Soc. 34: 309-326.
Elendt B. P. y Bias W. R. 1990. Trace nutrient deficiency in Daphnia
magna cultured in standard medium for toxicity testing effects of the
optimization of culture conditions on life history parameters of Daphnia
magna. Wat. Res. 24 (9): 1157-1167.
Girling, A. E. & Garforth, B. M. 1989. Influence of variations in culture medium on
the survival and reproduction of Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol.
42: 119-125.
Goulden, C. E., Comotto, R. M., Hendrickson, J. A. Jr., Horning, L. L., & K. L.
Johnson. 1982. Procedures and recomendations for the culture and use of
Daphnia in bioassay studies. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth
Conference, ASTM STP 766. J. G. Pearson, R. B. Foster, & W. E. Bishop, Eds.,
American Society for Testing and Materials. pp 139-160
Gutiérrez L. E., Lerdo de Tejada B. A., Herto-Delgadillo R. Y., y C. J. Garcia. 1989.
Procedimientos de evaluación tóxica de efluentes industriales líquidos utilizando
Daphnia magna Straus (Cladócera, crustácea), Instituto Mexicano de Tecnología
del Agua. México. pp 105
Klüttgen, B., Dülmer, U., Engels, M., & H. T. Ratte. 1994 ADAM, and artificial
freshwater for the culture of zooplankton. Water Research. 28 (3): 743-746.
Lewis, M. A., & A. W. Maki. 1981. Effects of water hardness and diet on
productivity of Daphnia magna Strauss, in laboratory culture. Hydrobiology. 85:
175-179.
US EPA Environmental Protection Agency (EPA). 1991. Methods for Measuring the
Acute Toxicity of Effluent and Receiving Waters to Freshwater and Marine
Organisms. 4th ed: Weber, C.I., Ed. EPA-600/4-90-027.
165
Bioensayo de toxicidad crónica con Microalgas Clorofíceas
Autor: Fernando Martínez Jerónimo
En general, el método propuesto por Yolanda me parece adecuado, solo que propondría
las siguientes modificaciones. Estas fueron ya comentadas con Yolanda en la pasada
reunión del Taller, por lo que creo que no habría inconvenientes en que se pudieran
incorporar para tener una propuesta que resulte mas conveniente para todos.
Entre los cambios sugeridos se encuentran los siguientes:
Principio de la prueba
La prueba se basa en la determinación de los efectos que sobre la tasa de crecimiento
poblacional pueden producir las sustancias tóxicas. El bioensayo se basa en que una
población microalgal, cuando se encuentra en condiciones propicias para su desarrollo, es
capaz de aumentar su tamaño de población. Debe recordarse que las microalgas, como
componentes del fitoplancton, constituyen el grupo de productores primarios, que son
fundamentales en todo ecosistema al permitir el desarrollo de consumidores de diferente
nivel. Siendo la tasa de crecimiento una respuesta sensible y relativamente fácil de
modificar adversamente por condiciones que afecten el desarrollo, entonces cuando se
presenta una situación de estrés, la población disminuirá su tasa de incremento. Este
supuesto es válido para especies de microalgas que se reproducen asexualmente, por
fragmentación o por la formación de autosporas. El incremento en el tamaño de población
se puede medir directa o indirectamente, lo cual también es una gran ventaja de esta
prueba. Es una medida directa la densidad poblacional, la que se realiza mediante la
cuenta de los individuos en muestras representativas (en una cámara de Neubauer o
hemacitómetro); son medidas indirectas la determinación de densidad óptica (o
absorbancia) a una longitud de onda adecuada, el peso seco, el contenido de clorofila ú
otros pigmentos fotosintéticos, la concentración de proteínas, etc.
El método consiste en exponer a las microalgas a una serie de concentraciones o
diluciones de los materiales real o potencialmente tóxicos, espaciadas geométricamente
en base 2; en el bioensayo definitivo, la concentración mayor deberá inhibir
completamente el crecimiento, en tanto que la menor no deberá diferir significativamente
del control.
Se sugiere como organismos de prueba a las microalgas clorofíceas Raphidocelis
subcapitata o Ankistrodesmus falcatus, que son especies reproducción asexual y
unicelulares por lo que es sencillo realizar las cuentas para determinación de densidad
celular
La respuesta medida es la inhibición en la tasa de crecimiento poblacional en un periodo
de 96 horas de exposición. La ventaja de esta prueba es de fácil realización y proporciona
un a medida directa de los efectos sobre la población experimental.
La prueba es adecuada para la evaluación de los efectos tóxicos agudos (letales) de
efluentes con o sin tratamiento, muestras de agua de cuerpos de agua receptores de
descargas, sustancias químicas puras y en mezclas de composición conocida o
desconocida, principios activos y productos formulados comerciales. Es útil para la
clasificación de la toxicidad de compuestos químicos, en el monitoreo de ecosistemas
166
acuáticos y en la evaluación de la eficiencia de los sistemas de tratamiento de las aguas
residuales.
Material biológico
La cepa utilizada debe provenir de un cepario o colección de laboratorio autorizado.
Aunque particularmente A. falcatus es una especie que puede ser colectada en muestras
de fitoplancton, el proceso de aislamiento, purificación e identificación son laboriosos y
tardados. La cepa debe ser conservada de acuerdo a las instrucciones del proveedor, en
refrigeración y en medio de cultivo solidificado con agar bacteriológico. La calidad
microbiológica de la cepa debe ser revisada periódicamente, pues aun cuando no se
requiere de cepas axénicas, la carga bacteriana debe ser reducida y nunca debe contener
hongos protozoarios ni otros organismos fotosintetizantes, tales como las cianobacterias,
que con relativa facilidad pueden contaminar a una cepa monoespecífica, sobre todo
cuando no se realiza un manejo aséptico o cuando no se trabaja con medios de cultivo y
materiales debidamente esterilizados.
Infraestructura en el laboratorio (cámaras especiales, campana de extracción, área estéril,
etc.)
Para esta prueba se requiere que el laboratorio cuente con un área para trabajo aséptico
(cuarto de inoculación o campana de flujo laminar con filtración de aire), además de área
para esterilización de materiales y soluciones (con horno y autoclave). Adicionalmente se
deberá contar con una área acondicionada para el cultivo, la cual debe tener sistema
regulado de iluminación artificial con lámparas fluorescentes “luz de día”, con control de
temperatura y con suministro de aire comprimido y filtrado. El suministro de aire se
emplea para la producción de inóculos y la propagación de cultivos activos de la cepa,
pues los bioensayos se realizan sin aireación, aunque en este caso es deseable el contar
con una placa agitadora orbital, a fin de evitar la sedimentación de las microalgas; esto
último se puede sustituir en forma conveniente mediante agitaciones manuales periódicas
durante el periodo de duración del bioensayo.
Material de laboratorio
La cristalería es la típica de un laboratorio, aunque debe incluir los requerimientos para el
trabajo microbiológico, además de balanza analítica, pipetas automáticas, propipetas, etc.
Reactivos
Se requieren los reactivos para la preparación del medio de cultivo para el crecimiento
algal (ver mas adelante); este medio funciona también como agua de dilución para la
aplicación y exposición a los tóxicos durante el bioensayo. Para simplificar la preparación
del medio de cultivo se sugiere la preparación de soluciones concentradas, que deberán
167
conservarse en frascos herméticos, protegidos de la luz y a baja temperatura. Todos los
reactivos deberán ser grado analítico y de la máxima pureza posible a fin de evitar estar
exponiendo a los organismos a elementos o compuesto potencialmente tóxicos, lo que
podría afectar la respuesta de las microalgas durante el bioensayo.
Cultivo y mantenimiento o almacenamiento de los organismos
Las cepas se conservarán en tubos de ensaye con tapón de baquelita, que contendrán
medio de cultivo solidificado con agar bacteriológico al 1.5 ó 2 %. También se recomienda
mantener cultivos activos de la cepa en matraces pequeños. El mantenimiento de las
condiciones asépticas es fundamental para garantizar la calidad de respuesta de las
microalgas. El medio de cultivo sugerido es el recomendado la Agencia para la protección
Ambiental de los Estados Unidos de Norteamérica (USEPA, 2002), que se muestra en la
Tabla 1, que es adecuado tanto para la conservación de la cepa como para la
propagación de los inóculos y como medio de dilución para los bioensayos. Sin embargo,
para realizar cultivos de rápido crecimiento se recomienda de manera adicional el medio
Basal de Bold, que se muestra en la Tabla 2.
168
Tabla 1. Concentraciones finales de macronutrientes y micronutrientes en el medio de
cultivo (USEPA, 2002), en agua destilada o desionizada (con conductividad
menor a 5 µS)
(mg/l)
Elemento
NaNO3
25.5
N
4.20
MgCl2 6H2O
12.2
Mg
2.90
CaCl2 2H2O
4.41
Ca
1.20
MgSO4 7H2O
14.7
S
1.91
K2HPO4
1.04
P
0.186
NaHCO3
15.0
Na
Macronutriente
(mg/l)
11.0
K
0.469
C
2.14
Micronutriente
(µg/L)
Elemento
(µg/L)
H3BO3
185.0
B
32.5
MnCl2 4H2O
416.0
Mn
115.0
ZnCl2
3.27
Zn
1.57
CoCl2 6H2O
1.43
Co
0.354
CuCl2 2H2O
0.012
Cu
0.004
Na2MoO4 2H2O
7.26
Mo
2.88
FeCl3 6H2O
160.0
Fe
Na2EDTA 2H2O
300.0
Na2SeO4
2.39
Se
33.1
0.91
169
Tabla 2. - Formulación del medio de cultivo Basal de Bold, para la propagación de
microalgas clorofíceas.
Solución
No.
1
NaNO3
REACTIVO
mg l-1 *
250
2
CaCl2 2H2O
25
3
MgSO4 7H20
75
4
K2HPO4
75
5
KH2PO4
175
6
NaCl
25
7
FeSO4 7H2O
H2SO4
8
H3BO3
11.42
9
EDTA
50
KOH
31
ZnSO4 7H2O
MnCl2 4H2O
MoO3
CuSO4 5H2O
Co(NO3)2 6H2O
* En agua destilada o desionizada
10
4.98
0.001 (ml l-1)
8.82
14.4
0.71
1.57
0.49
Los medios de cultivo se preparan a partir de soluciones patrón o concentradas. Tanto
para la propagación como para los bioensayos se requiere proporcionar iluminación
continua, intensidad luminosa de 4,500 a 5,000 luxes, temperatura de 25±2 °C. La calidad
de respuesta de la cepa debe ser evaluada periódicamente con el tóxico de referencia
sulfato de cobre, evaluando la concentración media de inhibición (CI50). Los bioensayos
en su fase definitiva, tiene duración de 96 horas
Preparación del material antes de la prueba
Todos los materiales empleados deberán ser de vidrio borosilicato, lavado de acuerdo al
protocolo correspondiente para eliminar todo vestigio tóxico que pudiera afectar los
resultados en el bioensayo. Como se ha dicho, todo el manejo debe realizarse en
condiciones asépticas, con materiales, medios de cultivo y soluciones esterilizadas de la
manera adecuada (calor seco, autoclave y/o filtración Millipore®.
170
Procedimiento de prueba
La prueba es estática, sin renovación de la solución de prueba, realizándose siempre con
soluciones acuosas de los materiales y muestras a evaluar. Cuando se trate de materiales
de baja hidrosolubilidad, se deberán emplear solventes de baja toxicidad, como acetona,
etanol, metanol o dimetil sulfóxido, procurando siempre que su concentración no sea
superior a 1 ml/l, independientemente de que se deberá implementar una segunda serie
control que contenga la máxima cantidad de solvente utilizada. Se deberá evaluar el pH y
la conductividad al inicio y al término de la prueba. La prueba dura 96 h, siendo importante
la determinación de efectos a la terminación, aunque se recomienda hacer observaciones
intermedias (24, 48 y 72 horas), además de observaciones microscópicas de la morfología
y coloración o cambio en los patrones de distribución citoplásmica de las células. Se
ensayarán al menos 5 concentraciones o diluciones de los materiales a evaluar, contando
cada una de ellas con al menos 3 réplicas. Los recipientes de prueba sugeridos son tubos
de ensaye de 10X1.5, de preferencia con tapón de baquelita; en caso contrario se
deberán utilizar tapones de algodón recubiertos de gasa. El volumen total de prueba será
de 7 ml. La temperatura será de 25±2 °C, la iluminación continua con intensidad luminosa
de 4,500 a 5,000 luxes proporcionada por lámparas fluorescentes “luz de día”. La
respuesta evaluada será la densidad celular al inicio y al término de la prueba
(preferentemente con observaciones intermedias). Para evaluar la densidad poblacional,
se empleará la cámara de Neubauer o hemacitómetro. SE debe tener una variación
máxima del 20 % entre cuentas consecutivas de una misma muestra, de lo contrario se
deberá aumentar el número de cuentas por muestra.
Expresión de resultados
Se determina la Concentración Media de Inhibición (CI50) a las 96 horas. El criterio de
aceptabilidad es un aumentó de al menos 16 veces de la densidad celular inicial en los
testigos.
Este método es semejante a los propuestos como métodos estandarizados: de la USEPA,
la ASTM y la OECD.
171
4.5. ENSAYO DE TOXICIDAD CRONICA CON
Selenastrum capricornutum (Pseudokirchneriella
subcapitata)
MÉTODO
DE
ENUMERACIÓN
CELULAR
BASADO
EN
EL
USO
DE
HEMOCITÓMETRO NEUBAUER
YOLANDA PICA GRANADOS
Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Cuernavaca, Morelos,
México
ALICIA RONCO
Centro de Investigaciones del Medio Ambiente, CIMA, Facultad de Ciencias
Exactas, Universidad Nacional de La Plata, La Plata, Argentina
MARIA CONSUELO DIAZ BAEZ
Unidad Académica de Ingeniería Ambiental, Facultad de
Ingeniería,Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia
4.5.1. Principio
4.5.2. Reactivos, Soluciones y Cultivo de los Organismos de Prueba
4.5.3. Materiales y Equipos
4.5.4. Procedimiento para el Desarrollo de la Prueba
4.5.5. Análisis de Datos
4.5.6. Conteo con la Cámara de Neubauer
REFERENCIAS
4.5.1. Principio
El género y la especie de Selenastrum capricornutum fueron modificados
formalmente a Pseudokirchneriella subcapitata (Hindak, 1990), sin embargo, para
mantener consistencia con la literatura que la refiere, se empleará en éste
procedimiento su nombre original,. Selenastrum capricornutum.
El alga Selenastrum capricornutum , es una alga verde (clorofita) unicelular con
forma de media luna (Figura 4.5.1.) y un volumen aproximado de entre 40 y 60
μm3, que puede encontrarse en sistemas acuáticos epicontinentales eutróficos u
oligotróficos. Este método puede ser utilizado por sí mismo o como parte de una
batería para estimar la potencial fitotoxicidad de aguas dulces superficiales o
172
subterráneas, aguas servidas y otro tipo de muestras líquidas, tales como:
eluriados o lixiviados, agua intersticial de sedimentos o cualquier compuesto puro
soluble en agua. La prueba es especialmente adecuada para ser practicada en
laboratorios que cuenten con una infraestructura básica, siendo un ensayo sencillo
y de bajo costo.
Figura 4.5.1. Microfotografìa de Selenastrum capricornutum
Cuando las células son expuestas a muestras que contienen contaminantes
tóxicos su reproducción se afecta alterando la tasa de crecimiento de la población
de las algas. El efecto de inhibición de la población causada por los agentes
tóxicos en una muestra luego de 72 hs de exposición, bajo condiciones de
temperatura controlada (24 ± 2º C), se determina comparándolo con el crecimiento
normal observado en un sistema libre de agentes contaminantes conocido como
control. Dependiendo del número de concentraciones y réplicas preparadas para
el desarrollo del experimento, se determina la CI50 (Concentración de Inhibición
Media), la LOEC (Concentración Mínima a la cual se Observa Efecto) y la NOEC
(Concentración a la cual No se Observa Efecto).
El protocolo de prueba con el alga Selenastrum. capricornutum presentado en este
manual, es una modificación del método estándar publicado por la Agencia de
Protección Ambiental de Canadá (Environment Canada, 1992 EPS1/RM/25). Los
cambios introducidos (Blaise et al., 2000) corresponden al uso de volúmenes
reducidos (2.6 mL en viales de borosilicato de vidrio de 20 mL) y la cuantificación de
las células mediante una cámara de conteo (Neubauer) utilizando un microscopio
óptico.
4.5.2. Reactivos, Soluciones y Cultivo del Organismo de Prueba
Todos los reactivos utilizados deben tener calidad ACS, o al menos de 99% de
pureza. Para su preparación se emplea agua destilada en vidrio o Millipore Super
Q (USEPA,1992).
173
Medio de cultivo para proliferación de algas (1X)
El medio de cultivo se basa en la preparación de una serie de cinco soluciones: la
primera de ellas conteniendo micro-nutrientes, y las cuatro restantes con macronutrientes, todas ellas con las concentraciones adecuadas para asegurar un
crecimiento óptimo de las algas durante el periodo de incubación.
a. Preparación de soluciones
Para la preparación de las cinco soluciones stock, rotular cinco frascos de 500 ml
(preferentemente material aforado) de la siguiente manera: Solución 1, 2, 3, 4 y 5,
respectivamente. Agregar 350 ml de agua a cada uno de ellos.
Solución 1. Micro-nutrientes:
Se inicia con la preparación de las soluciones de cloruro de zinc, cloruro de
cobalto, molibdato de sodio y cloruro de cobre. Con este fin, se emplean 5 frascos
de 100 ml de capacidad, que deben ser previamente etiquetados con el nombre
del compuesto. En el caso del cloruro de cobre se etiquetan dos frascos,
diferenciándolos con los números I y II. Posteriormente seguir las instrucciones
que se señalan a continuación.
Solución de cloruro de zinc
Verter en el frasco 70 ml de agua, agregar luego 164 mg de cloruro de zinc
(ZnCl2). Llevar a volumen final de 100 mL con agua y mezclar bien. A partir de
esta solución transferir 1 mL mediante pipeta al frasco 1.
Solución de cloruro de cobalto
Verter en el frasco 70 mL de agua, agregar 71,4 mg de cloruro de cobalto
(CoCl2·6H2O). Llevar a volumen con agua hasta completar 100 mL y mezclar bien.
A partir de esta solución, transferir 1 mL mediante pipeta al frasco 1.
Solución de molibdato de sodio
Verter en el frasco 70 mL de agua, luego agregar 363 mg de Molibdato de Sodio
(Na2MoO4·•2H2O). Finalmente completar el volumen hasta 100 mL con agua y
mezclar bien. A partir de esta solución, transferir 1 mL mediante pipeta al frasco 1.
Solución de cloruro de cobre
Verter 70mL de agua en dos de los frascos de 100 mL, en el primero de ellos
agregar 60,0 mg de cloruro de cobre (CuCl2·• 2H2O), luego llevar a volumen
174
de 100 mL con agua y mezclar bien. Una vez lista esta primera solución de
cloruro de cobre, tomar 1 mL, verter en el segundo frasco y completar el
volumen de 100 mL con agua. Un mL de esta segunda solución es la que se
emplea para la preparación de la Solución No 1. de Micro-nutrientes.
Cuando estén preparadas las soluciones anteriores, pesar el resto de los
reactivos, tomar el frasco de 500 mL etiquetado como Solución 1 y agregar cada
compuesto químico en el orden fijado a continuación. No alterar la secuencia ya
que se formarán precipitados difíciles de solubilizar.
Asegúrese que antes de adicionar el siguiente compuesto las sales se encuentren
completamente disueltas.
Tabla 4.5.1. Reactivos utilizados en la preparación de solución de
micronutrientes
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Compuesto
Fórmula
Masa en gramos (g) o
Volumen (mL) de
solución stock
Cloruro de Magnesio
Cloruro de Calcio
Ácido Bórico
Cloruro de Manganeso
Cloruro de Zinc
Cloruro Férrico
Cloruro de Cobalto
Molibdato de Sodio
Cloruro de Cobre
Etilen diaminotetracético: sal
disódica
MgCl2·•6H2O
CaCl2·•2H2O
H3BO3
MnCl2·•4H2O*
ZnCl2*
FeCl3·•6H2O*
CoCl2·•6H2O*
Na2MoO4·•2H2O
CuCl2·•2H2O
Na2EDTA·•2H2O
6,08
2,20
0,0928
0,208
1 mL de la solución
0,0799
1 mL de la solución
1 mL de la solución
1 mL de la solución
0,150
* Estos compuestos pueden ser sustituidos por sulfatos. Por ejemplo, ZnCl2 o
ZnSO4. Si así se hiciera, recalcular estequiométricamente las masa a utilizar.
Después de haber agregado todos los componentes al frasco de la Solución 1,
llevar a volumen de 500 mL con agua (Tabla 4.5.1).
Soluciones de Macro-nutrientes:
Adicionar en los frascos respectivos de 500mL restantes las cantidades de las
sales indicadas a continuación (Tabla 4.5.2.).
Tabla 4.5.2. Reactivos utilizados en la preparación de solución de macronutrientes
175
Compuesto
Fórmula
Masa (g)
NaNO3
MgSO4·•7H2O
25,5
14,7
K2HPO4
1,044
NaHCO3
15,0
Frasco
Solución 2 Nitrato de Sodio
Solución 3 Sulfato de
Magnesio
Solución 4 Fosfato de
Potasio
Solución 5 Bicarbonato de
Sodio
Mezclar bien hasta disolver, y posteriormente adicionar agua hasta alcanzar el
volumen de 1000mL en cada uno de los recipientes.
Las soluciones stock pueden ser conservadas refrigeradas (sin congelar) durante
dos meses.
Este medio de proliferación también puede ser empleado para otras especies de
algas tales como Ankistrodesmus sp, Scenedesmus sp, entre otras. Por cada litro
de medio de cultivo que se desee preparar, se adiciona en agua destilada 1 mL de
cada una de las 5 soluciones en forma ordenada. Así, se debe iniciar con la 1
hasta terminar con la 5, llevando a volumen al finalizar. Se sugiere no alterar el
orden de adición de las soluciones ya que se pueden formar precipitados difíciles
de eliminar. Mezclar bien después de la adición de cada solución.
Al final el pH del medio deberá ser 7.5 ± 0.1 por lo que es necesario ajustarlo, ya
sea con NaOH o HCl 1 N. Inmediatamente, filtrar el medio bajo condiciones
asépticas (mechero o campana de flujo laminar) a través de una membrana de
éster de celulosa de 0.22 µm de abertura de poro y 47 mm de diámetro. El sistema
de filtración y el matraz de captación deben estar estériles. Para la filtración se
puede utilizar una bomba de vacío. El medio nutritivo esterilizado se inocula con
las algas.
b. Cultivo y Propagación de las Algas
La inoculación se realiza bajo condiciones de esterilidad ya sea mediante el
trabajo cerca de un mechero, o utilizando una campana de flujo laminar. El cultivo
se puede iniciar a partir de cepas mantenidas en medio sólido tomando las células
con un asa y esparciéndolas en el medio nutritivo líquido, o a partir de un cultivo
líquido de algas que haya alcanzado la fase estacionaria y tenga una densidad
celular entre 1 y 3 millones de células/mL. Cuando los cultivos alcanzan esta
densidad se caracterizan por presentar un color verde intenso, que se logra entre
los 5 y 7 días después de la inoculación. En el caso que se seleccione esta última
opción, se debe tomar 50 mL del cultivo por cada litro de medio estéril.
El medio inoculado, se coloca a 24°C ± 2°C dentro de una cámara con iluminación
superior a 2000 lux, manteniendo aireación permanente. En el caso que no se
176
cuente con el sistema de iluminación se puede utilizar un sistema similar al
presentado en el Anexo 1. Para la aireación, se puede emplear una bomba de aire
para acuarios, o se utiliza directamente el aire de la línea del laboratorio. En este
último caso, se debe eliminar las impurezas intercalando filtros entre la fuente y el
recipiente de cultivo. Los filtros permiten mantener condiciones axénicas, y
eliminan las partículas sólidas o líquidas (polvo del aire, emulsiones de aceite,
etc). Existen filtros especiales disponibles en el mercado de artículos para
laboratorio, en el caso de no contar con ellos puede fabricarse en el laboratorio,
empacando carbón activado y lana de vidrio.
La manguera se conecta a un tubo hueco de vidrio o a una pipeta despuntada
previamente esterilizados. El tubo se introduce en el medio inoculado cuidando de
que el extremo llegue cerca del fondo del recipiente para que el burbujeo evite la
formación de depósitos de algas. El extremo opuesto, se conecta a la manguera, y
deberá sobresalir del recipiente; para ello, se fija a la boca de la botella de cultivo
con un tapón estéril.
Una vez que el cultivo alcanza la fase estacionaria (5-7 días), se retira de la
cámara de incubación y se deja reposar a 4º C. Esto puede hacerse en el
refrigerador o en el interior de un cuarto frío, bajo condiciones de oscuridad por 24
a 48 hs. El cultivo sedimentado es separado del sobrenadante por decantación, lo
cual permite obtener el concentrado de algas que se utilizará en las pruebas de
toxicidad, o en la alimentación de otros organismos como es el caso de Daphnia
magna. Igualmente, las algas pueden ser concentradas mediante centrifugación.
Reactivación de algas inmovilizadas
Alternativamente al mantenimiento de un cultivo de algas, algunos laboratorios
mantienen las algas inmovilizadas sobre alginato en la forma de perlas, las cuales
pueden conseguirse comercialmente. En este caso, cuando se van a realizar
pruebas de toxicidad, es necesario liberar las células de la matriz de alginato, para
lo cual se sigue el procedimiento que se describe a continuación.
Para la desinmovilización, se toman entre 10 y 12 perlas con algas asegurándose
de que estén libres de medio líquido. Se transfieren a un tubo cónico de 50 mL, se
adiciona 5 mL de citrato de sodio 0.1 M y se sella el recipiente. A continuación se
agita vigorosamente durante 30 segundos, repitiendo el procedimiento cada 2
minutos hasta que la matriz se haya disuelto completamente (20-30 min). Con ayuda
de un agitador o vortex (a intensidad moderada), se puede reducir el tiempo de
proceso a 5 minutos. Una vez disueltas las perlas, centrifugar a 3000 rpm durante 10
minutos. Eliminar el sobrenadante, conservar las algas sedimentadas, resuspender
las células en 5 mL de la solución amortiguadora utilizada para las pruebas (0.15 mg
NaHCO3/L).
Medio nutritivo enriquecido (18X) para las Pruebas de Toxicidad
Este medio se prepara a partir de las soluciones 1, 2, 3, 4, y 5 empleadas en la
elaboración del medio nutritivo para la proliferación de algas. Para la preparación
177
se recomienda utilizar un recipiente aforado de 1 L debidamente rotulado. Se
coloca 800 mL de agua a los cuales se adiciona 18 mL de cada una de las
soluciones ordenadamente como se indicó previamente. Terminada la adición de
las soluciones, llevar a volumen con agua destilada y ajustar el pH a 7.5 ± 0.1 con
NaOH o HCl 1 N.
Solución amortiguadora para las Pruebas (15 mg NaHCO3/L)
Para su preparación se toma un matraz aforado de 1L y se coloca 900 mL de agua
destilada, se adiciona 1 mL de la Solución 5 empleada anteriormente, se mezcla y
se completa a volumen.
Medio sólido para mantenimiento de las cepas
Disolver 1 g de agar-agar en 100 ml del medio nutritivo para desarrollo de
Selenastrum capricornutum, y llenar con medio los tubos de ensayo hasta la mitad
de su volumen. Cerrar los tubos y esterilizar en autoclave u olla de presión a 120°
C, 15 lb durante 15-20 minutos. Al término del período, sacar los tubos, apretar
sus tapas y dejar enfriar en posición inclinada hasta que el medio se solidifique. El
medio sólido puede conservarse en refrigeración hasta por 1 mes.
Inoculación de las algas en medio sólido
Bajo condiciones de esterilidad, transferir con una asa bacteriológica las algas
cultivadas en medio sólido al tubo con medio fresco, esparciendo las células en
estría sobre la superficie del medio. La inoculación se inicia en zona más profunda
del tubo, y se continúa hacia el exterior.
Una vez inoculado los nuevos medios, incubar a 24 ± 2 ºC, con iluminación
continua e intensidad de luz superior a 2000 lux por un periodo entre 48 y 72
h. Cuando se observe crecimiento se retiran los tubos de la cámara y se
almacenan en oscuridad a 4 ± 2 ºC. Bajo estas condiciones, las algas
continuarán creciendo pero de forma lenta
4.5.3. Materiales y Equipos
Materiales
•
•
•
•
•
Pipetas de vidrio graduadas (5 y 10mL)
Pipeta automática de 100µL con puntas estériles
Pipeta automática de 100-1000 µL con puntas estériles
Viales de centelleo de vidrio borosilicato claro de 20 mL de capacidad
Papel (film) transparente
178
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Cámaras de iluminación (ver en Anexo 1, como opción, un diseño de cámara
para pruebas
Gasa y algodón
Tubo de vidrio o pipeta de vidrio despuntada
Manguera de acuario
Botellas de 1L o matraces aforados de igual capacidad
5 Botellas de 500 mL o matraces aforados de igual capacidad
6 Botellas de 100 mL o matraces aforados de igual capacidad
Recipiente de vidrio claro para cultivo de boca angosta, preferentemente
esterilizable, de 10-20L de capacidad
Asas bacteriológicas
Tubos de centrífuga (opcional)
Tubos de cultivo con tapa de rosca.
Tubos de centrífuga de 50 mL, plásticos con tapa de rosca y estériles
(opcional)
Hemocitómetro o Cámara Neubauer (ver en punto 4.5.6, indicaciones de
manejo)
Matraz de Filtración de 4L
Equipos
• Microscopio óptico con aumento de 100x
• Potenciómetro
• Balanza Analítica
• Bombas de acuario
• Bomba de vacío
• Sistema de filtración
• Mechero o Campana de flujo laminar
• Centrífuga (opcional)
• Base de agitación o Vortex (opcional)
4.5.4. Procedimiento para el Desarrollo de la Prueba
Preparación del inóculo de algas para desarrollo de pruebas
Conocido el número células presentes en el inóculo mediante cámara de Neubauer,
se debe hacer una dilución con el fin de obtener en cada vial de prueba una
concentración inicial de 10.000 cél./mL. Como el volumen final en cada vial
incluyendo el inóculo es de 2.6 mL (Fig. 4.5.2.), se prepara 2 mL de una suspensión
de algas que contenga 2.6 x 106 células/mL de la siguiente manera:
Factor de dilución (FD) = Número cél./mL en el concentrado/2.6x106 cél./mL.
Volumen (mL) del cultivo de algas para 2mL = 2mL / Factor de dilución
179
La preparación del inóculo que será utilizado en las pruebas debe provenir de un
cultivo en fase exponencial. La densidad del cultivo será determinada con ayuda de
un celda de conteo o Cámara de Neubauer. La densidad celular del cultivo se
obtiene para poder calcular el factor de dilución necesario para asegurar una
concentración de 2.6 millones de células por mililitro (2,6 x 106 cél./mL) en un
volumen de 2 mL.
Con el fin de ilustrar este cálculo se presenta el siguiente ejemplo:
1. Cálculo del factor de dilución (FD):
FD = No. de cél./mL en el cultivo algal / 2.6 x 106 cél. /mL
Si la concentración de células por mililitro en el cultivo fue de 2,9 x 106 cél./mL,
entonces:
FD = 2,9 x 106 cel/mL / 2,6 x 106 cel/mL= 1,115
2. Cálculo del volumen de cultivo de algas en 2 mL (V):
V (mL) = 2mL / Factor de dilución
Sustituyendo en el ejemplo, el volumen de cultivo en 2 mL será:
V (mL) = 2mL / 1,115 = 1,79 mL
El resultado indica que deberá tomarse 1.79 mL del concentrado de algas y adicionar
solución amortiguadora hasta completar un volumen de 2mL. Esta dilución se puede
realizar en tubos cónicos de centrífuga de 50 mL con ayuda de una pipeta
automática.
Los 2 mL tendrán una concentración de algas de 2.6 x 106 cél./mL, la cual
nuevamente se diluye adicionando 18 mL del medio nutritivo enriquecido (18x) para
tener una densidad final de 2.6 x 105 cél/mL .
Método de dilución de muestras
En las pruebas se requiere de 20 viales de borosilicato de vidrio de 20 mL similares a
los utilizados en contadores de centelleo (Arensberg et al.,1995). Se toman 5 y se
rotulan como control (C1 hasta C5), y se adiciona en cada uno de ellos 2.5 mL de la
solución amortiguadora (NaHCO3 15 mg/L). Los restantes viales se organizan en 3
series de 5 viales cada una. Cada serie constituye una réplica. Se rotulan los viales
de la primera serie de la siguiente manera: P1, Q1, R1, S1, y T1, la segunda, deberán
rotularse de la misma forma pero con el subíndice 2, y la tercera con el subíndice 3.
En los viales rotulados P1, P2, y P3 se colocan 5mL de solución más concentrada de
la muestra (100%). Los restantes viales se utilizarán para la preparación de las
diluciones seriadas de la muestra.
180
Para iniciar el proceso de dilución de la muestra, en cada uno de los viales restantes
se coloca 2.5 mL de solución amortiguadora (NaHCO3 15 mg/L). A continuación, se
transfiere 2.5 mL de la muestra (100%) del vial rotulado como P1 al vial Q1, la
concentración en este vial corresponde a la primera dilución 1:2 o 50% (v/v). Se
mezcla y se continúa el proceso tomando 2.5 mL del vial Q1 y pasándolo al R1 en
cual se tiene la segunda dilución 1:2 y una concentración de 25% (v/v), y así
sucesivamente hasta llegar al vial T1 , como al finalizar en el vial T1 se tiene un
volumen de 5mL se toman 2.5 mL y se descarta. Se sigue el mismo procedimiento
para las series 2 y 3 y al finalizar el proceso de dilución, se mezcla el contenido de
cada uno de los viales del sistema de prueba.
Terminado el proceso de dilución de la muestra, se procede a adicionar 100µL del
inóculo de algas anteriormente preparado y cuya concentración es 2.6 x 105 cél/mL,
a cada uno de los viales de la prueba. La concentración final de las algas en cada
uno de los viales será 10.000 cél/mL.
Se colocan los viales en la cámara con iluminación fluorescente (luz blanca fría),
con una intensidad luminosa entre 60-80 µE/m2s (aproximadamente 4000 lux). En
el Anexo 1 se presenta el diseño y procedimiento de elaboración de un modelo
piramidal de cámara que puede ser construido con materiales de bajo costo y
permite que en toda el área se tenga una distribución homogénea de luz.
La incubación de los viales se lleva a cabo durante 72 h. Si no se cuenta con un
sistema de agitación orbital, se debe hacer agitación manual de cada uno de los
viales tres veces durante el día. La agitación contribuye a promover el adecuado
desarrollo de la población de las algas.
El resumen general de las condiciones de la prueba se presenta en la Tabla 4.5.3.
y en las Figuras 4.5.2. y 4.5.3.
181
Tabla 4.5.3. Resumen de las Condiciones Recomendadas para las Pruebas
de Toxicidad con S. capricornutum
1. Tipo de Ensayo
2. Temperatura
3. Calidad de Luz
4. Intensidad Luminosa
5. Fotoperíodo
6. Volumen del Recipiente
7. Volumen de la Solución de Prueba
8. Edad del Cultivo usado como Inóculo
9. Densidad Celular Inicial
10. Número de Réplicas
11. Velocidad de Agitación
12. Agua de Dilución
13. Factor de Dilución
14. Duración de la Prueba
15. Efecto Medido
16. Resultado Final
17. Aceptabilidad de los Resultados
18. Control positivo
Estático
24 ± 2°C
Fluorescente, blanco-frío
60-80 μE / m2/ s (4.000 lux)
Iluminación continua
Viales de 20 mL
2,6 mL
4 a 7 días
104 células/mL
3
manual, discontinua
solución amortiguadora (NaHCO3
15 mg/L)
0,3 ó 0,5
72 h
Crecimiento (conteo)
IC50
Densidad Celular en el Control >16
veces la densidad inicial
Cu(II) a partir de una solución de Cu
SO4
182
1. PREPARACION DE INOCULO
Conteo del número de células por
microscopía óptica con cámara Neubauerl
Dilusión del cultivo para obtener 2mL
con 2.6 x 10 6 células
Cultivo de S. capricornutum de 4 a 7 días
en desarrollo de fase exponencial
Adición de 18ml de medio de
enriquesimiento
2. PREPARACION DE
Inóculo con
2.6 x 10 5 células
CONTROL
2.5mL agua moderadamente dura
5mL Muestra
2.5 mL buffer
Transferencia secuencial de 2.5mL
Mezclar Mezclar Mezclar
Mezclar
Descartar 2.5 mL
REPLICA 1
REPLICA 2
REPLICA 3
Agregar 10µL a cada celdilla
100
50 %
25
12.5%
6.25%
3. DESARROLLO DE PRUEBA
(((
Iluminación
3000lux ± 10% por 72h
))) Agitación tres veces por día
100
50 %
25
12.5%
6.25%
183
Fig. 4.5.2. Esquema del procedimiento de prueba con
S. capricornutum
184
Diagrama de flujo ensayo S. capricornutum
Cultivo de S capricornutum
en medio sólido
Subcultivo en medio líquido
3 días, 24°C, 100rpm
Sustancias Tóxicas
Subcultivo en medio líquido
3 días, 24°C, 100rpm
Inóculo
Preparación de
Diluciones
BIOENSAYO
No. Cel./mL Inicial
pH inicial
Registro de Datos
No. Cel./mL diaria (72 h)
pH final
Cálculo de la Biomasa
% de Inhibición
Análisis Estadístico
(Probit)
IE 50-96h
185
Fig. 4.5.3. Ensayo de toxicidad crónica con S. capricornutum
186
4.5.5. Análisis de Datos
Al finalizar el tiempo de exposición se inicia el conteo del número de algas en cada
vial. Para el conteo se toman entre 20 a 50 µl de la suspensión con ayuda de una
pipeta automática, y se coloca en la celda de conteo o la cámara Neubauer.
La cuantificación se efectúa siguiendo el método de manejo recomendado para
este tipo de celdas, y que se describe en el numeral 4.5.6.
Conocidos los recuentos del número de algas, se procede a establecer el
porcentaje de inhibición (% I) en cada una de las diluciones, el cual se cuantifica
de la siguiente manera:
% I = 100 – [(promedio cél/mL de las réplicas en la dilución / promedio cél/mL de
las réplicas del control)] x 100
4.5.6. Conteo con la Cámara Neubauer
La cámara Neubauer, también conocida como hemocitómetro, consta de un cubreobjetos de cuarzo y un porta-objetos de un grosor mayor a los de uso común
(Figura 4.5.4). En la parte superior del porta-objetos se encuentran cuatro canales
longitudinales y uno transversal central. En la parte superior e inferior del canal
transversal están grabadas dos rejillas de 9 mm2 de superficie, las cuales están a
su vez subdivididas en una cuadrícula más pequeña (Figura 4.5.4. A-B) (UNAM,
1986).
Usando el objetivo de 10x de un microscopio óptico, se enfoca de forma que en el
campo se cubra un cuadrado cuya área corresponde a 1 mm2, generalmente se
trabaja con el cuadro central. El área del cuadro central es de 1mm2 y se
encuentra subdividida en 25 cuadrados. Cada uno de estos cuadrados mide 0.2
mm de lado, por lo que el área de cada uno será 0.04 mm2 (Fig. 4.5.4. C)
Al colocar el cubre-objetos sobre el porta-objetos se tiene una profundidad de
0.1mm de forma que el volumen contenido en cada uno de los cuadrados grandes
será 0.1 mm3 (1.0 mm2 x 0.1 mm = 0.1 mm3).
El conteo con la cámara se lleva a cabo de la siguiente forma:
•
•
•
•
Limpiar con papel de arroz la cámara de Neubauer.
Colocar el cubre-objetos sobre los canales tal como se indica en la Figura
4.5.4.
Agitar manualmente el frasco con la solución de algas a evaluar hasta observar
coloración homogénea o disolver los agregados celulares.
Con ayuda de una pipeta serológica de 1mL o con una pipeta automática de
100µL tome 0.1 mL de la suspensión de algas y colocando la punta de la
pipeta en el borde del cubre-objetos dejar que la solución ingrese a la cámara
187
•
•
•
•
•
•
por capilaridad, sin que ella pase a los canales laterales
(Fig 4.5.4.D).
Si se forman burbujas se debe repetir la operación, lavando y secando la
cámara previamente.
Colocar la cámara Neubauer en la platina del microscopio y enfocar con el
objetivo 10x.
Localizar el cuadro central de la rejilla de 25 cuadros de 0.04 mm2, hacer un
cambio de lente al objetivo de 40x y contar las células que se encuentran
sobre el mismo (Fig. 4.5.4.C).
Contar el número de células en el cuadrado central tomando precauciones
para evitar contar dos veces la misma célula u omitir alguna.
Para obtener resultados más exactos se recomienda tener un conteo entre 200
y 300 células por muestra. Cuando en el cuadro central existen menos de 200
células, es necesario revisar más cuadros para el conteo. Se sugiere continuar
el conteo en los cuatro cuadros que forman las esquinas de la cuadrícula. Si
aún así no se alcanza las 200 células, se debe contar el total en los 25
cuadros.
Anotar el número de cuadros contados.
En caso opuesto, en que el número de células sea muy elevado y se dificulte
su conteo, será necesario diluir la suspensión en una proporción conocida, la
que deberá ser tenida en cuenta en la estimación final.
Determinación de la densidad celular
La densidad celular de la suspensión de algas se calcula de la siguiente forma:
1. En caso de haber empleado los cuadrantes de 0.04 mm2
No. células en 0,1 mm3 = (No. total células contadas / No. cuadros 0,04 mm2
Esto dará el número total de células por 0,1 mm3 (volumen obtenido de multiplicar
el área de 1mm2 x 0.1mm profundidad de la cámara).
El número de células por mL, se obtendrá de multiplicar el valor obtenido
anteriormente por 10.000.
No. células por mL = No. células en 0,1 mm3 x 10.000
2. En caso de haber empleado los cuadrantes de 1 mm2
No. células en 0,1 mm3 =No. total células contadas / No. cuadros 1 mm2 en
conteo
Este valor corresponderá al número total de células en 0,1 mm3. Para obtener el
número por mL, se multiplica por 10.000.
188
CámaraNeubauer
A
B
1 mm
Canal transversal
Canales longitudinales
C
1 mm
Colocarcubreobjeto
2
3
1
5
4
0.2 mm
Conteopor cuadrantes
Adicionar 0.1mL
de soluciónalgal
Fig. 4.5.4. Conteo Celular mediante la utilización de la
189
Cámara de Neubauer
REFERENCIAS
Arensberg, P.; Hemmingsen, V. H.; Nyholm, N. 1995. A. miniscale algal toxicity
test . Chemosphere, 30:2103-2115.
Blaise C, Forget G, Trottier S. 2000. Toxicity Screening of Aqueous Samples using
a cost-effective 72-hour exposure Selenastrum capricornutum Assay. Environ
Toxicol. 15:352-359.
Environment Canada. 1992. Biological Test Method: Growth Inhibition Test Using
the Freshwater alga Selenastrum capricornutum. Environmental Protection series
EPS 1/RM/24.
Hindak, F. 1990. Studies of the clorococcal algae (clorophyta) V. Biologicke Prace
(Slovenskej Akademic Vied), Bratislava, 36:1-225
UNAM, 1986. Biología Celular. Manual de Prácticas. Departamento de Biología,
Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Autónoma de México. pag. 20-28
U.S EPA. 1992. Short -term Methods for Estimating the Chronic Toxicity of
Effluents and Receiving Waters to Freshwater Organisms EPA-600/4-91-022. 3th
Edition. Philip L ewis A, L., Klem D. J., Lazorchak J. M.
190
ANEXO 1
CONSTRUCCIÓN DE UNA CÁMARA DE ILUMINACIÓN CASERA
PARA EL ENSAYO DE TOXICIDAD CON S. capricornutum
HOMERO HERNÁNDEZ SALGADO
Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Cuernavaca, Morelos,
México
Materiales
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
2 Pliegos de papel empleado para construcción de maquetas, color blanco,
rígido y resistente (ej. Cascarón), de aproximadamente 1,40 x 0,60 m.
Cinta adhesiva de 5-7 cm ancho
Tijeras o navaja
Papel aluminio
Carrete de hilo nylon
Marcador indeleble color azul o amarillo
Guantes de látex
Embudo de tallo largo de plástico transparente o vidrio de 10,5cm de abertura
de boca y 10 de fondo
30 cm de alambre de 1mm de diámetro
extensión eléctrica
Socket para foco con entradas para clavija de conexión
Bombilla de luz halógena fría 20W/11-860-120V.-350mA, 1155 lumen 50/60Hz,
de triple foco (ej. Osram Dulux)
Conexión para anterior
Preparación de la pantalla de iluminación
De los pliegos de papel para construcción, cortar cuatro triángulos de 60cm por
lado, posteriormente cortar una de las esquinas de tal forma que se obtenga un
polígono de 60 cm de base por aproximadamente 57cm de altura. (Fig 4.5.5. A)
Forrar con papel aluminio los primeros 20 cm de la base de cada triángulo a
manera de banda, la cual quedará en el interior de la cámara una vez armada (Fig.
4.5.5. B).
Formar la cámara uniendo los triángulos por sus lados, para estructurar una
pirámide trunca en su punta (Fig. 4.5.5. C) con ayuda de la cinta adhesiva. Pegar
por la parte exterior.
191
Colocación del sistema de iluminación
a. Sistema de filtrado
A 20cm de la boca superior introduzca en una esquina hilo nylon resistente y cruce
a la esquina opuesta, repita la operación en otra de las esquinas de tal forma que
se forme una cruz o red de soporte (Fig. 4.5.6. D).
Trozar el tallo del embudo hasta su base.
Cortar el guante de cirujano conservando la banda de aproximadamente 8cm de la
muñeca del mismo. Eliminar el resto.
Colocar la banda de látex, obtenida del guante de cirujano, en la boca del embudo
sin tallo, de forma que cubra solo 5 cm, y dejar un espacio traslúcido de 5 cm (Fig
4.5.6. D).
Enderezar el alambre y enrollar uno de los extremos de tal forma que se fije en el
interior del embudo. Introducir el alambre por el orificio dejado por el tallo del
embudo. Dar un espacio de 5cm, y en el extremo saliente formar un gancho (Fig.
4.5.6. D). Colgar el embudo del centro de la red de sostén (Fig. 4.5.6. E).
Colocación de lámpara
Atornillar la bombilla de luz halógena de triple barra en el porta-lámpara
correspondiente.
Introducir el sistema por el interior de la pirámide de tal forma que la rosca del
porta-lámpara salga por la punta de la pirámide. Tomar la conexión múltiple y
enroscar al resto del sistema por el exterior. Esto dará estructura y soporte a la
lámpara (Fig. 4.5.6. E).
a. Base de la cámara
Cortar un cuadrado de papel para construcción de 62 cm2. Forrar una cara con
papel aluminio.
Ubicar el centro del cuadrado y en torno a él dibujar un cuadrado de 10cm,
después marcar dos más de forma concéntrica, el primero de 40 cm por lado y el
segundo de 60 cm por lado (Fig. 4.5.6. F).
Trazar líneas diagonales con el marcador, en la banda que se forma entre el
cuadrado 1 y 3. El área marcada señalará la zona donde siempre deberán ser
colocados los viales de prueba dentro de la cámara. En esta banda, bajo el diseño
antes mencionado, la iluminación será homogénea proporcionando una intensidad
luminosa de entre 2800 y 3000 lux.
192
El borde del recuadro 3 es el sitio donde la pantalla de la cámara de iluminación
deberá ser colocada (Figs. 4.5.6. F y 4.5.7. G).
Preparación de la Pantalla
Vista Lateral
2.5 cm
2.5 cm
A
B
cm
cm
60
cm
cm
60
60
60
20
cm
57 cm
60 cm
Papel Aluminio
60 cm
Vista interior
C
60 cm
60 cm
Fig.4.5.5. Preparación de pantalla de iluminación
193
Sistema de filtrado de luz
D
5 cm de alambre
Colocación de la lámpara
Extensión
eléctrica
Socket para foco con entradas
para clavija de conexión
Cono de vidrio
Cubierta de
látex
E
10 cm
Socket para bombilla
de luz fría, halógena
5 cm
Bombilla de luz fría,
halógena
10.5 cm
Base de la cámara
Forro de
aluminio
3
2
F
1
Area de
iluminación
10 cm
10 cm
40 cm
10 cm
Borde de unión
para la pantalla
60 cm
Fig. 4.5.6. Colocación de sistema de iluminación
194
G
Socket para foco con entradas para clavija de
conexión
Extensión eléctrica
Socket para bombilla de luz fría, halógena
Bombilla de luz fría, halógena
20
cm
Alambre
Red de sostén
5
cm
Trampa de luz
20 cm
Forro de
aluminio
Area de iluminación
homogénea
Fig.4.5.7. Vista tridimensional de la cámara de iluminación
Sugerencias
Cambiar la lámpara de iluminación de triple barra de forma regular, cada 45 días si
es que el uso es continuo, o calcule las horas de uso equivalentes. El cambio debe
efectuarse ya que el brillo de la lámpara tiende a disminuir con el uso reduciendo
la intensidad luminosa, lo que puede reducir significativamente el crecimiento de
las algas durante el desarrollo de pruebas
195
Prueba de toxicidad aguda con lombriz (Eisenia) para
suelos contaminados
María del Carmen Cuevas Díaz1,2, Ronald Ferrera Cerrato3, Adriana Roldán
Martín1, Refugio Rodríguez Vázquez1
1
CINVESTAV-IPN, 2Universidad Veracruzana, 3Colegio de Posgraduados
196
Contenido
Contenido .....................................................................................................................197
Resumen del bioensayo con lombrices a 14 días ........................................................198
1.1 Ensayo de toxicidad aguda con Eisenia andrei o foetida para suelo contaminado 199
1.2. Material, equipo, soluciones y organismo de prueba.........................................200
1.3 Preparación de las muestras de suelo................................................................202
1.4 Procedimiento .....................................................................................................203
1.5 Manejo de datos y reporte ..................................................................................205
Diagrama de flujo ensayo Eisenia andrei .....................................................................206
REFERENCIAS ........................................................................................................206
Referencias bibliográficas.............................................................................................206
Anexo 1.Cultivo de Eisenia...........................................................................................207
Anexo 2. Control positivo 2-cloroacetamida .................................................................207
Anexo 3 .Datos de la prueba de laboratorio .................................................................277
197
Resumen del bioensayo con lombrices a 14 días
Duración del bioensayo
14 días
Temperatura
20 ± 2º C
Fotoperíodo
24 horas, usando luz
ambiental(400 lx)
Contenedores
frascos de vidrio
Cantidad requerida de muestra de suelo
1000 g
Cantidad requerida por réplica
200-250 g
Humedad del suelo
35-45%
Organismo prueba
Eisenia andrei o foetida
Edad del organismo
> 2 meses (clitelada)
Número de organismos por réplica
10
Número de réplicas
4
Régimen
No dar alimento durante la
prueba
pH del suelo
5-9, no realizar la prueba si el
rango no es aceptable.
Punto a medir
Supervivencia, alteraciones
morfológicas
Control positivo
2-cloroacetamida
Control negativo
suelo artificial o suelo blanco no
contaminado
198
1.1 Ensayo de toxicidad aguda con Eisenia andrei o foetida para suelo contaminado
María del Carmen Cuevas Díaz1,2, Ronald Ferrera Cerrato3 Refugio Rodríguez Vázquez1
1
CINVESTAV-IPN, 2UV, 3Colegio de Posgraduados
1.1.1 Introducción
Los bioensayos con lombrices son ampliamente reconocidos como prueba para evaluar la
toxicidad de suelos contaminados (Lanno y McCarty, 1997; Dorn, et al., 1988; Wilson, et
al., 2002).
La lombriz más utilizada ha sido Eisenia en sus especies foetida y andrei. Pertenece a la
familia Lumbricidae, es una lombriz exógena en México, pero de amplia distribución, fácil
manejo y cultivo (Fragoso, 2002). Su característica morfológica principal es la presencia
de segmentos externos e internos en su cuerpo, son hermafroditas, cuando son adultos
se observa una protuberancia epidérmica denominada clitelo, en el que se forman los
capullos en los cuales son depositados los huevos (Romero, 1996). Se desarrolla bien en
pH de 5 a 7, temperaturas de 20 a 28º C (Kaplan, et al., 1980).
Este protocolo incluye dos clases de pruebas toxicológicas: prueba por contacto con papel
filtro, prueba con suelo artificial y muestras de suelo contaminado. La prueba por contacto
en papel filtro puede ser utilizada opcionalmente como preliminar para determinar las
concentraciones correspondientes a las que se tiene que llevar a cabo la prueba con
suelo, siendo ésta última mas detallada. La prueba de contacto es fácil de realizar y da
resultados reproducibles. El suelo artificial y el suelo contaminado son representativos de
la exposición de la lombriz al compuesto químico analizado.
El presente protocolo se basó en OECD Guidelines for toxical chemical 207 y la
publicación 96-327 del Departamento de Ecología del estado de Washington, así como
las experiencias obtenidas a nivel laboratorio.
199
1.1.2 Campo de aplicación
Medio: suelo artificial, suelo blanco
Sustancias probadas: TPH´s, benzo(a)pireno, pireno
1.1.3 Principio de la prueba
La prueba por contacto en papel filtro involucra la exposición de las lombrices a
sustancias prueba sobre un papel filtro húmedo con la finalidad de identificar el potencial
del tóxico presente en el suelo, se realiza en 48 a 72 horas.
El uso de suelo artificial involucra colocar a las lombrices en un suelo artificial aplicando la
un rango de concentraciones diferentes de la sustancia prueba y el suelo objeto de
estudio en la concentración que trae. La mortalidad es evaluada en 7 y 14 días.
1.1.4 Definiciones y unidades. Sustancias de referencias
CL50 es la concentración letal media, esto es cuando una concentración dada del
compuesto ocasiona la muerte de la mitad de los organismos durante el período de
prueba. Concentración del material en agua, suelo o sedimento que se estima letal para el
50% de los organismos de ensayo. La CL50 y sus límites de confianza (95%) son
usualmente derivados de análisis estadístico (Ronco y Díaz, 2004).
Para la prueba de contacto la sustancia prueba se expresa en mg/cm2, para el suelo
artificial y la muestra de suelo contaminado en mg/kg (base seca).
1.1.5 Condiciones para validar la prueba
La mortalidad en el control no debe de exceder el 10% al finalizar la prueba.
1.1.6 Sustancia de referencia o control positivo
La sustancia de referencia puede ser utilizada como control y ocasionalmente con la
finalidad de asegurarse que las condiciones utilizadas en la prueba son adecuadas y no
presentan cambio significativo, siendo la indicada la 2-cloroacetamida.
1.2. Material, equipo, soluciones y organismo de prueba
Todos los reactivos utilizados deben tener calidad ACS o, al menos, 99% de pureza. Para
su preparación se emplea agua destilada.
Material y Equipo
•
•
•
•
Potenciómetro
Balanza analítica con capacidad para pesar lombrices de 0.1 g
Balanza con capacidad para pesar muestras de suelo de 1.0 g
Frascos de vidrio de 0.5 l o 1 l
200
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Frascos de vidrio (diámetro de 4. 5cm y altura de 7 cm)
Pipetas volumétricas clase A de 1 a 100 ml
Pipetas serológicas de 1 a 10 ml graduadas
Micropipeta de 200 a 1000 µl
Termómetro
Espátula de acero inoxidable
Pinzas
Guantes
Papel filtro
Malla 2 a 2.36 mm
Baño o cuarto con control de temperatura 20 ± 2º C con intensidad luminosa de
400 a 800 lux.
Base de agitación o vórtex
Reactivos y soluciones
Buffers para pH
Solución buffer pH 4, 7 y 10 para calibrar el potenciómetro.
Tóxico de referencia (control positivo)
2-cloroacetamida, 99% pureza.
Agua destilada o desionizada tipo II
Suelo artificial
El suelo artificial presenta una composición de: 10% musgo (materia orgánica), 20%
arcilla y 70% arena, CaCO3 para ajustar a pH de 7.0 ± 0.5
Muestra de suelo
Se necesitan cuando menos 1100g de suelo, ya que son un mínimo de 4 réplicas cada
una con 200 a 250g de suelo contaminado, 100 a 200 g del remanente se utiliza para
realizar las determinaciones de pH, humedad y concentración del tóxico; pero si se
requiere de caracterizar la muestra es necesaria la recolección de mayor cantidad de
suelo. Los recipientes deben ser llenados en su totalidad. Si el análisis no se realiza de
inmediato, las muestras deben ser selladas y empacadas para minimizar la pérdida de
compuestos volátiles almacenadas a 4º C en la oscuridad. De preferencia el análisis se
debe de realizar en un lapso de 24 horas y no debe ser mayor de 14 días, ya que la
toxicidad pudiera no ser representativa por cambios del contaminante (degradación o
pérdida).
Organismos prueba
Se utilizan lombrices adultas al menos de 2 meses (cliteladas) del mismo cultivo y la
misma especie correspondientes al género Eisenia en sus especies andrei o foetida.
Estas especies pueden tener como fuente de alimento el estiércol de caballo.
201
1.3 Preparación de las muestras de suelo
Determinación de humedad
Se calcula la humedad inicial para adicionar el agua de hidratación necesaria. Para
determinar la humedad se toma una alícuota de 25 g de la muestra de suelo y se coloca
en una cápsula de porcelana previamente a peso constante, se pesa con muestra. Se
seca a 103-105º C durante 24 horas, colocándose en un desecador para enfriar. Una vez
fría se pesa. La diferencia de pesos nos da el peso seco final. (Publicación No 96-327).
Opcional: Se puede utilizar una balanza para determinar humedad del tipo de Kern MB-3
con capacidad de 50 g, para la cual se utiliza 1 g de suelo.
Cálculos
HS = (A-B)/[C-(A-B)]*100
HS = humedad de la muestra en %
A = peso inicial de la muestra + cápsula (g)
B = peso seco final de la muestra + cápsula (g)
C = peso de la alícuota inicial (g)
Ejemplo:
A = 78.005 g
B = 76.448 g
C = 25.078 g
HS = (77.168-76.063)/ [25.024(77.168-76.063) ]*100
HS = 4.61%
Hidratación de la muestra de suelo
Las muestras se pueden hidratar de 35 a 45% correspondiente al peso del suelo utilizado
en la prueba.
HA = T – HS
HA = hidratación necesaria (%)
T = humedad blanco (%)
HS = humedad del suelo (%)
Cálculos:
T = 45%
HS = 4.6%
HA = 45% - 4.6% = 40.4%
Para determinar la cantidad de agua a adicionar:
V = (W*HA/100)F
V = cantidad de agua a adicionar (ml)
W = peso de la muestra (g)
HA = hidratación necesaria (%)
F = factor de conversión (1 ml/1g)
Ejemplo:
HA = 40.4%
W = 250 g
V = (250 g * 40.4%/100)*(1ml/1g) = 101 ml
202
pH del suelo
Para medir el pH en el suelo se debe tomar una muestra de 5 g por 12.5 ml de agua, pero
si el suelo es arcilloso, se utiliza el doble de agua destilada con la finalidad de poder
procesar la muestra. Se agita la mezcla durante 5 minutos, dejando reposar por 30
minutos. Medir el pH de la solución sobrenadante.
1.4 Procedimiento
1.4.1 Prueba de contacto en papel filtro
Lavar los contenedores de vidrio (diámetro de 4.5cm y altura de 7 cm) con agua caliente
y detergente, dejar secar. Cortar papel filtro con 4 cm de ancho por 15 cm de longitud
según el frasco y depositarlo en él, no debe exceder del borde del frasco.
Se debe realizar una prueba de humedad con papel filtro para lo cual cuando menos se
preparan 5 viales con diferentes cantidades de agua (1 a 5.5 ml), se deposita una lombriz
en cada uno de ellos, la cantidad de agua a adicionar previo a la prueba será la
correspondiente a la mínima cantidad de agua en donde la mortalidad corresponde a 0.
La sustancia problema se disuelve en agua o en un solvente orgánico (acetona,
diclorometano, acetona) para dar una concentración conocida. Se deposita 1 ml de esta
solución problema en el papel filtro (con micropipeta), cuidando que se distribuya
homogéneamente, se seca por rotación del frasco con papel filtro, ver figura 1.
Los controles son: papel filtro con agua desionizada o destilada y papel filtro impregnado
del solvente seleccionado y secado.
Después de secado el papel filtro, se adiciona en cada vial de 1 a 5.5 ml de agua
desionizada o destilada (de acuerdo a los resultados de humedad del papel filtro
explicado previamente), cada vial es tapado con tela y con papel aluminio al que se le han
realizado algunos orificios con la finalidad de preservar la humedad y de facilitar el
intercambio de aire.
Figura 1. Secuencia general de prueba con papel filtro
Papel
filtro
Frasco gerber
lavado y secado
Adicionar solvente con compuesto a
probar
Secar en campana
Adicionar agua destilada
o desionizada
Depositar lombriz
lavada, secada y pesada
Como ejemplo de concentraciones a utilizar tenemos:
203
Cantidad aplicada al Concentración de la
papel filtro (mg/cm2)
solución aplicada g/ml
1.0
7 x 10-2
0.1
7 x 10-3
0.01
7 x 10-4
0.001
7 x 10-5
0.0001
7 x 10-6
En el ejemplo anterior 70 mg /70cm2 = 1.0 mg/ cm2, el área depende del tamaño del papel
y el frasco, al igual que la concentración.
Las concentraciones a emplear no deben ser menores de cinco. Para cada tratamiento o
nivel de concentración se realizarán 10 réplicas. Una lombriz se coloca en cada frasco,
depositándola sobre el papel filtro húmedo.
Antes de ser colocadas en los viales, las lombrices son depositadas por tres horas en
papel filtro humedecido con la finalidad de vaciar sus intestinos, después son lavadas y
secadas.
Los viales son colocados en forma horizontal en la oscuridad, a una temperatura de 20 ±
2 ºC, durante un período de 48 horas y opcionalmente hasta 72 horas.
Las lombrices se consideran muertas cuando no responden a ningún estímulo mecánico.
Cualquier síntoma patológico se reporta.
Esta prueba es rápida y nos indica las concentraciones a utilizar en la prueba de 14 días.
NOTA: Para adicionar la sustancia problema al papel filtro, previamente se realiza una
extracción de la misma del suelo contaminado, determinando su concentración y
procediendo a realizar diluciones si es necesario de la misma. Tomando como solución
madre a la concentración inicial del suelo.
1.4.2 Procedimiento con suelo contaminado y suelo artificial
Se determina la humedad del suelo contaminado, se pesan 250 g y se deposita en un
frasco de vidrio ajustando la humedad, se colocan un total de 4 réplicas. La duración de la
prueba es de 14 días, realizando una evaluación a los 7 días, la temperatura es de 20 ± 2º
C, con luz continua con la finalidad de asegurarse que se encuentran en todas partes del
medio.
La mortalidad se evalúa después de 7 días, por vaciamiento del medio en un recipiente de
vidrio, separando las lombrices y observando sus reacciones a los estímulos mecánicos,
posteriormente se vuelven a depositar en su contenedor hasta su evaluación final a los 14
días.
Al final de la prueba, se determina la humedad y el pH.
Control.- El control puede consistir de suelo no contaminado de la misma textura que la
muestra al cual se le ajusta la humedad de la misma forma que se procedió para la
204
muestra. Se colocan 4 réplicas, cada una de 250 g. Adicionar 10 lombrices libres de
alimento, para lo cual 3 horas antes se colocan sobre contenedor de vidrio cubierto con
papel filtro humedecido con agua destilada o desionizada. Las lombrices se lavan, se
secan y pesan.
Se puede utilizar como control suelo artificial previo ajuste de humedad y pH, se colocan 4
réplicas, cada una de 250 g. Adicionar 10 lombrices libres de alimento, para lo cual 3
horas antes se colocan sobre contenedor de vidrio cubierto con papel filtro humedecido
con agua destilada o desionizada. Las lombrices se lavan, se secan y pesan.
Al igual que la muestra, a los controles también se les determina al finalizar la prueba
humedad y pH.
Suelo artificial
La OECD 207 describe una prueba con suelo artificial de la misma composición que el
proporcionado en el listado de reactivos y soluciones. Este puede ser utilizado para
aquellos suelos muy arcillosos en los que el movimiento de la lombriz se dificulte por
textura del suelo. En este caso se utilizaría el extracto del suelo contaminado. Como
controles se tendría además del suelo humedecido, un suelo al que se le ha adicionado el
solvente utilizado en la extracción (solvente como acetona, diclorometano, etc) con la
finalidad de corroborar el efecto del solvente sobre el organismo prueba.
1.4.3 Prueba de ecotoxicidad directa
Esta determinación denominada directa se puede utilizar para suelos contaminados y
aquellos que se encuentran sujetos a bioremediación, para lo cual se pesan 200g de
suelo problema, se ajusta con 10% de tierra de hoja y 15% de arena de río (previamente
se le ha determinado humedad y pH), se ajusta humedad y pH de la manera descrita
anteriormente. Se colocan cuando menos 5 contenedores de vidrio, depositando en c/u de
ellos 10 lombrices cliteladas, a las que se dejó
cuando menos 3 horas antes, lavadas,
secadas y pesadas. Las lombrices se dejan a 20±2º C (también pueden dejarse a una
temperatura de 24±2º C, sin que se observe efecto por la temperatura). El control puede
ser suelo artificial sin contaminante o suelo cercano al sitio de recolección de la muestra
que no contenga el contaminante. Se revisa al día 7 y se sacan las lombrices a los 14
días, se cuentan, lavan, secan y pesan.
1.5 Manejo de datos y reporte
1.5.1 Tratamiento de resultados
Los datos de concentración/mortalidad (CL50) se pueden determinar por el método Probit
o Trimmed-Spearman según sea el caso, para ello se puede utilizar el software
proporcionado por EPA.
1.5.2 Reporte de la prueba
Se debe incluir la información siguiente:
205
•
•
La sustancia a prueba, datos químicos
Organismo prueba, edad, condiciones de cultivo, fuente de alimento, número de
lombrices utilizadas por réplica.
•
Condiciones de la prueba, así como cualquier variación de las condiciones de la
misma.
Preparación del medio, esto es, si hay alguna variación en la forma de preparación
del suelo artificial o de la muestra de suelo contaminado, así como si existe
variación en la cantidad de suelo.
•
Los resultados deben incluir:
• Peso promedio del organismo al inicio y final de la prueba
• Descripción de cambios físicos o patológicos observados en el organismo blanco.
• Humedad y pH del suelo y control al inicio y final de la prueba.
• Método usado para determinar CL50 incluyendo los datos y resultados de la
prueba.
• Mortalidad en el control
• Mortalidad con la sustancia prueba
• La concentración más alta que no causa mortalidad
• La concentración más baja que ocasiona 100 % de mortalidad.
Diagrama de flujo ensayo Eisenia andrei
Prueba en papel filtro
(48-72 h)
Suelo
(14d)
Suelo contaminado
4 réplicas por
concentración + 10
lombrices en c/u
Control: suelo sin contaminante +
aguaREFERENCIAS
destilada o desionizada; también
se puede utilizar suelo artificial
4 réplicas + 10 lombrices en c/u
Referencias bibliográficas
Extracción de la
sustancia problema
Suelo artificial
4 réplicas por
concentración + 10
lombrices en c/u
Controles:
1)Suelo artificial + agua destilada o
desionizada
2)Suelo artificial + solvente utilizado
4 réplicas + 10 lombrices
Dorn, P.B., Vipond, T.E., Salanitro, J.P., and Wisniewksi, H.L. 1998. Assessment of the
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206
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www.igv.kvl.dk/download/software
Anexo 1. Cultivo de Eisenia
Eisenia puede desarrollarse en diferentes residuos animales, especialmente en estiércol
de caballo, aunque puede ser una mezcla 50:50 de estiércol y residuos vegetales. El pH
debe ser de 7 ±5, de conductividad baja, menos de 6.0 miliSiemens. Para asegurar una
buena producción de lombrices se debe tener 20 kg de residuos por 1 kg de lombrices.
Anexo 2. Control positivo 2-cloroacetamida
El control positivo sirve como una referencia para determinar la sensibilidad del
organismo. Por lo que cada vez que haya un cultivo nuevo, se debe realizar este control.
Esta parte de la prueba debe llevarse a cabo previo a la exposición de la lombriz a la
sustancia prueba.
Para el control positivo se requieren cuandomenos tres concentraciones diferentes con
cloroacetamida. Existen reportes de LC50 para 38.5 mg/kg (Edwards, 1984). Se sugieren
concentraciones de 19.25, 38.5 y 77.0 mg/kg como tóxico de referencia.
Los cálculos para determinar la cantidad a preparar de una solución stock para adicionar
a 600 g de suelo artificial (200g c/u). Usando la concentración de 38.5 mg/kg como
ejemplo:
a) Calcular la cantidad de 2-cloroacetamida a adicionar en 600g de suelo artificial
(Publication No. 96-327. 1996).
T = W *F*C
207
T = Cantidad de tóxico de referencia a adicionar (mg)
W= Peso de la muestra (g)
F = Factor de conversión (1kg/1000g)
C = Concentración de referencia del tóxico (mg/kg)
W = 600 g
C = 38.5 mg/kg
T = (600 g) (1kg/1000g) (38.5 mg/kg) = 23.1 mg
En este caso, 23.1 mg es lo que se necesita para 600 g de suelo, pero es necesario
preparar una solución stock usualmente de 22.5 mg de 2-cloroacetamida/ml de agua (se
puede utilizar cualquier concentración, tratando de evitar residuos). Si se utiliza la solución
stock propuesta 22.5mg/ml (pesar 4.5 g y disolver en 200 ml de agua), realizar el
siguiente cálculo:
V = R/S
V = volumen de la solución stock a adicionar (ml)
R = cantidad del tóxico de referencia a adicionar (mg)
S = concentración de la solución stock (mg/ml)
R = 23.1 mg
S = 22.5mg/ml
V = (23.1 mg)/(22.5 mg/ml) = 1.03 ml
Pero debemos recordar que es necesario hidratar el suelo en 45%, lo que equivale a
adicionar 270 ml de agua. Si consideramos que la 2-cloroacetamida de la solución stock
está disuelta en agua entonces tendríamos 270 -1.03 = 269 ml de agua por adicionar. Los
269 ml de agua y 1.03 ml de la solución stock se mezclan en un matraz agitando y se
adicionan a los 600 g de suelo. Se mide también el pH y la humedad.
208
Anexo 3 . Datos de la prueba de laboratorio
Inicio
Clave de No de
muestra réplica pH Tº Humedad Peso de
No
C
%
lombrices lombrices
vivas
pH
Tº
C
Final
Humedad Peso de
No
%
lombrices lombrices
vivas
Efectos
(movimiento
lento,
seccionamientos)
Observaciones en el 7º día
Tipo de organismo _____________________________ Fecha inicial _____________________ Fecha final __________________
Realizó _______________________________
277
Prueba de toxicidad aguda con lombriz de tierra (Eisenia foetida).
Autor: Raúl Uribe Hernández
Introducción
La contaminación del suelo por hidrocarburos del petróleo tiene un fuerte efecto
adverso sobre las comunidades de invertebrados de suelo como son las lombrices
de tierra, nematodos, otros poliquetos y microartropodos. En particular la lombriz
de tierra ha sido utilizada en estudios en donde se evalúa la sobrevivencia,
crecimiento y reproducción.
Estos organismos son cosmopolitas en ambientes en donde se provee suficiente
humedad y adecuada temperatura, siendo vulnerables a la mayoría de los factores
que afectan este microecosistema especialmente aquellos asociados con la
aplicación de químicos agrícolas y residuos dispuestos inadecuadamente.
Método
EPA 712-C-96-167-1996 y OECD-207-1984.
Fundamento
La exposición de estos organismos a suelos y sedimentos contaminados produce
el contacto directo con la epidermis del organismo dando pauta para producir
daño dermal o la absorción de tóxicos por esta vía al grado de provocar la muerte.
La mortalidad en estos organismos es determinada por la falta de movimiento,
como repuesta a estímulos táctiles definidos en su porción final. Otro aspecto con
el que se determina la condición de muerte es la tendencia a su desintegración
rápida, quedando como remanente del organismo una mancha amarillenta,
síntomas patológicos previos son las lesiones superficiales y la hinchazón de la
porción de intersegmentos o áreas ulceradas en la epidermis.
277
Materiales y Reactivos
•
Papel filtro Whatman de fibra de vidrio.
•
Diclorometano grado HPLC (fco. c/4 litros)
•
Hipoclorito de sodio 5%
•
Agua destilada
•
Frascos de vidrio de 250 ml
•
Cajas petri de 210 mm
•
Papel Aluminio
•
Parafilm
•
Micropipetas (10-1000μl)
•
Pipetas serológicas de 1, 5 y 10 ml
•
Regla o Bernier
•
Probetas de 50 y 100 ml
Material biológico
Organismos adultos de la lombriz de tierra Eisenia foetida con clitelo en la
parte anterior del cuerpo, con peso entre 300 y 600 mg
Instrumentos
Cámara ambiental / Incubadora
Balanza analítica
Campana de extracción
Procedimiento
1. Las pruebas preliminares o de tamiz, se realizaron con el extracto del suelo
contaminado a una concentración al 100%.
278
2. Se colocaron discos de papel filtro Whatman de fibra de vidrio dentro de las
cajas petri proporcionales al diámetro de la caja de cristal (aprox. 20 cm de
diámetro).
3. Se colocó un control positivo agregando 1ml de diclrometano grado hplc en
una caja petri. Y un control negativo en el que se adicionó agua destilada en
otra caja petri.
4. Se adicionaron 2 ml de cada una de las disoluciones preparadas del extracto
original en un intervalo de concentraciones amplio (en serie logarítmica),
distribuyendo de forma homogénea sobre papel filtro.
5. Se dejó evaporar el disolvente, por 10min en una campana de extracción.
6. Posteriormente se agregó en la caja petri 1ml de agua destilada y 0.5 de dietil
sulfoxido al 1% como vehículo para disolver el tóxico adecuadamente para el
organismo.
7. Finalmente fueron colocadas 5 lombrices en cada caja, los organismos deben
estar previamente pesados y aclimatados por 24 hrs.
8. Se mantuvieron las cajas en completa oscuridad a 22± 2°C y humedad relativa
50±5 %.
9. Se registraron los cambios morfológicos observados así como la mortalidad
después de 7 días, (considerando como muerto al organismo que no responda
a ningún estímulo mecánico).
10. Se adicionó agua 0.5 ml de agua destilada para evitar la desecación del
organismo cada 48 hrs.
11. Posteriormente se realizaron las pruebas definitivas utilizando un intervalo de
concentraciones más reducido (en serie geométrica), seleccionando aquellos
tratamientos en los que se observo efecto adverso, para insertar entre alguno
de ellos, este nuevo intervalo de concentraciones
(ejemplo:100,50,25,12.5,6.25,3.125 %).
12. Se elaboró la curva dosis-respuesta de las diferentes concentraciones en un
intervalo reducido y se calcularon los valores de CL50, por medio del método
Probit.
279
Nota: Los organismos de la especie E. foetida que se seleccionen para la prueba
debe permanecer dentro del rango de 300-600 mg y debe tener más de 6
semanas de edad.
Calculo de la CL50
Se utiliza el metódo Probit, también conocido como método de unidades
probabilísticas, que es utilizado para evaluar la relación de dosis-respuesta de un
contaminante sobre un organismo, medida en términos de la concentración letal
media (CL50) y su precisión o intervalo de confianza. Asignando el valor Probit de
tablas respecto del porcentaje de mortalidad obtenido para cada concentración.
Después efectuar el análisis de regresión lineal mediante el método mínimos
cuadrados y utilizando los valores obtenidos de la ecuación de la recta, calcular la
CL50, considerando el valor de la “y” a la mitad del numero de individuos utilizados
en cada lote o tratamiento. Y finalmente calcular el intervalo de confianza al 95 %
por medio de la desviación estándar y el valore de tablas del estadístico de “t” de
student.
Interpretación de resultados
El resultado es un valor virtual obtenido estadísticamente, en términos de
concentración, ya sea en mg de HTP/kg de suelo o de µg de algún compuesto
HAP/kg de suelo, en base seca, este valor se relaciona de forma inversa con el
potencial de toxicidad, es decir una sustancia es mas tóxica si requiere de una
menor concentración para producir la letalidad o algún otro daño subletal. Para tal
efecto se ha establecido una clasificación para asignar categorías de toxicidad en
función de la concentración:
Extremadamente tóxico
<1 mg/kg
280
Altamente tóxico
1 a 50 mg/kg
Moderadamente tóxico
50 a 500 mg/kg
Ligeramente tóxico
0.5 a 5 g/kg
Prácticamente atóxico
5-15 g/kg
Relativamente inocuo
mas de 15 g/kg
Tomado de Loomis, 1978
Este valor es de importancia relativa, es decir se utiliza de forma comparativa con
los valores obtenidos de otras sustancias o mezclas y no se maneja como una
constante biológica, ya que de acuerdo a las condiciones de la muestra es el valor
que se obtiene de toxicidad.
Referencias
-
ASTME 1676: Standard Guide for Conducting a Laboratory Soil Toxicity Test
with Lumbricid Earthworm Eisenia foetida (1997).
-
EPA, 1996. Earthworm subchronic toxicity test. Ecological Effects Test
Guidelines. 712-C-96-167. OPPTS 850.6200, Washington DC, Abril 1996.
-
Loomis TA, 1978. Fundamentos de Toxicología. Ed. Acribia, 1ª ed. Zaragoza
España. 274 pp.
-
OECD. 1984. Guideline for Testing of Chemicals. Eartworm acute toxicity test.
207, April.
-
ISO 11268 Soil Quality- Effects of Pollutants on Earthworms (Eisenia foetida).
Part 1 Method for the Determination of the Acute Toxicity Using Artificial Soil
Substrate.
281
4.1. ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA CON Allium
cepa L MEDIANTE LA EVALUACIÓN DE LA
INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO PROMEDIO DE
RAÍCES DE CEBOLLA.
MARIA CONSUELO DIAZ BAEZ
Unidad Académica de Ingeniería Ambiental, Facultad de Ingeniería, Universidad
Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia
ALICIA RONCO
Centro de Investigaciones sobre el Medio Ambiente, CIMA, Universidad Nacional
de La Plata. Argentina
YOLANDA PICA GRANADOS
Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Cuernavaca, Morelos, México
4.1.1.
4.1.2.
4.1.3.
4.1.4.
Principio
Reactivos y Materiales
Procedimiento de la Prueba
Expresión de Resultados
REFERENCIAS
4.1.1. Principio
Cuando un bulbo de cebolla (Allium sp) se re-hidrata se produce una estimulación
del crecimiento de las células, lo cual permite la elongación de las raíces de la
planta. Sin embargo, cuando la hidratación se lleva a cabo en presencia de
sustancias tóxicas, la división celular de los meristemos radiculares puede
inhibirse ya sea, retardando el proceso de mitosis o destruyendo las células. Este
tipo de alteraciones generalmente impide el crecimiento normal de la raíz, y por
tanto su elongación (Fiskesjô, G. 1985, 1993).
El efecto puede determinarse en forma indirecta, mediante la comparación de la
elongación de las raíces de cebollas expuestas al tóxico, con las de cebollas no
expuestas, luego de un periodo de 72 h de prueba. La cuantificación del efecto se
realiza estableciendo el porcentaje de inhibición del crecimiento de las raíces
respecto a la longitud promedio de las raíces del control.
4.1.2. Reactivos y Materiales
282
Bulbos de Allium sp (cebolla amarilla)
Para la elaboración de las pruebas se debe seleccionar bulbos de 1,5 cm de
diámetro, secos y sin formación de hojas y/o raíz. Pueden ser obtenidos del
mercado local o adquiridos a través de algún proveedor.
Previo al montaje de la prueba, los bulbos deben limpiarse eliminando la epidermis
seca y removiendo, con un bisturí o instrumento punzante, los restos de tejido y
raíces del área radicular. (Fig. 4.1.1 (1)). No se deben dañar las raíces primordiales.
Con el fin de eliminar los restos de tejidos es conveniente, colocar los bulbos en
agua destilada por dos horas y secar.
Medio de crecimiento
La preparación del medio de crecimiento utilizado para el desarrollo del ensayo se
indica en la tabla 4.1.1.
La solución madre preparada para los elementos traza de acuerdo a lo indicado
se diluye 10 veces con agua destilada, y el pH se ajusta a 7 antes de utilizar.
También se puede utilizar con agua destilada, y el pH se ajusta a 7 antes de
utilizar. También se puede utilizar agua dura o agua de la llave como medio de
crecimiento. En el caso de utilizar cualquiera de estas opciones, el control
negativo, y el agua utilizada para preparar las diluciones de los compuestos
químicos o las muestras, deberá ser la misma.
Tabla 4.1.1. Medio de Crecimiento para Allium sp.
Masa de sal para disolver en un Litro de agua destilada
Reactivo
Ca (NO3)2• .4H2O
KNO3
MgSO4•7H2O
KH2PO4
Fe EDTA•3H2O
mg
236,1
202
246
136,1
67,6
Elementos Traza
Reactivo
MnSO4
CuCl2
NaMnO4
ZnSO4
H3BO3
mg
0,55 (*)
0,0645 (*)
0,001 (*)
0,0007 (*)
0,23 (*)
(*) Los componentes correspondientes a elementos traza deben ser adicionados a partir de una
solución stock.
283
Materiales
•
•
•
•
Tubos de ensayo de vidrio de 10 cm de largo y 1,5 cm de diámetro (o
recipientes de mayor tamaño, dependiendo del tipo de bulbos a utilizar).
Gradillas o soportes para tubos
Bisturí
Reglilla para hacer mediciones en cm o mm
Almacenamiento de los bulbos de cebolla
Se recomienda adquirir los bulbos en vísperas de la realización de pruebas o en
su defecto, almacenarlos en un lugar donde se pueda garantizar condiciones
secas, y una temperatura entre 10 y 20°C , a fin de evitar la aparición de hongos.
En algunas regiones, los bulbos pueden mantenerse almacenados hasta por un
año, sin embargo, en zonas geográficas donde la temperatura y humedad son
altas, el almacenamiento está limitado a unos pocos días.
4.1.3. Procedimiento de la Prueba
Preparación de diluciones
Generalmente, se sugiere el empleo de una serie de cinco concentraciones, un
control negativo, y uno o dos controles positivos. Para su preparación se emplea el
método de dilución en forma secuencial aplicando un factor de 0,2 ó 0,3.
Cuando se va a llevar a cabo, una evaluación presuntiva puede emplearse una
serie de diluciones logarítmicas, por ejemplo: 100; 10; 1; 0,1; 0,01 etc., lo cual
permitirá establecer el intervalo de concentración conveniente para la
determinación de la Concentración Inhibitoria Media (CI50).
Se recomienda igualmente utilizar, agua dura para el control negativo, así como
para la preparación de las diluciones de la muestra, y la preparación del control
positivo con el tóxico de referencia Cu(II).
Ensayo
Cuando se trabaja con bulbos de diámetro pequeño, las pruebas se realizan en
tubos de ensayo de 10 cm de longitud x 1,5 cm de ancho, en el caso de bulbos de
mayor diámetro puede utilizarse tubos o recipientes de mayor volumen,
dependiendo del tamaño de los mismos. Es importante destacar que la
profundidad de los recipientes debe ser tal que, al término de la prueba la
elongación máxima no alcance el fondo del recipiente (Fiskesjô, G. 1985).
En la prueba se utilizan cinco concentraciones de la muestra, un control negativo,
y uno o dos controles positivos (ver capítulo 6), cada una con doce réplicas. El
284
ensayo se inicia con el llenado de los tubos con cada una de las diluciones y
controles; este llenado deber hacerse hasta el borde del tubo. A continuación se
colocan los bulbos limpios sobre la boca del tubo, cuidando que la zona radicular
quede inmersa en el líquido (Fig. 4.1.1 (2)).
Figura 4.1.1. Esquema gráfico de los pasos a seguir en la prueba con Allium
cepa. 1) Limpieza y pelado de bulbos; 2) ubicación de bulbos en tubos para
exposición a las soluciones de ensayo; 3) colocación de tubos en soporte; 4)
agregado de soluciones a tubos durante el ensayo; 5) medición de longitud del haz
de raíces al finalizar el tiempo de exposición de los bulbos.
Los tubos se colocan en una gradilla, la cual se localiza sobre una mesa que no
presente vibraciones y se mantienen a temperatura ambiente (20°C) por un
periodo de tiempo de 72 horas. Debe evitarse la iluminación directa. Dos veces al
día durante el periodo de prueba, se debe restablecer el volumen perdido por
evaporación o absorción. Para restablecer este volumen se utiliza la muestra o
dilución correspondiente. Se recomienda inclinar el bulbo sin sacar las raíces del
tubo, adicionando cuidadosamente el volumen con ayuda de una pipeta Pasteur.
(Fig. 4.1.1 (3 y 4).
En las figuras 4.1.1 y 4.1.2 y en la tabla 4.1.2 se resumen las condiciones de
prueba.
285
Condiciones de la Prueba
Temperatura
20°C
Iluminación
Indirecta
Volumen de Prueba
15-20 mL
Tiempo de Prueba
72 h
Control Negativo
Agua Dura o de la Llave
o Medio de Crecimiento
12 Réplicas
Control Positivo
Cu+2
Control Positivo
Solución de
Cu (II)
12 Réplicas
Soluciones de Prueba
5 Concentraciones
12 Réplicas
72 h de
Incubación
Control Negativo
Agua Dura o de la Llave
o Medio de Crecimiento
12 Réplicas
Control Positivo
Solución de
Cu (II)
12 Réplicas
Soluciones de Prueba
5
Concentraciones
12 Réplicas
Registro de Signos de Fitotoxicidad
Disminución de la Longitud de las Raíces.
Medición de elongación descarte valores extremos
Cálculo del % de Inhibición del Crecimiento de
las Raíces
Cálculo de la CI50
Control Negativo
Figura 4.1.2. Ensayo de Toxicidad con Allium cepa L.
286
Tabla 4.1.2. Resumen de las Condiciones Recomendadas para las Pruebas
de Toxicidad con Allium cepa L.
1. Tipo de Ensayo
2. Temperatura
3. Calidad de Luz
4. Iluminación
5. Recipientes
6. Número de Réplicas
7. Material Biológico
8. Condición de los bulbos
9. Agua de Dilución
10. Número de concentraciones
11. Duración de la Prueba
12. Efecto Medido
13. Control Negativo
14. Control Positivo
15. Resultado Final
Estático
20°C; Ambiente
Fluorescente, blanco-frío
Indirecta
Tubos de Ensayo de 10 cm x 1,5 cm diámetro
12
Bulbos de aproximadamente 1,5 cm de
diámetro
Pelar los bulbos y la base, evitar dañar el
anillo radicular.
Agua de la llave o canilla o medio de
crecimiento
5
72 h
Inhibición de crecimiento de las raíces
Agua de la llave o medio de crecimiento
Cobre (II) a partir de una solución de CuSO4
CI50
4.1.4. Expresion de Resultados
Medición
Al término del período de exposición se registra la longitud promedio de las raíces,
cuya medición se lleva a cabo con ayuda de una regla común con escala en
milímetros (ver Figura 4.1.3. La medición se lleva a cabo, colocando la escala en
el margen del tubo, se ubica el valor de longitud mínimo y máximo donde incide la
mayoría de las raíces, y el punto medio se define como el promedio. Se efectúa la
estimación en cada tubo y se obtiene el promedio matemático de diez réplicas (los
dos valores más extremos se descartan). Para obtener el porcentaje de efecto de
inhibición se debe realizar la siguiente operación:
(Longitud del Control – Longitud de la Muestra) x 100/ Longitud del Control
Con estos valores se construye una gráfica de concentración en función del
porcentaje de inhibición y se calcula la CI50 mediante cualquiera de los siguientes
métodos: Probit, Promedios Móviles o Sperman and Karber
287
Figura 4.1. 3 Elongación de las raíces de bulbos de cebolla después de un
proceso de hidratación
0
1
2
Prom edio
3
REFERENCIAS
Fiskesjô, G. 1985. The Allium test as standard in environmental monitoring.
Hereditas 102:99-112.
Fiskesjô, G. 1993. The Allium test in wastewater monitoring. Env. Toxicol. Wat.
Qual. 8: 291-298
Fiskesjô, G. 1997. Allium test for screening chemicals; evaluation of cytological
parameters. In: Plants for Environmental Studies. Wancheng W., J. W. Gorsuch, J.
S. Hughes Eds. CRC Press. Florida, pp.308-329
288
4.3. ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA (EFECTOS LETALES Y
SUBLETALES) CON HYDRA ATTENUATA
YOLANDA PICA GRANADOS
Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Cuernavaca, Morelos, México
ALICIA RONCO
Centro de Investigaciones sobre el Medio Ambiente, CIMA, Universidad Nacional de La
Plata. Argentina
MARIA CONSUELO DIAZ BAEZ
Unidad Académica de Ingeniería Ambiental, Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional
de Colombia, Bogotá, Colombia
4.3.1.
4.3.2.
4.3.3.
4.3.4.
4.3.5.
Principio
Reactivos y Soluciones.
Cultivo y Mantenimiento de los Organismos de Prueba
Procedimiento de la Prueba
Expresión de los Resultados
REFERENCIAS
4.3.1. Principio
Los pólipos de agua dulce del género Hydra son microinvertebrados de la clase Hydrozoa
de amplia disribución geográfica y se caracterizan por ser animales pluricelulares, cuyas
células se disponen en dos capas: la epidermis y la gastrodermis, separadas por una
mesoglea gelatinosa la cual encierra una cavidad digestiva continua que se comunica
directamente con el exterior a través de una abertura o boca. Algunas de las células
intersticiales de la epidermis dan origen a los órganos característicos de defensa y ataque.
Los más conocidos son los nematocistos, que corresponden a los miembros más simples
de esta clase. En el extremo inferior presentan un pedúnculo con una base que se adhiere
a diferentes superficies; en el extremo anterior se encuentra la boca, rodeada de cinco
tentáculos (Campbell y Bode, 1983). Su tamaño varía de 5 a 20 mm de longitud y de 2 a 3
mm de espesor (Fig. 4.3.1).
La especie Hydra attenuata es empleada como organismo de prueba por la facilidad de su
cultivo en laboratorio, su rápida reproducción, su estructura primaria (ectodermo,
mesodermo y endodermo) que favorece el intercambio intra e intercelular aumentando su
potencial para la detección de tóxicos, así como el presentar cambios morfológicos
fácilmente reconocibles bajo condiciones progresivas de intoxicación (Trottier et al., 1997).
Los ensayos de toxicidad con Hydra attenuata, permiten determinar subletalidad y
letalidad potencial de sustancias químicas puras, aguas residuales domésticas e
289
industriales, lixiviados, aguas superficiales o subterráneas, agua potable, y agua de poro
de sedimentos, entre otros.
Las pruebas de toxicidad con Hydra attenuata tienen una duración máxima de 96 h, tiempo
durante el cual los organismos son expuestos al tóxico o muestra problema. Durante el
ensayo, diariamente se hace un examen microscópico, y se registra los cambios
morfológicos producidos. La exposición de los organismos a compuestos tóxicos da lugar a
una serie de cambios morfológicos (efectos subletales), y dependiendo de la concentración
puede producir la muerte de los individuos (efectos letales). Los resultados de las pruebas
permiten además de la estimación de la CL50 y la CE50, establecer la LOEC, la NOEC, y
la TOEC (Blaise y Kusui, 1997).
Fig. 4.3.1.
Morfología de Hydra attenuata
Boca
Hidróide
Hipostoma
Región Gástrica
Columna
Región de producción
de gemas
Pedúnculo
Disco Basal
4.3.2. Reactivos y Soluciones
Todos los reactivos utilizados deben tener una calidad ACS o por lo menos tener un 99%
de pureza. Para la preparación de las soluciones se debe utilizar agua destilada en vidrio o
agua calidad Millipore Super Q.
Medio de cultivo de Hydra:
Para el mantenimiento del cultivo y la limpieza del mismo después del proceso de
alimentación, se utiliza el medio cuya formulación se presenta en la Tabla 4.3.1.
Tabla 4.3.1. Reactivos utilizados en la preparación de medio de Hydra
290
Reactivo
Cloruro de Calcio: CaCl2.2H2O
N-tris (hydroximetil)metil 12aminoetanosulfónico, Buffer TES
Acido Etilen-diamino-acético, EDTA
Agua Destilada
Cantidad
2,94 g
2,2 g
0,080 g
20,0 L
Para la preparación del medio, se disuelven inicialmente los compuestos en 1L de
agua, posteriormente se coloca la solución en un recipiente de polipropileno o
equivalente (material inerte), y se completa a volumen (20L) con agua destilada. El
pH del medio debe ser 7.0 ± 0.1, en caso contrario deberá ajustarse con una
solución de NaOH o HCl 1 N. El volumen preparado se almacena a temperatura
ambiente (20 ± 2ºC) y será suficiente para proveer medio fresco para dos
semanas.
Medio de cultivo de Hydra sin EDTA:
Para el enjuague de las Hydras, antes de llevar a cabo las pruebas de toxicidad,
se recomienda utilizar medio de cultivo sin EDTA. Su preparación se efectúa
siguiendo el procedimiento anterior, pero sin la adición del Acido Etilen-diaminoacético (EDTA)
Medio de cultivo de Hydra para suplementar las muestras de agua que van a
ser ensayadas
Cuando se analizan muestras de aguas naturales, aguas residuales, o agua de
poro de sedimentos, se debe adicionar a la muestra una concentración de cloruro
de calcio y buffer TES igual a la presente en el medio de cultivo de Hydra. Para
adicionar estos compuestos se procede de la siguiente forma: a un volumen de
100 mL de muestra filtrada (0,22 μm) se adiciona 0.0147 g de Cloruro de Calcio y
0.011 g de Buffer TES. Se disuelven los compuestos y se ajusta el pH a un valor
de 7.0 ± 0.1 con una solución de NaOH o HCl 1 N.. Este ajuste se realiza antes de
la preparación de las diluciones de la muestra.
4.3.3. Cultivo y Mantenimiento de los Organismos de Prueba
Para el cultivo masivo de H. attenuata se utilizan recipientes circulares de vidrio de
fondo plano de aproximadamente 20 cm de diámetro. Los individuos se mantienen
en un volumen de medio suficiente para llenar 2 ó 3 cm de la altura del recipiente.
Los recipientes se mantienen a 20 ± 2° C, bajo una intensidad luminosa de 800 lux
(equivalente a la incidencia de luz natural en áreas interiores,) y un fotoperíodo de
16h de luz y 8h de oscuridad. Los cultivos se alimentan con Artemia sp recién
eclosionada, por lo menos cuatro días a la semana, y la limpieza se hace
regularmente dos veces al día después de la alimentación.
291
Alimentación y limpieza
1. Dependiendo de la calidad de los huevos de Artemia, 24 ó 48h antes de la
alimentación, se coloca media cucharadita de quistes de Artemia sp en 500 mL de
una solución salina (10 g NaCl/L). Para una óptima eclosión de los quistes se debe
mantener la solución con aireación constante, iluminación continua y una
temperatura de 28 ± 2°C. Aunque existen diferentes diseños para obtener estas
condiciones, la forma más simple de lograrlas, es colocar una bombilla de 100
wats sobre el recipiente a una distacia conveniente para evitar exceder la
temperatura óptima de eclosión Una vez que los quistes han eclosionado y se
obtienen nauplios, se procede a la desinfección de la Artemia, deteniendo el
burbujeo de aire. Después de 5 minutos, los quistes no eclosionados sedimentan y
los nauplios forman una nube que flota cerca al fondo del recipiente.
2. Una vez sedimentados los quistes, se succiona la nube de nauplios mediante
una pipeta Pasteur, evitando tomar los quistes no eclosionados. A continuación,
se los coloca en un tamiz de 125 mallas, permitiendo el drenaje del exceso de
líquido. Inmediatamente, se sumerge el tamiz en un recipiente circular de vidrio de
10 cm de diámetro de fondo plano, que contenga 100 a 150 mL de una solución
de NaCl (10g/L) y media pastilla de iodo disuelta en dicha solución. Generalmente
se utilizan tabletas de iodo comerciales para desinfección de aguas formuladas
con tetraglicina hidroper-yodo, en el caso que exista dificultad para obtenerlas, se
puede utilizar cinco gotas de
una solución de
yodo-povidona de uso
fármaceutico, cuya formulación debe indicar un contenido de 8 a 10 g de yodopovidona en 100mL.
3. Después de 10 ó 15 minutos se drena el tamiz para eliminar el excedente de la
solución y se transfiere a otro recipiente de iguales dimensiones, con medio de
cultivo de hydra. Se deja reposar 3 minutos, y se enjuaga dos o tres veces
repitiendo la operación de transferencia a recipientes con medio fresco. Durante
este proceso los quistes no eclosionados deben ser removidos, evitando su
incorporación al cultivo de hydra durante la alimentación y reduciendo el riesgo de
infecciones en el cultivo (Figura 4.3.2.)
4. Desinfectada la Artemia, se procede a alimentar a las hidras esparciéndolas
sobre el cultivo masivo en forma de zig-zag, con ayuda de una pipeta Pasteur.
Este procedimiento se lleva a cabo por lo menos cuatro días a la semana, en
general se recomienda alimentar de martes a viernes. Una vez alimentado el
cultivo, se debe esperar 1 ó 2 horas para efectuar una primera limpieza y eliminar
los nauplios excedentes. Después de 4 ó 5 horas de la alimentación se debe
llevar a cabo una segunda limpieza del cultivo para eliminar los residuos de la
digestión. La limpieza se efectúa reemplazando todo el medio de cultivo con medio
fresco. Durante el cambio, las hydras flotantes se recuperan al filtrar el medio de
desecho con un tamiz de 60 mallas.
292
Desinfección con iodo
Proliferación
Fig. 4.3.2. Preparación de Artemia para alimentación
5. Se recomienda realizar una limpieza intensiva una vez por semana. Para ello se
deben desprender los organismos del fondo del recipiente frotando suavemente
con el dedo medio de la mano, posteriormente se mueve el líquido generando un
efecto de vórtice. Se espera a que las hidras se acumulen en el centro del
recipiente y luego se las transfiere a un tamiz de 60 mallas (esta operación puede
realizarse con ayuda de una pipeta volúmetrica de 100 mL en posición invertida).
A continuación se procede a eliminar las impurezas retenidas por el cultivo
mediante el enjuague con medio fresco. Los recipientes vacíos se lavan con
abundante agua destilada hasta eliminar la película mucosa formada en el fondo.
Terminada la limpieza, se colocan los organismos en un recipiente limpio con
medio de cultivo fresco y se cubren permitiendo la entrada de aire (Johnson et al.,
1990) (Figura 4.3.3.).
293
Limpieza cotidiana
Limpieza intensiva
Desprendimiento de
hidras y tamizado
Fig. 4.3.3. Limpieza de Hydra attenuata
Control del cultivo
Antes de iniciar las pruebas de toxicidad, es importante verificar si la salud de las
hydras y el desarrollo del cultivo están en condiciones óptimas. Para ello, se
recomienda evaluar bajo las condiciones prevalentes en el laboratorio la tasa de
crecimiento del cultivo.
Para determinar la tasa de crecimiento, se coloca en un recipiente pequeño con
suficiente medio de cultivo 5 organismos de similar tamaño, que presenten una
gema. En una hydra adulta cada hidrante está localizado en la cabeza del animal,
como cada hydra seleccionada tiene una yema, el número de hidrantes al tiempo
cero será igual a 10. Durante todo el período de evaluación, se debe realizar la
limpieza y alimentación de forma rutinaria evitando que durante la manipulación se
produzca la pérdida de hidrantes. Diariamente, durante un período de 5 a 6 días,
se cuenta y registra el número de hidrantes con ayuda de una
lupa
estereoscópica (Fig. 4.3.1.)
Para el cálculo de la tasa de crecimiento (k) se utiliza la siguiente ecuación:
k = (ln 2) / T
= 0.693 / T
donde T es el tiempo, expresado en días. requerido para que la población se
duplique (días).
294
Se sugiere que la determinación de la tasa de crecimiento (k) se realice de forma
periódica. En general los valores de k varían entre 0.3 y 0.4. En caso de
obtenerse valores menores al mencionado intervalo, es necesario efectuar
acciones correctivas sobre la alimentación y limpieza del cultivo a fin de lograr el
crecimiento óptimo (Trottier et al., 1997). En la tabla 4.3.2. se resumen las
condiciones de cría y mantenimiento de los organismos.
Tabla 4.3.2. Resumen de las condiciones recomendadas para el mantenimiento
de cultivos de Hydra attenuata
1 Temperatura
2 Calidad de Luz
3 Intensidad Luminosa
4 Fotoperíodo
5Recipientes
Mantenimiento
6 Alimentación
7 Dosis de Alimento
8 Densidad Poblacional
9 Limpieza
21 ± 2oC
Fluorescente, blanco-frío
< 800 lux (luz blanca fría) en la superficie del liquido
16 horas luz - 8 oscuridad
de Circulares de vidrio transparente de 20 cm de diámetro
de fondo plano, tipo refractario. Deben permanecer
cubiertos con un vidrio o papel de modo que se
permita la entrada de aire.
4 días por semana alimentar con nauplios de Artemia
sp, desinfectados con solución iodada.
No requiere de control estricto, sólo la adición de 2 a
3mL de medio de hydra conteniendo una nube densa
de artemias eclosionadas a cada recipiente de cultivo
y homogeneizar su distribución para que cada hydra
pueda tomar entre 1 y 6 nauplios.
No requiere control estricto. Sólo requiere cuidado
iniciar un nuevo recipiente cuando se observa una
cobertura densa de hydras en el fondo y demasiados
organismos libres flotando en el medio.
Diaria; con dos recambios de medio: el primero 2
horas después de la alimentación, y el segundo 4 ó 5
horas más tarde. Recuperar organismos flotantes con
tamiz de 60 mallas.
Semanal; desprendimiento de organismos del fondo,
recuperar con tamiz y transferir a recipientes limpios
con medio de hidra fresco.
4.3.4 Procedimiento de la Prueba
Preparación de la muestra:
En caso de muestras acuosas, excepto soluciones de compuestos químicos
puros, debe filtrarse un volumen aproximado de 150 mL de muestra a través de
una membrana de 0,22 μm.
295
Preparación de diluciones:
Para la realización de pruebas se recomienda trabajar con un mínimo de siete
diluciones seriadas de la muestra problema, y una concentración del tóxico de
referencia (ver capítulo 6). Para las pruebas preliminares con compuestos tóxicos
puros o muestras ambientales, se recomienda emplear una serie de diluciones
logaritmicas (100; 10; 1; 0,1; etc), e identificar posteriormente el intervalo de
concentraciones conveniente en el que deberá desarrollarse la prueba definitiva.
Para el control negativo, medio de dilución para la preparación de las diluciones
de la muestra, y la del tóxico de referencia (sea Cr VI o NaCl), emplear agua dura
reconstituida sin ningun suplemento. Ver fórmula del agua de dilución. en el
protocolo de prueba para Daphnia magna (Numeral 4.2.3).
Sistema de prueba:
Las pruebas de toxicidad se llevan a cabo en micro placas de cultivo celular de 12
pozos (Figura 4.3.4.). En ellas se preparan tres réplicas por cada concentración de
la muestra o del control positivo y tres más para el control negativo. El llenado de
los pozos se efectúa adicionando un volumen de 4mL, se inicia con los tres
pozos o réplicas del control negativo y se continúa con las diluciones de la
muestra, comenzando con la de menor concentración. En paralelo, se adiciona un
volumen de 3 a 4 ml de cada solución en cajas Petri de 35 x 10 mm.
Incremento de la concentración de la muestra ( % v/v)
Control
negativo
1.56
3.125
6.25
12.5
25
50
100
R
E
P
L
I
C
A
S
Transferir de 10 a 15 hidras a cada caja de Petri y
posteriormente tres a cada pozo
Fig. 4.3.4. Disposición de las concentraciones de prueba en el ensayo y
transferencia de organismos
Transferencia de hydras:
1. Se selecciona un grupo de organismos mantenidos sin alimentación durante 24
h. Se elimina el medio de cultivo invirtiendo el recipiente y descartando el líquido,
296
los organismos permanecerán adheridos al fondo del recipiente, a continuación
adicionar un volumen de medio de cultivo de hydra sin ácido etil-diaminoacético
(EDTA).
2. Se resuspenden los organismos y se concentran en el centro del recipiente
utilizando el mismo procedimiento indicado para la limpieza intensiva. En este
procedimiento se omite el empleo del tamiz para retener a los organismos
flotantes ya que puede producirse daño de la epidermis y causar hipersensibilidad
de los organismos durante la prueba.
3. A continuación, se colocan las hydras en un recipiente de 10 cm de diámetro
con medio de cultivo sin EDTA, y con la ayuda de una pipeta Pasteur se
transfieren de 10 a 15 organismos a cada una de las cajas Petri. Esta
transferencia permite reducir el efecto de dilución producido por el medio de cultivo
sobre la concentración de la muestra. Posteriormente se colocan tres hydras en
cada pozo, evitando aquellas que presenten gemas (Fig. 4.3.4.).
4.3.5.
Expresión de los Resultados
La prueba se desarrolla por un período de exposición de 96 h. Cada 24 h se
realiza la observación de los organismos con la ayuda de un microscopio
estereoscópico o lentillas de acercamiento con capacidad de 6 a 10X, con la
intención de registrar los cambios morfológico ocurridos. Dichos cambios se
clasifican como se establece en la Figura 4.3.5.
Tentáculos con bulbos (B)
Hydra attenuata normal (N)
Tentáculos acortados (C)
(B-C) = Expresiones de subletalidad
Estado de tulipán (T)
Desintegración (D)
(T-D) = Expresiones de letalidad
Fig. 4.3.5. Microfotografías de Hydra attenuata mostrando los diferentes
cambios morfológicos. a) normal, b) bulbo, c) acortamiento de tentáculos, d)
estadio de tulipán, e) desintegración (Trottier et al, 1997)
Al términar la revisión diaria, sumar el número total de hydras que presentan el
mismo estado morfológico en los tres pozos correspondientes a cada dilución. Con
los resultados formar tres grupos; el primero definido por el número de hydras
normales, el segundo con organismos que presentan efectos reversibles (No.
297
bulbos + No. cortas), y el tercero con organismos que presentan efectos
irreversibles (No. Tulipán + No. desintegradas).
A partir de los resultados registrados, obtener para cada concentración el
porcentaje de efecto subletal y letal. El primero se calcula a partir de la suma del
número de organismos que presentan anomalías en su morfología ya sea del tipo
reversible o irreversible y el porcentaje de letalidad se obtendrá a partir del número
de organismos con anomalías exclusivamente irreversibles. Con estos datos se
estiman los valores de CE50 o de CL50, según correponda, mediante los métodos
estadísticos Probit, Promedios Móviles o Sperman y Karber, así como los valores
de la LOEC, NOEC, y TOEC (Threshold Observable Effect Concentration, por
sus siglas en ingles), este último se calcula según:
TOEC = (NOEC x LOEC)1/2.
En la Tabla 4.3.3 y la Figura 4.3..4 se resumen las condiciones recomendadas
para las pruebas de toxicidad con H. attenuata.
Tabla 4.3.3. Resumen de las Condiciones Recomendadas para las Pruebas de
Toxicidad con H. attenuata
1. Tipo de Ensayo
2. Temperatura
3. Calidad de Luz
4. Intensidad Luminosa
5. Fotoperíodo
6. Volumen del Recipiente
7. Volumen de la Solución de Prueba
8. Características de los organismos
9. Densidad inicial de organismos
10. Número de Réplicas
11. Agua de Dilución
12. Factor de Dilución
13. Duración de la Prueba
14. Efecto Medido
15. Resultado Final
16. Aceptabilidad de los Resultados
Estático
22 ± 2°C
iluminación natural (cercana a una ventana)
fluorescente o blanco-frío,
≤ 800 lux
16 h luz/8 h de obscuridad
5mL en placas estériles de 12 pozos
4,0 mL
pólipos (hydras ) sin gemas, en ayuno de 24 h
3 hydras por pozo
3
Agua dura (sin suplementos) 0,3 ó 0,5
96 h , revisión cada 24 h.
Cambios morfológicos. Número de organismos
normales, con tentáculos con bulbos o
acortados (reversibles), o sin tentáculos y
pólipos desintegrados (irreversibles)
CE50 para subletalidad y (CL50) letalidad
Morfología normal en el 100% de los
organismos en el control negativo
Cr (VI) a partir de una solución de K2Cr2O7
17. Control positivo
298
REFERENCIAS
Blaise, C., and T. Kusui. 1997. Acute toxicity assessment of industrial effluents with
a microplate-based Hydra attenuata assay. Environm. Toxicol. Water. Qual. 12:5360.
Campbell,R.D., and H. R. Bode. 1983. Terminology for morphology and cell
types, p.5 – 14, In H. M. Lenhoff (ed) Hydra: Research Methods, Plenum Press,
New York.
Johnson, E. M., Gabel, B.E. G., Newman, L. M., and R. Giacobbe. 1990. The
Hydra assay manual. A practical guide to supplies, techniques and mechanics of
the assay. Department Anatomy, Daniel Baugh Institute, Jefferson Medical
College, Philadelphia. PA, USA 19107. 96p.
Trottier S., Blaise, C., Kusui T., Johnson E.M. 1997. Acute toxicity assessment of
aqueous samples using a microplate-based Hydra attenuata assay. Environm.
Toxicol. Water. Qual. 12:265-271.
299
4.4. ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA
SEMILLAS DE LECHUGA (Lactuca sativa L.)
CON
MARIA CECILIA SOBRERO
Centro de Investigaciones sobre el Medio Ambiente, CIMA, Universidad Nacional
de La Plata. Argentina
ALICIA RONCO
Centro de Investigaciones sobre el Medio Ambiente, CIMA, Universidad Nacional
de La Plata. Argentina
4.4.1. Principio
4.4.2. Reactivos y Materiales
4.4.3. Procedimiento para el Desarrollo de la Prueba
4.4.4. Expresión de los Resultados
4.4.5. Interpretación de los Resultados
REFERENCIAS
4.4.1. Principio
El bioensayo de toxicidad con semillas de lechuga (Lactuca sativa L.) es una
prueba estática de toxicidad aguda (120 hs de exposición) en el que se pueden
evaluar los efectos fitotóxicos de compuestos puros o de mezclas complejas en el
proceso de germinación de las semillas y en el desarrollo de las plántulas durante
los primeros días de crecimiento. Como puntos finales para la evaluación de los
efectos fitotóxicos, se determina la inhibición en la germinación y la inhibición en la
elongación de la radícula y del hipocotilo. Es importante destacar que durante el
período de germinación y los primeros días de desarrollo de la plántula, ocurren
numerosos procesos fisiológicos en los que la presencia de una sustancia tóxica
puede interferir alterando la supervivencia y el desarrollo normal de la planta,
siendo por lo tanto una etapa de gran sensibilidad frente a factores externos
adversos (Figura 4.4.1). Por otra parte, muchas de las reacciones y procesos
involucrados son generales para la gran mayoría de las semillas por lo que la
respuesta de esta especie y los datos obtenidos a partir de la aplicación de esta
prueba son en gran medida representativos de los efectos en semillas o plántulas
en general. El éxito o aptitud de una plántula para establecerse en un ambiente
determinado es de importancia relevante para garantizar la supervivencia de la
especie. La evaluación del desarrollo de la radícula y del hipocotilo constituyen
indicadores representativos para determinar la capacidad de establecimiento y
desarrollo de la planta.
300
Fig. 4.4.1. Morfología de la semilla y la plántula de lechuga
A diferencia de la prueba tradicional de germinación de semillas, la evaluación del
efecto en la elongación de la radícula y del hipocotilo de las plántulas permite
ponderar el efecto tóxico de compuestos solubles presentes en niveles de
concentración tan bajos que no son suficientes para inhibir la germinación, pero
que sin embargo pueden retardar o inhibir completamente los procesos de
elongación de la radícula o del hipocotilo, dependiendo ello del modo y sitio de
acción del compuesto. De esta manera, la inhibición en la elongación de la
radícula e hipocotilo constituyen indicadores subletales muy sensibles para la
evaluación de efectos biológicos en vegetales, aportando información
complementaria a la proporcionada al estudiar el efecto en la germinación. Este
ensayo puede ser aplicado para la evaluación de la toxicidad de compuestos
puros solubles, de aguas superficiales (lagos, ríos), aguas subterráneas, aguas
para consumo humano, aguas residuales domésticas e industriales, además de
lixiviados de suelos, sedimentos, lodos u otras matrices sólidas (Bowers et al,
1997; Cheung et al, 1989; Dutka, 1989). A diferencia de otras pruebas en las que
se consideran algas o plantas acuáticas sumergidas como organismo diagnóstico,
el bioensayo con semillas permite evaluar la fitotoxicidad de muestras coloreadas
o con elevada turbiedad de manera directa y sin necesidad de filtración previa,
reduciéndose así las interferencias debidas al pretratamiento además de
simplificar el procedimiento de prueba.
Si bien L. sativa no es una especie representativa de ecosistemas acuáticos, la
información generada a partir de esta prueba de toxicidad proporciona datos
acerca del posible efecto de los contaminantes en las comunidades vegetales
cercanas a las márgenes de cuerpos de agua contaminados, siendo también una
especie interesante de considerar por su importancia desde el punto de vista
hortícola. Por otra parte, es de fácil y rápida germinación por lo que es posible
desarrollar la prueba en pocos días.
301
Este bioensayo de toxicidad ha sido recomendado y aplicado por diferentes
organismos de protección ambiental para la evaluación ecotoxicológica de
muestras ambientales y compuestos puros, además de la evaluación del efecto
fitotóxico de pesticidas sobre especies no blanco necesarios para el registro de
pesticidas (OECD, 1984, Wang,. 1987; USEPA, 1989; Boutin et al., 1993).
En la incorporación de esta prueba en una batería de bioensayos es importante
considerar el compromiso entre la sensibilidad de la especie L.sativa, el reducido
tiempo de exposición de la prueba con semillas, los bajos costos asociados y que
no requiere equipamiento sofisticado, en particular en la aplicación a muestras
ambientales o en el monitoreo de procesos de detoxificación, saneamiento, control
de efluentes, o reuso de biosólidos.
4.4.2. Reactivos y Materiales
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Material biológico: Semillas de lechuga (Lactuca sativa L var. mantecosa).
Agua dura reconstituida (APHA, 1992). Para su preparación se recomienda
utilizar reactivos Grado ACS y agua destilada en vidrio o Millipore Supera Q.
Cápsulas de Petri de 100 mm de diámetro.
Papel de filtro Whatman No. 3 (o equivalente), 90 mm de diámetro. El papel de
filtro que se seleccione como sustrato de germinación debe tener las siguientes
características:
- Trama amplia y porosa que asegure una buena capacidad de retención de
líquido.
- Resistencia de la fibra del papel para que las radículas crezcan por su
superficie sin atravesarlo, situación que dificultaría la remoción de las
plántulas sin dañarlas.
- Ausencia de residuos tóxicos (ej. blanqueadores).
- Que no promueva el desarrollo de hongos (no asociados a las semillas).
Matraces aforados de 50 mL
Pipetas volumétricas de 1, 2, 5 y 10 mL.
Regla u otro elemento de medición.
Pinzas.
Toallas de papel.
Bolsas plásticas.
Cámara oscura termostatizada (22±2 °C).
Obtención, control y conservación de las semillas:
La obtención de semillas de lechuga (L.sativa L. var. mantecosa) se realiza en
semillerías locales, procurando que sean semillas sin curar (sin fungicidas o
plaguicidas), con buen poder germinativo y baja variabilidad en la elongación de la
radícula e hipocotilo. Los criterios de control del material biológico y del desarrollo
de la prueba se describen en el capítulo 6.
302
Las semillas seleccionadas se almacenan fraccionadas a 4º C, en oscuridad y en
ambiente seco. Conservadas en estas condiciones mantienen su vigor al menos
durante 2 años. Un indicador de la reducción de la vitalidad y envejecimiento de
las semillas es la reducción en el poder germinativo y el aumento en la variabilidad
de las medidas de elongación de radícula e hipocotilo en el control negativo (Ver
capitulo 6). En este caso se recomienda realizar las pruebas de toxicidad
utilizando un nuevo lote de semillas.
4.4.3. Procedimiento para el Desarrollo de la Prueba
Preparación de las diluciones:
Para realizar una curva dosis respuesta se recomienda preparar un mínimo de 5 o
6 diluciones de la muestra o compuesto a estudiar de manera, que se obtengan
valores de toxicidad intermedios entre el 100 y 0%. Para las muestras ambientales
se recomienda el uso de un factor de dilución de 0,3 ó 0,5 para la preparación de
la serie de diferentes concentraciones. El uso de un factor de 0,3 permite evaluar
la toxicidad considerando el intervalo entre el 100% y 1% de la muestra realizando
5 diluciones (100%, 30%, 10%, 3% y 1%). Al aplicar un factor de dilución de 0,5,
es necesario utilizar mayor número de diluciones para abarcar el mismo intervalo
de concentraciones (100%, 50%, 25%, 12%, 6%, 3%, 1,5 %) pero se obtiene
mayor precisión en los resultados. Para la preparación de cada dilución se utiliza
agua dura reconstituida (es posible el uso de agua mineral dura para consumo
humano), realizando el control negativo con el agua de dilución empleada.
Para el caso de las muestras cuya toxicidad es desconocida, previo a la
realización de la prueba definitiva, se sugiere hacer una prueba presuntiva
(ensayo preliminar) utilizando diluciones logarítmicas (100,10,1,0.1,0.01) que
permitan establecer el intervalo de concentración conveniente para obtener
valores de efecto entre 100 y 0% necesarios para calcular la CI50.
Con el fin de controlar la sensibilidad de las semillas, simultáneamente a la
evaluación de la toxicidad de una muestra, debe realizarse un control positivo
utilizando, por ejemplo, una sal de Zn(II) como tóxico de referencia. La
concentración de prueba de este control es la correspondiente a la CI50 para el lote
de semillas en uso (Ver capitulo 6).
Protocolo de ensayo:
En la Figura 4.4.2. y Tabla 4.4.1. se resume el procedimiento del ensayo de
toxicidad aguda con semillas.
•
•
Colocar en cada cápsula de Petri un disco de papel de filtro.
Marcar correctamente cada caja con la dilución correspondiente, así como la
303
•
•
•
fecha y hora de inicio y término del bioensayo.
Saturar el papel de filtro con 4 ó 5 ml de la dilución evitando que se formen
bolsas de aire.
Con la ayuda de una pinza, colocar cuidadosamente 20 semillas, dejando
espacio suficiente entre las semillas para permitir la elongación de las raíces.
Tapar las cápsulas y colocarlas en bolsas plásticas para evitar la pérdida de
humedad. Dado que algunas variedades de semillas de lechuga requieren
oscuridad para que se produzca la germinación (semillas fotoblásticas
negativas), las cajas de Petri deben cubrirse de la luz inmediatamente después
de colocarlas en las cápsulas y durante el período de ensayo. Incubar por 120
horas (5 días) a una temperatura de 22 ± 2 ºC. Realizar repeticiones para cada
dilución ensayada.
Medida de los puntos finales de evaluación de la fitotoxicidad:
Cada punto final se evalúa comparando el efecto generado en los organismos
expuestos a la muestra con respecto a la respuesta en los organismos del control
negativo sujetos a las mismas condiciones de ensayo, excepto por la ausencia de
muestra.
Terminado el período de exposición (120 hs), se procede a cuantificar el efecto en
la germinación y en la elongación de la radícula y del hipocotilo.
Efecto en la germinación:
Registrar el número de semillas que germinaron normalmente, considerando como
criterio de germinación la aparición visible de la radícula.
304
Figura 4.4.2. Esquema general del procedimiento de prueba de toxicidad con
semillas
305
Tabla 4.4.1. Resumen de las condiciones recomendadas para las pruebas de
toxicidad con Lactuca sativa L.
1. Tipo de ensayo
Estático
2. Temperatura
22 ± 2°C
3. Calidad de luz
Oscuridad
4. Volumen de solución de prueba
5. Agua de dilución
4 ml
Agua dura reconstituída
6. Número de semillas por replica
20
7. Número de replicas
3
8. Duración de la prueba
120 h
9. Efecto medido
Inhibición en la elongación de la radícula
e hipocotilo. Inhibición en la germinación
10. Resultado final
11. Aceptabilidad de los resultados
12. Control positivo
CE50, o CI50 o % inhibición
Germinación > 90%
Control positivo y negativo de acuerdo a
los valores admitidos en las cartas control
Zn (II)
Efecto en la elongación de la radícula e hipocotilo:
Utilizando una regla o papel milimetrado, medir cuidadosamente la longitud de la
radícula y del hipocotilo de cada una de las plántulas correspondientes a cada
concentración de tóxico o dilución de muestra y a los controles. La medida de
elongación de la radícula se considera desde el nudo (región más engrosada de
transición entre la radícula y el hipocotilo) hasta el ápice radicular. La medida de
elongación del hipocotilo se considera desde el nudo hasta el sitio de inserción de
los dos cotiledones (Figura 4.4.3.). La figura 4.4.4. muestra los distintos estadios
de la semilla durante la prueba de germinación y elongación.
306
Figura 4.4.3. Esquema de plántula de L. sativa al
finalizar el período de exposición
hipocotilo
cotiledones
Antes de retirar las plántulas de las cápsulas de Petri
para evaluar el efecto en los puntos finales
anteriormente mencionados, es importante realizar
una observación detallada del estado general de las
radícula
mismas y del crecimiento de la radícula sobre el papel de
filtro. Informar cualquier indicador de fitotoxicidad o de
crecimiento anormal en las plántulas tratadas y en los controles (ápices
radiculares con necrosis, pelos absorbentes poco desarrollados, radículas con
crecimiento ensortijado, necrosis en los cotiledones, etc.). La necrosis (presencia
de tejido muerto) se evidencia como manchas localizadas de coloración parda,
blanca o marrón. Al evaluar el efecto en la germinación, consignar además
aquellas semillas con germinación anormal (emergencia de cotiledones o
cotiledones e hipocotilo solamente, pero sin emergencia de la radícula) o con
desarrollo de hongos.
Un procedimiento factible de realizar para facilitar la medición de la radícula e
hipocotilo, es proceder a congelar las cápsulas de Petri correspondientes a todos
los tratamientos y descongelarlas a medida que se van midiendo (no conservar el
material luego de ser descongelado). De esta manera las plántulas descongeladas
adquieren una consistencia blanda, favoreciendo la medición. Si se procede a
evaluar el efecto sobre las plantas descongeladas es importante proceder de igual
manera con todas las réplicas de la prueba. Este procedimiento reduce la
variabilidad en las medidas, principalmente cuando el crecimiento de las radículas
es ensortijado o no es parejo. Por otro lado, antes de congelar el material se debe
realizar previamente la observación general de efectos fitotóxicos en las plantas
vivas al finalizar el período de exposición.
Control de calidad de la prueba:
El ensayo deberá repetirse en caso de que los controles presenten:
En el Control negativo:
•
•
Porcentaje de germinación inferior al 90 %.
Alta variabilidad en la elongación de la radícula (CV>30%)
En el Control positivo:
•
•
Porcentaje de germinación inferior al 90 %.
Variación de la sensibilidad de las semillas fuera de lo permitido por las cartas
control (Ver capitulo 6)
307
Fig. 4.4.4. Estadios por los que atraviesa la semilla durante el ensayo de
germinación y elongación
Posibles interferencias en el proceso normal de germinación o desarrollo de las plántulas
en los controles:
•
•
•
•
Toxicidad del sustrato: cuando se reemplaza el papel utilizado por otras
marcas más económicas o se utiliza papel de filtro cualitativo en planchas, hay
que tener en cuenta los posibles efectos tóxicos del papel. Si se ha tenido
buenos resultados con una marca o calidad determinada de papel, es
conveniente no variar el sustrato de ensayo.
Suciedad de las cápsulas: si no es posible utilizar material descartable, es
importante asegurar un enjuague minucioso del material para evitar la
presencia de residuos de detergente u otra solución de limpieza.
Exceso de agua o de muestra utilizada para embeber el papel, lo que
determina una baja disponibilidad de oxígeno necesario para el normal
desarrollo del proceso de germinación. El papel de filtro utilizado como sustrato
de germinación de las semillas debe estar bien mojado, con sobrante de
líquido para evitar la desecación, pero en ningún caso las semillas deben
quedar sumergidas.
Déficit hídrico durante el periodo de exposición: se recomienda envolver las
cápsulas con una bolsa plástica para evitar que el papel de filtro de las mismas
pierda agua durante el ensayo. Si se esta experimentando con compuestos
volátiles, no deben colocarse en una misma bolsa cápsulas que correspondan
a diferentes concentraciones de ensayo. También se puede colocar dentro de
la cámara de cultivo un recipiente con agua para generar un ambiente húmedo,
reduciendo así la evaporación. Hay que tener en cuenta que la pérdida de
humedad de las cápsulas genera una concentración del tóxico cuya toxicidad
estamos evaluando y por lo tanto, las conclusiones a las que arribaremos
serán erróneas.
308
•
•
Exposición a la luz durante el proceso de imbibición: inmediatamente después
de colocar las semillas sobre el papel de filtro, se recomienda tapar y envolver
las cápsulas de Petri cubriéndolas de la luz (Para el caso de semillas
fotoblásticas negativas).
Temperatura de ensayo: las semillas de L. sativa expuestas a una temperatura
superior (apenas unos grados) a la óptima para la germinación, no germinarán
aunque se les coloque posteriormente a temperaturas inferiores
(termodormancia o dormancia inducida por la temperatura).
4.4.4. Expresión de los Resultados
Se realizan los siguientes cálculos:
•
promedio y desviación estándar de la elongación de la radícula y del
hipocotilo de las plántulas de cada repetición.
•
porcentaje de inhibición del crecimiento de la radícula y del hipocotilo
con el promedio de elongación para cada dilución respecto del promedio
de elongación del control negativo.
•
porcentaje de inhibición en la germinación.
Elaborar la gráfica dosis-respuesta colocando en la ordenada el porcentaje de
inhibición y en la abscisa la concentración. Mediante un método gráfico o el uso de
programas estadísticos, calcular la concentración que produce el 50% de
inhibición (CI50/CE50) para cada punto final evaluado. Para el caso de muestras en
donde la inhibición es inferior al 50%, o para determinar el valor correspondiente al
NOEC o LOEC, se realiza el análisis de comparación de medias (t Student,
Dunnett) para verificar la significancia estadística en el porcentaje de efecto.
4.4.5. Interpretación de los Resultados
Los efectos cuantificados sobre la elongación de la radícula o del hipocotilo son
efectos subletales. La inhibición en la germinación podría considerarse como un
efecto letal siempre y cuando podamos corroborar que finalizada la exposición a
una muestra las semillas no germinaron por muerte del embrión y que no existe
simplemente un retraso en el proceso de germinación manteniéndose la viabilidad
de la semilla. Al evaluar la fitotoxicidad de muestras ambientales complejas o con
compuestos volátiles, en algunos casos se ha observado que al finalizar el período
de exposición la inhibición en la germinación es elevada, pero si se extiende el
período de ensayo, sin renovar la exposición a la muestra, las semillas comienzan
a germinar. La vitalidad de las semillas que no han germinado es posible
verificarla mediante la prueba de tetrazolium para viabilidad (Ellis et al., 1985),
pudiendo de esta manera asignarle con certeza a la inhibición de la germinación,
el valor e importancia de un efecto letal. No obstante esto, la inhibición en la
germinación registrada al finalizar la prueba, se considera fitotoxicidad aunque el
efecto en la germinación sea reversible.
Otro aspecto a considerar es el mayor desarrollo en la elongación de la radícula o
el hipocotilo en algunas muestras con respecto al control. La exaltación en un
309
punto final u hormesis no debe ser interpretada como un efecto favorable o
estimulante. Si bien es posible que muchos compuestos (Ej.: Cu, Zn) a bajas
concentraciones produzcan exaltación por ser micronutrientes vegetales, esta
respuesta debe ser evaluada de manera conjunta con los efectos registrados en
otras pruebas. En la aplicación de la prueba con semillas a muestras ambientales
conjuntamente con otros organismos como parte de una batería, se ha detectado
en diferentes ocasiones que la exaltación en la respuesta en el hipocotilo y/o
radícula se corresponde con toxicidad frente a otros ensayos de la batería.
REFERENCIAS
APHA-AEEA-WPCF, 1992. Metodos Normalizados para el Análisis de Aguas
Potables y Residuales. Ed. Diaz de Santos, S.A., Madrid. 1576 pp.
Bowers N., Pratt J.R., Beeson D. & Lewis M., 1997. Comparative evaluation of soil
toxicity using lettuce seeds and soil ciliates. Environ. Toxicol.and Chemistry 16(2),
207-213.
Cheung Y.H., Wong M.H. & Tam N.F.Y., 1989. Root and shoot elongation as an
assessment of heavy metal toxicity and “Zn Equivalent Value” of edible crops.
Hydrobiologia 188/189, 377-383.
Dutka B., 1989. Short-Term Root Elongation Toxicity Bioassay. Methods for
Toxicological Analysis of Waters, Wastewaters and Sediments. National Water
Research Institute (NWRI). Environment Canada.
Ellis RH, Hong TD & Roberts EH, 1985. Handbook of Seed Technology for
Genebanks. Vol.1 Principles and Methodology. International Board of Plant
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Wang W, 1987. Root elongation method for toxicity testing of organic an inorganic
pollutants. Environmental Toxicology & Chemistry 6, 409-414.
310
I. Prueba de toxicidad aguda con Vibrio fischeri
(Photobacterium phosphoreum), procedimiento al
100%.
YOLANDA PICA GRANADOS
GISSEL TRUJILLO DOMÍNGUEZ
Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Cuernavaca, Morelos,
México
1.1. Principio
1.2 Campo de aplicación
1.3 Definiciones
1.4. Reactivos
1.5. Materiales y Equipos
1.6. Procedimiento para el Desarrollo de la Prueba
1.7. Cálculos
1.8. Interferencias
1.9. Control de Calidad
REFERENCIAS
I.1 PRNCIPIO
La toxicidad aguda de la solución de prueba sobre una población de 10 6 bacterias
de la especie V. fischeri (bacteria bioluminiscente), se determina a través del cambio
en la intensidad de luz emitida después de un período controlado de exposición.
I.2 CAMPO DE APLICACION
Estudios de toxicología acuática, control legal de descargas agrícolas, industriales y
municipales, evaluación de procesos de tratamiento y estudios integrales de
contaminación, donde para el análisis de toxicidad se requiera manejar una
concentración inicial de la muestra del 100%. Este método puede emplearse
también para el análisis de extractos orgánicos y elutriados de suelos y sedimentos
o sustancias puras líquidas o sólidos solubilizables.
311
I.3 DEFINICIONES
Estas definiciones han sido adecuadas a las necesidades del procedimiento.
Bioluminiscente.- es un fenómeno en donde los organismos vivos emiten luz como
resultado de procesos enzimáticos ligados a la respiración.
Blanco.- es usado indistintamente con la palabra control.
Concentración efectiva media (CE50).- es la concentración estimada de material que
causa un efecto no letal detectado por la reducción del 50% de la intensidad
luminosa generada por una población de 106 bacterias.
Control.- Se asigna este término al lote o tratamiento, dentro del diseño
experimental, que replica las condiciones que afectan al conjunto de tratamientos,
excepto la sustancia o mezcla de ellas que son investigadas en la prueba.
Cultivo.- conjunto de plantas o animales que se mantienen bajo condiciones
definidas y controladas, para producir organismos saludables.
Efecto tóxico agudo.- es aquel que es inducido y observado en un período corto,
que puede ser de 5 a 30 minutos para el caso de V. fischeri. Este periodo de
respuesta óptimo, está definido a partir de estudios previos basados en el
conocimiento de biología bacteriana en conjunto a la química de los tóxicos. Se ha
observado la existencia de procesos que facilitan el paso de tóxicos al interior de las
células bacterianas, siendo más ágiles y rápidos los relacionados a compuestos
orgánicos que los de incorporación de elementos metálicos (Bulich, 1979; Bulich et.
al., 1981; Kaiser, 1984; Bulich, 1988).
Liofilizado.- significa congelado y deshidratado al vacío, y es aplicado a la bacteria
usada en la prueba Microtox, la cual está comercializada.
Porcentaje (%).- es una concentración expresada en partes por ciento. Representa
una unidad o parte del material (por ejemplo efluente, o agua receptora) diluida con
agua a un total de 100 partes. Las concentraciones pueden ser preparadas en
volumen-volumen o peso-peso y son expresadas como un porcentaje de material de
prueba en la solución final.
Toxicidad.- es la capacidad o potencialidad inherente de un material para causar
efectos adversos en los organismos. El efecto puede ser letal o subletal.
Prueba de Toxicidad.- también denominados bioensayos o ensayos de toxicidad,
los cuales consisten en la exposición de organismos vivos a soluciones
preparadas o muestras naturales con el fin de evaluar en ellas la presencia de
algún compuesto tóxico a través de alteraciones de la vitalidad o funcionamiento
metabólico de los organismos de prueba.
312
Tóxico de referencia.- sustancia química pura utilizada en ensayos de toxicidad para
determinar la sensibilidad de los organismos de prueba y validar las mediciones de
toxicidad.
Agua desionizada.- es el agua que a través de purificación se le han removido los
iones en solución, pasando a través de columnas de resina o sistema de ósmosis
inversa.
Análisis replicado.- es la prueba realizada a una muestra en dos o más ocasiones
durante la misma sesión de trabajo.
Blanco de pretratamiento.- Deberá entenderse como blanco de pretratamiento
aquel que se prepara de la misma forma que las muestras pero sin contener a la
muestra. Se realiza cuando las muestras son tratadas previamente al análisis de
toxicidad y se elabora para evaluar en que medida el pretratamiento contribuye a la
toxicidad de la muestra.
I.4 REACTIVOS
- Reactivo liofilizado (bacteria Vibrio fischeri liofilizada).
- Solución diluente, para fase líquida.
- Solución de ajuste osmótico
- Solución de reconstitución
I. 5. MATERIALES Y EQUIPO
- Sistema Microtox ® Modelo 500 constituido por:
Fotosensor (Luminómetro)
Pozos de incubación con temperatura controlada de 15°C
Pozo para reactivo reconstituido con temperatura controlada de 5°C (pozo de
activación).
- Congelador a una temperatura de –20°C.
- Sistema de cómputo acoplado con: software MTX7, Probit u otro de utilidad, y
hojas de cálculo.
- Hielera y hielo o geles refrigerantes.
- Pipetas automáticas de 250, 500 y 1000 µL (de volúmen fíjo o ajustable).
- Pipeta automática de 10 µL o de repetición ajustable a medición de 10 µL.
- Puntas para micropipetas.
- Jeringas de 0.6 mL para pipeta de repetición.
- Celdillas de vidrio borosilicato.
313
I.6 PROCEDIMIENTO PARA EL DESARROLLO DE PRUEBA
Este protocolo es una versión ampliada y modificada por el Instituto Mexicano de
Tecnología del Agua, basada en MICROBICS (1992) y en la Norma Mexicana
NMX-A-112-1995-SCFI (1995).
I.6.1 Obtención, manejo y transporte de la bacteria (Vibrio fischeri)
La bacteria Vibrio fischeri, es abastecida por la representación en México de la
empresa con derecho de patente y de comercialización de la tecnología. Durante
su traslado debe conservarse siempre en congelación, de preferencia a una
temperatura de -20 ± 4°C. El inadecuado manejo de las bacterias, afecta la
sensibilidad de estos microorganismos y por consecuencia la confiabilidad de los
resultados.
Para el transporte de las bacterias, utilizar hieleras con geles refrigerantes, hielo o
hielo seco, para mantener en frío a una temperatura de 4 ± 2 °C. De esta forma
pueden permanecer hasta 8 horas. En caso de traslados breves puede emplearse
bandejas con hielo o geles fríos
1.6.2. Preparación de la bacteria.
Encender el equipo y permitir la estabilización automática de las temperaturas en
los pozos de incubación (15 ± 1°C) y de activación (5 ± 1°C). El tiempo requerido es
de aproximadamente 15 minutos, lo cual se verifica al apagarse en la pantalla del
equipo, la señal de termómetro.
Colocar 5 celdillas en los pozos de incubación del sistema Microtox® (ej. fila A).
Colocar una celdilla en el pozo de activación del sistema Microtox®
Agregar a la celdilla del pozo de activación, 1000 µL de solución de reconstitución.
Dejar estabilizar por un tiempo aproximado de 5 a 10 minutos para que ésta
alcance una temperatura de 5 ± 1°C la que será controlada internamente por el
equipo.
Sacar un frasco de bacteria liofilizada del congelador y manejar en frío hasta que de
inmediato se vacíe en ella la solución de reconstitución mantenida en el pozo de
activación a 5 ± 1°C y disolver. Estas acciones deben efectuarse rápidamente para
evitar un efecto de choque osmótico a las bacterias. Transferir la mezcla
nuevamente a la celdilla de activación y continuar su incubación a 5 ± 1 °C.
Mezclar la bacteria, ya sea con ayuda de una pipeta automática, aspirando y
eyectando la mezcla en la celdilla o por medio de agitación suave generando el
efecto ligero de vórtice. Dejar reposar por un tiempo aproximado de 15 minutos con
el propósito de que la bacteria se hidrate y revitalice.
314
1.6.3 Preparación de la prueba.
Para muestras de agua epicontinental. Agregar 1000 µL de solución diluente en
las celdillas A1, A2, A3 y A4 a la A4 indicadas en 11.2.2.
Agregar 250µL de solución de ajuste osmótico y 2500 µL de la muestra a analizar.
Mezclar por pipeteo absorbiendo y eyectando la solución 3 veces con ayuda de la
pipeta de 1000 µL.
Para muestras de agua marina y salobre
Se requieren preparar dos sistemas de prueba, uno igual al de muestras de agua
epicontinental (ver numerales 11.3.1-2), conteniendo 250µL de solución de ajuste
osmótico y 2500 µL de la muestra de agua salina por analizar y otro preparado sin
la solución de ajuste osmótico, es decir 2750 µL de la muestra por analizar.
El empleo del análisis de la muestras con y sin ajuste osmótico nos es de ayuda
para elegir el método de trabajo adecuado para las muestras por analizar, ya que
cuando la adición del ajuste osmótico representa un exceso de sales para la
bacteria los niveles de luminosidad adquieren valores significativamente más
elevados que en el control y no es posible usar este sistema para la obtención de la
CE, cuando esto sucede, generalmente el sistema preparado en ausencia de ajuste
osmótico da lecturas útiles para los cálculos de la CE, o viceversa.
En forma paralela, se prepararán muestras replicadas y de blancos de
procedimiento, cuando este aplique, consideradas para el control de calidad
analítico, así como muestras preparadas con tóxicos de referencia elaboradas con
la adición de 250 µL de solución de ajuste osmótico y 2500 µL de la solución de
fenol de aproximadamente 100 µg/mL.
Elaborar una serie de diluciones transfiriendo 1000 µL de A5 a A4, de A4 a A3 y de
A3 a A2, mezclando cada vez. Efectuar la transferencia en el orden indicado, con la
pipeta automática de 1000 µL empleando una sola punta.
Desechar 1000 µL de A2 y 750 µL de A5 para uniformizar volúmenes a 1000 µL. La
celdilla A1 será considerada como control. Se emplearán las pipetas automáticas de
1000, 500 y 250 µL.
Dejar estabilizar el aparato durante aproximadamente 5 minutos para que las
soluciones alcancen una temperatura de 15 ± 1 °C
1.6.4 Preparativos para capturar los datos
Una vez preparado el sistema experimental de prueba, se deben disponer las
herramientas de captura de datos. Con este fin, puede emplearse el sistema en
315
línea de captación automática por software MTX7 o cualquiera otro de utilidad. De
no ser posible el empleo del software integrado, se puede efectuar la toma de
datos directa de la pantalla del Microtox y su registro en bitácora o a una hoja
electrónica diseñada en Excell para la corrección de los valores de luminiscencia a
porcentaje de efecto, (ver numeral 1.7).
En el caso de toma directa de datos, los valores pueden ser ingresados
manualmente al programa MTX7, Probit o cualquier otro de utilidad para el manejo
de los mismos y el cálculo de la CE. En este caso, es importante el uso de un
cronómetro o reloj, que permita el control del término del tiempo de exposición (ej:
5 o 15 minutos), para dar inicio a la lectura de cada celdilla.
Al término del tiempo de exposición colocar la celdilla A1 (control) en el pozo de
lectura y efectúe la autocalibración presionando el botón SET (aparecerán en la
pantalla del equipo valores entre 90-100). Posteriormente oprima el botón READ. La
lectura de la celdilla A1 aparecerá en la pantalla y deberá ser anotada en la bitácora
o en la hoja de excell, en el sitio asignado para las lecturas de las celdillas control.
Retire la celdilla A1(control) y continúe la lectura de las celdillas restantes o
experimentales (ej: A2, A3, A4 y A5) iniciando con la de menor concentración,
oprimiendo el botón READ del equipo cada vez. Ingrese una nueva celdilla para
lectura de forma inmediata a la expulsión de la anterior, registrando los datos que
aparecen en la pantalla del equipo.
Al término de las lecturas, el analista efectuará el cálculo de la CE, ya sea
ingresando los datos al programa MTX7, Probit o cualquier otra herramienta de
utilidad a su alcance.
I.7 CALCULOS
Los resultados se expresan a través de la CE50 (concentración efectiva media) y las
unidades pueden estar en porcentaje, mL/L o mg/L, Eq. mg/ml, o cualquiera otra
unidad acorde con el tipo y manejo de muestra que se desee analizar.
Los cálculos para la determinación de la CE50, así como la elaboración de la curva
asociada pueden ser realizados a través de diversas herramientas como los
software MTX 7 o el de mas reciente creación, ambos producidos por el fabricante
de Microtoxo para el registro automático de datos. Estos programas despliegan la
información en pantalla y después esta puede ser impresa.
De no contarse con estos programas, también puede emplearse el programa Probit
(versión US EPA 1.5 o cualquiera otro que pueda efectuar dicho análisis). En caso
de emplear el Probit será necesario hacer la conversión de los valores de
luminiscencia a porcentajes de efecto los cuales deberán ser capturados en el
programa Probit en los espacios correspondientes al número de organismos
afectados para cada dilución.
316
Para efectuar la corrección deberá hacerse lo siguiente
1) Tomar el valor de luminiscencia del control (si es solo uno) o promediar el valor
de los controles (si se cuenta con más de uno) y hacerlo equivalente a 100% a
través de una regla de tres (ver ejemplo).
2) Tomar el valor de luminiscencia de cada dilución para obtener su valor en
equivalencia respecto al control de acuerdo a:
Ejemplo de una dilución:
Luminiscencia del control
96
100%
Luminiscencia de la dilución
70
X
Resultado
X= 72.91
3) Restar de 100 cada valor de dilución obtenido de la corrección de acuerdo a :
100 - 72.91 = 27.09
El valor de 27.09 es el porcentaje de efecto que deberá ingresase al Probit como el
número de organismos afectados.
4) Realizar este ajuste a cada una de las distintas diluciones
I.8 INTERFERENCIAS
Color en la muestra original y diluida. Si se sospecha de interferencia por color,
hacer la corrección de la lectura siguiendo el numeral 11.5 de éste protocolo.
Turbiedad en las muestras diluidas. Dejar sedimentar la muestra y emplear el
sobrenadante.
En caso en que la muestra contenga compuestos volátiles, es factible que la
pérdida continua de estos agentes sean un factor de variabilidad que afecta la
estabilidad de la respuesta y puede generar, en caso de análisis replicados,
resultados poco consistentes. Para evitar dicha alteración se sugiere correr en
paralelo a la muestra original, muestras aireadas, de modo que los resultados de
toxicidad que así se obtengan corresponderán a la fracción soluble y no volátil de
la muestra.
Si es requerido conocer la toxicidad de muestras con carga volátil sin que esta sea
removida, es importante tener en cuenta que los métodos biológicos como el de V.
fischeri, Daphnia magna o Selenastrum capricornutum, entre otros, son de gran
317
utilidad para la detección de tóxicos solubles o solubilizados y los agentes volátiles
no entran en estas categorías, principalmente por su corta persistencia en fase
acuosa que limita el desarrollo de pruebas en sistemas abiertos cuya duración, que
en términos generales, es mayor a 24h. En este sentido, la única prueba factible de
ser aplicada para esta clase de agentes con V. fischeri, por su corto periodo (5
minutos) y por la posibilidad de manejarse en frío y en sistemas parcialmente
cerrados. Estas propiedades, manejadas por técnicos con experiencia, pueden
permitir lograr lecturas analíticamente confiables, sin embargo esta clase de análisis
no se realizaran de rutina y deben ser protocolizados como investigaciones o
procesos especiales dada la complejidad de su manejo y necesidad de ser
interpretadas por gente especializada.
1.9 CONTROL DE CALIDAD
Tóxicos de referencia.
De acuerdo a Microbics Coo. (1992), actualmente “Strategic Diagnostics
Incorporated (SDI)”, el Fenol es el compuesto utilizado como tóxico de referencia
para la prueba con V. fischeri (P. Phosphoreum) y alternativamente pueden ser
empleados otros compuestos cuya respuesta sea bien conocida, tal es el caso del
Zn(II) o alguno otro. Sin embargo, en todos los casos los reactivos deberán
presentar una pureza mínima del 99%.
Preparación de la solución de Fenol
Es necesario elaborar una solución de prueba de aproximadamente 100 µg/mL
(ppm). Para su obtención se sugiere preparar una solución madre, colocando 0.1g
del reactivo en un matraz volumétrico clase A de 100mL y aforar con agua
destilada o desionizada para obtener una concentración de 1000µg/mL. A partir de
ella pueden transferirse 10mL, medidos con una pipeta volumétrica clase A, a un
segundo matraz volumétrico de 100mL (clase A) aforándolo con agua destilada o
desionizada para obtener una concentración final de 100µg/mL (solución de
prueba). Estas cantidades y forma de preparación podrán modificarse, siempre y
cuando la concentración de la solución de la solución final no sea alterada.
La solución de fenol deberá ser valorada de forma regular (por lo menos una vez
cada tres meses), empleando el método de titulación con tiosulfato en su apartado
de valoración de solución madre de fenol, al que se hace mención en la NOM-AA050 de la SCFI,2001.
La soluciones deberán mantenerse en frascos ámbar o protegidos de la luz con
cubierta de papel aluminio a 4 ± 2 ºC (refrigeración). En estas condiciones, la
solución de prueba podrá preservarse por un promedio de 20 días o continuar su
empleo siempre y cuando el valor de CE50 no exceda los límites del ámbito de
respuesta preestablecido para el tóxico de referencia (13 a 26 µg/mL.) y/o su
concentración, verificada a través de la valoración, no indique cambios relevantes .
318
Prueba con el tóxico de referencia.
Para confirmar la sensibilidad y el estado fisiológico de los microorganismos (V.
fischeri), se preparará una serie de 4 o 5 diluciones a partir de la solución de prueba
de fenol, de acuerdo al numera 1.6.3 que contiene el protocolo de realización de la
prueba de toxicidad.
Los resultados de CE50 para el fenol, después de un tiempo de exposición de 5
minutos deberá ser de entre
La prueba de verificación con tóxicos de referencia deberá realizarse al inicio de la
sesión de trabajo y/o cuando se abra una nueva ampolleta correspondiente a un
lote de bacteria distinto al que se ha estado trabajando.
Carta control
El valor de CE50 obtenido para el Fenol, al inicio de la sesión de trabajo, se marcará
en la carta control para el tóxico de referencia en la cual se indican los límites
máximos y mínimos ( ± 2ds) en que debe encontrarse la CE50 del tóxico
seleccionado, construyéndose de esta forma un gráfico que puede también ser
empleado como Gráfico de exactitud
Análisis replicados.
Estos se efectuarán a una de las muestras por grupo de muestras o en caso de
que este contenga un número elevado de muestras (>30) a un 10 % de éstas. Los
análisis replicados deberán realizarse a lo largo de la misma sesión de trabajo y
bajo condiciones idénticas.
Análisis de pruebas replicadas.
Los resultados de CE50 obtenidos de los análisis replicados de una muestra serán
sometidos a una prueba de significancia estadística para el análisis de las
diferencias siguiendo el método indicado por Standard Methods, 1992.
Blanco de procedimiento.
Se incluirá un blanco por cada lote de
muestras procesadas y sometidas a
pretratamiento. La preparación del blanco variará de acuerdo a los procedimientos
aplicados, como pueden ser extracción con solventes orgánicos o producción de
elutriados , entre otros, sin embargo el efecto o toxicidad resultante del proceso de
manejo de muestra y/o del uso de solventes en la prueba, no deberá exceder del
319
10% (Standard Methods, 1992) ya que de lo contrario pueden producirse
interferencias importantes que alteren los resultados de la prueba.
El análisis de toxicidad de los blancos de procedimiento deberá realizarse al igual
que las muestras
REFERENCIAS
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Testing and Materials.
Bulich, A. 1988. Analytical application of the MICROTOX system. Analytical
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Specialty Conference, April 19-20, Atlanta.
Kauser, K. L. E: 1984. Organic contaminants in the environment: Research Progress
and Needs. Environm. Int., 10: 241-250.
Environment Canada. (1992). Biological test method: Toxicity test using luminiscent
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American Public Health Association. Ap. 8010G. pag 8-20-8-23.
Microbics Corporation. (1992). Manual Microtox. Carlsbad, California, U.S.A. Part
No. 55H550-1-5.
Secretaria de Comercio y Fomento Industrial. 1995. Norma Mexicana NMX-AA112- SCOFI. Análisis de agua y sedimentos. Evaluación de toxicidad aguda con
Photobacterium phosphoreum. Método de pruebas DGN. Pag. 36.
320
2. ENSAYO DE TOXICIDAD CON EL NEMATODO
Panagrellus redivivus
YOLANDA PICA GRANADOS
Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Cuernavaca, Morelos,
México
2.1. Principio
2.2 Campo de aplicación
2.3. Reactivos, Soluciones
2.4. Materiales y Equipos
2.5 Cultivo de los Organismos de Prueba
2.6. Procedimiento para el Desarrollo de la Prueba
2.7. Análisis de Datos
REFERENCIAS
2.1 . PRINCIPIO
Panagrellus . redivivus es una especies dioica y ovovivípara. El primer estadio de
desarrollo ocurre en el útero de las hembras y es denominado como J1, en el que se
desarrolla la embriogénesis con una duración aproximada de 20 hrs. Cuando el
estadio J1 muda, da lugar a la los juveniles o J2 que emergen del huevo y son
expulsados por la vulva de la hembra como libres nadadores ( figura 1)
Fig. 1. Microfotografía de Panagrellus redivivus
321
Fig. 1. Microfotografía de Panagrellus redivivus
Los recién nacidos (J2) continúan su crecimiento pasando pon dos estadios
juveniles más, J3 y J4 hasta alcanzar el estado adulto a las 96 h posteriores a su
nacimiento.
Cada estadio se caracteriza por la longitud del organismo (Burke D.J. y Samoiloff M.
R. 1980., Samoiloff M.R. et. al. 1980 ), ámbito que esta bien definido para P.
redivivus. (tabla 1 ), sin embargo bajo condiciones adversas del medio de vida los
organismos responden ya sea muriendo o mostrando alteraciones en su periodo
de desarrollo. Las manifestaciones de efecto se determinan por el monitoreo del
crecimiento de una población de 100 organismos en estadio J2 a lo largo de un
periodo de 96 h. A partir de su seguimiento es posible determinar efectos letales, a
través del número de organismos muertos, así como efectos subletales crónicos y
de genotoxicidad, a través del número de organismos estancados en etapas
retardadas de desarrollo (J2, J3 y J4), o en caso de alcanzar etapas adultas también
se pueden evaluar efectos de mayor escala temporal a través del por el número de
hembras grávidas y el número de sus huevos
2.2 CAMPO DE APLICACIÓN
El nematodo de la especie Panagrellus redivivus es un organismo de prueba
aplicable al biomonitoreo de aguas y sedimentos. Se ha usado para la detección
de toxicidad de muestras ambientales complejas como son aguas residuales,
suelos, sedimentos y lodos contaminados, ya sea a través del análisis de
fracciones químicas obtenidas a partir del pretratamiento de muestras, a través de
la obtención de elutriados y/o extractos ( Samoilof et al 1983, Ongley et al ,
1988).
2.3 REACTIVOS, SOLUCIONES Y CULTIVO DEL ORGANISMO DE PRUEBA
Todos los reactivos utilizados deben tener calidad ACS, o al menos de 99% de
pureza. Para su preparación se emplea agua Tipo II destilada o desionisada
(ASTM, 1983).
Buffer M 9
Es una solución buffer no nutritiva empleada durante la transferencia o inoculación
de P. redivivus a medios de cultivo masivo o de aislamiento y producción de J2 .
Provee solo condiciones estándar del ambiente de vida adecuado para los
nemátodos, se compone de :
322
1
2
3
4
5
Compuesto
Fórmula
Masa en gramos (g)
o Volumen (mL) de
solución stock
Fosfato de sodio dibásico
Fosfato de potasio monobásico
Cloruro de sodio
Agua Destilada (tipo II, ASTM
1983)
Autoclavear la anterior mezcla y
después agregar :
Sulfato de magnesio solución
1M (12.034 g/100mL)
Na2HPO4 •7H2O
KH2PO4
Na Cl
H2O
6.00
3.00
5.00
1000
Mg SO4
1 .00
Mezclar los reactivos señalados uno a uno en el orden señalado, disolver y
autoclavear a 121°C durante 15 minutos . El buffer M-9 es un líquido no nutritivo
usado para lavar animales limitando su crecimiento y dando un medio ambiente
estándar. En el caso que se observara precipitación de las sales después de
autoclavear se puede esterilizar el medio por filtración utilizando una membrana de
0.22 μ.
Solución de colesterol
P. redivivus requiere esteroles para lograr su maduración, esta solución proveerá
la cantidad necesaria para todos los medios relacionados con su crecimiento.
La solución se prepara mezclando 1g de colesterol en 10 ml de etanol. Se debe
calentar suavemente, mezclando hasta que el colesterol se disuelva. Esta solución
provee los esteroides requeridos en el medio de crecimiento.
Medio Harina – agua para cultivo masivo
Se emplea para mantener los cultivos en stock
Su elaboración consiste en mezclar 100 g de harina, preferentemente de trigo, de
producción orgánica y poco refinada, en 100 mL de agua desitiada. L mezcla se
vacía en un frasco de boca ancha evitando ensuciar sus paredes y se cubre con un
plato de caja de Petri . Esta mezcla se autoclavea a 121 °C por 15 minutos.
323
Fig. 2 Cultivo masivo de Panagrellus redivivus
Medio Agar - Agua
Medio útil para mantener los cultivos stock para la reproducción de hembras
grávidas y posterior obtención de organismos en estadio J2 .
En 1000 ml de agua destilada mezclar 17 g de Agar bacteriológico (Oxoid No.3 o
Bioxon). Una vez disuelto el agar, autoclavear la mezcla por 15 minutos a 121°C.
Después, agregar 0.5 ml de la solución de colesterol al agar caliente agitándolo para
evaporar el etanol. Dejar entibiar y vaciar aproximadamente 20 ml de en cajas de
Petri de 100 mm. Las placas pueden mantenerse en refrigeración hasta su
inoculación con nematodos.
Después de enfriar y solidificar las placas se almacenan en un refrigerador.
Figura. 2 . Medio Agar-agua. Para reproducción
posterior aislamiento de J2
de hembras grávidas y
324
Suspensión de levadura
Disolver 50 mg de levadura en 100mL de agua destilada, distribuir 4 mL en una
serie de viales o tubos de 7 mL y autoclavear durante 15 min a 121° C. Esta
suspensión es usada como una fuente de comida para cultivos en crecimiento.
Medio de crecimiento M9Y
Es un medio limitado en nutrientes que se emplea como medio de dilución durante la
preparación del sistema de prueba.
Se elabora mezclando 99 mL de buffer M 9 y 1 mL de suspensión de levadura. La
solución se autoclavea por 15 minutos a 121°C. Posteriormente y antes de que se
enfríe, agregar 0.05 mL de la solución de colesterol y agitar el agar para evaporar el
etanol de dicha solución.
Todas las soluciones y medios descritos pueden conservarse en refrigeración, a
4 ± 2 °C hasta por dos meses.
2.4. MATERIALES Y EQUIPOS
Materiales
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Pipetas sexológicas de vidrio graduadas (1 y 10mL)
Pipeta automática de 100µL con puntas estériles
Pipeta automática de 100-1000 µL con puntas estériles
Pipeta automática para tubo capilar de 25µL ( ej. Drummond serie 200
dialamatic)
Pipetas Pasteur
Puntas Geloader para pipeta Eppendorf
Viales de vidrio borosilicato de 2.5 ml de fondo plano
Bases para viales de 2.5 mL, pueden emplearse microplacas de 16 pozos sin
tapa para tal fin.
Recipientes para preparación de diluciones, pueden emplearse tubos de cultivo
de 20 mL.
Aro de soporte para mini tamiz y malla de nylon poliamida de 12 µm
Aro de soporte para mini tamiz de 2 a 2.36 mm de maya (8 mallas ) para
separación de material sólido (sedimento o suelos) en la lectura de pruebas
6 Cajas de petri de vidrio de 100 mm
6 Cajas de petri de vidrio de 35 x 10 mm
Pipetas volumétricas de vidrio, clase A de 1 a 100 mL
Matraces volumétricos de vidrio , clase A o de 10 a 1000 mL
2 Frascos de vidrio de 1L de boca ancha
325
•
•
•
•
•
•
4 Botellas de dilución de 250 mL
1 Matraz Erlen Meyer de 1L autoclaveable
Gasa y algodón
Bulbos para pipetas
Pincel de pelo natural con mango de madera (autoclaveable)
Tubos de centrífuga de 50 ml de vidrio con tapa.
Equipos
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Microscopio estereoscópico con resolución de 10x/21
Retícula para lente ocular de 100 x 1 mm2
Balanza Analítica capas de medir 0.001 g calibrada
Autoclave o similar
Sistema de filtración
Mechero o Campana de flujo laminar
Base de agitación o Vortex (opcional)
Controlador de temperatura ambienta o incubador (20 ± 2°C)
Centrífuga con capacidad de 700 Gs
326
Figura 3. Materiales y preparación de prueba. Separación de J2 y colocación en
viales con muestras para análisis.
2.5 . PROCEDIMIENTO PARA MANEJO DE CULTIVO
Cultivo masivo .
El cultivo de P. redivivus se mantiene en frascos con medio de harina- agua, el cual
se inocula con una pequeña población (varios cientos de individuos en buffer M-9
utilizando una pipeta Pasteur, después de algunos días los enjambres de nematodos
pueden ser observados en las paredes del frasco . Poblaciones muy grandes
pueden ser mantenidas por varios días en este cultivo pero deberán ser preparados
nuevos cultivos por lo menos una vez al mes.
Cuando se tienen programadas una serie de pruebas es conveniente preparar una
semana antes , el medio de cultivo A en cajas de Petri las cuales se inoculan con el
nematodo de la forma mencionada , éstos organismos al reproducirse empezarán a
hacerse visibles en la tapa de la caja de Petri de donde pueden lavarse con buffer M9 para obtener las hembras sin arrastrar restos de harina que interfieran en la prueba
.
Cultivos para pruebas de toxicidad.
La prueba se inicia con organismos en estado de desarrollo J3 por lo que un día
antes de cada prueba se separan hembras y se inoculan en placas de cultivo con
medio agar-agua (P. redivivus) que contiene también colesterol, para tener un
adecuado suplemento de animales J3 en un estado fisiológico similar.
Los nematodos de un cultivo stock en caja de Petri son inundados con buffer M-9 y
son pasados a través de un tamíz , en la maya de éste quedarán los organismos de
327
mayor tamaño los cuáles serán recuperados mediante un enjuague con buffer M-9
sobre una placa fresca de agar a una profundidad no mayor de 2-4 mm de buffer .
Dentro de éstos adultos separados habrá muchas hembras grávidas, estas hembras
producirán de 10 a 20 organismos J2 en un período de 12 hrs .
Al día siguiente se tamizan nuevamente los organismos y se lavan con medio M-9 ,
pero ahora los organismos que se utilizarán serán los que pasan por el tamiz , ésta
progenie definida en estado J3 será usada en el bioensayo.
Se recomienda lavar perfectamente a las hembras y a los J3 con buffer M-9 (P.R) o
medio K (C .E), a temperatura ambiente para remover los residuos de harina que
pudieran tener.
2.6 PROCEDIMIENTO PARA DESARROLLO DE LA PRUEBA (ver figura 3)
2.6.1 Preparativos
2.6.1.1 Muestras líquidas
Preparación de diluciones (ej : agua, extractos orgánicos y elutriados)
Para bioensayos se preparan alícuotas de 10 ml. de material de prueba diluidas en
M9-Y, con este fin pueden ser empleadas los siguiente principios de preparación
Muestras acuosas ( la concentración mas alta podrá ser de solo el 10%)
1.0 ml de muestra + 9.0 ml. de M9-Y
Extracto orgánico metanol (contenido máximo 3 % )
0.3 ml. de extracto orgánico de la muestra en 9.7 ml. de M9-Y
Extracto orgánico DMSO ( contenido máximo 1% )
0.1 ml. de extacto orgánico de la muestra + 9.9 ml. de M9-Y
Para cada serie de pruebas se debe preparar un serie del blanco l de procedimiento
para cada medio empelado en la preparación de muestras ( ej. agua, metanol,
DMSO ) en M9-Y a la misma concentración empleada en el montaje de las muestras
por evaluar y un control con solo M9-Y.
328
2.6.2 Montaje del sistema de prueba
2.6.2.1 Muestras líquidas
Bajo el microscopio y con la ayuda de una micropipeta Drummond con capilar y
punta ( Eppenor geloader tips ) se toman 10 nematodos J2 y se colocan en cada
1
Mezcla 1:1 de harina se prepara cada 4-6
Stock
Cultivo Masivo de
Placas harina -
3
Sol. amortiguadora
2
2-3 semanas más
observan los
formando una red en la
de la caja de
Se inician cultivos cada semana
en el centro de la caja de Petri con
agua de 3-4 ml de nematodos en
con M-9Y para tener un
constante de nemátodos
4
Lavar los nematodos de la tapa
caja de Petri con buffer M-9
tamíz con malla de
5
Sol. amortiguadora
Los adultos que quedan en el tamíz
muchas hembras grávidas, éstas se
buffer M-9. para transferirlas a una
agar-agua con buffer M-9 a una
mayor de 2 mm. y se incuban
6
Adul
Después de 12 hrs. se
mezcla de adultos y J2
el tamíz para separar los
adultos que quedan en el
pueden usarse para iniciar
cultiv
J2 en
7
Con la ayuda del
estereoscópico se selecciónan
8
10 J2 juveniles en cada
Cuadrícula de 100 x
2
1
Registro de No. de
longitud de los
Adultos 750Despúes de 96 hs.
vasos se abren y
nematodos se
microscó
Se preparan 10 vasos
cada control y cada
J4 550J3 350-
Muest
Si es necesario,
solvente en
Cont
(J2 en M9
329
Figura 3. Procedimiento para el desarrollo de pruebas
recipiente de análisis que para el caso de muestras líquidas pueden ser recipientes
de fondo plano de 2.5 ml para después agregar 0.5 ml de la muestra diluida a cada
vaso, en caso de análisis de sedimentos se sugieren cilindros de polipropileno de
palcas de 2.9 a 35 mm de base, fondo plano y un altura de 1-2.6 cm .
Se hacen 10 réplicas para dilución de la muestra a probar así como para los
controles y blancos mencionados, es muy importante que la gota en que se tomen a
los diez nematodos sea lo más pequeña posible a fin de que la dilución de la
muestra problema sea lo mínimo posible.
Los animales se dejan crecer en los vasos bien tapados durante 96 h. con control de
temperatura a 20 ± 2 ° C .
Después de 96 h, los recipientes se abren y se registra el número de sobrevivientes
en cada vaso. Los vasos se tapan y se colocan en agua caliente a 60°C por unos
minutos, el calor mata a los nemátodos y provoca su estiramiento para una mejor
apreciación de su tamaño, posteriormente se tiñen con una gota de rosa de bengala
(0.5 g/L) referentemente, aunque también pueden emplearse otros colorantes como
azul-algodón-lactofenol ó azul de metileno.
La longitud debe determinarse de forma inmediata midiendo a través de un
microscopio con reglilla ocular, se recomienda hacer la medición a un aumento de
1.6X . De esta manera se registra el número de animales en cada estadio de
acuerdo al siguiente rango.
Tabla 1. Longitud corporal de nematodos en las distintas etapas de desarrollo
Etapas
J2
J3
J4
Adulto
Talla
250 a 350 μm
350 a 550 μm
550 a 750 μm
750 a 2000 μm
2.7. ANÁLISIS DE DATOS
Los efectos sobre la sobrevivencia, el crecimiento y la maduración de la población
expuesta a muestras problema son expresados como porcentajes en relación a los
valores obtenidos para estos mismos parámetros en la población del control.
330
2.7.1 Sobrevivencia: Es el porcentaje de sobrevivientes en la población expuesta a
una muestra que se sospecha tóxica, en relación a los sobrevivientes de la
población control, este parámetro se estima a partir de :
Sobrevivencia =
100 x
ST
SC
donde ST es sobrevivientes de la prueba
SC es sobrevivientes del control
Para determinar si la diferencia de la sobrevivencia observada para la muestra
problema es significativamente distinta respecto a la del control se calcula el valor
de x2 de la siguiente forma :
x² =
( ST - SC) ²
SC
Si x² es mayor a 5 indica que la letalidad es significativa.
2.7.2 Crecimiento. El segundo parámetro empleado es la inhibición del crecimiento,
término que se aplica cuando un número significativo de animales en la prueba no
alcanza el estadio J4 o el estado adulto. Su calculo se obtiene a partir de la
siguiente expresión :
Crecimiento =
donde
100 x
( J4T + AT ) / ST
( J4C + AC ) / SC
J4T y AT = J4 y adultos en la población prueba.
J4C y AC = J4 y adultos en la población control.
La determinación de la significancia de este parámetro respecto al los resultados
observados para la población control se calculan también a través del análisis por x²..
de modo que sea posible establecer la significancia de la inhibición o determinar
estimulación del crecimiento
x²=
( ( J4T + AT ) - ( J4C + AC ) ) ²
( J4C + AC )
2.7.3 Maduración. La maduración, resulta de un desarrollo normal hasta el estadio
de J4, sin embargo los nematodos no logran la maduración gonádica que les permite
convertirse en adultos y avanzar con su reproducción
331
La evolución del estadio J4 a adulto requiere de la acción de esteroides y de la
actividad genética. La inhibición específica de ésta muda sugiere la acción de
agentes genotóxicos.
Para el cálculo de este parámetro se emplea la siguiente expresión:
Maduración = 100 x ( AT ) / ( J4T + AT)
( AC ) / ( J4C + AC)
La significancia estadística de las diferencias entre al maduración ene le control y la
muestra problema se calcula por x². a paritr de :
x²= ( AT - AC )²
AC
Si x² es mayor a 5 indica un efecto significativo en la maduración.
2.7.4 Estado general de salud
Es una valor sumario que relaciona los diversos parámetros y pone gran énfasis
en la comparación del crecimiento y de la maduración. Para ello, se da a los
diferentes parámetros un valor de peso ponderado que para la sobrevivencia es de
4, para el crecimiento de 2 y para la maduración de 1.
Para su cálculo se emplea la notación siguiente
Estado General de Salud = = 100 x ( 4 x ST ) + ( 2 x GT ) + MT
7
Donde ST , Gt y Mt representan las sobrevivencia , el crecimiento y la maduración .
2.7.7 Consideraciones para la aceptación de resultados
Los resultados de la prueba deben ser ignorados y la prueba repetida si alguno de
los siguientes puntos es observado :
a) Si menos que el 90 % de la población control alcanza el estado adulto.
332
b) Si más del 10 % de la población control muere.
c) Si hay crecimiento microbiano excesivo en el sistema de prueba.
control)] x 100
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334
Prueba de citotoxicidad aguda con celomocitos de lombriz de
tierra (Eisenia foetida).
Autor: Raúl Uribe
Introducción
La contaminación del suelo tiene un marcado efecto adverso sobre las
comunidades de invertebrados de suelo como son las lombrices de tierra,
nematodos, otros poliquetos y microartropodos. En particular la lombriz de tierra
ha sido utilizada en estudios en donde se evalúa la sobrevivencia, crecimiento y
reproducción.
Los organismos vivos integran el efecto tóxico por la exposición a diferentes
xenobioticos o contaminantes ya que repoden de manera integral, en sus
diferentes niveles de organización (subcelular, celular, tejidos, órganos y
sistemas), al efecto adverso de compuestos químicos o mezclas de ellos. Los
bioensayos proveen una medida más directa de la toxicidad ambiental relevante
en los sitios contaminados que los análisis químicos, ya que se integra la repuesta
de los factores ambientales y de los contaminantes
Método
Citotoxicidad Rojo Neutro-50 (Babich y Borenfreund, 1992)
Fundamento
Este ensayo se basa en la asimilación y retención del colorante la matriz lisosomal
de las células vivas después de la incubación con agentes tóxicos.
335
Materiales y Reactivos
Benzo (a) pireno
Ácido acético
Rojo neutro 50 µg/ml en sol. amortiguadora de fosfatos
Azul de tripan al 0.2%
Dimetil-sulfoxido (DMSO)
Etanol absoluto
Formol al 40 %
Cloruro de calcio
Medio RPMI-1640
Cajas Petri de 100 mm
Frascos de vidrio con tapon de rosca de 100 ml
Jeringa desechable de 10 ml
Matraz Erlenmeyer de 100 y 250 ml
Matraz Erlenmeyer con tapon de rosca de 50 y 125 ml
Micropipetas de 50,500 y 1000 μl
Pipetas graduadas de 1,5 y 10 ml
Pipetas Pasteur
Probetas de 50 y 100 ml
Tubos con tapón de rosca de 120 mm
Tubos de centrifuga de 15 ml con tapón de rosca
Tubos de ensaye de 13x100 mm
Vasos de precipitados de 50 y 100 ml
Material biológico
Celomocitos obtenidos de organismos adultos de la lombriz de tierra
Eisenia foetida con clitelo en la parte anterior del cuerpo, con peso entre
300 y 600 mg
336
Instrumentos
Agitador vortex.
Balanza analítica
Cámara de Neubauer
Campana de flujo laminar
Centrifuga
Espectrofotómetro uv-visible
Incubadora hasta 60°C
Microscopio de contraste de fases
Balanza analítica
Campana de extracción
Procedimiento
Obtención de los celomocitos
1.- Se lava cada individuo en una sol. de NaCl al 4 % y se coloca sobre papel filtro
humedecido con la misma solución.
2.- Se aplica masaje suavemente en los últimos segmentos de la región posterior
del cuerpo.
3.- Se colocó cada individuo en una caja petri sobre un trozo de hielo, durante 2
min.
4.- Se practico una incisión superficial a nivel de la región abdominal, posterior al
segmento donde se donde se encuentra el clitelo.
5.- El fluido celomico se extrajo por medio de un pipeta Pasteur y se colocó en
337
tubos de vidrio con 5 ml de sol. LBSS.
6.- Se lavo con sol. LBSS, centrifugando a 2000 rpm durante 10 min. a 4 º C
7.- El botón celular se resuspendió en 1ml ajustando a 106 células/ml
Viabilidad celular
1.-Se mezclaron 0.1 ml de la suspensión celular con 0.1 ml de azul de tripan al
0.08 % en un tubo de ensayo y se agitaron.
2.-Se dejaron reposar durante 3 min, colocar 20 μl en la cámara de Newbauer con
un cubre objetos sobrepuesto.
3.-Después se contó el número de células teñidas de azul en el cuadrante del
centro y en los cuatro de las orillas.
4.- El número de células por ml es calculado multiplicando el promedio de los
cuadrantes por el factor de dilución y por el volumen de la cámara 104. La
viabilidad se calculó dividiendo el numero de células viables entre el total y
multiplicado por 100.
Viabilidad Celular =(No. de células no teñidas / No. de células totales) x 100 =
Prueba de citotoxicidad con rojo neutro
1. Las pruebas preliminares o de tamiz, se realizan con el extracto del suelo
contaminado a una concentración al 100%.
2. El extracto de diclorometano se concentra a sequedad y es disuelto en 1 ml de
de DMSO y se preparan las diluciones en un volumen de 2.5 µl de DMSO.
338
3. Se coloca un testigo agregando del extracto de diclrometano. Y un control
negativo en el que se adiciona medio RPMI-1640.
4. Se adicionan cada una de las disoluciones preparadas del extracto
original en un intervalo de concentraciones amplio (en serie logarítmica),
agitando suavemente.
5. En la campana de flujo laminar, utilizando tubos de ensayo, se adicionan 50
μl de la suspensión celular en cada uno de los tubos, se agregaron 2 ml del
medio de cultivo RPMI 1640. Se incuban a 22 °C por 24 hrs en una
atmósfera de CO2 al 5%.
6. Son reemplazadas con medio de cultivo con diferentes diluciones del tóxico a
un volumen final de 2 ml se incuban a 22 °C por 24 hrs en una atmósfera de
CO2 al 5%.
7. Se elimina el agente tóxico por centrifugación a 2500 rpm 5 min,
se resuspenden las células en una solución amortiguadora de fosfatos y se
vuelve a centrifugar.
8. Se resuspendieron en 2 ml de una solución del colorante Rojo Neutro (50
µg/ml) cada uno de los tubos.
9. Posteriormente fueron incubados 3 hrs en las mismas condiciones anteriores.
Se eliminó el colorante por centrifugación a 2500 rpm durante 5 min y se
resuspende el cultivo rápidamente, en una solución de amortiguadora de
fosfatos.
10. Se agregaron 1.3 ml de una solución de ácido acético (1%)-etanol al 50% a
cada tubo y se dejó a temperatura ambiente por 15 minutos.
339
11. En el sobrenadante se hace la lectura de absorbancia en un
Espectrofotómetro de luz visible a 540 nm. El porcentaje de viabilidad se c
calculó con las a absorbancia obtenida, tomando como referencia al testigo con
100 % de viabilidad y calcular la RN50 o CL50 , efectuando una regresión lineal
entre las concentraciones y los porcentajes de viabilidad transformados a
logaritmo.
12. Posteriormente se realizaron las pruebas definitivas utilizando un intervalo de
concentraciones más reducido (en serie geométrica), seleccionando aquellos
tratamientos en los que se observo efecto adverso, para insertar entre alguno
de ellos, este nuevo intervalo de concentraciones
(ejemplo:100,50,25,12.5,6.25,3.125 %).
13. Se elaboró la curva dosis-respuesta de las diferentes concentraciones en un
intervalo reducido y se calcularon los valores de CL50, por medio del método
de regresión logarítmica .
Calculo de la CL50
Se utiliza el metódo Probit, también conocido como método de unidades
probabilísticas, que es utilizado para evaluar la relación de dosis-respuesta de un
contaminante sobre un organismo, medida en términos de la concentración letal
media (CL50) y su precisión o intervalo de confianza. Asignando el valor Probit de
tablas respecto del porcentaje de mortalidad obtenido para cada concentración.
Después efectuar el análisis de regresión lineal mediante el método mínimos
cuadrados y utilizando los valores obtenidos de la ecuación de la recta, calcular la
CL50, considerando el valor de la “y” a la mitad del numero de individuos utilizados
en cada lote o tratamiento. Y finalmente calcular el intervalo de confianza al 95 %
por medio de la desviación estándar y el valore de tablas del estadístico de “t” de
student.
340
Interpretación de resultados
El resultado es un valor virtual obtenido estadísticamente, en términos de
concentración, ya sea en mg/kg de suelo o de µg de algún compuesto HAP/kg de
suelo, en base seca, este valor se relaciona de forma inversa con el potencial de
toxicidad, es decir una
sustancia es mas tóxica si requiere de una menor
concentración para producir la letalidad o algún otro daño subletal. Para tal efecto
se ha establecido una clasificación para asignar categorías de toxicidad en función
de la concentración:
Extremadamente tóxico
<1 mg/kg
Altamente tóxico
1 a 50 mg/kg
Moderadamente tóxico
50 a 500 mg/kg
Ligeramente tóxico
0.5 a 5 g/kg
Prácticamente atóxico
5-15 g/kg
Relativamente inocuo
mas de 15 g/kg
Tomado de Loomis, 1978
Este valor es de importancia relativa, es decir se utiliza de forma comparativa con
los valores obtenidos de otras sustancias o mezclas y no se maneja como una
constante biológica, ya que de acuerdo a las condiciones de la muestra es el valor
que se obtiene de toxicidad.
341
Referencias
-
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-
OECD. 1984. Guideline for Testing of Chemicals. Eartworm acute toxicity test.
207, April.
342
Prueba de Germinación de semillas
Autor: Raúl Uribe
Introducción
La contaminación del suelo por hidrocarburos del petróleo tiene un fuerte efecto
adverso sobre las comunidades vegetales. Los hidrocarburos de bajo punto de
ebullición del petróleo exhiben alto grado de toxicidad de contacto en las porciones
frágiles o jóvenes de raíces y brotes después del derrame, sin embargo tienen
poco efecto sobre las partes leñosas de arbustos y de arboles.
Una de las etapas mas importantes del desarrollo de una planta es la germinación
de las semillas y la emergencia del primer cotiledón. En la germinación ocurren
cuatro procesos; a) la imbibición o toma física de agua, b) la formación de los
sistemas enzimáticos e inicia la síntesis de proteínas y de RNA, c) emergencia de
la radícula e d) iniciación del crecimiento.
Método
EPA-OPPTS 850.4200
Fundamento
Las pruebas de germinación son importantes para la evaluación de suelo debido a
que se observa el efecto que causa el tóxico en la promoción o inhibición del
surgimiento radicular en la semilla a diferentes concentraciones del tóxico, siendo
registrada la frecuencia del evento y cuando se registra el 50 % de la germinación
en el testigo se da por concluido la prueba.
La activación de la semilla es inhibida, ante la presencia de sustancias tóxicas,
afectando la germinación de la misma. La división celular de los meristemos
radiculares puede afectarse, retardando el proceso de mitosis o alterando el
343
proceso de alargamiento radicular, por lo que la fitotoxicidad de un compuesto
puede ser determinada a través de la medición de éste parámetro.
Materiales y Reactivos
•
Papel filtro Whatman de fibra de vidrio
•
Diclorometano grado HPLC (fco. c/4 litros)
•
Hipoclorito de sodio 5%
•
Agua destilada
•
Frascos de vidrio de 250 ml
•
Cajas petri de 210 mm
•
Papel Aluminio
•
Parafilm
•
Micropipetas (10-1000μl)
•
Pipetas serológicas de 1, 5 y 10 ml
•
Regla o Bernier
•
Probetas de 50 y 100 ml
Material biológico
Semillas certificadas de Allium cepa, Glycine max
Instrumentos
Cámara ambiental / Incubadora
Balanza analítica
Campana de extracción
Procedimiento
1. Las pruebas preliminares o de tamiz, se realizaron con el extracto del suelo
contaminado a una concentración al 100%.
344
2. Fueron seleccionadas y escarificadas las semillas con cloro al 5% durante 15
min, se enjuago con agua de la llave y al final con agua destilada.
3. Se colocaron discos de papel filtro Whatman de fibra de vidrio dentro de la
caja petri de 110 mm, proporcionales al diámetro de la caja (aprox. 9 cm).
4. Se adicionaron 2 ml de cada una de las disoluciones preparadas del extracto
original en un intervalo de concentraciones amplio (en serie logarítmica),
distribuyendo de forma homogénea sobre papel filtro.
5. Como testigo positivo se utilizó una caja agregando 2 ml de diclorometano o
del solvente utilizado para la extracción. Y como testigo negativo se adicionó
agua destilada.
6. Se dejó evaporar el disolvente, durante 10min, dentro de la campana de
extracción.
7. Se colocaron 10 semillas por cada caja, distribuyendo de tal forma que se
permitiera un adecuado crecimiento. Efectuando 3 réplicas por tratamiento.
8. Se incubaron las semillas dentro de una cámara ambiental controlada a
temperatura de 22 +2 ºC y en total oscuridad hasta que el 65% de las semillas
del testigo negativo hayan germinado.
9. Se registró el número de semillas germinadas, siguiendo el criterio de
germinación con radicula mayor de 5 mm.
10. Posteriormente se realizaron las pruebas definitivas utilizando un intervalo de
concentraciones más reducido (en serie geométrica), seleccionando aquellos
tratamientos en los que se observo efecto adverso, para insertar entre alguno
de
ellos,
este
nuevo
intervalo
de
concentraciones
(ejemplo:100,50,25,12.5,6.25,3.125 %).
11. Se elaboró la curva dosis-respuesta de las diferentes concentraciones en un
intervalo reducido y se calcularon los valores de CL50, por medio del método
Probit.
Calculo de la CL50
Se utiliza el metódo Probit, también conocido como método de unidades
probabilísticas, que es utilizado para evaluar la relación de dosis-respuesta de un
contaminante sobre un organismo, medida en términos de la concentración letal
345
media (CL50) y su precisión o intervalo de confianza. Asignando el valor Probit de
tablas respecto del porcentaje de mortalidad obtenido para cada concentración.
Después efectuar el análisis de regresión lineal mediante el método mínimos
cuadrados y utilizando los valores obtenidos de la ecuación de la recta, calcular la
CL50, considerando el valor de la “y” a la mitad del numero de individuos utilizados
en cada lote o tratamiento. Y finalmente calcular el intervalo de confianza al 95 %
por medio de la desviación estándar y el valore de tablas del estadístico de “t” de
student.
Interpretación de resultados
El resultado es un valor virtual obtenido estadísticamente, en términos de
concentración, ya sea en mg de HTP/kg de suelo o de µg de algún compuesto
HAP/kg de suelo, en base seca, este valor se relaciona de forma inversa con el
potencial de toxicidad, es decir una sustancia es mas tóxica si requiere de una
menor concentración para producir la letalidad o algún otro daño subletal. Para tal
efecto se ha establecido una clasificación para asignar categorías de toxicidad en
función de la concentración:
Extremadamente tóxico
<1 mg/kg
Altamente tóxico
1 a 50 mg/kg
Moderadamente tóxico
50 a 500 mg/kg
Ligeramente tóxico
0.5 a 5 g/kg
Prácticamente atóxico
5-15 g/kg
Relativamente inocuo
mas de 15 g/kg
Tomado de Loomis, 1978
Este valor es de importancia relativa, es decir se utiliza de forma comparativa con
los valores obtenidos de otras sustancias o mezclas y no se maneja como una
constante biológica, ya que de acuerdo a las condiciones de la muestra es el valor
que se obtiene de toxicidad.
346
Referencias
-
EPA 712-C-96-154 Abril 1996, OPPTS 850.4200.
-
Loomis TA, 1978. Fundamentos de Toxicología. Ed. Acribia, 1ª ed. Zaragoza
España. 274 pp.
-
OECD. 1984. Guideline for Testing of Chemicals. Terrestrial Plants, Growth
test. 208, April.
-
ISO. 1997. 11269 Soil Quality- Determination of the effects of Pollutants on Soil
Flora. Part 1. Method for the Measurement of Inhibition of Root Growth.
347
Nombre
Prueba de crecimiento de plantas terrestres y de alargamiento
radicular.
Introducción
La fitotoxicidad generalmente se refiere a la manifestación o aparición de una o
más respuestas adversas o desfavorables en las plantas, resultado de la
exposición (por una o varias vías) a una sustancia o mezcla de ellas (Kapustka
,1998).
La Fitotoxicidad de un xenobiótico, por tanto, es evaluada a través del análisis
cualitativo y cuantitativo
del efecto provocado en uno o más parámetros
fisiológicos que se consideran relevantes o representativos. En este sentido, es
común que las pruebas de fitotoxicidad estén orientadas a la valoración de: 1) la
mortalidad (toxicidad aguda), 2) el índice de germinación, 3) la elongación
radicular, 4 el crecimiento o producción de biomasa, 5)el contenido de clorofila y
6) la tasa fotosintética, principalmente.
Método
Combinación de los métodos OECD-208 y EPA-OPPTS 850.4200.
Fundamento
Comparado con los arboles y arbustos, las plantas herbáceas especialmente los
pastos tienen características de rápido crecimiento característica que las hace
excelentes organismos de prueba para la evaluación de los parámetros
biometricos mencionados y ser utilizados como puntos finales de respuesta tóxica.
En algunas plantas los hidrocarburos forman una película grasosa alrededor de la
raíz, lo que impide la entrada de agua provocando un estrés hídrico que afecta
algunas etapas de su crecimiento, vulnerables a las sustancias tóxicas. Con
348
efectos negativos en los parámetros biometricos ya mencionados (Ramanathan,
1996)
El conocer los efectos fitotóxicos que provoca un compuesto, permite valorar y
determinar los factores de riesgo asociados a su exposición así como el grado de
tolerancia o sensibilidad de la planta examinada, lo cual, en conjunto
puede
aportar mayor certeza, aunque no contundente, para vislumbrar el impacto
ambiental y, en un momento dado, poder también atribuirle a una especie el papel
de bioindicador ambiental para un xenobiótico o conjunto de ellos en particular.
Procedimiento
1. Se partió del intervalo de concentraciones obtenidas de la prueba de toxicidad
aguda (CL50), de germinación para aplicar concentraciones similares o
ligeramente por abajo de CL50.
2. Se seleccionaron y escarificar las semillas con cloro al 5% durante 15min, se
enjuagaron con agua de la llave 10 min y al final destilada.
3. Fueron colocados 10 g de material inerte (agrolita) en un frasco de vidrio de
250 ml y se humedeció con 30 ml de agua destilada, alcanzando
aproximadamente el 40 % de humedad.
4. Se adicionaron 2 ml de cada una de las disoluciones preparadas del extracto
original en un intervalo de concentraciones amplio (en serie logarítmica),
distribuyendo de forma homogénea sobre la agrolita en toda la base del frasco.
5. Como testigo positivo se utilizó un frasco agregando 2 ml de diclorometano o
del solvente utilizado para la extracción. Y como testigo negativo se adicionó agua
destilada.
6. Como testigo positivo se utilizó una caja agregando 2 ml de diclorometano o
del solvente utilizado para la extracción. Y como testigo negativo se adicionó agua
destilada.
7. Se colocaron 10 semillas por cada caja, distribuyendo de tal forma que se
permitiera un adecuado crecimiento. Efectuando 3 réplicas por tratamiento.
8. Se incubaron las semillas dentro de una cámara ambiental controlada a
temperatura de 22 +2 ºC y en total oscuridad hasta que el 65% de las semillas
del testigo negativo hayan germinado.
349
9. Posteriormente se les aplico iluminación con lámparas luz de día (30 μmolm-2/s1
) y con un fotoperíodo (16:8) luz/obscuridad.
10. Adicionar a las plantas diariamente 1ml de solución de agua destilada.
11. Se realizaron las observaciones diariamente de las plantas y se registraron
anomalías (decoloración, necrosis de hojas, etc.).
12. Después de 14 días a partir de la germinación se da por terminada la prueba y
se miden los parámetros de crecimiento: Biomasa, Longitud de tallo y raíz.
13. De ser necesario se realizan las pruebas definitivas en un intervalo de
concentraciones más reducido.
14. Se elaboró la curva dosis-respuesta de las diferentes concentraciones en un
intervalo reducido y se calcularon los valores de CE50 (Concentración efectiva
cincuenta), por medio del método Probit.
Calculo de la CE50
Se utiliza el metódo Probit, también conocido como método de unidades
probabilísticas, que es utilizado para evaluar la relación de dosis-respuesta de un
contaminante sobre un organismo, medida en términos de la concentración
efectiva cincuenta (CE50) y su precisión o intervalo de confianza. Asignando el
valor Probit de tablas respecto del porcentaje de mortalidad obtenido para cada
concentración. Después efectuar el análisis de regresión lineal mediante el método
mínimos cuadrados y utilizando los valores obtenidos de la ecuación de la recta,
calcular la CE50, considerando el valor de la “y” a
la mitad del numero de
individuos utilizados en cada lote o tratamiento. Y finalmente calcular el intervalo
de confianza al 95 % por medio de la desviación estándar y el valore de tablas del
estadístico de “t” de student.
350
Interpretación de resultados
Para la interpretación de resultados del EC50 se maneja en los mismos términos
que la CL50, es un valor virtual obtenido estadísticamente, en términos de
concentración, ya sea en mg de HTP/kg de suelo o de µg de algún compuesto
HAP/kg de suelo, en base seca, este valor se relaciona de forma inversa con el
potencial de toxicidad, es decir una sustancia es mas tóxica si requiere de una
menor concentración para producir la letalidad o algún otro daño subletal.
No se manejan valores de referencia por no ser una constante biológica y solo se
puede interpretar en términos de comparación. Siendo de gran valía en el contexto
de riesgo ambiental, la obtención de los percentiles del 1, 5 y10 %, que permiten
obtener niveles de efecto umbral, además con la pendiente de la recta, poder
estimar el margen de seguridad para el tóxico o contaminante en cuestión.
Reactivos y materiales.
•
Agrolita
•
Diclorometano (fco. c/4 litros)
•
Agua destilada
•
Frascos de vidrio de 250 ml.
•
Parafilm
•
Micropipetas (10-1000μL)
•
Regla u otro elemento de medición (vernier)
•
Material biológico:
Semillas certificadas de Allium cepa y Glycine max.
351
•
Instrumentos:
Cámara ambiental / Incubadora
Balanza semianálitica
Luxometro
Higrómetro
Timer
Referencia:
- EPA 712-C-96-154 Abril 1996, OPPTS 850.4200.
- OECD Guideline for Testing of Chemicals. Terrestrial Plants, Growth test. 208
Abril 1984.
-ISO 11269 Soil Quality- Determination of the effects of Pollutants on Soil Flora.
Part 1. Method for the Measurement of Inhibition of Root Growth.
352
Método Microfluctuación modificado para
determinar genotoxicidad en compuestos
químicos puros y muestras ambientales
Autor:
Ana María Sandoval Villasana
353
INDICE
1
OBJETIVO ..............................................................................................................355
2
CAMPO DE APLICACIÓN ......................................................................................355
3
DEFINICIONES ......................................................................................................355
4
FUNDAMENTO.......................................................................................................356
5
EQUIPO ..................................................................................................................357
6
REACTIVOS ...........................................................................................................357
7
MATERIAL ..............................................................................................................366
8
INTEREFERENCIAS ..............................................................................................368
9
PRECAUCIONES ...................................................................................................368
10
DESCRIPCIÓN DE LA PRUEBA ........................................................................369
11
PROCEDIMIENTO ..............................................................................................369
12
RESULTADOS ....................................................................................................376
13
RECOMENDACIONES .......................................................................................378
BIBLIOGRAFÍA.............................................................................................................378
354
1
OBJETIVO
Determinar la posible genotoxicidad y/o mutagenicidad de muestras ambientales
empleando una versión modificada de la prueba de microfluctuación de Ames
tradicional (Gee, et. al.,1998).
2
CAMPO DE APLICACIÓN
La prueba de microfluctuación de Ames tradicional Ames (Ames et. al., 1975) se
emplea en la evaluación de mutagenicidad y/o genotoxicidad de muestras
ambientales (agua, aire, lixiviados de residuos sólidos, extractos acuosos, etc)
asimismo en la detección y localización de fuentes potenciales de agentes
genotóxicos.
Este método tiene la ventaja de poder ser utilizado en muestras que presentan alta
viscosidad, siendo en estos casos, el uso de la técnica de pre-incubación (Maron
& Ames, 1983).
3
DEFINICIONES
Para los efectos de esta prueba son adoptadas las siguientes definiciones:
3.1 ADN
Ácido desoxirribonucleico.
3.2 Auxótrofico
Organismo mutante que presenta exigencias nutritivas más allá de las
presentadas por los organismos silvestres.
3.3 Operón
Conjunto de genes que controlan la biosíntesis de una proteína.
3.4 Mutación
Mecanismo biológico universal que promueve modificaciones genéticas en los
organismos. A nivel molecular, hay una alteración de la molécula de ADN,
resultando en la formación de proteínas alteradas o ausentes en el organismo que
sufre una mutación.
3.5 Mutación rfa
Mutación que causa modificaciones en la capa de lipopolisacaridos de la
membrana celular bacteriana, propiciando una mayor permeabilidad de la célula a
moléculas grandes.
3.6 Mutación uvrB
Mutación causada por la delección de los genes responsables por la reparación de
excisión, e igual impide a una bacteria reparar algunos tipos de daños causados al
ADN, tornándose más sensible a agentes mutagénicos. Por razones técnicas, una
delección del
gene uvrB se extendió hasta el gen de biotina y, consecuentemente, las cepas se
tornaron auxótroficas para biotina (bio-).
3.7 Plásmido pAQ1
Plásmido que contiene un gene para resistencia a tetraciclina y contiene una
mutación hisG428
3.8 Plásmido pKM101
Plásmido que contiene un gen para resistencia a ampicilina. Su presencia confiere
una bacteria con mayor sensibilidad a mutágenos.
3.9 Prototrofico
Organismo de tipo silvestre.
12.6 p.a.
Para análisis (o grado reactivo)
3.10 c.s.p.
Cantidad suficiente para
4
FUNDAMENTO
En este procedimiento se presenta una prueba alternativa a realizar
completamente en medio líquido empleando una versión modificada de la prueba
de microfluctuación de Ames tradicional, basada sobre puntos múltiples de
color/no color (Hubbart, 1984). El bioensayo esta basado en la prueba de
mutación génica reversa conocida como la prueba de Ames La prueba emplea
cepas mutantes de Salmonella typhimurium, la mutación en el operón de la
histidina codifica para la biosíntesis de la histidina. Cuando esta bacteria es
expuesta a agentes mutagénicos, bajo ciertas condiciones de mutación reversa
ocurre un cambio de auxótrofos aminoácido (histidina) a prototrofos. La prueba de
microfluctuación ofrece ventajas metabólicas debido a que la concentración del
material citosolico es constante (Gatehouse, 1990).
356
Las cepas de Salmonella typhimurium, fueron especialmente construidas, para
detectar productos químicos que causan mutaciones génicas por dislocamiento
del cuadro de lectura ("frameshift") o por sustitución de pares de bases del ADN.
Para la detección de substancias promutagénicas, se incluye el ensayo de fracción
microsomal de hígado de rata, un sistema de activación metabólica, que permite
una evaluación de metabolitos de la sustancia de prueba.
5
EQUIPO
5.1
Agitador tipo vortex
5.2
Autoclave
5.3
Balanza analítica
5.4
Balanza granataria
5.5
Campana de seguridad biológica (cámara de flujo laminar vertical).
5.6
Congelador
5.7
Espectrofotómetro para medir densidad óptica a 600 nm
5.8
Incubadora bacteriológica
5.9
Incubadora con agitación orbital.
5.10 Potenciómetro
5.11 Refrigerador
5.12 Ultracongelador
6
REACTIVOS
6.1 Para la preparación de medios de cultivo y las soluciones empleadas en esta
prueba, se requieren los siguientes reactivos
6.1.1
2-aminofluoreno
6.1.2
Acido cítrico (C6H8O7•H2O) p.a.
6.1.3
Ácido picrolónico
6.1.4
Agar
6.1.5
Ampicilina
6.1.6
Ácida de sodio (NaN3)
357
6.1.7
β–nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP)
6.1.8
D-biotina
6.1.9
Caldo nutritivo N° 2 (OXOID
6.1.10 Cloruro de magnesio (MgCl2•6H2O) p.a.
6.1.11 Cloruro de potasio (KCl) p.a.
6.1.12 Dimetilsulfoxido
6.1.13 D-glucosa
6.1.14 Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4)
6.1.15 Fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4)
6.1.16 Fosfato de potasio dibásico (K2HPO4) p.a.
6.1.17 Fosfato de sodio y amonio (NaNH4PO4•.4H20) p.a.
6.1.18 Fracción S9 – Homogeneizado de hígado de rata, inducido con Aroclor
1254, congelado, proveniente del Instituto de Investigaciones Biomédicas,.
UNAM – Ciudad Universitaria, México D.F.
6.1.19 Glucosa-6-fosfato
6.1.20 Hidróxido de sodio
6.1.21 L-histidina HCl
6.1.22 Púrpura de bromocresol
6.1.23 Sulfato de magnesio (MgSO4.•7H20) p.a.
6.2 Los reactivos deben ser grado p.a. o bacteriológicos y de procedencia idónea,
no deben presentar olor, color y consistencia alterada, deben estar libres de
elementos bacteriostáticos inespecíficos, por ejemplo, carbohidratos
inespecíficos
6.3 Preparación de Medios de cultivo
6.3.1 Agar nutritivo
Formula:
Nutrient Broth N° 2 (OXOID)
Agar
Agua destilada
pH final después de la esterilización: 7.0
2.5.0
1.5.0
g
100.0
g
mL
Forma de preparación:
Pesar los componentes y adicionar 100 mL de agua destilada fría, dejar en reposo
durante aproximadamente 15 minutos. Agitar hasta una completa
358
homogeneización de los ingredientes. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15
minutos. Después de esterilizar, estabilizar el medio a una temperatura de 50 °C.
Con todos los cuidados de asepsia, distribuir aproximadamente 24 mL en cajas
de Petri esterilizadas. Las cajas de Petri que contienen agar nutritivo son
almacenadas en refrigeración (4 ± 2 °C) durante un periodo de 14 días.
6.3.2 Caldo nutritivo Oxoid
Formula:
Nutrient Broth N°2 (OXOID)
Agua destilada
2.5 g
100.0 mL
Forma de preparación:
Pesar el caldo nutritivo y disolver en 100 mL de agua destilada fría. Distribuir
alícuotas de 5 mL en tubos de ensaye de 15 mm x 150 mm, con tapa de rosca.
Posteriormente esterilizar a 121 °C durante 15 minutos, almacenar en refrigeración
(4 ± 2 °C) durante un periodo de 30 días.
6.4
Soluciones
6.4.1 Solución de ampicilina 8 mg/mL
Formula:
Ampicilina
Hidróxido de sodio 0.02 N c.s.p
0.08 g
10.0 mL
Forma de preparación:
Una solución de ampicilina debe ser preparada como sigue:
a) Preparar una solución de hidróxido de sodio 0.02 N con la siguiente
composición:
Hidróxido de sodio (NaOH)
Agua destilada
0.08 g
100.0 mL
Para la preparación de esta solución, disolver el hidróxido de sodio en 100 mL de
agua destilada esterilizada fría.
b) Preparar la solución final disolviendo la ampicilina en 10 mL de solución de
hidróxido de sodio 0.02 N. Esterilizar por membrana de filtración (0.45 μm), en un
359
vial con tapa de rosca, previamente esterilizado y envuelto en papel de aluminio.
Los tubos que contienen una solución de ampicilina son almacenados en
refrigeración (4 ± 2 °C) durante un periodo de máximo de 30 días.
6.4.2 Solución Vogel Bonner/Histidina/Biotina
Formula:
Glucosa
Medio Vogel- Bonner “E” (10X)
Solución de histidina/biotina
100.0 mL
100.0 mL
5.0 mL
Esta solución se prepara como sigue:
a) Preparar la glucosa de la siguiente manera:
D-Glucosa
Agua destilada
10.0 g
100.0 mL
Pesar la glucosa y adicionar 100 mL de agua destilada fría. Agitar inmediatamente
hasta disolución completa. Esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 minutos.
c) Preparar el medio de Vogel-Bonner “E” (50X) con los siguientes componentes:
Sulfato de magnesio (MgSO4.•7H20) p.a.
Acido cítrico (C6H8O7•H2O) p.a.
Fosfato de potasio dibásico (K2HPO4) p.a.
Fosfato de sodio y amonio (NaNH4PO4•.4H20) p.a.
Agua destilada
10.0 g
100.0 g
500.0 g
175.0 g
1000.0 mL
Pesar las substancias mencionadas arriba en las cantidades especificadas y
disolver en 1000 mL de agua destilada fría. Distribuir en un frasco color ámbar y
mantener a temperatura ambiente
A partir de la solución preparada de Vogel-Bonner “E” (50X) tomar 10 mL y
adicionarlos a 90 mL de agua destilada, obteniéndose una solución de VogelBonner “E” (10X). Agitar inmediatamente hasta disolución completa. Esterilizar en
autoclave a 121 °C por 15 minutos.
d) Juntar asépticamente los medios de glucosa, Vogel-Bonner "E" (10X) y
adicionar asépticamente 5 mL de solución de histidina0.5%/biotina 5 mM (ver
6.4.3). Agitar suavemente y distribuir en frascos volúmenes de 20 mL son
almacenadas en refrigeración (2 a 8 °C) durante un periodo de 14 días.
360
6.4.3 Solución Vogel Bonner/Biotina
Formula:
Glucosa
Medio Vogel- Bonner “E” (10X)
Solución de biotina
100.0 mL
100.0 mL
5.0 mL
Se preparan los reactivos especificados y mezclan de acuerdo a lo especificado.
6.4.4 Solución de biotina
Formula:
D-biotina
Agua destilada
0.0138 g
100.0 mL
Forma de preparación:
Pesar la D-biotina y disolver en 100 mL de agua destilada caliente (temperatura de
ebullición). Distribuir volúmenes de 20 mL en frascos cubiertos con aluminio.
Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Los frascos son
almacenados en refrigeración (4 ± 2 °C) durante un periodo máximo de 45 días.
6.4.5 Solución de histidina/biotina
Formula:
L-histidina HCl
D-biotina
Agua destilada
0.0117 g
0.0138 g
100.0 mL
Forma de preparación:
Pesar los componentes y disolver en 100 mL de agua destilada caliente
(temperatura de ebullición). Distribuir volúmenes de 20 mL en frascos cubiertos
con aluminio. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Los frascos
son almacenados en refrigeración (4 ± 2 °C) durante un periodo de máximo de 45
días.
6.4.6 Solución de Púrpura de Bromocresol
Púrpura de bromocresol (5’-dibromo-o-cresolsulfonaphaleno)
Agua destilada
0.1 g
50 mL
Forma de preparación:
361
Pesar y disolver en 100 mL de agua destilada. Distribuir volúmenes de 5 mL.
Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Los frascos son
almacenados en refrigeración (4 ± 2 °C) durante un periodo máximo de 45 días.
6.4.7 Solución amortiguadora de fosfatos 0.2 M
Fórmula.
Solución amortiguadora A
81.0 mL
Solución amortiguadora B
19.0 mL
pH final: 7.4
Para la preparación de la solución, se procede como sigue.
a) Solución amortiguadora A.
Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4) p.a.
Agua destilada c.s.p.
2.84 g
100 mL
Disolver el fosfato de sodio dibásico en 100 mL de agua destilada fría. Esterilizar
en autoclave a 121 °C por 15 minutos
b) Solución amortiguadora B:
Fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4) p.a.
Agua destilada c.s.p.
2.76 g
100 mL
Disolver el fosfato de sodio monobásico en 100 mL de agua destilada fría.
Esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 minutos
c) Mantener a) y b) en refrigeración (4 ± 2 °C) durante un periodo máximo de 60
días.
d) Cuando se lleva a cabo el experimento juntar la solución stock A en la solución
stock B
6.4.8 Solución de cloruro de potasio 1.65 M
Formula:
Cloruro de potasio (KCl) p.a.
Agua destilada c.s.p.
20.5 g
100 mL
Forma de preparación
Disolver el cloruro de potasio en 100 mL de agua destilada. Esterilizar en
autoclave a 121 °C por 15 minutos, almacenar en refrigeración (4 ± 2 °C) durante
un periodo máximo de 60 días.
362
6.4.9 Solución de cloruro de magnesio 0.4 M
Formula:
Cloruro de magnesio (MgCl2•6H2O)
Agua destilada c.s.p.
8.14 g
100 mL
Forma de preparación
Disolver el cloruro de magnesio en 100 mL de agua destilada. Esterilizar en
autoclave a 121 °C por 15 minutos, almacenar en refrigeración (4 ± 2 °C) durante
un periodo máximo de 60 días.
6.4.10 Solución de glucosa-6-fosfato 1M
Formula:
Glucosa-6-fosfato
Agua destilada c.s.p.
0.282 g
1.0 mL
Forma de preparación:
Para la preparación de esta solución, disolver la glucosa-6-fosfato en 1 mL de
agua destilada esterilizada. Esterilizar por membrana filtrante (0.45 μm) en un vial
desechable previamente esterilizado. Los tubos con la solución son almacenados
en congelador (-20 ± 2°C) durante un período máximo de 60 días.
6.4.11 Solución de NADP 0.1 M
Formula:
β–nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP)
Agua destilada
0.03827 g
5.0
mL
Forma de preparación:
Para la preparación de esta solución, disolver el NADP en 5 mL de agua destilada
esterilizada. Esterilizar por membrana filtrante (0.45 μm) en un vial con tapa de
rosca previamente esterilizado. Esta solución debe prepararse el mismo día y el
volumen necesario que se va a requerir para el experimento.
6.4.12 Fracción S9
La fracción S9 – Homogeneizado de hígado de rata, inducido con Aroclor 1254,
congelado, proveniente del Instituto de Investigaciones Biomédicas,. UNAM –
Ciudad Universitaria, México D.F.
Es mantenido en viales congelados a –70 ± 2°C en ultracongelador o a –195 °C en
tanque de nitrógeno líquido durante tres años. Cuando este se va a requerir para
un experimento únicamente se descongela la cantidad de viales necesarios si
sobra volumen de esta fracción esta se desecha. Para emplearlo en la mezcla S9
este de ser esterilizado por membrana filtrante (0.45 μm) en un vial con tapa de
363
rosca previamente esterilizado. Esta solución debe prepararse el mismo día del
experimento
6.4.13 Mezcla S9 4%
La combinación de la fracción S9 y los cofactores se denomina mezcla S9 y en su
preparación se utiliza la siguiente formula:
Formula:
Agua destilada
Amortiguador de fosfatos 0.2 M
Glucosa 6-fosfato
Solución de NADP 0.1 M
Solución de cloruro de potasio 1.65 M
Solución de cloruro de magnesio 0.4 M
Fracción S9
375 μL
500 μL
5 μL
40 μL
20 μL
20 μL
40 μL
Forma de preparación:
Esta solución debe ser preparada en una campana de flujo laminar y todos los
componentes se deben mantener en baño de hielo. Adicionar los componentes
asépticamente en tubos con tapón de rosca o matraces según el volumen que se
vaya a preparar, tomando cuidado de que al adicionar los componentes en el
orden presentado arriba (S9 al último) y manteniendo la solución final en baño de
hielo o refrigerador a 4 ± 2°C hasta el momento de ser utilizado en la prueba.
Al mismo tiempo, se debe hacer el control de esterilidad de cada solución tomando
10 μL de cada solución con una micropipeta y distribuir el volumen sobre una
placa de agar nutritivo. Dejar que la gota se absorba en el agar Esta placa de
agar nutritivo debe estar marcada previamente en la parte del fondo de la caja,
con el nombre de cada una de las soluciones. Realizar por duplicado incubar en
forma invertida las placas durante 24 horas a 37 ± 2°C.
6.4.14 Solución de azida de sodio 1 mg/mL
Formula:
Azida de sodio (NaN3)
Agua destilada esterilizada
1.0 mg
1.0 mL
Forma de preparación:
Pesar 1 mg de azida de sodio, con mascarilla de protección respiratoria para pesar
tóxicos y con guantes quirúrgicos, colocarlo en viales desechables estériles.
Adicionar 1 mL de agua destilada esterilizada bajo condiciones asépticas.
Almacenar los viales, en el congelador a –20 ± 2° por tiempo indefinido
364
6.4.15 Solución de 2-aminofluoreno 1mg/mL
Formula:
2-aminofluoreno
Dimetilsulfoxido
1.0 mg
1.0 mL
Forma de preparación
Pesar 1 mg de 2-aminofluoreno, utilizando mascarilla de protección respiratoria
para tóxicos y con guantes quirúrgicos desechables, colocarlo en viales
desechables. Adicionar 1 mL de dimetilsulfoxido bajo condiciones asépticas.
Almacenar a –20 ± 2 °C por 18 meses. Las alícuotas de esta solución solo se
descongelaran el día de la prueba.
6.4.16 Solución de Ácido picrolónico
Formula:
Ácido picrolónico
Agua destilada esterilizada
1.0 mg
1.0 mL
Forma de preparación
Pesar 1 mg de ácido picrolónico, utilizando mascarilla de protección respiratoria
para tóxicos y con guantes quirúrgicos desechables, colocarlo en viales
desechables. Adicionar 1 mL de dimetilsulfoxido bajo condiciones asépticas.
Almacenar a –20 ± 2°C por 18 meses. Las alícuotas de esta solución solo se
descongelaran el día de la prueba.
6.4.17 Agua destilada
Agua destilada
pH 7.4
1000 mL
a) Distribuir, en frascos de dilución, cantidades adecuadas para que el volumen
final, después de la esterilización, sea de 100 mL ± 2 mL
b) Tapar los frascos sin apretar y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15
minutos
c) Una vez fríos, apretar las tapas y almacenar a temperatura ambiente o en
refrigeración a 4 ± 2 °C.
6.4.18 Preparación del medio de exposición con indicador
Mezclar Asépticamente estos componentes en un matraz estéril de 50 mL como
sigue:
Solución de Solución Vogel-Bonner/Biotina (7.5 mL) + Solución de Púrpura de
Bromocresol (12.5 µL)
365
NOTA: Para todas los medios de cultivo y soluciones se debe realizar una prueba
de esterilidad de la siguiente manera: Después de ser preparadas, y antes de ser
usadas, cualquier solución, y medios de cultivo, deben probarse de manera
rutinaria en cuanto a la presencia de hongos/y o bacterias. La prueba consiste en
que inmediatamente que fueron esterilizados. Se dejan estabilizar hasta
temperatura ambiente. Posteriormente son incubados a 37 ± 2 °C durante 24 a 48
horas. Constituye una evidencia de la presencia de
microorganismos cualquier turbidez en el caso de medios de cultivo líquidos o
semisólidos así como en soluciones. Para el caso de medios sólidos hay
contaminación cuando hay crecimiento de colonias en el agar. Si ocurre esto
desechar y volver a preparar nuevamente material. Una contaminación puede
ocurrir debido a fallas en el proceso de esterilización o contaminación después de
la esterilización.
7
MATERIAL
7.1 Biológico
Las cepas de Salmonella typhimurium TA98 y TA100 proceden del laboratorio del
Dr. B.N. Ames (University of California, Berkeley, CA).
7.2
Cristalería
7.2.1 Matraces Erlenmeyers
De borosilicato (pyrex) o de vidrio neutro, con tapa de rosca, no tóxica
7.2.2 Matraces para la preparación de medios de cultivo
De borosilicato (pyrex) o de vidrio neutro, con capacidad de un litro.
7.2.3 Frascos para soluciones
De borosilicato (pyrex) o de vidrio neutro, con tapa de rosca, no tóxica.
7.2.4 Pipetas
Pipetas bacteriológicas, de 1 mL, 5 mL y 10 mL con graduación de 1/10.
7.2.5 Tubos de ensaye
De borosilicato (pyrex) o de vidrio neutro, de medidas aproximadas de 13 x
100 mm y 15 x 150 mm, con tapón de rosca de material no tóxico.
7.3
Otros materiales
366
7.3.1 Asas de inoculación
Con una longitud de 7 a 8 cm de diámetro de 0.5 mm.
7.3.2 Tubos criogénicos
De polipropileno autoclaveables, con tapas apropiadas para congelar de –70
°C (ultracongelador) o –195 °C (nitrógeno líquido) para volúmenes máximos
de 2 mL.
7.3.3 Mechero de Bunsen
7.3.4 Gradillas
7.3.5 Filtros para esterilización
Del tipo swinnex, de polipropileno con diámetro de 13 mm o del tipo unidades
de filtración, con diámetro de 47 mm.
7.3.6 Cinta indicadora de esterilidad
7.3.7 Lámpara germicida (UV) de 15 W.
7.3.8 Guantes quirúrgicos
7.3.9 Membranas de filtración estériles
De acetato de celulosa, con poros de 0.45 µm y 0.22 µm
7.3.10 Microplacas de 24 pozos con capacidad para 3 mL por pozo, esterilizadas
por radiación gamma.
7.3.11 Microplacas de 384 pozos con capacidad para 240 µL por pozo,
esterilizadas por radiación gamma.
7.3.12 Micropipetas con capacidad para medir volúmenes de 10 a 100 µL, 100 a
1000 µL.
7.3.13 Papel filtro
7.3.14 Parafilm
7.3.15 Pipeteador
367
7.3.16 Pinzas
7.3.17 Porta-pipetas de acero inoxidable
7.3.18 Jeringas desechables 3, 5 mL
La prueba debe de realizarse lo más rápido posible y las muestra deberá ser
siempre mantenida en refrigeración (4 ± 2°C) hasta el momento de realizarla. El
recipiente debe llenarse completamente para evitar la pérdida de volátiles.
8
INTEREFERENCIAS
Verificar el pH de la muestra. En caso de que se presenten valores menores a 5.0
o mayores de 8.0, ajustar el pH a 7.0 antes de proceder a la filtración de la
muestra.
Presencia de sólidos suspendidos y microorganismos por lo que se debe proceder
a la filtración de la muestra en membranas de acetato de celulosa de 0.45 μm,
para obtener la esterilidad de la muestra. En el caso en que las muestras
presenten mucho material particulado, es recomendable una pre-filtración con prefiltro.
Verificar la esterilidad de la muestra en placas de agar nutritivo, inoculando 200 μL
e incubándolas por 24 horas a 37 ± 2 °C. En caso de que la muestra presente
contaminación, repetir el proceso de filtración.
9
PRECAUCIONES
Entre las personas que trabajan en el laboratorio, aquellas que tienen menor
tiempo de entrenamiento y las que están más directamente asociadas a las
maniobras con el material contaminado, son aquellas que presentan mayores
posibilidades de ser contaminadas accidentalmente. Una inhalación de los
aerosoles, una aspiración de las soluciones contaminadas a través de pipetas y
otros accidentes deben prevenirse por el uso de protectores faciales adecuados,
pipeteadores y por la obediencia a las normas especificas relativas al trabajo y al
uso del equipo.
368
Protector facial y máscaras de protección contra gases y tóxicos. De utilización
obligatoria (en forma conjunta con los guantes adecuados) durante la preparación
de soluciones de ácidos que son utilizados en el lavado de materiales, la forma de
preparación de soluciones de compuestos mutagénicos y la manipulación de
solventes.
10.1
Cuidados en la manipulación de cepas Salmonella typhimurium
Salmonella typhimurium puede causar diarreas e intoxicación alimenticia cuando
es ingerida. La baja virulencia presentada por estas cepas es debida a la
presencia de mutación rfa.
Como precaución rutinaria, se debe autoclavear cualquier material contaminado,
antes de lavar o desechar. No se debe mantener ningún tipo de alimento en el
interior de los refrigeradores, o donde se encuentran las cepas almacenadas,
10 DESCRIPCIÓN DE LA PRUEBA
Aproximadamente 107 bacterias de his- son expuestas a cuatro concentraciones
de la sustancia de prueba, además de incluir controles positivos y negativos, por
90 minutos en medio conteniendo suficiente histidina para mantener dos divisiones
celulares. Después de 90 minutos, los cultivos de exposición son diluidos en un
medio con indicador de pH, y distribuido en 48 pozos por concentración. En 48
horas, la células sufren una reversión a
His. El número de pozos conteniendo células revertantes son contadas para cada
dosis y comparadas con el control de dosis cero.
Un incremento en el número de revertantes en la exposición de la sustancia de
prueba relacionado al control de dosis cero indica que la sustancia de prueba es
mutagénica en la prueba de Ames_microfluctuación.
11 PROCEDIMIENTO
11.1 Preparación de los inóculos de Salmonella typhimurium empleados en la
prueba
11.1.1 Sembrar con la ayuda de un asa de inoculación calibrada, una pequeña
cantidad del crecimiento del cultivo de la placa “maestra” en tres tubos que
contienen 5 mL de caldo nutritivo estéril y previamente marcados con TA98,
TA100 y blanco negativo.
11.1.2 Adicionar 10 μL de ampicilina (8 mg/mL) a los tres cultivos de prueba
369
11.1.3 Incubar a 37 ± 2 °C durante 16 a 18 horas, con agitación (150 a 170 rpm).
11.1.4 Una vez transcurrido el tiempo del tubo marcado como blanco tomar 1000
μL y colocar en la cubeta para espectrofotómetro.
11.1.5 De cada uno de los tubos marcados con las cepas TA98 diluir el cultivo de
una noche 1:10 en caldo nutritivo (100 µL de cultivo bacteriano de una noche en
900 µL de caldo nutritivo) en una cubeta para espectrofotómetro.
11.1.6 Agitar para mezclar homogéneamente y tomar la lectura de DO600 de cada
uno de los cultivos con las cepas
11.1.7 Multiplicar la lectura de DO600 por 10 para obtener la densidad óptica de
los cultivos de una noche y registrar los valores.
Cultivo de una
noche
TA98
TA100
Control negativo
OD600 (X10) Rango aceptable
Aceptación
≥2.0
≥2.0
∼0.0
11.1.8 Verificar que los valores de DO600 para las cepas TA100 y TA98 sea de al
menos 2.0, y que los valores de DO600 del control negativo sea ∼0.0. Realizar el
siguiente paso solo si este paso no es aceptado.
11.1.9 Si los cultivos de una noche no presentan una DO600 ≥2.0, no ha ocurrido
el crecimiento suficiente de una noche. Verificar que las tapas hayan sido cerradas
adecuadamente para permitir la aireación y que las cepas estaban almacenadas
correctamente a –70 °C. Los tubos de cultivo pueden incubarse un tiempo
adicional si así se requiere, pero no debe exceder un tiempo de incubación de 24
hrs. Si los valores de DO600 del control negativo es considerablemente mayor que
0.0, se debe a una contaminación y no se recomienda que sean utilizados los
cultivos.
11.2 Forma de preparación de la mezcla S9
11.2.1 Preparar las cantidades adecuadas de la mezcla S9 conforme a
recomendaciones en 6.4.11, inmediatamente antes del inicio de la prueba.
11.2.2 Mantener la mezcla en baño de hielo o refrigeración (4 ± 2°C) por no más,
de cinco horas.
370
11.2.3 Observar los cuidados de asepsia durante la forma de preparación de la
manipulación de la mezcla S9.
11.3 Controles negativos
Los controles negativos consisten en el solvente utilizado para la disolución del
producto químico o muestra de prueba. Utilizar el volumen equivalente en el mayor
volumen de muestra probada.
11.4 Controles positivos
Todo ensayo debe ser realizado incluyendo controles positivos para confirmar las
propiedades de reversión de especificidad de cada cepa, bien como una eficiencia
del sistema de activación metabólica. Recomendándose el uso de las substancias
estándar descritas en la Tabla 1 pudiéndose emplear otros controles en las
concentraciones adecuadas.
TABLA 1 Controles positivos empleados en la prueba
Prueba
Sin activación
(-S9)
Con activación
(-S9)
Compuesto (b)
Solvente
Concentración
por placa
Cepas
Ácido
picrolónico
DMSO (a)
100 μg
TA98
Azida de sodio
Agua
destilada
5.0μg
TA100
2-aminofluoreno
DMSO (a)
10.0 μg
TA98, TA100
Notas: a) DMSO - dimetilsulfoxido
b) Las soluciones de los compuestos mencionados arriba deben ser
manipulados con máximo cuidado de forma de evitar cualquier contacto
con el operador.
11.5 Procedimiento para determinar el rango de dosis óptimo de una sustancia de
prueba
Si se prueba una sustancia por primera vez, se deben determinar los efectos de
citotoxicidad y solubilidad en una prueba de depuración antes de realizar la prueba
de microfluctuación. Para esta prueba debe utilizarse la concentración más alta del
compuesto y evaluar si esta concentración es soluble en el solvente a utilizar. A
través de la misma se evalúan los efectos citotóxicos de las concentraciones
solubles.
371
Si el mismo cultivo de una noche es usado en la prueba de depuración y la prueba
de microfluctuación modificada, ambas pruebas se pueden ejecutar el mismo día.
11.5.1 Preparación de las concentraciones estándar de la sustancia de prueba.
11.5.1.1
Se requiere preparar un estándar químico 25 veces más concentrado
que la concentración más alta a ser usada en la prueba. para alcanzar la
concentración 1X donde incluye la dilución en el cultivo de exposición.
11.5.1.2
Colocar siete tubos de ensaye y marcar del 1 al 7.
11.5.1.3
Transferir 100 μL de esta concentración 25X del estándar al tubo
marcado como 7, este tubo se considerará como control positivo (+).
11.5.1.4
Adicionar 90 μL del solvente a los tubos 0 a 6 de la placa de la
estándar químico. La concentración del solvente debe ser la misma en todos los
tubos de la sustancia química del 0 a 7.
Nota: los volúmenes adicionados a esto y el siguiente paso es dependiente del
factor de dilución a ser usado. Se requiere 60 μL de cada concentración de la
sustancia de prueba. Por consiguiente, planear los volúmenes a adicionar en estos
pasos para que después que se realicen la serie de diluciones, debe haber
suficiente volumen a dosificar.
11.5.1.5
Realizar diluciones seriales 1 a 10 de la sustancia de prueba
transfiriendo 10 μL del pozo de la sustancia química del pozo 7 al 6, y mezclar
pipeteando suavemente de arriba abajo.
11.5.1.6
Una vez que se tiene una solución mezclada uniformemente
transferir 10 μL del compuesto químico del pozo 6 al pozo 5, y mezclar pipeteando
suavemente de arriba abajo.
11.5.1.7
Completar la serie de diluciones de los pozos 5 a 4, 4 a 3, 3 a 2, 2 a
1. No transferir la sustancia química al pozo 0. El pozo 0 es la dosis control y debe
contener solvente únicamente.
Llenar la siguiente tabla con los estándar químicos y el solvente usado en las
diluciones realizadas.
372
Químico:
Solvente: ___________________
Conc. Inicial (25X) __________%S9:
Pozo
Concentración
Conc. de
exposición 1X
6
5
4
3
2
1
0
+ TA98
+ TA100
11.6 Preparación del cultivo de exposición para la depuración (Gee, et. al., 1994,
1998)
11.6.1 Adicionar 2.7 mL del medio Vogel-Bonner/histidina/biotina a un tubo de
ensaye y 0.3 mL del cultivo de una noche de TA98 ó TA100; (agitar el contenido
del tubo de cultivo antes de tomar el volumen indicado).
11.6.2 Marcar una placa de 24 pozos como “depuración”. Del tubo con el medio de
cultivo y la bacteria transferir 240 μL a los pozos de las columnas 1A a 6D de la
placa de exposición
11.6.3 Transferir 10 μL de los tubos con la sustancia de prueba marcados del (0 a
3) a la columna 1,3, y 5 de la placa de 24 pozos. Y de los tubos marcados como
4,5,6 y “+” a las columnas 2, 4, y 6. Cambiar las puntas en cada transferencia.
11.6.4 Una vez llenados los 24 pozos colocar la microplaca en la incubadora con
agitación a 37 °C, 150-170 rpm durante 90 minutos.
11.6.5 Repetir los pasos 1 a 2 con la cepa TA100 en otra microplaca. Registrar el
tiempo de incubación
11.6.6 Después de los 90 minutos de exposición, sacar la microplaca y comparar
visualmente la turbidez de cada pozo. Las dosis no citotoxicas de la sustancia
química de prueba deben estar turbias, como la dosis cero (tubo 1). Y las dosis
altamente citotoxicas no presentan turbidez.
373
11.6.7 Finalmente las dosis de prueba son seleccionadas por las limitaciones de
solubilidad. Seleccionar la concentración más baja de la sustancia química que
presento citotoxicidad o la concentración de mayor solubilidad con respecto a la
concentración más alta de la prueba.
11.6.8 A los pozos que presentan estas características adicionar 2.8 mL del medio
Vogel-Bonner/biotina con indicador.
11.6.9 Marcar una microplaca de 384 pozos con la cepa a dosificar y la
concentración de la sustancia de prueba.
Colocar la placa de cultivo de exposición con los 24 pozos ocupados
al lado de la primera placa de 384 pozos.
11.6.10
Deslizar la cubierta de la placa de cultivo de exposición de las cepas
de los 24 pozos ocupados hasta dejar la columna 1 descubierta.
11.6.11
Usando una pipeta multicanal, mezclar la solución en los pozos de la
columna 1 de la placa de 24 pozos pipeteando suavemente de arriba abajo.
11.6.12
Distribuir alícuotas de 50 μl en las primeras columnas 1 a 12 de la
placa de 384 pozos. Cada punta especifica para cada pozo, así una transferencia
completa requiere de llenar 48 pozos por concentración de la mezcla de la cepa y
la sustancia de prueba.
11.6.13
Deslizar la cubierta de la placa de cultivo de exposición de la mezcla
de cepas de los 24 pozos hasta dejar la columna 1 y 2 descubiertas.
11.6.14
Cambiar las puntas de la pipeta y mezclar la solución en los pozos de
la columna 2 de la placa de los 24 pozos ocupados pipeteando suavemente de
arriba abajo.
11.6.15
Distribuir alícuotas de 50 μl en las primeras columnas 13 a 24 de la
placa de 384 pozos en la posición A. Una punta especifica para cada pozo de la
placa.
11.6.16
Repetir este procedimiento para las columnas restantes de la placa
de 24 pozos. Las columnas 3 y 4 de la placa de 24 pozos distribuirlas en la
segunda placa de 384 pozos, y las columnas 5 y 6 de la placa de 24 pozos es
distribuida en la tercera placa de 384 pozos.
11.6.17
11.6.18
Realizar el mismo procedimiento para la cepa TA100.
374
Colocar las cubiertas de las cuatro microplacas y sellarlas con papel
parafilm. Para prevenir la evaporación durante los 2 días de incubación a 37 °C.
Registrar el tiempo de incubación al que se inicia y termina .
11.6.19
11.6.20
Sacar las microplacas de la incubadora.
11.7 Manejo de la muestra cuando se trabaja con activación metabólica.
11.7.1 Adicionar 6.0 mL del medio Vogel-Bonner/histidina/biotina, a siete tubos
marcados con MS9.
11.7.2 Adicionar 0.8 mL de cultivo de una noche al tubo marcado con la cepa
apropiada. Agitar el contenido de los tubos de cultivo antes de tomar el inoculo.
11.7.3 Adicionar 1.2 mL de la mezcla S9 al 30% a estos tubos.
11.7.4 Inmediatamente después la mezcla S9 es adicionada al contendor,
transferir 240 µL de toda la mezcla a cada pozo de la placa de 24 pozos.
11.7.5 Repetir los pasos 3 a 17 de la prueba sin activación metabólica.
11.8 Realizar los controles negativos y positivos (utilizar aquellos de acuerdo con
las cepas que se utilizaran en el experimento). A los controles negativos
únicamente se les adiciona 0.1 mL de cultivo bacteriano de una noche y 0.5 mL de
la mezcla S9, mientras que para los controles positivos debe adicionarse un
volumen adecuado del control especifico (ver Tabla 1) y 0.1 mL de cultivo
bacteriano de una noche y 0.5 mL de la mezcla S9.
11.9 Transcurrido el tiempo de incubación de dos días proceder al conteo del
número de pozos positivos en secciones de 48 pozos, y registrar los datos en la
siguiente tabla. Los pozos positivos son aquellos que cambiaron a color amarillo o
tiene crecimiento bacteriano visible en el fondo del pozo. La solución indicadora de
púrpura de bromocresol es sensible al pH que pasa de un color púrpura a amarillo
cuando ocurre crecimiento (revertantes) en los pozos generándose un pH ácido, el
medio inicialmente tiene un pH de 7.0.
375
Número de pozos positivos en la cepa TA98
Concentració
n
0
1
2
3
4
5
6
+
Placa 1
Placa 2
Placa 3
Número de pozos positivos en la cepa TA100
Concentració
n
0
1
2
3
4
5
6
+
Placa 1
Placa 2
Placa 3
La presencia de crecimiento en los pozos control de medio de cultivo sin inoculo
indica contaminación por lo que la microplaca seria desechada.
El ensayo deberá repetirse si la si la tasa de reversión espontánea estuviera fuera
de lo esperado (ver tablas 2) o si los controles positivos no tuvieran actividad
mutagénica frente a las cepas de prueba.
12 RESULTADOS
12.1 Expresión de evaluación
Los resultados son expresados cuantitativamente a través del número de
revertantes por mL o litro de muestra, determinado por la inclinación de la recta
obtenida de la curva dosis-respuesta. Los resultados son también expresados a
376
través de la razón de mutagenicidad (RM) que es una razón entre el número de
pozos positivos por concentración dividida entre el número promedio de pozos
positivos del control cero. Nota: Si el número promedio de pozos positivos para el
control dosis cero es >1.0, ajustar a 1.0 para este cálculo.
Se expresan los resultados gráficamente a través de una curva dosis respuesta,
colocando en la abcisa las concentraciones de la muestra probada y en la
ordenada el número de revertantes inducidos en cada dosis.
Calcular la desviación estándar de los pozos positivos por concentración.
12.2 Interpretación de los resultados
Una muestra es considerada positiva cuando existe una relación dosis-respuesta
entre las concentraciones probadas y/o el número de revertantes inducidas en por
lo menos una dosis, la razón de mutagenicidad (RM) es mayor o igual a 2.
12.3 Evaluación de la prueba
13.3.1 Resultados positivos
Indican que, con base a las condiciones de la prueba, una muestra en la prueba
induce mutaciones de punto por substitución de bases o del tipo “frameshift” en el
genoma de estos microorganismos.
13.3.2 Resultados negativos
Indican que, con base a las condiciones de la prueba, la muestra no presenta
actividad mutagénica frente a las cepas probadas de Salmonella typhimurium.
13.3.3 Informe técnico
El informe técnico sobre la prueba debe incluir la siguiente información:
a)
b)
c)
d)
e)
f)
Tipos de cepas empleadas;
Sistema de activación metabólica empleando;
Resultados de la prueba
Interpretación de los resultados;
Método empleado;
Nombre y firma del responsable de los análisis
Una vez que hayan contado totalmente el número de microplacas que
constituyeron el experimento los resultados serán vaciados a los formatos
electrónicos (ver 14.0), dichos formatos serán posteriormente impresos y
anexados a la carpeta de resultados con la firma del analista y el responsable del
área.
377
13 RECOMENDACIONES
Para un análisis de rutina la actividad mutagénica de una muestra, se recomienda
el uso de las cepas TA98 y TA100, se ha demostrado su eficiencia en la detección
de un gran número de mutágenos ambientales; dependiendo de la muestra, el
objetivo, y de las condiciones del volumen de la muestra disponible para prueba,
también son utilizadas otras cepas (por ejemplo, TA102, TA104, TA97a, TA1535,
TA1538, TA1537).
Debe tomarse cuidados especiales con relación a la estandarización de la
metodología, la verificación de las características genéticas de las cepas
empleadas, la actividad de la fracción S9, el control de calidad de los reactivos,
medios de cultivo y cristalería utilizada en la prueba, a fin de asegurar la
confiabilidad de los resultados,
BIBLIOGRAFÍA
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mutagens with the Salmonella/mammalian microsome mutagenesis test. Mutat.
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378
Bioensayo de la Actividad Deshidrogenasa
Martha Barajas Aceves
Depto. de Biotecnología y Bioingeniería, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados
del IPN. Av. IPN 2508, Col. San Pedro Zacatenco México D.F.
Principio
La oxidación microbiana de sustancias orgánicas bajo condiciones aeróbicas está ligada a
la cadena de transporte de electrones enlazada a la membrana con O2 como aceptor final.
El sistema de transporte de electrones está acoplado con la síntesis de ATP, llamado
fosforilación oxidativa.
NADH es la forma en el cual los electrones son colectados de diferentes sustancias a
través de la acción de NAD-ligado deshidrogenasa. Los electrones son además
trasportados al sistema de citocromos, donde son oxidados por O2 (Leninger, 1975).
En los años de 1930 la medida de una o más actividades enzimáticas en la cadena
respiratoria podría ser usada como un índice para las actividades oxidativas totales de las
células, de tal forma que la actividad deshidrogenasa en suelos se ha usado como una
medida para la actividad microbiana global (Lenhard, 1956; Klein et al, 19971; Casida,
1977).
El método está basado en la suposición de que en la ausencia de O2 el cloruro de 2, 3, 5trifeniltetrazolium (TTC) actúa cuantitativamente como el aceptor terminal de H para el
sistema dehidrogenasa con la formación del rojo de trifeniltetrazoliumformazan (TPF).
TTC + 2H+ + 2e- = TPF + HCl
Cuando esta prueba se aplica a suelos, las condiciones son hechas anaeróbicas, y la
deshidrogenasa anaeróbica tanto como la deshidrogenasa aeróbica se asume que usan
el TTC como aceptor de H.
Materiales y aparatos
Tubos de ensaye de 16 x 150 mm.
Vortex
Estufa de Incubación ajustable a 37 ˚C.
Espectrofotómetro
Papel filtro Whatman No. 42
Extractante
Acetona (grado analítico) ó Metanol
Compuestos químicos y Soluciones
379
CaCO3
Solución TTC
3 % W/V de 2, 3,5-cloruro de trifeniltetrazolium en agua destilada
Curva estándar de TPF
TPF Solución estándar
Disolver 100 mg de TPF en 80 ml de acetona (1000 µg TPF ml-1) y aforar con acetona a
100 ml.
Procedimiento
Pesar 3 porciones de suelos de suelos húmedos equivalente a 6 g de suelo seco en tubos
de ensaye de 16 x 150 mm. A cada tuvo se adiciona 67 mg CaCO3, 1 ml de una solución
acuosa de 2, 3,5-cloruro de trifeniltetrazolium (TTC) al 3% (w/v) y 2.5 ml de agua
destilada. Los contenidos son mezclados en el vortex para excluir tanto como sea posible
el aire atrapado. Los tubos son incubados por 24 hr a 37 ˚C.
Al finalizar la incubación, el trifenilformazan (TPF) formado por la reducción de TTC se
extraen agitando a mano en un embudo de separación con 10 ml de acetona por 5 min y
filtrar. Esto se repite de 7 a 8 veces para asegurar una extracción completa del TPF. El
filtrado se diluye con acetona adicionar a un volumen final de 50 ml. Se lee a una
absorbancia de 485 nm usando acetona como blanco.
La actividad deshidrogenasa en suelos se expresa como µg TPF producido g-1 suelo 24
hr-1. La absorbancia se comparan con una curva estándar de 0 – 1000 mg TPF l-1 en
acetona. Los blancos se utilizan con extractos de suelos acetónicos o metanólicos sin
TTC o TPF.
Curva de Calibración
Pipetear 0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 y 4.0 ml de la solución estándar de TPF en un matraz
volumétrico (50ml) y adicionar 8.3 ml de buffer Tris (pH 7.6) y se afora con acetona a 50
ml para obtener las siguientes concentraciones: 0, 10, 20, 40, 60 y 80 µg TPF ml-1.
Cálculos
La lectura de las concentraciones (µg/ml) de la curva de calibración, corregidos por los
valores control y calculados:
TPF (µg/ml) x 40
Dwt x 5
380
De donde: dwt es le peso seco de 1 g de suelo húmedo, 5 es el peso húmedo usado (g) y
40 es el volumen de la solución adicionada (acetona) a la muestra de suelo en el ensayo.
Referencias
Casida L.E. Jr., Klein, D.A., Santoro T., 1964. Soil Dehydrogenase activity. Soil Science.
98, 371-376.
Casida L.E. Jr., 1977. Microbial metabolic activity in soil as measured by dehydrogenase
determinations. Applied and Environmental Microbiology. 34, 630-636.
Klein D.A., Loh T.C., Goulding R.L., 1971. A rapid procedure to evaluate the
dehydrogenase activity of soils low in organic matter. Soil Biology and
Biochemistry. 3, 385-387.
Lenhard G., 1956. The dehydrogenase activity in soils as a measure of the activity of soil
microorganisms. Z. Pflanzenernah Düng Bodenkd. 73, 1-11.
Lenninger A.L., 1975. Biochemistry. Worth Publishers, Inc. New York.
381
Bioensayo de Trifosfato de Adenosina (ATP)
Martha Barajas Aceves
Depto. de Biotecnología y Bioingeniería, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados
del IPN. Av. IPN 2508, Col. San Pedro Zacatenco México D.F.
Principios
El trifosfato de adenosina (ATP) es un compuesto de energía importante en el
metabolismo de todos los organismos vivos. El contenido de ATP en suelos está
correlacionado muy de cerca con otros indicadores de biomasa por ejemplo; C, N, etc., y
puede servir como una estimación independiente del contenido de biomasa en suelos.
En la extracción de ATP del suelo pueden ocurrir algunos problemas tales como: obtener
la máxima liberación del ATP de células vivas, la hidrólisis de ATP por ATPasas en suelos
y la absorción de ATP en los coloides del suelo. El método desarrollado por Jenkinson y
Oades (1979), se usa un reactivo; ácido tricloroacético/fosfato/paraquat para extraer ATP
y ultra zonificación para romper las células microbianas. El anión (fosfato) y el catión
(paraquat) son absorbidos fuertemente en los sitios positivos y negativos del suelo,
bloqueando de esta forma, los sitios donde pudieran absorberse el ATP microbiano.
Aún usando estos reactivos, algo de ATP pudiera absorberse al suelo, por lo que se hace
necesario calcular la cantidad recuperada. Esto se hace por la adición de una cantidad
conocida de ATP al extractante B y comparando la cantidad obtenida con los obtenidos
del extractante A sin adición de ATP.
El ATP se mide usando el análisis del sistema luciferina-luciferaza, descrito por Tate y
Jenkinson (1982) usando el extracto purificado de luciferaza. La luz emitida durante la
reacción es medida usualmente por un contador de centiliación.
A. Extracción del ATP
Reactivos
ATP (Adenosine 5¨-trifosfato (ATP) sal de disodio hidratado – Sigma FL-AAS
Ácido tricloroacético
Na2HPO4.12H2O (ortofosfato de hidrogeno disodio dodecahidratado)
Dicloruro de paraquat (dicloruro de 1,1-dimetil-4,4’-bipiridina)
Solución 0.01 mM ATP
Disolver 59.9 mg en agua y ajustar a 1 Lt y almacenar a -15 ˚C.
Nota: el peso molecular de la fórmula puede cambiar de un lote a otro debido al
contenido de agua. Calcular la molaridad de la fórmula dada en la botella adquirida.
Solución stock del extractante
382
Pesar 81.6 g de ácido tricloroacético y diluir en 600 ml de agua destilada. Pesar 89.6g
Na2HPO4.12H2O y disolver en los 600 ml con tricloroacético, adicionar 70 ml del bicloruro
de paraquat 36%, aforar en un litro con agua destilada y almacenar a -15 ˚C.
Esto da una solución de 0.5M con respecto al TCA, 0.25M a fosfato y 0.1M a paraquat. Se
recomienda preparar un volumen de la solución stock considerable como para usarse a
través de todo el número de muestras para el análisis planeado de ATP.
Advertencia: Algunos de los reactivos usados en la extracción de ATP y análisis son
altamente tóxicos, carcinogénicos y mutagénicos. Usar guantes y protección para los
ojos todo el tiempo.
Extracto A
Tomar una alícuota de 5 ml de agua destilada y usar la solución stock para aforar a 1lt.
Extracto B
Tomar una alícuota de 5 ml de 0.1nM ATP y aforar con la solución stock a 1 litro.
Método
1.- Por cada réplica de la muestra, (normalmente 3), pesar 2 muestras de suelo de 2.5g.
Colocar una de las muestras en un tubo marcado con A y el otro con B. Los tubos deben
ser de centrífuga (50ml) para resistir la utrasonificación. Se adicionan 25 ml del extracto A
al tubo A y 25 ml de extracto B al tubo B.
2.- Inmediatamente después de adicionar el extracto A al primer tubo, se zonifica por 2
min. con la ultrasonificador usando una sonda de 12.5 mm a toda potencia.
3. – Enfriar el tubo en hielo por lo menos 5 min.
4.- Continuar el siguiente tubo con el mismo procedimiento
Es necesario trabajar los tubos individualmente, de donde es importante que el extracto
esté en contacto con el suelo por el mismo tiempo.
5.- Filtrar usando papel filtro Whattman No 44 hasta que se obtenga de 5 a 10 ml del
filtrado.
6.- Almacenar los extractos a -15˚C.
Advertencia: La sonificación con paraquat puede producir aerosoles. El ultra-sonicador
deberá estar colocado dentro de una campana de extracción de gases.
B. Medida de ATP
Reactivos
31.2g Na2HAsO4.7H2O (sal de sodio ácido arsénico hepta hidratado)
10 ml 0.2M EDTA (etilén-diamino-tetra-ácido acético)
2.46 g MgSO4.7H2O (sulfato de magnésio)
383
H2SO4 IM
Preparación
Pesar 31.2g de Na2HasO4.7H2O y disolver en 800 ml de agua destilada, adicionar 10 ml
0.2M EDTA y después adicionar 2.46g de sulfato de magnesio disuelto en 100 ml de agua
destilada. Ajustar el pH a 7 con H2SO4 IM. Aforar a 1 litro con agua destilada.
Esto dará una solución 0.1M con respecto a Arsenato, 0.01M con respecto a Mg2+ y
0.002M a EDTA.
Solución de la enzima
Reactivo
ATP assay Mix FLAAM ─ Sigma
Nota: un vial es suficiente para 50 ensayos
Preparación
1.- Reconstituir la dilución buffer inyectando de 10 a 12 ml de agua de alta pureza con una
jeringa de plástico y mezclarla suavemente para evitar la formación de espuma.
2.- Reconstituir el reactivo por la adición del contenido completo de la solución buffer y
permitir que la solución repose en hielo por 1 hora antes de usarse.
Nota: Se especifica por el proveedor que la preparación es capas de detectar la
concentración de ATP de 2 x 10-10 a 2 x 10-7 moles por litro, pero si no se requiere tal
sensibilidad, la solución puede ser diluida con buffer, pero si se requiere más
sensibilidad, se debe adicionar extra luciferina.
Preparación de los estándares
Solución 1
Pipetear 1 ml de la solución 0.1 nM ATP en un matraz volumétrico de 50 ml y aforar con el
extractante A. Esto da 100 pmoles de ATP en 50 ml de la solución estándar.
Solución 2
Pipetear 2 ml de la solución 0.1 nM ATP en un matraz de 50 ml y aforar con la solución
del extractante A. Esto da 200 pmoles de ATP en 50 ml de la solución estándar.
384
Tabla 1 - Concentración de estándares de ATP para la construcción de la curva de
calibración
ATP
pmoles/50 µl
0
10
20
40
50
80
100
120
150
200
Solución 1
ml
1
2
4
5
8
10
-
Solución 2
ml
6.0
7.5
10
Extractante A
ml
10
9
8
6
5
2
0
4
2.5
-
Sí se trabaja con suelos adicionados con sustratos, usar los estándares arriba de 100
pmoles.
Método
1.- Arreglar los viales de 25 ml para Contador de Centiliación
2.- Pipetear 5 ml del buffer de arsenato en cada vial
3.- Pipetear 50 µl de los estándares, o extractaos de suelo en el buffer de arsenato en los
viales.
4.- Preparar la solución enzimática Pico enzima F
5.- Pipetear 50 – 75 µl de la solución enzimática en las muestras y mezclar suavemente
girando los viales
6.- Tapar los viales y contar en un Contador de Centiliación utilizando el unquenched
Standard de calibración 14C.
Nota: La exactitud del pipeteo es extremadamente importante especialmente cuando la
solución de la enzima es pipeteada.
Sugerencias del orden de la corrida
3 replicas de cada estándar
3 replicas del Blanco A (o ppm)
3 replicas del Blanco B
3 replicas de las muestras de suelo A y B
Repetir los estándares y blancos A y B al final de la corrida
385
Se recomienda que no se analicen más de 130 muestras (incluyendo blancos A y B y
estándares). Esto es porque se toma 1 hora en contar las muestras y por se un número
máximo manejable ara una persona con exactitud.
Cálculos
% Recuperación de ATP adicionado = (Cuenta ext B ─ Cuenta ext A) × 100
(Blanco B – Blanco A)
ATP (nmol g-1 suelo) = (Cuenta ext B ─ cuenta ext A) × SF × (25 + w)
% Recuperación × 5 × 50
De donde:
Cuenta ext B = cuenta del suelo con extacto B
Cuenta ext A = cuenta del suelo con extacto A
Blanco B = cuenta del extracto B
Blanco A = cuenta del extracto A
SF = la inversa de la pendiente de la curva estándar (ATP/cuenta)
w = agua contenida en la muestra de suelo
25 = ml del solución extractante A o B
5 = g de suelo en base seca
50 = µl del extracto de suelo usado para el análisis de ATP
Referencias
Jenkinson D.S. and Oades J.M. (1979). A method for measuring adenosine triphosphate
in soil. Soil Biology and Biochemistry 11, 193-199.
Tate K.R. and Jenkinson D.S., 1982. Adenosine triphosphate measurements in soil: an
improved method. Soil Biology and Biochemistry 14, 331-335.
386
Bioensayo de la Tasa de Mineralización del Nitrógeno
Martha Barajas Aceves
Depto. de Biotecnología y Bioingeniería, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados
del IPN. Av. IPN 2508, Col. San Pedro Zacatenco México D.F.
Principios
Tanto las plantas como los microorganismos dependen del nitrógeno combinado para su
nutrición. El nitrógeno combinado es la forma de amonio, nitratos o compuestos
orgánicos, a menudo son el factor limitante para los procesos biológicos del suelo
(Haynes and Goh, 1978). Por esta razón, el ciclo de la transformación de la materia
orgánica nitrogenada son de gran importancia en el recambio total de este elemento en el
suelo.
La mineralización del nitrógeno consiste en dos procesos importantes: la amonificación de
compuestos orgánicos por un gran número de microorganismos heterótrofos y la
oxidación de amonio liberado a nitritos y nitratos (nitrificación), principalmente por
bacterias autótrofas.
La mineralización de nitrógeno orgánico depende principalmente en la temperatura,
humedad, aireación, tipo de N orgánico y pH.
El nitrógeno inorgánico producido por mineralización está sujeto a la inmovilización del N
y fijación por arcillas. También se puede perder por desnitrificación y lixiviación.
Principios del método.
El método esta basado en la incubación del suelo húmedo (ajustado entre un 40 a 50 %
capacidad de retención de agua) a 25˚C y seguido por la determinación de nitratos y
amonio extraídos con una solución 0.5 M K2SO4 .
Procedimiento
Las muestras de suelos húmedos (25 g en base seca) se pesan (por triplicado) en frascos
de vidrio de 100 ml y se colocan dentro de botellas de vidrio de 1Lt de boca ancha de
color ámbar. Tres muestras de suelo húmedo se congelan inmediatamente (control) a 20˚C. En el fondo de la botella de 1Lt se colocan 10 ml de agua destilada para evitar la
deshidratación y un vial con 20 ml de NaOH 1N para atrapar el CO2 desprendido durante
la incubación. Se tapan la botella de 1lt con tapas de rosca, perfectamente selladas y se
incuban de 7 a 30 días a 25˚C.
Extracción
Las muestras pesadas (25 g) por triplicado en los recipientes de plástico limpios y secos,
se adiciona el 0.5 M K2SO4 en una proporción 4:1 (ml de sulfato de potasio: muestra
seca) (100 ml) y se agita a 200 rpm a temperatura ambiente por 30 min.
Terminada la agitación se filtra inmediatamente con el papel Whatman # 42 a un
recipiente de plástico limpio y seco. Se guardan los extractos en congelación (< 5˚C)
hasta su análisis.
387
Solución extractora:
0.5 M K2SO4
Pesar 871.35 g de K2SO4 y diluir a 10 Lt de H2O destilada. Mezclar y agitar por 2 horas a
75 rpm en una agitadora transversal.
Cálculos de la tasa de nitrógeno mineralizado
Nmin (µg g-1 suelo seco día-1) = (NH4-tx+NO3-tx+NO2-tx) – (NH4-t0+ NO3-t0+NO2t0)
t x PS
De donde: NH4-tx es concentración del NH4 después de la incubación, NO3-tx es la
concentración de NO3 después de la incubación, NO2-tx es la concentración de NO2
después de la incubación, NH4-t0 es la concentración de NH4 del control, NO3-t0 es la
concentración de NO3 del control, NO2-t0 es la concentración de NO2 del control t es el
tiempo de incubación y PS es el peso en base seca del suelo húmedo.
Referencias
Haynes R.J., Goh K. M., 1978. Ammonium and nitrate nutrition of plants. Biol. Rev. 53,
465-510.
Determinación de amonio
Martha Barajas Aceves
Principios
El nitrógeno orgánico (ejemplo, proteínas y ácidos nucleicos) es convertido por la
descomposición microbiana a amonio. La primera etapa de la hidrólisis de la proteina por
ejemplo, la liberación de aminoácidos, los cuales son hidrolizados bajo condiciones
aeróbicas o anaeróbicas (Ladd and Jenkinsosn, 1982).
La velocidad de amonificación depende en la relación C/N de los compuestos orgánicos,
altas tasas de amonificación generalmente ocurren a una relación baja de C/N (Alef and
Kleiner, 1986a, Alef and Kleiner, 1986b, Nannipieri et al, 1990). Excepto para la hidrólisis
de urea por ureasa extracelular, la amonificación es enlazada al metabolismo de las
células activas.
Principio del método
El amonio y el nitrato de la solución del suelo se pueden destilar directamente sin ninguna
preparación de la muestra. La transformación de amonio a amonia el cual es colectado en
el destilado, se logra con la adición de MgO. (Keeney and Nelson, 1982)
388
Reactivos
Acido bórico 4 %
Oxido de magnesio
H2SO4 0.02 N
Rojo de metilo
Azul de metileno
Etanol 95 %
NH4SO4
Solución indicadora
Pesar 200 mg de rojo de metilo y aforar a 100 ml con etanol al 95%. Pesar 100 mg de
azul de metileno y disolver en 50 ml de etanol al 95%. Combinar las dos soluciones.
Preparar mensualmente.
Acido Bórico
Pesar 40 g de ácido bórico y disolver en 900 ml de agua destilada. Aforar a 1 litro.
Adicionar 10 ml de la solución indicadora.
Solución stock 1000 µg NH4SO4/ml
Pesar 3.66 g de NH4SO4, disolver y aforar a 1000 ml con agua destilada.
Solución de trabajo 10 µg NH4SO4/ml
Tomar una alícuota de 10 ml de la solución stock (1000 µg NH4SO4/ml) y aforar a 1000 ml
con agua destilada.
Procedimiento
Tomar una alícuota de 10 ml de la muestra extraída con 0.5 M K2SO4 en un tubo de
destilación de 500 ml, adicionar 10 ml de agua desionizada y adicionar 0.2 g de óxido de
magnesio e insertar el tubo en el aparato de destilación.
El destilado es colectado en 10 ml de ácido bórico al 4 %. Recibir 100 ml del destilado.
Titular con H2SO4 0.02 N
Factor de conversión
Tomar una alícuota de 10 ml de la solución de trabajo (10 µg NH4SO4/ml) y repetir todo el
procedimiento de las muestras extraída. Repetir de 4 a 5 veces y calcular el promedio del
gasto de H2SO4 0.02 N.
Cálculos
NH4+ (µg g-1 suelo) = (ml H2SO4 gastados * 100*Y)
10*25
De donde:
389
100 = ml de 0.5 M K2SO4 usados para extracción
Y = factor de conversión (µg NH4SO4 destilados de la alícuota de la solución patrón / ml
promedio del gasto de H2SO4 0.02 N).
10 = alícuota de la muestra destilada
25 = g de suelo en base seca usados para la extracción.
Referencias
Alef K., Kleiner D. 1986a. Arginine ammonification, a saple method to estimate microbial
activity potentials in soils. Soil Biology and Biochemistry. 18, 233-135.
Alef K., Kleiner D. 1986b. Arginine ammonification in soils samples. In: The application of
enzymatic and microbiological methods in soil analysis. Veroff Landwirtsch-Chem.
Bundesanstalt Linz/Donau 18, 163-168.
Nannipieri P., Grag S., Ceccanti B. 1990. Ecological significance of the biological activity in
soil. In: Soil Biochemistry, vol. 6 Bollag J.M. Stotzky G. (eds) Marcel Dekker, New York. Pp
293-355.
Keeney D.R., Nelson D.W., 1982. Nitrogen inorganic forms. In Methods of Soil Analysis.
Part 2, 2nd edn. Page A.L., Miller R.H., Keeney D.R. (eds) American Society of Agronomy,
Madison, Wt. pp. 643-698.
390
Determinación de nitratos
Martha Barajas Aceves
Principios
La conversion de amonio a nitratos es a través de dos grupos de bacterias altamente
especializadas: chimioautótrofas, aeróbicas obligadas.
La nitrificación ocurre en dos etapas: primeramente, el amonio es oxidado a nitrito y
segundo el nitrito es oxidado a nitrato.
El amonio más que el nitrato se puede adsorber en los coloides orgánicos e inorgánicos
del suelo.
La estimación de la velocidad de mineralización de nitrógeno se puede usar como un
criterio cuantitativo de actividad microbiana en suelos, y se ha usado para estudiar la
influencia de contaminantes y factores ambientales en actividades microbiana en suelos
(Greaves et al., 1980; Somerville and Graves, 1987).
Principio del método
La determinación de NO3- con el ácido 2,4 fenol-fenoldisulfónico en un medio ácido, que
al añadir el KOH desarrolla el color amarillo de la sal potásica del ácido
nitrofenoldisulfónico.
Reactivos
H2SO4
12 N KOH
KNO3
Fenol blanco
Ácido fenol disulfónico. Pesar 25 g fenol blanco puro en 150 ml de H2SO4 fumante (15%
de SO3 libres) Se agita bién y se calienta por 2 horas en baño. Se enfría y se guarda en
un frasco ámbar a temperatura ambiente.
Sol. 1N H2SO4
Se disuelven 28 ml H2SO4 concentrado en 1 Lt de agua destilada
Sol Madre de NO3
Pesar 7.223 g KNO3 en 1000 ml agua destilada concentración es de 1000 µg/ml de NO3N. 25 ml de la solución stock (1000 µg/ml de NO3-N) diluir a 500 ml con agua destilada.
Concentración final 50 µg/ml de NO3-N
Curva tipo: ml de la solución patrón conc. 50 µg/ml de NO3-N: 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1.0.
Concentraciones en µg: 0, 5, 10, 15, 20, 25, 50.
391
Procedimiento
Tomar una alícuota de 10 ml de muestra en un vaso de precipitado de 100 ml y evaporar
en una parrilla de calentamiento con temperatura controlada. Adicionar 2 ml de ácido
fenoldisulfónico y dejar reposar por 10 ml. Disolver con 15 ml de agua destilada. Adicionar
7 ml sol KOH 12 N lentamente hasta desarrollar color. Aforar a 100 ml con agua destilada.
Leer a 410 nm. El color es estable por varias horas y las lecturas se pueden hacer más
tarde si es necesario.
Cálculos
NO3-N (µg g-1 suelo) = Abs × Fc × 100
25 × 10
De donde:
Abs = absorbancia leída a 410 nm
Fc = factor de conversión, que es la inversa de la pendiente de la curva de estándares
100 = ml de K2SO4 usados para la extracción del suelo
25 = gramos de suelo en base seca
10 = alícuota tomada para la determinación de nitratos
Referencias
Graves M.P., Poole N.J. Domsch K.H. Jagnow G., Verstraete W., 1980. Recommended
test for assessing the side effect of pesticides on soil microflora. Tech. Rep. Res Council,
Weed Res Organization No 59; 1-15.
Somerville L. Graves M.O. 1987. Pesticide effects on soil microflora. Somerville L. And
Graves M.P. (eds.) Taylor and Francis. London, New York. Pp 115-132.
Primo Yúfera E., Carrasco J.M.., 1973. Química Agrícola. Tomo I. Editorial Alambra.
392
Determinación de nitritos
Martha Barajas Aceves
Principios
El contenido de nitritos en suelo, normalmente es muy pequeño. Sin embargo, en suelos
abonados con fertilizantes nitrogenados, se pueden acumular cantidades apreciables.
El nitrito se determina por la formación de un colorante azo púrpura rojizo, producido a pH
2.o a 2.5 por acoplamiento de sulfanilamida diazotizada con diclorohidrato de N-(1-naftil)etilendiamina (diclorhidrato de NED).
Reactivos
Clorhidrato de L-Naftilamina
Ácido sulfanílico
EDTA disódico
Acetato de sodio
NANO2
6 N NaOH
Sol. Ácido sulfanílico
Ácido sulfanínico 0.60 g
Ácido clorhídrico 70 ml
Agua destilada ……aforar a 100 ml
Sol EDTA disódico
Pesar 0.5 g de EDTA y disolver en 100 ml de agua destilada
Sol. Clorhidrato de L-naftilamina
Clorhidrato de L-naftilamina 0.60 g
Ácido clorhídrico 1 ml
Agua destilada ……aforar a 100 ml
Refrigerar
Evitar inhalación o exposición a la piel
Sol amortiguadora de acetato de sodio 2M
Acetato de sodio
16.4 g
Acetato de sodio.3 H2O 27.2 g
Agua destilada libre de NO2 100 ml
NaOH 6N
Disolver 240g de NaOH en 1000 ml de agua destilada
393
Solución Madre de NO2
Pesar 1.232 g NaNO2 en 1000 ml agua destilada, adicionar 1 ml de cloroformo
concentración es de 250 µg/ml de NO2-N. 50 ml de la solución madre (250 µg/ml de NO3N) diluir a 250 ml con agua destilada. Concentración final de la solución intermedia 50
µg/ml de NO2-N. Solución patrón, tomar 10 ml de la sol intermedia (50 µg/ml de NO2-N) y
diluir a 1000 ml, solución Patrón 0.50 µg.
Curva tipo: ml de la solución patrón conc.: 0, 1, 2, 3, 5, 10, 10, 15, 20ml. Las
concentraciones en µg son: 0, 0.50, 1.0, 1.50, 2.50, 5, 7.50, 10.
Procedimiento
10 ml de muestra
40 ml de agua destilada
1 ml naftilamina, agitar
1 ml de ácido sulfanílico
1 ml EDTA,
Dejar reposando por 10 min.
Adicionar 1 ml naftilamina
1 ml de acetato de sodio
Reposar por 30 min.
Leer a 520 nm
Cálculos
NO2-N (µg g-1 suelo) = Abs × Fc × 100
25 × 10
De donde;
Abs = absorbancia leída a 520 nm
Fc = factor de conversión, que es la inversa de la pendiente de la curva de estándares
100 = ml de K2SO4 usados para la extracción del suelo
25 = gramos de suelo en base seca
10 = alícuota tomada para la determinación de nitritos
Referencias
Primo Yúfera E., Carrasco J.M.., 1973. Química Agrícola I. Editorial Alambra. Pag. 301.
394
MÉTODOS PARA EVALUAR LOS EFECTOS DE CONTAMINANTES
EN Argopecten ventricosus
Autor: Alma Socorro Sobrino Figueroa
Los organismos que se utilizaron para los bioensayos se obtienen de
Laboratorios de Cultivo de Moluscos, o de “Parque de Cultivo” o “vivero”, que se
localizan en el mar, en jaulas suspendidas por medio de flotadores. a una profundidad
no mayor a 4-8 metros. Se tomarán muestras de agua y se evaluará in situ la
salinidad y temperatura. Los especimenes y las muestras de agua se transportaran en
hieleras de plástico al laboratorio o al lugar donde se desarrollará la parte experimental
de la investigación.
Inducción en el laboratorio para la obtención de larvas de almeja catarina
Organismos reproductores de A. ventricosus provenientes del campo se
recolectaron cuidadosamente.
En el laboratorio se realizará una inspección visual para seleccionar a los
individuos “maduros” (con gónada evidente) y aquéllos que tengan esa condición se
someterán a estimulación térmica para inducir el desove. Este proceso denominado por
Lossanoff y Davis (1963), como “choque térmico”, consiste en variar de forma alternada la
temperatura del agua donde se encuentran los organismos de 18 ºC hasta 27 ºC.
Después de la inducción, 14 ± 2 organismos se colocaran en canastas de plástico
(denominadas canastas Nestier), mismas que se sumergirán en tanques de fibra de vidrio
con capacidad para 1500 litros, con agua marina filtrada (15, 10, 5 y 1 m) e irradiada
con luz ultravioleta (UV).
A las 12 ± 2 horas después de la estimulación se retiraran los reproductores de los
tanques de cultivo. Los procesos de desove, la fecundación, el desarrollo del primer
estadío larval (trocófora) y del segundo (larvas veliger “D”) se verificaran en las primeras
18 horas después del choque térmico.
Las larvas en estadíos de veliger “D” (85 a 96 m de altura) (Figura 1), se
concentraran por medio de una malla de 50 micras a un volumen de 1litro. Se tomará 1 ml
de esta suspensión para realizar un conteo por quintuplicado en una cámara SedgwickRafter, para determinar el número de larvas presentes.
0
50 μm
Figura 1. Larvas veliger “D” de Argopecten ventricosus de aproximadamente 96
altura y de 8 días de edad.
m de
395
Posteriormente las larvas “D” se colocaran en estanques de 500 litros de
capacidad, llenos con agua marina filtrada e irradiada con luz UV, a una densidad de 5
larvas/ml. Se mantendrán a 36 o/oo, 23 ± 2 °C y con suministro diario de alimento, que
consiste en una mezcla de microalgas (Isocrysis galbana. y Chaetoceros calcitrans), a
densidades de 80,000 a 120,000 cel/ml.
Parte de las larvas “D” obtenidas, permanecerán 2 a 4 días en aclimatación
(APHA, 1994), en las siguientes condiciones: 36 %o, 20 ± 2 °C y burbujeo constante.
Asimismo se les alimentaran diariamente con una mezcla de las microalgas Tetraselmis
sp. y Chaetoceros sp. a una densidad de 300,000 a 800,000 cel/ml, cultivadas con medio
F/2 Guillard (Stein, 1973).
Otra parte de la cohorte se mantendrá por un periodo máximo de 21 días, hasta
que alcanzaron el estadio de pediveliger (con mancha ocular; 200 a 350 m de altura).
para efectuar los bioensayos.
Evaluación del efecto de los metales y sus mezclas sobre larvas de A. ventricosus
Los efectos de los metales sobre las larvas de almeja catarina se evaluaran en
bioensayos con recambios de agua.
Supervivencia de larvas veliger y pediveliger de A. ventricosus
Para evaluar el efecto deletéreo de los xenobioticos sobre la supervivencia de las
larvas veliger (“D”) y pediveliger de almeja catarina, se efectuaran microbioensayos,
siguiendo las recomendaciones de Hunt et al., (1998). Se utilizaran placas multipozos,
cada pozo con un volumen de 3 ml. En estas pruebas se realizaran con recambios de
agua cada 24 horas, para mantener constante la concentración de los metales. Se
probaran 5 concentraciones de metal por quintuplicado además de un testigo.
Cada 24 horas se evaluará la supervivencia de los organismos para cada
concentración de tóxico por medio de observaciones directas con la ayuda de
un microscopio de disección.
La muerte de los especimenes se determinará de acuerdo a los criterios establecidos
por FAO (1982; 1986).
Con los datos obtenidos, se determinara la CL50 (Concentración Letal 50) a 24, 48
y 72 horas, por medio del método Probit (Finney, 1971).
Fijación de larvas pediveliger
El efecto de los metales sobre la fijación de las larvas al sustrato se evaluará
mediante un bioensayo. El experimento se realizará en cristalizadores de vidrio Pyrex con
capacidad de 400 ml. En el fondo de éstos se colocaran sustratos, consistentes en placas
delgadas de vidrio (Roosenburg et al., 1980), las cuales se revisaran cada 24 horas con
ayuda de un microscopio de disección. Se efectuara un conteo del número de
organismos adheridos a las placas, para determinar los porcentajes de especimenes fijos
y no fijos a las 24, 48 y 72 horas (Roosenburg et al., 1980).
Con los datos obtenidos se determinara la CE50 (Concentración Efectiva 50) que
es la concentración de metal, donde se observó una disminución del 50% en la fijación de
larvas en comparación con el testigo.
396
Evaluación del efecto de los contaminantes sobre juveniles y adultos de A.
ventricosus
Para evaluar el efecto tóxico de los xenobioticos sobre juveniles y adultos se
realizaron bioensayos con juveniles de 3 a 4 meses de edad y con adultos de 12 a 14
meses de edad.
Las pruebas de letalidad o de intoxicación aguda se efectuarán con juveniles de 3 a
10 mm de altura y adultos de 40 a 50 mm de altura.
Se realizaran bioensayos con recambios de agua cada 48 horas, siguiendo los
protocolos propuestos por la FAO (1982, 1986), Buikema et al., (1982) y APHA (1994).
Las pruebas con juveniles se realizaran en cristalizadores de vidrio Pyrex con capacidad
de 400 ml, los cuales permanecieron cerrados durante el desarrollo del experimento
para evitar la evaporación del agua y la variación de los niveles del metal.
Se probaran 5 concentraciones de los xenobioticos por triplicado, además de un testigo
sin tóxico y otro sin organismos. Se colocaran 10 juveniles por recipiente. El tiempo de
duración de las pruebas fue de 168 horas.
Los experimentos con adultos se realizaran en acuarios de 12 litros de capacidad en
donde se colocaran de 5 a 6 organismos por acuario. Se probaron 5 concentraciones de
los tóxicos por duplicado, además de un testigo sin tóxico y otro sin organismos.
El agua marina que se utilizará en todos los bioensayos, debe ser filtrada (5 y 1 m)
e irradiada con luz UV.
Cada 48 horas se evaluaron los siguientes parámetros en ambos experimentos:
niveles de metales en el agua, por medio de un espectrofotómetro de absorción atómica
(AA Perkin Elmer mod. 3100), concentración de oxígeno con un oxímetro (Cole Palmer
Mod. 5946-55), pH con un potenciómetro (Orion Mod.520A), salinidad con refractómetro
(Makko), temperatura con termómetro de 0.1 ºC de precisión y concentración de amonio,
según el método descrito por Lind (1985).
Además cada 24 horas se registró la supervivencia de los organismos en cada
prueba.
Con los datos de supervivencia y mortalidad se determinó la CL50 a 24, 48, 72, 96,
120, 144 y 168 horas, por el método Probit (Finney, 1971), utilizando el programa para
computador “TOXIC” (Amin 1994, com. pers).
El TL50 (Tiempo Letal 50) que por definición, es el tiempo que tardan en morir el 50%
de los organismos expuestos a cada una de las concentraciones de metales probadas, se
calculó también por medio del método Probit (Finney, op. cit.).
La CL50 asintótica, que se define como la concentración en la cual la CL50 se
aproxima a una constante teórica, en la que ya no ocurren más muertes, se obtuvo
experimentalmente entre las 120 y 168 horas de observación (FAO, 1982; 1986).
La Razón de Potencia, que compara la toxicidad de un metal con respecto a otro,
al analizar sus CL50, se calculó con la relación descrita por Ahsanullah et al., (1981):
Donde
R.P. = Razón de potencia.
ACL50
ACL50 = CL50 del metal A (mg/l). R.P. =
BCL50
BCL50 = CL50 del metal B (mg/l).
(4)
Las curvas de mortalidad obtenidas se ajustan al modelo potencial negativo y
fueron calculadas con la relación:
y = axb
(5)
397
Donde
y = CL50 (mg/l).
x = tiempo (horas).
a y b son constantes.
Evaluación de la tasa de crecimiento de juveniles expuestos a metales tóxicos
En pruebas con juveniles de 3 ± 0.5 mm de altura, expuestos a los xenobioticos
durante 30 días, se evaluará el efecto de estos xenobióticos sobre su crecimiento.
Se probaran 5 concentraciones de tóxico además de un testigo sin tóxico, por
triplicado (Tabla 2). Se expondrán 60 organismos en cada concentración. Durante el
experimento, las almejas serán alimentadas diariamente con una mezcla de microalgas
Tetraselmis sp. Chaetoceros sp, con una densidad de 600,000 ± 150,000 (AvilésQuevedo, 1990).
Al inicio y término del experimento los especimenes se midieran para determinar
su altura, con un microscopio de disección provisto de una reglilla graduada y calibrada
en m.
La tasa de crecimiento se calculó mediante la relación propuesta por Stromgren
(1982):
T.C. =
h final -
h inicial
(3)
Tiempo
Donde
T.C. = Tasa de crecimiento (mm/día).
h final = Altura de los organismos en el tiempo final de observación (mm).
h inicial = Altura de los organismos al inicio del experimento (mm).
Tiempo = Días.
El aumento de la biomasa de los juveniles, se determinó por la diferencia del peso
seco de los especimenes al inicio y al final del experimento.
Treinta organismos de cada tratamiento, fueron extraídos de su concha y se
pesaron en una balanza analítica (Mettler, mod. Toledo, ag2-45 de ± 0.01 mg) para
determinar su peso húmedo. Posteriormente se colocaron en una caja Petri y se secaron
en un horno a 60 - 70 °C por un lapso de 12 horas o hasta alcanzar peso constante.
Después las muestras se colocaron en un desecador durante una hora e inmediatamente
se pesaron para determinar tanto el peso seco como su porcentaje de humedad.
Con los datos obtenidos se determinó la CE50 (Concentración Efectiva 50), que es
la concentración de metal donde se observó una disminución del 50% en la tasa de
crecimiento en comparación con el testigo.
Evaluación de la tasa de consumo de oxígeno en juveniles y adultos de
ventricosus
A.
La tasa de consumo de oxígeno se determinó siguiendo las recomendaciones de
Barber y Blake (1985), mediante cámaras cerradas (sistemas estáticos) de volumen
conocido, las cuales contenían en disolución la concentración de metal a que fueron
expuestos los organismos. Los niveles de oxígeno al inicio ( [O2 ini] ) y al final ([O2 fi] ) del
tiempo de permanencia de los especimenes en estos dispositivos, se determinaron
mediante un oxímetro de 0.1 ppm de lectura mínima, con corrección para salinidad.
398
En los bioensayos con juveniles se colocaron 10 organismos en recipientes de 400 ml
de capacidad y se realizaron 3 mediciones, con un lapso de 2 horas entre cada
medición .
En los experimentos con adultos se utilizaron cámaras de 1 litro de volumen, se
colocó un organismo por cámara (Figura 2). Se hicieron de 3 a 4 registros con un lapso de
1 hora entre cada uno.
Para determinar el consumo de oxígeno se aplicó la relación descrita por Cech,
(1990):
([O2 fi] - [O2 ini]) V
Consumo de O2 =
Donde
Tiempo
([O2 fi ]) = Concentración de oxígeno (mg/l) al final del tiempo de observación.
([O2 ini]) = Concentración de oxígeno (mg/l) al inicio del tiempo de observación.
V
= Volumen de la cámara (litros).
Tiempo =Tiempo transcurrido entre cada medición (horas).
Los valores de consumo de oxígeno se corrigieron con los datos obtenidos en la
cámara sin organismos.
La tasa de consumo de oxígeno se obtuvo al normalizar el consumo de oxígeno
con el peso seco de las almejas y se expresó en ml O2/h/g (peso seco).
Además, se determinó la CE100
(Concentración Efectiva 100) que es la
concentración de metal en la cual se observó un aumento del 100% en la tasa de
consumo de oxígeno y la CE50 (Concentración Efectiva 50) que es la concentración de
metal en la cual disminuye el 50% la tasa de consumo, en comparación con lo
observado en el testigo.
1
5
4
2
3
Figura 4. Dispositivo construido para realizar las evaluaciones de consumo de oxígeno: 1)
cámara hermética; 2) Oxímetro; 3) agitador magnético; 4) Electrodo para la lectura de
oxígeno; 5) cámara testigo sin organismos.
Evaluación de la tasa de excreción de juveniles y adultos de
expuestos a metales tóxicos
A.
ventricosus
399
(6)
La tasa de excreción se evaluará paralelamente en los bioensayos donde se
hicieron las determinaciones del consumo de oxígeno.
En las cámaras herméticas se determinó el contenido de NH3-N en el agua al
inicio y término de los experimentos.
Se tomaron muestras de 50 ml, se fijaron con fenol 5% (0.5 ml) y se almacenaron
a 5 ºC hasta el momento de realizar las determinaciones.
Posteriormente se analizaron alícuotas de 10 ml por duplicado, mediante la
microtécnica descrita por Solórzano, modificada por Lind (1985) (ver anexo 1).
Los valores de excreción de amonio se corrigieron con los datos obtenidos en la
cámara control sin organismos y normalizados con el peso seco de las almejas, para
obtener la tasa de excreción de NH3-N y se expresaron en g NH3-N /h/g (peso seco).
Evaluación del efecto de los metales y sus mezclas sobre la tasa de aclaración
La tasa de aclaramiento (tasa de filtración) se estimó de manera indirecta por
medio de la remoción de partículas (microalgas Chaetoceros sp.), de una suspensión con
volumen y densidad conocidas. Se usó un inóculo de 498,079 cel/ml, mismo que se
determinó como el más adecuado en pruebas preliminares, ya que no se observó la
formación de seudoheces (Grifftihs y King, 1979).
Tanto juveniles como adultos se expusieron a 5 concentraciones de metal y un
testigo por triplicado (Tabla 2), además de una cámara sin organismos que se utilizó para
determinar el porcentaje de sedimentación de las microalgas.
Durante el desarrollo de estos experimentos los organismos fueron alimentados
para evitar problemas de estrés por falta de alimento.
Las pruebas con juveniles se realizaron en recipientes de 400 ml de capacidad,
con burbujeo constante, donde se colocaron 20 organismos. Después de aplicar el inoculo
de microalgas, se tomaron muestras (10 ml, por duplicado) cada hora hasta obtener 3
alícuotas las cuales se fijaron con formalina al 5%, para ser analizadas posteriormente.
Los experimentos con adultos se hicieron en cámaras de 1 litro de volumen, con
burbujeo constante, donde se colocó un organismo por cámara. Se tomaron muestras
cada hora después de que se adicionó el inoculo de microalgas, hasta obtener 4
muestras, las cuales se fijaron con formalina al 5%. En las muestras se contó el número
de células presentes, con la ayuda de un hematocitómetro (American Optical). El cálculo
(7)
de la tasa de filtración se hizo mediante la ecuación de Griffiths y King (1979).
T. A.
V x (ln [Ci]– ln [Cf ])
t
Donde
T. A. = Tasa de aclaramiento(l/h).
V = Volumen de la cámara (litros).
Ci = Concentración inicial de células (células/l).
Cf = Concentración final de células (células/l).
T = Tiempo (horas).
También se calculó la CE100
(la concentración efectiva 100) que es la
concentración de metal donde la tasa de filtración aumenta 100% en comparación con el
testigo y la CE50 (Concentración efectiva 50) donde se observó una disminución del 50%
en la tasa de filtración.
400
BIOMARCADORES
Determinación de niveles de lipoperoxidación en glándula digestiva y branquia
La formación y el efecto de radicales libres originados por la acción de los metales,
se evaluará por medio de la técnica desarrollada por Buege y Aust (1978). Este análisis
se basa en la reacción del ácido tiobarbitúrico para identificar la presencia de
malondealdehídos (MDA) que son el producto de la actividad de los radicales libres sobre
las membranas.
Se tomaron alícuotas de 1 ml de los homogenizados de la branquia y de la
glándula digestiva y se incubaron a 90 ºC con una mezcla de ácido tiobarbitúrico (15%),
ácido tricloroacético (0.375%) y ácido clorhídrico (0.25 M) durante 20 minutos.
Posteriormente las muestras se centrifugaran (150 rpm) y se analizaran en un
espectrofotómetro a 535 nm.
Para el cálculo de la concentración de MDA presente en la muestra se utilizó la
fórmula de Buege y Aust (op. cit.):
C=
A
εP
Donde
C = Concentración de MDA (nM de MDA).
A = Absorbancia de la muestra.
= Coeficiente de extinción 1.56 x 105 M/cm.
P = Grosor de la fotocelda (1 cm).
Los valores obtenidos se expresaron en nM de MDA/g. (peso seco)
(14)
Evaluación de daño genético en el tejido de la branquia.
El daño genético en las células del tejido de la branquia se evaluará con la técnica
de electroforesis unicelular conocida también como ensayo cometa (Singh et al., 1988).
Este método consiste en la evaluación de la integridad del material genético de
una muestra de por lo menos 100 células, las cuales se lisan bajo condiciones alcalinas y
con los núcleos se realiza una electroforesis. La migración del núcleo forma una cauda
similar a la cola de un cometa, con el material genético dañado. La longitud de la cauda o
cola de cometa es proporcional al grado de daño que tiene la célula (Figura 4).
La branquia de los organismos supervivientes en los bioensayos, se extrajo y se
pesó en una balanza analítica; posteriormente se disgregó en forma manual. Del
disgregado se tomaron 20 l, colocándose sobre una capa de agarosa soportada en un
portaobjetos esmerilado.
Los portaobjetos con las muestras (dos por cada organismo) se colocaron en una
solución (2.5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10mM Tris, 1% Tritón X100 y 10% DMSO), para
romper las células y obtener los núcleos. Después los portaobjetos se colocaron en la
cámara de electroforesis y se les agregó buffer (10 N NaOH, 200 mN NaCl). La duración
de la electroforesis fue de 20 minutos, a 25 voltios y 300 amperios. Al término de este
proceso, las laminillas con las muestras se tiñeron con 75 l de bromuro de etidio y se
analizaron en un microscopio de epifluorescencia con un filtro de 560 nm.
401
Se evaluará la frecuencia de núcleos con y sin cauda, así como el tamaño de las
caudas en una muestra de 100 núcleos. Se aplicó la prueba estadística de "t" de student,
para determinar la existencia de diferencia entre los lotes de células expuestas al
genotóxico y las no expuestas.
B
A
Figura 5. Evaluación de daño genético con la técnica de Electroforesis unicelular.
A) núcleo sin daño; B) núcleo con daño genético, se observa el desarrollo de la cauda o
cola de cometa.
Con el peso de la branquia se determinó el Índice de Tejido Branquial (ITB)
mediante la relación:
I.T.B. =
Peso de la branquia
X 100
Peso del organismo
(15)
Evaluación de cambios histológicos (Histopatología)
Para la evaluación histológica, se tomaran muestras de organismos (2 a 3 por
tratamiento) cada 24 horas de iniciado un experimento. Los ejemplares se fijaran con
formalina al 10% durante 24 horas y después se cambiaron a alcohol etílico al 70%.
Posteriormente las muestras se lavaran en agua corriente durante 1 hora y se
deshidrataran con alcohol etílico de concentraciones graduales en un procesador de
tejidos, luego se incluirán en parafina. Los bloques se cortaran en un micrótomo de
rotación para obtener cortes histológicos de 3-5 micras de espesor.
Las muestras de tejido se montaran sobre portaobjetos y posteriormente se tiñeron
con hematoxilina-eosina (NOAA, 1983; Martoja y Person, 1970;).
Las preparaciones se revisaran al microscopio (Olympus con cámara) (40X1200X) para evaluar los cambios en los tejidos con respecto al testigo.
402
BIOENSAYOS DE TOXICIDAD EN CAMARONES PENEIDOS
Vanegas C., Zúñiga S., Gaxiola G., Robles C. y Betancourt M.
1. Campo de aplicación.
Los lineamientos que se presentan se centran en la evaluación de la toxicidad
aguda y crónica de xenobióticos en los camarones peneidos, haciendo énfasis en
el camarón blanco Litopenaeus setiferus (Golfo de México) y Litopenaus vannamei
(Pacífico mexicano). Se efectúa el mayor énfais en la determinación de la
toxicidad aguda (CL50) de tóxicos aislados en agua si bien se señalan
lineamientos para la determinación de la toxicidad crónica de xenobióticos.
2. Selección de organismos.
El camarón blanco L. vannamei y L. setiferus presentan una amplia distribución en
el Pacífico mexicano y en el Golfo de México. Ambas especies presentan una
reconocida importancia comercial a la vez que desempeñan un papel ecológico
relevante en el ecosistema marino y en los ambientes lagunares-estuarinos. L.
vannamei ha sido ampliamente cultivado a nivel mundial mientras que estudios
recientes demuestran el elevado potencial de L. setiferus como especie cultivable
en México. La reproducción y obtención de ambas especies bajo condiciones de
laboratorio ha sido exitosa lo cual garantiza un suministro constante de
especímenes. Numerosa literatura ha sido reportada para L. vannamei en
contraste con la generada para L. setiferus. No obstante estudios recientes han
abordado la fisiología, nutrición, reproducción y ecología de esta última especie (16). Evidencia directa demuestra que las postlarvas y juveniles de la especie son
sensibles al efecto tóxico de compuestos nitrogenados (7-11), a los metales
pesados (12, 13), a plaguicidas y bifenilos policlorinados (14-20) y a fluidos de
perforación del petróleo (21).
3. Origen de los organismos
Los organismos para las pruebas, en etapa de larva y/o postlarva deberán de provenir de
Laboratorios de producción de postlarvas de reconocida calidad. Para garantizar la
calidad de los organismos, deberá de conocerse el manejo previo de los reproductores, el
mantenimiento previo de los organismos a ser utilizados en los bioensayos (patrón y
dinámica de alimentación; parámetros fisicoquímicos; densidad; pruebas de calidad; etc.)
así como las condiciones de su transporte al laboratorio donde se efectuarán las
evaluaciones. Los lineamientos que se señalan se circunscriben a los estadios de
postlarva y juvenil.
4. Mantenimiento
Dependiendo del origen de los organismos, a su llegada al laboratorio deberán ser
mantenidos al menos durante los tres primeros días en las condiciones de envío. Los
parámetros fisicoquímicos de temperatura y salinidad deberán ser ajustados en una tasa
de 1 °C/d y 1 ups/d hasta alcanzar las condiciones de evaluación requeridas, siempre
dentro de los intervalos óptimos para cada estadío y para cada especie (Tabla 1). Una vez
alcanzadas las condiciones adecuadas, los organismos deberán ser mantenidos en éstas
al menos durante tres días antes de los ensayos.
403
Tabla 1. Parámetros fisicoquímicos considerados adecuados para el mantenimiento
en condiciones de laboratorio de diferentes estadios de L. setiferus y L. vannamei.
T
N-NH3 N-NO2S
pH
O.D.
mg/l
mg/l
mg O2/L
°C ups
PL 9
25
30
8.4
< 0.2
<5
L. setiferus
≥ 5.0
PL 20-30 28 25-28 8.4
<
0.2
<
5
≥ 5.0
Juveniles 28 25-28 8.4
< 0.2
<5
≥ 5.0
> 30 días
< 0.2
<5
L. vannamei Juveniles 28 30-35 8.1
≥ 5.0
1.6±0.1 g
T: temperatura; S: salinidad; O.D: oxígeno disuelto; PL-x: días después
de larva.
Espécie
Estadio
Densidad
n/l
2 org/ L
2 org/ L
1 org/ L
Referencia
9;10;4;5;8
9;10;4;5;8;21
9;10;8;21
1 org/ L
22
de la última metamorfosis
De manera ideal los organismos deben ser mantenidos en sistemas con filtro biológico y
agua de mar artificial (o reconstituída) o bien en sistemas de flujo de agua marina
proveniente de áreas no contaminadas, previamente filtrada, y garantizando las
condiciones de calidad de la misma. El agua utilizada no deberá estar en contacto con
bombas o tubería metálica. El agua de mar artificial (o reconstituída) deberá mantenerse
en aireación intensa el mayor tiempo posible antes de su uso tanto para el mantenimiento
de los organismos como para las pruebas experimentales. Durante la etapa de
mantenimiento y aclimatación, el fotoperiodo se mantendrá acorde a la estación climática
o bien 12:12 luz:oscuridad. Diariamente se deberán registrar, controlar y/o regular los
parámetros fisicoquímicos. El patrón de alimentación deberá ajustarse de acuerdo a los
requerimientos nutricionales de los estadios de cada especie que garantizen una
condición fisiológica óptima (Tabla 2).
Tabla 2. Patrones de alimentación para diferentes estadios del camarón blanco.
Espécie
L. setiferus
Estadio
PL 9
Proteína* Suministro
%
ad libitum
60
PL 20-30 50
Complemento
Referencia
Nauplios Artemia sp; 40 1;3;4;5;8
n/d/org
Nauplios Artemia sp; 20 1;3;4;5;8
100% PH
2-3 veces/d n/d/org
100% PH
8
2-3 veces/d
Juvenile 40
s
> 30 días
L. vannamei Juvenile 25 – 35
3 veces/d
s
1.6±0.1 g
* Porcentaje proteico de alimento formulado, particulado. PH: peso húmedo.
22
Esquemas de alimentación para estadios tempranos de L. setiferus y L. vannamei (misis a
PL7-10) han sido establecidos por Brito et al. (4) y Brito et al. (5) incluyendo en la dieta
nauplios de artemia, Chaetoceros gracilis, Tetraselmis chuii y alimento microparticulado
formulado, de acuerdo a las necesidades específicas proteicas de los diferentes estadios
tempranos de la especie.
La evaluación de los niveles de nitrógeno del amoníaco (N-NH3; mg/L) y del nitrógeno de
nitrito (N-NO2; mg/L) deberan efectuarse de manera rutinaria para evitar su acumulación y
404
en consecuencia su acción tóxica sobre los organismos (8,9). La evaluación de los niveles
del nitrógeno del amonio total (N-AT; mg L-1) y del nitrito pueden realizarse a través de
los métodos de azul de indofenol y de sulfanilamida, respectivamente (23). La
determinación de la concentraciónes del N-NH3 se obtendran a través de las ecuaciones
señaladas por Bower y Bidwell (24), considerando la salinidad, la temperatura y el pH de
la solución experimental.
Durante el periodo de aclimatación y mantenimiento los organismos deberán de ser
revisados constantemente. Si más del 20% del grupo bajo análisis presenta mortalidad,
muestra señales de enfermedad o presenta una condición fisiológica inadecuada, el lote
deberá ser descartado para experimentación.
5. Pruebas de toxicidad
5.1. Tóxicos
Los tóxicos utilizados deberán tener un elevado grado de pureza (grado reactivo). Si el
tóxico es soluble en agua, la solución stock deberá ser preparada en agua desionizada. Si
el tóxico es estable en solución, deberá prepararse una solución stock única al inicio de
las pruebas. Si el tóxico no es estable en solución (ej. sujeto a oxidación u otras
transformaciones químicas y/o biológicas) una nueva solución deberá prepararse previo a
su uso. Si el tóxico es una substancia orgánica, no soluble en agua, una solución acuosa
stock puede ser obtenida por la disolución inicial del compuesto orgánico en un solvente
adecuado (ej. acetona, etanol, propilen-glycol) y posteriormente ser disuelto en un
volumen conocido de agua desionizada; si se presenta alguna precipitación se deberá
eliminar la solución stock preparada. Cabe señalar que cuando se utiliza un solvente
orgánico para preparar la solución acuosa de un tóxico se deberá considerar un testigo
reactivo en las pruebas experimentales (evaluación de la concentración del solvente
adicionado en el acuario conteniendo la mayor concentración del tóxico evaluado).
El volumen máximo que se adicionará de la solución stock a los acuarios experimentales
deberá ser el menor volumen posible que no modifique las características del medio
experimental (ej. volumen; salinidad; pH). La concentración real del tóxico deberá ser al
menos evaluada en submuestras del medio al inicio y al término de los bioensayos. Si se
presumen transformaciones y/o cambios en las concentraciones de los tóxicos, se
deberán evaluar las concentraciones reales durante el transcurso de las pruebas. Si se
efectuán recambios del medio, se deberán evaluar las concentraciones reales antes y
después del recambio.
5.2 . Sistema de bioensayos
5.2.1. Cámaras experimentales
Los bioensayos deberán ser de tipo estático o semi-estático dependiendo del suministro,
la calidad del agua, de la estabilidad del compuesto en estudio y de los estadios de los
organismos en evaluacion. El agua para los experimentos provendrá de un sistema
contínuo de bombeo de agua de mar de una playa cercana, previamente filtrada (filtración
mecánica, química y UV), fuertemente aireada y decantada en oscuridad al menos 48 h
antes de su utilización; alternativamente se utilizará agua de mar artificial preparada
según protocolos convencionales, fuertemente aireada y decantada en oscuridad al
menos 48 h antes de su utilización. Los acuarios experimentales deberán ser
preferentemente de vidrio, lavados previamente con agua ácida y enjuagados con agua
de mar antes de su uso.
La forma de las cámaras dependerá de los estadios bajo análisis; en el caso de los
juveniles de los camarones el área es un aspecto de importancia dado el hábito bentónico
405
de los organismos. El volumen de las cámaras deberá de considerar la edad y el peso de
los organismos. Se recomienda un litro de solución por gramo de tejido animal si bien de
manera ideal deberá de utilizarse de 2 a 3 l de solución por gramo de tejido animal.
5.2.2. Parámetros fisicoquímicos
En el transcurso de las pruebas deberán registrarse y mantenerse constante la salinidad,
el pH, la temperatura y el oxígeno disuelto (la aireación deberá ser constante, de burbujeo
fino); los niveles de amonio y de nitrito no deberán exceder los señalados en la Tabla 1. El
fotoperiodo se mantendrá en 12:12 luz:oscuridad.
5.2.3. Alimentación
24 h antes del desarrollo de las pruebas, los organismos no deberán ser alimentados a fin
de evitar interferencia de los procesos digestivos (9-11). Dependiendo del tiempo de
exposición y de los objetivos de las pruebas, los organismos serán o nó alimentados
durante el transcurso de éstas. Si los organismos son alimentados, el suministro deberá
ser de manera ideal una vez al día, retirando el alimento remanente después de periodo
de alimentación adecuado para cada estadio y retirando posteriormente las heces
producidas. En este caso, el agua de los acuarios deberá ser recambiada diariamente (al
menos 50%) y las soluciones y concentración de los tóxicos deberán ser apropiadamente
ajustadas.
5.2.4. Organismos
Tanto las postlarvas como los juveniles en analisis deberán estar en etapa de intermuda y
deberán de presentar estadios y pesos similares. De manera ideal los organismos a ser
colocados en las cámaras experimentales deberán ser pesados y medidos.
Alternativamente, una sub-muestra representativa (mínimo 30 organismos) deberá ser
pesada y medida. Durante el desarrollo de esta actividad los organismos deberán
manipularse lo menos posible para evitar un estres excesivo.
5.2.5. Duración de las pruebas y recambio
El periodo de exposición dependerá de los objetivos que se persiguen. De manera ideal
las pruebas se realizarán durante 72 h para postlarvas y de 96 h para juveniles. Para
periodos mayores, los organismos deberán ser alimentados para evitar alteraciones
nutricionales o de inanición. Cuando los organismos no son alimentados, en el caso de
pruebas con tóxicos de baja estabilidad química y biológica, las soluciones de prueba
deberán ser recambiadas diariamente; en caso contrario, la prueba será inválida. Para
tóxicos de conocida estabilidad, de manera ideal las soluciones deberán ser renovadas
cada 48 h. Por otro lado, cuando los organismos son alimentados diariamente, se deberán
renovar las soluciones inmediatamente después del retiro de las heces producidas. En las
pruebas con recambio se deberán tomar muestras de las soluciones antes y después de
los recambios para determinar las concentraciones reales de los tóxicos. Si la
concentración de los tóxicos se modifica más del 20% respecto a las concentraciones
nominales, se deberán considerar mayores volúmenes de recambio.
5.3. Biobúsqueda o Pruebas de Intervalo de toxicidad
Para estimar la toxicidad de un xenobiótico se deberán efectuar pruebas previas de
biobúsqueda o de intervalo de toxicidad. Cuando se carece de la información relativa a la
toxicidad del producto se deberán de utilizar progresiones de las concentraciones en
escala logarítimica; cuando existe información disponible, por ej. en otras especies de
peneidos de estadios y habitas similares, se podrán utilizar progesiones de las
concentraciones en escala aritmética. Se considerará un mínimo de seis concentraciones
406
experimentales y un grupo testigo sin adición del tóxico. En el caso de que el tóxico se
requiera disolver para incrementar su solubilidad deberá de considerarse un grupo testigo
adicional para valorar el efecto del solvente utilizado. Se considerará al menos una réplica
por cada concentración. Por cada concentración se expondrán un mínimo de 20
organismos en el caso de postlarvas y de 10 en el caso de juveniles, los cuales en cada
caso serán elejidos de los sistemas de mantenimiento y colocados al azar en los acuarios
experimentales de exposición. Previo a la adición de los tóxicos, los organismos se
mantendrán mínimo 24h en aclimatación en los acuarios de exposición, sin adición de
alimento.
El volumen máximo que se adicionará de la solución stock a los acuarios experimentales
a fin de obtener las concentraciones seleccionadas de los tóxicos, deberá ser el menor
volumen posible que no modifique las características del medio experimental (ej. volumen;
salinidad; pH). La adición deberá efectuarse de manera muy lenta (para evitar una posible
exposición de los organismos a la elevada concentración de la solición stock o madre)
con una agitación suave, garantizando la completa mezcla del tóxico en el medio y
cuidando de no alterar el comportamiento de los organismos expuestos.
La mortalidad se registrará a lo largo del tiempo de exposición, con observaciones a las 0,
2, 4, 8, 12 y cada 12 horas posteriores hasta el término de la exposición. Los organismos
muertos durante el periodo de exposición deberán ser removidos lo antes posible para
evitar el deterioro de la calidad del agua. En adición a la mortalidad, se registrarán
posibles cambios en el comportamiento de los camarones (ej. alteraciones del equilibrio,
nado errático, cambios en la actividad locomotora, alteraciones en la alimentación, etc.)
así como las mudas producidas. La falta de respuesta de los organismos cuando sean
tocados suavemente con una varilla de vidrio se considerará como criterio de mortalidad.
Si en el transcurso de las pruebas, la mortalidad de los grupos testigo excede el 10%, la
prueba se invalida; el uso de factores de corrección por la mortalidad de los testigos no es
válida.
5.4. Bioensayo definitivo.
A partir de los resultados de la biobúsqueda, se establecerán las concentraciones
adecuadas para evaluar la toxicidad aguda del producto o compuesto. Se seguirá
el mismo procedimiento señalado previamente si bien se recomienda en este caso
evaluar un mínimo de dos réplicas por concentración experimental. Al igual que en
la biobúsqueda, la mortalidad se registrará a lo largo del tiempo de exposición, con
observaciones a las 0, 2, 4, 8, 12 y cada 12 horas posteriores hasta el término de
la exposición la cual puede prologarse hasta 144 h o más dependiendo de los
objetivos que se persiguen y garantizando siempre un suministro de alimento
adecuado para los organismos. El periodo fijado de exposición deberá ser durante
el periodo de intermuda de los organismos, a fin de evitar interferencias con los
eventos (bioquímicos y fisiológicos) que se desencadenan en el proceso de muda.
5.5. Cálculos
A partir de los resultados de mortalidad obtenidos se determinará la concentración
letal media (CL50-t), esto es la concentración (X) a la cual muere el 50% de la
población en un tiempo determinado (t, h) y/o el tiempo mediano de muerte (TL50),
esto es el tiempo (t, h) en el cual muere el 50% de la población en una
concentración determinada (X). En ambos casos no se considerarán en los
análisis el grupo testigo (no adición del tóxico; mortalidad < 10%) o las
concentraciones en las cuales se obtuvo el 100% de mortalidad.
407
Para la determinación de la CL50 y/o TL50, se utilizarán los programas de cómputo
diseñados para ello utilizando preferentemente modelos probit : X, probit : log X
y/o arcoseno : X, seleccionando el modelo de mejor ajuste y estableciendo la
significatividad de los modelos a través de la prueba de X2. En cada caso se
obtendrán los valores de CL50-t ± I.C. y TL50-x ± I.C. (I.C. = intervalo de confianza;
α = 0.05).
5.6. Validación de los bioensayos definitivos.
Los bioensayos serán validos siempre y cuando cumplan con los siguientes
especificaciones:
a) La mortalidad del grupo testigo no deberá ser mayor del 10% en el caso de
juveniles. Para el caso de postlarvas, la mortalidad del grupo testigo no debera
ser mayor a la mortalidad natural de cada una de las especies.
b) La concentracion real de los toxicos no debera exceder el 20% de la
concentracion nominal de los mismos
c) Independientemente de la aceptación del modelo seleccionado, el valor de la
CL50 deberá estar incluido dentro de las concentraciones experimentales
(interpolación) con la finalidad de asegurar un adecuado nivel de confianza.
5.7. Literatura Citada
(1) Gaxiola G. 1994. Requerimientos nutricionales de las postlarvas de Penaeus
setiferus y Penaeus duorarum (Crustacea, Penaeidea). Tesis de Grado de
Doctor en Ciencias. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional Autónoma de
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(3) Rosas C., A. Sánchez, P. Gallardo, J. Quiroz, G. Gaxiola, E. Diaz and L. Soto.
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Ciencias del Mar y Limnología. Universidad Autónoma de México. UNAM.
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Tesis de Grado de Maestría en Ciencias. Facultad de Ciencias. Universidad
Nacional Autónoma de México. México.
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(10) Alcaraz G., V. Espinosa and C. Vanegas. 1999b. Acute effect of ammonia and
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activity, behavior and feeding rate of the white shrimp (Litopenaeus vannamei).
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(21) Nuñez R. 2002. Efecto letal y subletal de un fluido de perforación polimérico
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(25) UNEP/FAO/IAEA. 1986. Test of the lethal toxicity of pollutants to marine fish
and invertebrates. Reference Methods for Marine Pollution Studies. No 43.
UNEP. 23 pp
410
BIOENSAYOS DE TOXICIDAD EN Xiphophorus montezumae
G. Alcaraz y M. Badillo
1. Campo de aplicación.
Los lineamientos que se presentan se centran en la evaluación de la toxicidad
aguda y crónica de tóxicos en peces poecílidos de la especie Xiphophorus
montezumae. Se efectúa el mayor énfasis en la determinación de la concentración
letal media (CL50) de tóxicos aislados, si bien se señalan lineamientos para la
determinación de la toxicidad crónica de xenobióticos.
2. Selección de organismos.
El pez cola de espada de Moctezuma (X. montezumae) es una especie endémica
de México. Se distribuye en el noroeste de México, en las cuencas del río Tamesí
en Tamaulipas, al norte de Veracruz y en los afluentes del río Pánuco en San Luis
Potosí. Sin embargo, su localidad tipo es en el manantial Capuchinas y Río Verde,
cerca de Rascón en San Luis Potosí (Espinoza, 1993). En general todas las
especies del género Xiphophorus son cultivables y pueden estar a disposición de
cualquier acuarista. Sin embargo, el 95% de los “Xifos” que se encuentran en los
comercios de peces nada tienen que ver con los ejemplares silvestres. Es decir,
los Xifos comerciales con llamativos colores son consecuencia de la hibridación
realizada por el hombre entre especies de peces con espadas (como X. helleri) y
los Platys o especies de peces sin espada (como X. Maculatus). Por lo tanto, los
organismos que se adquieran en comercios para ser utilizados en las pruebas de
toxicidad deberán ser descendientes directos de organismos silvestres o bien
deberán ser capturados de las cuencas de donde son endémicos.
3. Origen de los organismos
Los organismos para las pruebas deberán de ser capturados o ser descendientes de
organismos silvestres, de preferencia de alguna de las localidades tipo en San Luis Potosí
(Manantial Capuchinas y Río Verde). Para garantizar la calidad de los organismos
deberán de capturarse organismos sanos. Durante su traslado al laboratorio, donde se
411
realizarán las evaluaciones de toxicidad, los organismos deberán ser manipulados lo
menos posible para disminuir el estrés.
4. Mantenimiento
Las condiciones físicas y químicas del agua en que se mantendrán los organismos en el
laboratorio dependerán del origen de los organismos, dado que se mantendrán las
condiciones de colecta. Los organismos se mantendrán durante los tres primeros días en
las condiciones de captura. Los parámetros fisicoquímicos de temperatura deberán ser
ajustados a los niveles deseados a una tasa de 1 °C/d hasta alcanzar las condiciones de
evaluación requeridas (siempre dentro de los intervalos registrados en el ambiente). Una
vez alcanzada las características físico-químicas deseadas, los organismos se
mantendrán en éstas al menos durante 7 días antes de dar inicio a los ensayos.
La temperatura óptima para esta especie es de 25 °C aunque se puede mantenerse de
manera adecuada en un intervalo de 20 a 27 °C. El pH adecuado es Neutro-alcalino (7 8) y la dureza debe de mantenerse entre 4 y 8 dH (tipo dura). El control de la
concentración de amonio, nitritos y nitratos en el agua se mantendrá a través de cambios
parciales de agua. Durante la etapa de mantenimiento y aclimatación, el fotoperiodo se
mantendrá a 12:12 luz:oscuridad. Diariamente se deberán registrar y controlar los
parámetros fisicoquímicos del agua.
Los organismos se mantendrán en tanques medianos o grandes (40 –80 L de capacidad)
equipados con sistemas de filtro biológico o filtros de cascada. El sistema de filtración
debe ser potente, pero con poca generación de corriente. Se deberá de evitar el contacto
del agua con bombas o tubería metálica, el agua almacenada para recambios deberá de
mantenerse con aireación intensa el mayor tiempo posible antes de su uso, tanto para el
mantenimiento de los organismos como para las pruebas experimentales.
En cuanto a la alimentación se recomienda un aporte alimenticio combinado entre
alimento comercial en hojuelas y de tipo congelado (Artemia sp) o vivo (Artemia, larvas de
mosquito o Daphnia). El patrón de alimentación diaria será: alimento vivo o congelado por
las mañanas y en hojuelas por las tardes.
412
Tabla 1.- Valor nutricional del alimento desecado en hojuelas
Análisis
Porcentaje
Proteína cruda
46
Grasa cruda
8.0
Fibra cruda
2.0
Humedad
6.0
Fósforo
1.3
Vitamina
193 mg/kg
Durante el periodo de aclimatación y mantenimiento, los organismos deberán de ser
revisados constantemente. Si se presenta mas del 10% de mortalidad en el grupo, se
observan indicadores de enfermedad o se detecta algún tipo de condición funcional o
conductual inadecuada, el lote deberá ser descartado para experimentación.
5. Pruebas de toxicidad
5.1. Tóxicos
Los reactivos utilizados para las pruebas deberán tener un elevado grado de pureza
(grado reactivo). Si el tóxico es soluble en agua, la solución stock deberá ser preparada
en agua desionizada. Si el tóxico es estable en solución, deberá prepararse una solución
stock única al inicio de las pruebas. Si el tóxico no es estable en solución debido a
posibles transformaciones químicas y/o biológicas deberá de prepararse una nueva
solución antes de su uso. Cuando se trate de una sustancia orgánica, no soluble en agua,
deberá de realizarse una disolución inicial del compuesto orgánico en un solvente
adecuado (de acuerdo al químico de que se trate), para y posteriormente ser disuelto en
un volumen conocido de agua desionizada. En estos casos será necesario utilizar un
testigo reactivo en las pruebas experimentales.
El volumen máximo que se adicionará de la solución stock a los acuarios experimentales
deberá ser el menor volumen posible, de tal manera que no modifique de manera
significativa las características físico-químicas del medio experimental (volumen, pH, etc).
413
En todos los casos la concentración real del tóxico deberá ser evaluada en muestras del
medio al inicio y al término de los bioensayos. Si se presumen transformaciones y/o
cambios en las concentraciones de los tóxicos, se deberán evaluar las concentraciones
reales de manera frecuente durante el transcurso de los ensayos.
5.3 . Sistema de bioensayos
5.2.1. Cámaras experimentales
Los bioensayos deberán ser de tipo estático o semi-estático. El agua para los
experimentos se almacenará en tanques de plástico y será aireada en oscuridad 48 h
antes de su utilización. Los acuarios experimentales deberán de ser de vidrio. El material
que se utilice debe estar limpio; el lavado deberá de realizarse con agua ácida y el
enjuague con agua destilada. Se deberá de utilizar el material completamente seco. Las
dimensiones y volumen de los acuarios experimentales dependerán del tamaño y peso de
los organismos bajo análisis. Aunque de acuerdo a la literatura se recomienda un litro de
solución por gramo de tejido animal para organismos juveniles, para asegurar condiciones
adecuadas deberá de utilizarse de 2 a 3 L de solución por gramo de tejido animal.
5.2.2. Parámetros fisicoquímicos
En el transcurso de las pruebas deberán registrarse y mantenerse constante el pH, la
salinidad, la temperatura, la dureza y el oxígeno disuelto (la aireación deberá ser de
burbujeo fino y constante durante el tiempo de exposición). El fotoperiodo se mantendrá
en 12:12 luz:oscuridad.
5.2.3. Alimentación
Se suspenderá la alimentación de los animales 24 h antes iniciar el desarrollo de las
pruebas, esto con el fin de evitar interferencia de los procesos digestivos. Cuando se trate
de exposiciones crónicas o semi-crónicas los organismos deberán de ser alimentados
durante el transcurso de los ensayos. En este caso la alimentación deberá de ser
estrictamente controlada en cuanto a la cantidad y tiempo de alimentación (restringiendo
el tiempo de esta actividad a dos periodos de 1 h/ día). Es indispensable
retirar el
alimento remanente al término del periodo de alimentación y las heces producidas
posteriormente; estas actividades se deberán de realizar evitando al máximo generar
estrés en los animales. En los casos en los que se requiera alimentar a los animales
durante los ensayos se deberán de realizar recambios de agua diariamente, ajustando la
414
concentración de los tóxicos de manera adecuada. Se deberá en este caso de medir la
concentración real del tóxico de manera diaria.
5.2.4. Organismos
Todos
los
organismos
experimentales
deberán
de
ser
medidos
y
pesados
cuidadosamente 24 horas antes de colocarlos en los acuarios experimentales. Los
organismos experimentales expuestos a los diferentes niveles del tóxico deberán de ser
similares en talla (longitud estándar y peso), así como en madurez sexual (se recomienda
usar juveniles).
5.2.5. Duración de las pruebas
El periodo de exposición dependerá de los objetivos que se persigan. Las pruebas de
toxicidad aguda deberán de realizarse por un periodo mínimo de 96 h. Como se señala
anteriormente, para periodos mayores los organismos deberán de ser alimentados
durante la prueba para evitar alteraciones nutricionales.
Cuando se requiera alimentar a los animales, los recambios de agua deberán de
realizarse después del retiro de las heces. En todos los casos en que se practiquen
recambios se deberán tomar muestras de las soluciones de exposición antes y después
de los recambios para determinar las concentraciones reales de los tóxicos. En caso de
que la concentración del tóxico difiera en más del 20% respecto a la concentración
nominal, se deberán considerar mayores volúmenes de recambio. En el caso de tóxicos
de baja estabilidad química y biológica, las soluciones de prueba deberán ser
recambiadas diariamente. En el caso de tóxicos de conocida estabilidad las soluciones
deberán ser renovadas cada 48 h.
5.3. Biobúsqueda
Antes de iniciar las pruebas de toxicidad definitivas se deberán de efectuar pruebas
previas o biobúsqueda para determinar los intervalo de toxicidad. Se recomienda utilizar
progresiones de las concentraciones en escala logarítimica. Sólo cuando se cuente con
información disponible sobre la toxicidad del químico y de la especie se sugiere utilizar
progresiones de las concentraciones en escala aritmética. Se utilizará mínimo de siete
concentraciones experimentales y un grupo testigo sin adición del tóxico. En el caso de
415
que el tóxico se requiera disolver para incrementar su solubilidad deberá de considerarse
un grupo testigo adicional para valorar el efecto del solvente utilizado. Se considerará al
menos una réplica por cada concentración. Por cada concentración se expondrán un
mínimo 10 organismos. Los organismos se mantendrán durante un mínimo e 24h en
aclimatación en los acuarios de exposición antes de añadir el tóxico.
La mortalidad se registrará a lo largo del tiempo de exposición, con observaciones a las 0,
2, 4, 8, 12 y cada 12 horas posteriores hasta el término de la exposición, la cual se
sugiere de 96 h para juveniles. Los organismos muertos durante el periodo de exposición
deberán ser removidos inmediatamente para evitar la contaminación del agua. En adición
a la mortalidad, se registrarán posibles cambios en el comportamiento de los organismos
(ej. alteraciones del equilibrio, nado errático, alteraciones en la alimentación, etc.). La falta
de respuesta de los organismos cuando sean tocados suavemente con una varilla de
vidrio se considerará como criterio de mortalidad. Si en el transcurso de las pruebas, la
mortalidad de los grupos testigo excede el 10 %, la prueba se considerará inválida. En
ningún caso deberá de aplicarse el uso de factores de corrección para la mortalidad de los
testigos.
5.4. Bioensayo definitivo.
A partir de los resultados de la biobúsqueda se establecerán las concentraciones
adecuadas para evaluar la toxicidad aguda del tóxico. Se seguirá el mismo
procedimiento señalado previamente si bien se recomienda en este caso evaluar
un mínimo de dos réplicas por concentración experimental. Al igual que en la
biobúsqueda, la mortalidad se registrará a lo largo del tiempo de exposición, con
observaciones a las 0, 2, 4, 8, 12 y cada 12 horas posteriores hasta el término de
la exposición. Se considerarán 96 horas en pruebas de toxicidad aguda o más en
pruebas crónicas, dependiendo de los objetivos.
5.5. Cálculos
A partir de los resultados de mortalidad obtenidos de las pruebas de toxicidad
aguda se determinará la concentración letal media (CL50) y/o el tiempo mediano
de muerte (TL50). Para el análisis no se considerarán los datos de los grupos
testigos, las concentraciones o tiempos en que la sobrevivencia sea 100% o bien
416
las concentraciones con 100% de mortalidad. Para la determinación de la CL50
y/o TL50, se utilizarán los programas específicos de cómputo diseñados para este
fin. Preferentemente se utilizarán modelos tipo probit : X, probit : log X y/o
arcoseno: X. Se utilizará el modelo de mejor ajuste. La validez de los modelos se
determinará a través de la prueba de X2. En cada caso se obtendrán los valores
de CL50-t ± I.C. y TL50-x ± I.C. (I.C. = intervalo de confianza; α = 0.05).
5.6. Referencias
Alcaraz G., X. Chiapa, V. Espinosa and C. Vanegas. 1999a. Acute toxicity of
ammonia and nitrite to white shrimp Penaeus setiferus postlarvae. Journal of the
World Aquaculture Society. 30 (1): 90-97
Alcaraz G., V. Espinosa and C. Vanegas. 1999b. Acute effect of ammonia and
nitrite on respiration of Penaeus setiferus postlarvae under different oxygen levels.
Journal of the World Aquaculture Society. 30 (1): 98-106.
Espinoza, H. P. 1993. Listados faunísticos de México III. Los peces dulceacuícolas
mexicanos. Depto. De Zoología, I.B. Universidad Nacional Autónoma de México.
México.
Kruesi, C. K. 2004. Desempeño de nado en machos de Xiphophorus montezumae:
El costo de un ornamento. Tesis Licenciatura. Facultad de Ciencias, UNAM. 45 p.
Vanegas C. 1996. Efectos subletales del cadmio y del zinc en el camnarón blanco
Penaeus setiferus. Tesis de Grado de Doctor en Ciencias. Facultad de Ciencias.
Universidad Nacional Autónoma de México. México.
417
ANEXO 9.
PROCEDIMIENTO PARA LA GENERACIÓN DE
EXTRACTOS ORGÁNICOS Y ELUTRIADOS DE
SUELOS Y SEDIMENTOS PARA SU ANÁLISIS EN
PRUEBAS DE TOXICIDAD
418
3. PROCEDIMIENTO PARA LA GENERACIÓN DE EXTRACTOS ORGÁNICOS
Y ELUTRIADOS DE SUELOS Y SEDIMENTOS PARA SU ANÁLISIS EN
PRUEBAS DE TOXICIDAD
YOLANDA PICA GRANADOS
Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Cuernavaca, Morelos,
México
3.1. Principio
3.2 Campo de aplicación
3.3 Definiciones
3.4. Reactivos
3.5. Materiales y Equipos
3.6. Procedimiento
3.7 Precauciones
3.8. Manejo de datos
REFERENCIAS
3. 1 PRINCIPIO
La toxicidad, medida a través de los protocolos de prueba actualmente planteados
para organismos como Daphnia magna, Vibrio . fischeri, P. subcapitata y algunos
otros, esta referida a los efectos causados por compuestos en la fase soluble o
solubilizados, de tal modo que en el caso de matrices sólidas es necesario llevar a
esta fase los materiales contaminantes contenidos en los sólidos que se desean
analizar ( ej. sedimentos, suelos y productos industriales ) aplicando un
procedimiento controlado que permita el análisis de su toxicidad empleando
diversas especies de organismos de prueba sin la generación de falsos positivos.
Causados por la interferencia del tratamiento de las muestras.
3. 2 CAMPO DE APLICACIÓN
Es aplicable en el análisis de matrices sólidas (ej. suelos, sedimentos, productos
químicos etc.) con el objetivo de extraer los compuestos tóxicos solubilizables en
los solventes de extracción seleccionados por su posibilidad de aplicarse, en
volúmenes controlados, para el desarrollo de pruebas de toxicidad.
Los resultados de toxicidad que surjan de esta clase de manejo de muestra ya sea
por medio de elutriados, de extractos orgánicos o ambos, pueden ser aplicables
419
para comparaciones de dosis efectos cuando se comparan con el contenido de
contaminantes químicos (en casos en que las propiedades de polaridad de los
solventes empleados sea consistente para ambos), así mismo es de utilidad para
zonificar los gradientes de afectación en un sitio (ej. suelos o sedimentos), o en
su defecto, para el seguimientos del comportamiento en el tiempo, de un material
que se sospecha tóxico (ej. suelo, sedimento o materiales diversos), entre otros.
La aplicación de esta herramienta en estudios ambientales más amplios también
puede ser aplicable con fines de investigación ya que brindan información sobre el
potencial tóxico, sin embargo su interpretación requerirá de conjuntar otras
variables acordes a los objetivos de cada proyecto, de modo que la integración y
las implicaciones de dicha información deberá ser manejada por especialistas en el
tema.
3.3 DEFINICIONES
Estas definiciones han sido adecuadas a las necesidades del procedimiento.
Elutriado.- Extracto acuoso
Blanco .- es usado indistintamente con la palabra control.
Control negativo o blanco de procedimiento.- se asigna este término al lote o
tratamiento, dentro del diseño experimental, que replica las condiciones que
afectan al conjunto de tratamientos, excepto la sustancia o mezcla de ellas que son
investigadas en la prueba.
Control positivo se asigna este término a una muestra, dentro del diseño
experimenta del procedimiento de trabajo, cuya respuesta (CE 50) y su variabilidad
ha sido previamente evaluada y calibrada a través de pruebas de toxicidad. Esta
muestra se prepara tomando como muestra materiales empleados como de
referencia.
3. 4 REACTIVOS
•
•
Metanol calidad HPCL, Plaguicida o Nanogrado.
Agua destilada o desionisada
3.5 MATERIAL Y EQUIPO
Material
•
•
•
•
Sistema de extracción soxhlet.
Vaso pp. 250 o 500 mL
Conos de papel filtro No.1 purificados
Pipetas pasteur
420
•
•
•
•
•
Viales cromatográfico de 5 mL con tapa de rosca
Viales aforados de 5mL
Tubos de centrífuga plástico, desechables, estériles y de fondo cónico de 50 mL
con tapa
Tamiz de No. 60
Morteros y mano de mortero
Equipo
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Balanza analítica
Parrilla de extracción:
Evaporador Rotatorio Buchi
Horno de secado (40 ± 5 °C).
Plancha de calentamiento o Dispensador de nitrógeno.
Refrigerador a temperatura de 4 ± 2°C.
Pipetas automáticas de 1000 μL
Centrífuga
Baño ultrasónico
3.6 PROCEDIMIENTO
Para el análisis de materiales sólidos (ej. suelos, sedimentos u otros) se maneja el
material con base en peso seco para la producción de extractos orgánicos. Para la
generación de elutriados puede emplearse el material en su estado original (base
húmeda o seca).
3.6.1 Preparativos
Para muestras de suelo y sedimentos, y en otros casos en que esto aplique, el
material es secado a temperatura ambiente o, en su defecto, con ayuda de un horno
de secado a una temperatura de 40 ± 5 °C.
Posteriormente el material se disgrega y se muele en mortero hasta que este logre
su paso por un tamiz de malla del No. 60 (equivalente a 2mm de apertura de
malla).
En caso de productos químicos o manufacturados cuya presentación sea en
polvos, estos se procesan en su forma original sin molido o tamizado previo .
Una vez listo el material, se pesan idealmente 20 gr, sin embargo de no haber
muestra suficiente puede emplearse cantidades de 10 gr. en adelante o incluso
menores (5 gr), sólo si se sospecha que la muestra podría contener carga elevada
de tóxicos.
421
El material, para la producción de los extractos orgánicos, se pesa llenando un
cono de papel filtro del No. 1 (12.5 cm.) donde quedarán empacados. El papel filtro
se purifica con días de anticipación empleando la extracción en soxhlet en los
mismos términos del manejo indicado para muestras (11.5.1- 11.5.5) dejándose
secar a temperatura ambiente.
En el caso de la producción de elutriados, el material se pesa llenando un tubo de
centrífuga de 50 mL de material plástico esterilizado en el que se efectuará el
elutriado.
Para ambos casos, extractos orgánicos o elutriados,
deberá registrarse en la bitácora del analista.
el peso correspondiente
3.6.2 Extracción soxhlet (extracto orgánico)
La muestra contenida en el cono de papel filtro se introduce en el vaso del sistema
soxhlet y se monta junto con el refrigerante y el matraz de bola. El volumen del
solvente en el matraz de bola puede variar dependiendo de la capacidad del
sistema soxhlet en uso,, requerirá de 250 mL para el mas pequeño o hasta 350 ml
para uno de mayor volumen
Ajuste el volumen del solvente considerando que al condensarse e ir goteando en
el interior del vaso del soxhlet, debe llegar al codo de vaciado sin que el matraz
de bola se vacíe, en el debe quedar siempre un excedente para evitar que el
extracto se queme.
Montar el sistema soxhlet en la parrilla de extracción. En el caso del uso de
metanol como solvente de extracción, encender cada parrilla colocando el
indicador de temperatura en el número 5 o 6, conectar simultáneamente el sistema
de enfriamiento a una temperatura de 10 a 18 °C, cuanto más frío la condensación
será más eficiente.
En el caso de uso de metanol la extracción debe mantenerse en funcionamiento por
un tiempo de alrededor de 20 h, que es equivalente a aproximadamente a 10 o
12 ciclos de renovación. En caso del uso de otro solvente el tiempo de extracción
puede variar, en cuyo caso deberán hacerse los ajustes de tiempo, temperatura y
ciclos adecuados correspondientes.
Al término del periodo apagar las parrillas y dejar enfriar aun con el flujo de
enfriamiento en funcionamiento.
Desmontar los sistemas de extracción
Recuperar en el matraz de bola el solvente aún contenido en el vaso.
422
Cubrir con papel aluminio la boca de los matraces de bola que contienen los
extractos orgánicos y mantener en refrigeración hasta que se proceda a la
evaporación y concentración del extracto.
Por cada lote de muestras monte un blanco y un control positivo
3.6.3 Evaporación
Llene el Baño Maria del equipo de evaporación a un nivel que cubra los matraces
de bola una vez inmersos en él. Si el extractos es con base en metanol, caliente el
baño a 40 ± 5 °C y conecté la fuente de enfriamiento del refrigerante del mismo
cuidando que se logre un a cuya temperatura de 10 a 18 °C.
En caso de la concentración de extractos metabólicos, acoplar una bomba de vacío
conectada al refrigerante del evaporador rotatorio
Colocar el matraz de bola conteniendo el extracto, ajustar el seguro de la boca de
evaporador y girar a cierre la válvula de alivio del condensador del evaporador
rotatorio. Encienda la bomba de vacío y ajústela a una presión de 30 a 40 psi,
simultáneamente gire la perilla de rotación del equipo evaporador para que el
matraz de bola empiece a girar. Elija una velocidad media.
Ajuste su sistema de evaporación a fin de optimizar el proceso de concentración,
para ello ajuste la presión, la temperatura del Baño Maria y de la fuente de
enfriamiento tomando como base la siguiente información. Cuanto menor es la
presión que se emplea se requiere manejar la temperatura del baño en el límite
máximo aceptable (45 °C) y la de enfriamiento en los niveles más bajos mientras
que cuando la presión es mayor podemos emplear una menor temperatura en el
baño y un enfriamiento de temperatura media dentro del ámbito optimo señalado.
Cuando el volumen del solvente sean de alrededor de 2 ml, detenga la rotación de la
bola, apague la bomba de vacío y gire la válvula de alivio del condensador para
abrirla y liberar el vacío. Una vez hecho lo anterior podrá retirar el matraz de bola y
colocar el siguiente.
3.6.4 Trasvasado
Enjuague los viales de 5 ml con metanol y deje secar.
Transfiera el concentrado contenido en el matraz de bola a un vial de 5 ml
empleando una pipeta Pasteur (no las reutilice). Tome volúmenes adicionales de
solvente limpio (ej. Metanol) para limpiar las paredes del matraz, recupérelo y
adiciónelo también al vial junto con el concentrado previamente trasvasado.
Reduzca los volúmenes del concentrado del extracto colocando los viales sobre
una parrilla tibia, logre la temperatura idónea solo encendiendo la parrilla
sin
423
seleccionar niveles de calor (aproximadamente 30- 45 °C), también puede hacerse
uso de flujo de nitrógeno para su concentración. Cuando el nivel del volumen en el
vial se encuentre reduzca a la mitad de su capacidad, podrá nuevos volúmenes
que resulten de los enjuagues posteriores del matraz de extracción. Enjuague este
recipiente hasta que las paredes queden limpias, siempre
incorporando el
solvente al vial con el concentrado. Una vez terminada la limpieza del matraz deje
reducir e volumen del concentrado contenido en el vial hasta alcanzar un
aproximadamente 3 mL..
Cubra y guarde los viales en refrigeración hasta
toxicidad.
su análisis
en pruebas de
3.6.5 Preparativos para pruebas de toxicidad de extractos orgánicos
Transfiera el volumen de los viales conteniendo el concentrado a viales aforados.
Emplee enjuagues al vial original usando solvente limpio (ej. metanol), adicione al
vial aforado hasta alcanzar el nivel de 4 mL
Para preparar su sistema de prueba emplee como volumen máximo del extracto
orgánico, un volumen menor o igual a la concentración de solvente ( % v/v)
correspondiente al nivel de efecto no observable (NOEC), el cual deberá haber sido
previamente determinado. Dentro del sistema de prueba, la manera de demostrar
una adecuada selección de los volúmenes de solvente a niveles que no generan
falsos positivos es a través de la respuesta obtenida del análisis de toxicidad del
Blanco de procedimiento el cual deberá no presentar efecto en las pruebas de
toxicidad, o en su defecto. este no deberá ser mayor al efecto observado en el
control negativo .
Para el caso del metanol, la concentración máxima de este solvente en el sistema
de prueba que se establece como recomendable para Daphnia magna, Vibrio
fischeri, e Hydra attenuata, debe ser ≤ 1.2 .% . En caso de P. subcapitata este debe
ser ≤ 0.1%.
Tomando como ejemplo el sistema de prueba con Vibrio fischeri, cuyo volumen final
en el preparado de la concentración inicial es de 2750 μL, que se logra al adicionar
250μL de solución de ajuste osmótico (MOAS) y 2500mL de la muestra, entonces
se tendría que hacer el siguiente preparado:
Adicional los 250 μL de MOAS a la celdilla que contendrá la máxima concentración
Posteriormente adicionar 2500 μL de agua de reconstitución. Mezclar con ayuda de
la micropipeta de 1000 μL, succionando y eyectando el líquido tres veces
Con ayuda de una micropipeta de volumen variable ajustada a 30 μL, succionar ese
volumen de la celdilla en preparación, de modo que quede a 2720 μL su llenado.
424
Posteriormente restituir el volumen, nuevamente a 2750 μL, adicionando 30 μL del
concentrado del extracto orgánico.
Bajo este esquema de preparación de la muestra, se logra una concentración de
metanol en el sistema de prueba de 1.09% (v/v), menor al máximo recomendado.
Para efectuar los cálculos de la concentración inicial del sedimento en el sistema de
prueba ver 3.8
3.6.6 Elutriados
El material contenido en los tubos de centrífuga deberá asentarse al fondo del
recipiente. Logrará esto golpeando ligeramente la base del tubo sobre una
superficie, al terminar mida el volumen que ocupa el material leyendo en la escala
que presentan los tubos. Anote el dato en la bitácora junto con el registro del peso
correspondiente.
Mezclar el sedimento con agua destilada en una relación máxima de 1:4 (una parte
de sedimento por cuatro de agua) haciendo uso de la lectura del volumen que
ocupa el material de la muestra para establecer las proporciones. Puede elegir el
uso de relaciones de volumen menores, tal como 1:2, o 1:3, considere que la
limitante será la capacidad del tubo a 50 mL.
Cierre los tubos y agite vigorosamente a fin de mezclar
material en el agua y anote el volumen adicionado
anteriormente señalados.
homogéneamente el
junto con los datos
Posteriormente puede colocar los tubos en una parrilla de agitación
defecto emplear un baño ultrasónico.
o en su
En caso de usar baño ultrasónico, llene la tina a la capacidad correspondiente,
introduzca los tubos y cúbralos manteniéndolos sumergidos en el agua hasta el
nivel de la base de su tapa.
Ajuste el baño ultrasónico para
su funcionamiento por 60 minutos
calentamiento, tiempo que los tubos deberán permanecer en su interior
sin
Al término de una hora de agitación o sonicación apague los instrumentos y saque
los tubos. Déjelos reposar en posición vertical dentro de un refrigerador para su
sedimentación.
Por cada lote de muestras o número de control monte un blanco y un control
positivo
425
Previo al desarrollo de pruebas de toxicidad, coloque los tubos en centrifugación
por un tiempo de 15 min, hasta que se sedimente una velocidad de 2000 a 4000
rpm será suficiente.
Detenga la centrifugación y emplee el sobrenadante acuoso (elutriado) para el
desarrollo de pruebas de toxicidad
obteniendo los volúmenes necesarios
succionando el líquido sin resuspender el sedimentado.
Debido a que el elutriado es un extracto acuoso el procedimiento de prueba podrá
desarrollarse de la misma forma en que se llevan a cabo las pruebas de toxicidad
rutinarias.
Para efectuar los cálculos para determinar la concentración inicial emplee las guías
correspondientes indicadas en el numeral 12.1 haciendo los ajustes de volúmenes y
pesos que correspondan.
3.7 PRECAUCIONES
Cuidar que los materiales empelados en la producción de extractos o elutriados
este siempre libres de tóxicos.
Cuidar que a lo largo del procedimiento para la elaboración de extracto orgánico
no se adicione a este agua que puede incorporarse por condensación en los
refrigerantes del sistema soxhlet o por un inadecuado secado de la muestra.
Cuidar que durante la extracción, la cantidad de solvente siempre sea la
suficiente para alcanzar el nivel de vaciado del vaso del soxhlet, a fin de que se
mantengan los ciclos de renovación de extracción funcionando, de otra manera se
quemará el extracto contenido en el matraz de bola. En caso de que este no
alcance el nivel necesario puede adicionarse más solvente al matraz de bola
cuidando de apagar la parrilla y dejar enfriar previamente.
Cuidar que la temperatura del agua empleada para enfriar los refrigerantes se
mantenga en un intervalo adecuado para promover la condensación del solvente,
en el caso de metanol se recomienda manejar una temperatura de 10- 18 °C, de
emplearse otro solvente deberá ajustarse a la temperatura que convenga de
acuerdo a su volatilidad, evitando siempre la pérdida del solvente de extracción.
Para el enfriamiento puede emplearse un baño de recirculación de agua o en su
defecto agua directa de la toma.
Cuidar que al término o al inicio de cada lote extraído o por extraer en el sistema
soxhlet, se efectúe un enjuague con acetona (grado HPLC, nanogrado o
plaguicidas) y posteriormente con Metanol (grado HPLC, nanogrado o plaguicida)
con el objetivo de evitar contaminación cruzada.
426
Cuidar que mientras el sistema soxhlet no este en uso, se protejan las entradas de
los refrigerantes con papel aluminio para aislar de polvos.
Cuide que durante el uso del evaporador rotatorio se maneje un balance de las
variables de presión y temperatura del baño María a fin de evitar que el extracto de
la muestra se proyecte en el interior del condensador y lo contamine, o en su
defecto, se provoque la pérdida del extracto.
Cuide que durante la reducción de volúmenes durante el trasvasado de la muestra
a los viales de 5 mL si emplea parrilla de calentamiento , esta se encuentre solo
tibia de lo contrario el concentrado se proyectará y la muestra se perderá.
En el caso de la producción de elutriados, etiquete los tubos escribiendo
directamente sobre la pared o la tapa del mismo con plumón indeleble ya que las
etiquetas de papel puede desintegrarse en el baño ultrasónico
3.8. MANEJO DE RESULTADOS.
Consideraciones para los cálculos de concentración.
Tomando en cuenta que en el caso de la producción de extractos orgánicos, el
volumen de concentrado que se emplea para el análisis de toxicidad será solo una
porción del concentrado, deberemos hacer los ajustes y cálculos necesarios para
expresar adecuadamente el resultado.
Continuando con el ejemplo de la prueba con V. fischeri, se empleó una proporción
de 30 μL de un volumen total del concentrado de 4 mL obtenidos a partir de un
peso inicial de la muestra que para fines del ejemplo será de 20 g, entonces
podemos decir que la concentración inicial, expresada con mg Eq./ ml, en la
máxima concentración preparada sería de 54.54 mg Eq. /mL, a partir de los
siguientes cálculos
20 g_______
4000 μL / 30 μL
150 mg/mL/ 2.750 mL
x 1000 =
150 mg/ml
= 54.54. mg Eq../ml
Donde:
20 g
4000 μL
= Peso inicial del material extraído
= Vol. del concentrado del extracto
427
30 μL
2.750 m
= Vol. Del concentrado del extracto adicionado al sistema de
prueba para análisis de toxicidad
= Volumen total de la solución en el sistema de prueba.
La concentración obtenida debe ser expresada anteponiendo el término
“Equivalentes”, que se expresa como Eq. (54.54 mg Eq. /mL). Se introduce esta
modalidad ya que debe considerarse que la concentración obtenida esta referida a
una cantidad de material que fue extraída, de modo que en realidad los organismos
de prueba se exponen al material soluble o extractado cuya cantidad no es posible
determinar, sin embargo esta es relativa al peso medido del material trabajado.
Las concentraciones de las diluciones subsecuentes tendrán que afectarse por el
factor de dilución empleado para su preparación.
3.8.1 Interpretación de resultados
Los resultados de la prueba al concentrado del control negativo o blanco de
procedimiento, proveen información útil para detectar la posibilidad de falsos
positivos, ya que a través de su análisis se determinar la contribución que el
proceso de manejo de muestras, ya sea por producción de extractos o elutriados,
tiene sobre la respuesta tóxica obtenida en pruebas de toxicidad, así como la del
posible efecto que pueda causar la adición de volúmenes de solvente en el sistema
de prueba.
Con fines de aceptación de los resultados, las pruebas de toxicidad del blanco de
procedimiento deberán demostrar que no hay efecto, o que este no es mayor al
efecto observado en el control negativo. Esto indicará que el proceso de manejo de
muestra así como el volumen de solvente adicionado al sistema de prueba no
contribuye a la toxicidad ni a la generación de falsos positivos..
El control positivo permitirá controlar la efectividad del proceso de extracción de tal
manera que la respuesta de la prueba de toxicidad del concentrado o elutriado
deberá encontrarse en una concentración previamente determinada para el
material de referencia, tanto e el caso del elutriado como del extracto orgánico.
REFERENCIAS
Pica-Granados Y., Huerto-Delgadillo R.I., Trujillo D. G., Hernández S. H y Bucio
O.U.. 1998. “ CONTROL INTEGRAL DE LIRIO ACUATICO E IMPLICACIONES
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Subcoordinación de Hidrobiología y Evaluación Ambiental. Coordinación de
Tratamiento y Calidad del Agua. Instituto Mexicano de Tecnología del Agua.
México. Vol II: 58pp
428
Ho. T.Y. H. and Quinn G. J. 1993. Physical and Chemical Parameers of sediment
extaction and fractionation that influence toxicity as evaluated by Microtox. Env.
Toxicol and Chem. 12:615-625.
Secretaria de Comercio y Fomento Industrial. 1995. Norma Mexicana NMX-AA112- SCOFI. Análisis de agua y sedimentos. Evaluación de toxicidad aguda con
Photobacterium phosphoreum. Método de pruebas DGN. Pag. 36
Sveson A., Vikor T and Remberger M. 1997. Toxicity of elemental sulfur in
sediments 1998. Env. Toxicol. 13: (3): 217-224
Jonson T and Long. E. R. 1998. Rapid toxicity assessment of sedimets from
estuarine ecosystems a new tandem in vitro testing aproach. Environm. Toxicol.
Chem. 17 (6) 1099-1106.
Hong Do C. L. Becker-van Stooten K, Jean-Jacques S., Lam Minh T., Tarradellas J.
2000. Toxicity of sediments from the Ho Chi Minh city canals and Saigon River , Viet
Nam. Env. Toxicol. 15: (5): 469-475
Wang C., Wang, Y. , Mo Z. and Wang Z. 2003. Ecotoxicological Examination of
sediment extracts of Huaihe River, China by in vitro bioassay. Bull. Env. Contam.
Toxicol. 71: 782-790.
U.S Army Corps of Enginierrs, 1976. Ecological Evaluation of proponed discharge
of dredge or fill material into navegable waters. COE D-76-17 Final Report U.S
Army Engineer Water Ways Experiment Sation Vicksburg. MS.
429
DETERMINACION DE DUREZA
1.0
Objetivo y Alcance
2.0
Definiciones
3.0
Referencias
4.0
Interferencias
5.0
Medidas de Seguridad
6.0
Equipos y Materiales
7.0
Reactivos y Materiales de Referencia
8.0
Control de Calidad
9.0
Desarrollo
10.0 Cálculos
430
1. Objetivo y Alcance
1.1 Objetivo
Establecer el procedimiento para determinar Dureza total.
1.2 Alcance
Este procedimiento es aplicable para muestras de agua, naturales, residuales
y residuales tratadas.
2.0 Definiciones
2.1 Dureza
Concentración total de iones de calcio y magnesio expresada como su
equivalente
en Carbonato de Calcio ( CaCO3 ).
3.0 Referencias
3.1 NOM-AA-072-SCFI-2001, “Análisis de agua.- Determinación de Dureza Total
en aguas naturales, residuales y residuales tratadas.
4.0 Interferencias
4.1 El E.D.T.A forma complejos con hierro, manganeso, cobre, zinc, plomo,
cobalto, níquel, bario, estroncio y algunos otros metales.
4.2 En la titulación de calcio y magnesio, los estados altos de oxidación del
manganeso reaccionan rápidamente con el indicador para formar productos de
oxidación incoloros.
4.3
En presencia de aluminio en concentraciones mayores a 10 mg/L, el color
azul que indica el punto final de la titulación puede aparecer y en poco tiempo
puede regresar a rojizo.
4.4
La materia orgánica coloidal o en suspensión también puede interferir en el
punto final.
5.0 Medidas de Seguridad
5.1 Cuando se trabaje con cualquiera de los compuestos químicos descritos en el
Procedimiento, usar equipo de seguridad tales como; bata, guantes de látex y
lentes de seguridad.
431
6.0 Equipos y Materiales
6.1 Equipos
6.1.1 Balanza analítica con precisión 0.1 mg
6.2 Materiales
6.2.1 Matraces erlenmeyer de 250 mL
6.2.2 Pipetas volumétricas de diferentes capacidades clase A
6.2.3 Bureta de 25 o 50 mL clase A
6.2.4. Vasos de precipitado
6.2.5 Matraces aforados de diferentes volúmenes.
7.0 Reactivos y Materiales de Referencia
Todos los reactivos utilizados deben ser grado reactivo analítico. El agua utilizada
debe entenderse como agua desionizada.
7.1.1 Cloruro de Amonio (NH4 Cl)
7.1.2 Hidróxido de Amonio concentrado (NH4 OH)
7.1.3 E.D.T.A de Magnesio
7.1.4 E.D.T.A de Sodio
7.1.5 Indicador negro de eriocromo T (sal sódica del ácido 1-(1-hidroxy-2Naftilazo)-5 Nitro-2 Naftol- 4 Sulfónico)
7.1.6 Clorhidrato de Hidroxilamina ( NH2 OH HCl).
7.1.7 Cloruro de Sodio (NaCl)
7.1.8 Carbonato de Calcio (CaCO3)
7.1.9 Acido Clorhídrico (HCl)
7.1.10 Rojo de metilo.
7.1.11 Agua desionizada.
432
7.1.12 Solución Amortiguadora.
Puede prepararse por cualquiera de los procedimientos siguientes:
7.1.12.1 Disolver 16.9 g de cloruro de amonio (NH4Cl) en 143 mL de hidróxido de
amonio
concentrado (NH4OH), agregar 1,25 g de sal de E.D.T.A. de magnesio y diluir a
250 mL con agua.
7.1.12.2 En ausencia de la sal de magnesio de E.D.T.A., disolver 1,79 g de la sal
y 0,78 g de MgSO4 H2O o 0,644 g de MgCl2 6H2O en 50 mL de agua destilada.
Disolver 16,9 g de NH4Cl en 143 mL de NH4OH concentrado. Mezclar ambas
soluciones y aforar a 250 mL con agua.
Guardar en un recipiente de plástico de vidrio resistente, herméticamente cerrado
para evitar pérdida de NH3 o entrada de CO2. Renovar mensualmente o cuando al
añadir 1 o 2 mL a la muestra el pH sea < 10.0 ± 0.1.
7.1.13 Indicador Negro de Eriocromo T mezcla seca pulverizada.
7.1.14 Solución valorada de E.D.T.A.
Pesar 3.723 g de E.D.T.A. de sodio, disolver en agua destilada y aforar a 1 L.
7.1.15 Reactivos para preparar la solución estándar de carbonato de calcio.
7.1.16 Indicador de rojo de metilo.
Disolver 0.1 g de sal de sodio de rojo de metilo y diluir a 100 mL con agua
7.1.17 Solución de ácido clorhídrico 1:1
Mezclar un volumen de ácido clorhídrico concentrado con un volumen igual de
agua.
7.1.18 Solución de hidróxido de amonio 3N.
Diluir a 1 L de agua 240 mL de hidróxido de amonio (NH4OH).
7.1.19 Preparación de la solución estándar de Calcio.
Secar el carbonato de calcio CaCO3 anhídro en polvo (bajo en metales pesados,
álcalis y magnesio) a 200 0C durante toda la noche. Pesar 1,0 g de carbonato de
calcio en un matraz erlenmeyer de 500 mL. Colocar un embudo en el cuello del
matraz y agregar poco a poco, solución de ácido clorhídrico 1:1 hasta que todo el
carbonato se disuelva. Agregar 200 mL de agua y hervir por unos minutos para
eliminar el CO2. Enfriar y agregar unas cuantas gotas del indicador rojo de metilo y
ajustar a un color intermedio anaranjado, por adición de hidróxido de amonio 3N o
ácido clorhídrico 1:1. Aforar a un litro en un matraz aforado. Esta solución es
equivalente a 1.0 mg de CaCO3 por 1.0 mL.
433
7.1.20 Valoración de la solución de E.D.T.A.
7.1.20.1 Tomar 10 mL de la solución estándar de carbonato de calcio y diluir a 50 mL con
agua en un matraz Erlenmeyer de 250 mL.
7.1.20.2 Agregar de 1 a 2 mL de la solución amortiguadora para llevar la solución
a un pH de 10 +/- 0.1
7.1.20.3 Agregar de 1 a 2 gotas o una cantidad adecuada del indicador en polvo
de
negro de eriocromo T.
7.1.20.4 Titular con la solución de E.D.T.A lentamente, con agitación continua
hasta un vire a color azul.
7.1.20.5 Hacer un mínimo de tres titulaciones y calcular F.
Cálculo de (F):
F =
mg de CaCO3 en la solución titulada
Volumen de solución de E.D.T.A., empleada en la titulación.
8.0 Control de Calidad
8.1 Analizar por duplicado las muestras.
8.2 Al titular agregar lentamente el titulante agitando continuamente la muestra.
9.0 Desarrollo
9.1 Tomar 50 mL de la muestra o una alícuota llevada a 50 mL con agua
desionizada.
9.2 Ajustar a un pH de 10 +/- 0,1 adicionando el volumen necesario de solución
amortiguadora (generalmente de 1 a 2 mL).
9.3 Agregar una cantidad adecuada de negro eriocromo T (0.2g).
9.4 Titular con la solución de E.D.T.A. valorada 0.01 M agitando constantemente
hasta que desaparezcan los últimos matices rojizos. Añadir las últimas gotas a
intervalos de 3 a 5 segundos hasta a azul.
434
10 Cálculos
10.1 El cálculo de la dureza total se determina utilizando la siguiente ecuación.
(A-B) x 1000 x C
Dureza total en mg/L de CaCO3
=
D
Donde:
A= mL de solución de E.D.T.A. gastados en la titulación.
B = mL de solución de E.D.T.A. gastados en la titulación del blanco.
C = Factor obtenido en la valoración de la solución de E.D.T.A.
D= mL de muestra utilizados.
Medición de pH
10.0
Objetivo y Alcance
11.0
Definiciones y Notaciones
12.0
Referencias
13.0
Interferencias
14.0
Medidas de Seguridad
15.0
Equipos y Materiales
16.0
Reactivos y Materiales de Referencia
17.0
Control de Calidad
18.0
Calibración
10.0 Desarrollo
11.0 Prevención de la contaminación
435
1.0 Objetivo y alcance.
1.1 Objetivo.
Establecer el procedimiento
acuosas.
para la medición del pH en soluciones
1.2 Alcance.
Este procedimiento es aplicable a muestras de agua o soluciones acuosas.
2.0 Definiciones y notaciones.
2.1 Definiciones.
2.1.1 Potencial de hidrógeno pH.
Es el logaritmo negativo de la concentración del ión hidrógeno en una
solución acuosa o el logaritmo del recíproco de la concentración de iones
hidrógeno. El valor del pH es la acidez o alcalinidad de una sustancia
expresada en términos de la relación entre la fuerza electromotriz (E)
expresada en volts, entre un electrodo de vidrio y uno de referencia cuando
se sumergen en el agua, y la fuerza electromotriz (Es) expresada en volts,
entre los mismos electrodos cuando se sumergen en una solución
reguladora de referencia.
pH = - Log [H+]
2.1.2
Acidez.
Es la capacidad cuantitativa del agua para reaccionar con los iones
hidroxilos.
2.1.3
Alcalinidad.
Es la capacidad cuantitativa del agua para reaccionar con los iones de
hidrógeno.
2.2 Notaciones
2.2.1 Potencial de hidrógeno ( pH )
2.2.2 Compensador de temperatura ( ATC )
2.2.3 Control de calidad ( CC )
2.2.4 Muestra duplicada ( MD )
2.2.5 Calibración ( CAL )
436
2.2.6
Lectura ( READ )
3.0 Referencias.
3.1USEPA Método 9040 C Medición electrométrica de pH Revisión 3,
Agosto 2002.
3.2 NMX-AA-008-SCFI-2000 Determinación de pH en Agua.
3.3 Standard Methods for the Examination of water and Wastewater
American Health Association American Water Works Association Water
Pollution Control Federation 14 Edition
3.4 1978 Annual Book of ASTM Standards Part 31 D 1293 “Standard Test
Method”
4.0 Interferencias.
4.1 Error por Sodio a niveles de pH > 10 pueden ser reducidos o eliminados
utilizando un error para bajo error en sodio, el cual puede funcionar a
temperaturas elevadas y para medir valores de pH superiores a 10. Las
variaciones de la temperatura pueden causar errores en la medición por
lo que siempre se debe de indicar la temperatura a la cual se ha medido
el pH.
4.2 Puede haber errores de lectura si el electrodo se recubre con algún
material grasoso que no se remueva fácilmente con los enjuagues, por
lo que el electrodo se puede limpiar con detergente y enjuagarlo varias
veces con agua, dejarlo remojar en una solución 1:10 HCl de tal forma
que la tercera parte baja del electrodo esté sumergido, y después
enjuagar con agua en abundancia.
5.0 Medidas de seguridad.
5.1 Usar bata, guantes y lentes de seguridad.
6.0 Equipos y materiales.
6.1 Equipos.
6.1.1Medidor de pH capaz de medir el pH en el intervalo de 0 a 14
por medio del empleo de un electrodo de vidrio y otro de referencia o un
electrodo combinado. De preferencia con compensación de temperatura.
6.1.2 Electrodo bajo error en Sodio
437
6.1.3 Parrilla de agitación.
6.2 Materiales.
6.2.1
6.2.2
6.2.3
6.2.4
Vasos de precipitados 250 ml
Pizetas de 500 ml.
Cepillo pequeño de cerdas suaves.
Barras de agitación magnéticas.
7.0 Reactivos y materiales de referencia.
7.1 Reactivos.
7.1.1 Todos los productos químicos usados en este procedimiento deben
ser grado reactivo analítico a menos que se indique otro grado, el
agua utilizada debe entenderse que se trata de agua desionizada.
7.1.2 Acido Clorhídrico
7.1.3 Detergente líquido neutro libre de fosfatos.
7.1.4 Solución interna para electrodo de referencia KCl 3.33 mol.
7.2 Materiales de referencia.
7.2.1 Se usarán soluciones amortiguadoras, con trazabilidad a un
organismo autorizado.
Las soluciones amortiguadoras utilizadas deben cubrir el intervalo de
medición en el que se trabaja.
Estas soluciones se pueden deteriorar por el crecimiento de hongos o por
contaminación, por lo cual se recomienda que se conserven bien tapadas y
en refrigeración.
8.0 Control de calidad.
8.1 Secuencia de análisis:
8.1.1Calibrar el equipo en el intervalo de medición adecuado.
8.1.2Leer el lote de muestras.
8.1.3Por cada 10 muestras leer una muestra por duplicado.
8.1.4Por cada 10 muestras leer una solución amortiguadora de pH
conocido para verificar la calibración del potenciómetro.
8.1.5Terminar el análisis leyendo una solución amortiguadora de pH
conocido.
438
9.0 Calibración.
9.1 Para calibrar el equipo elegir dos soluciones amortiguadoras a
temperatura ambiente que cubran el intervalo de trabajo.
9.1.1 Para el primer punto de calibración, colocar la punta del electrodo en
la primera solución amortiguadora y proceder de acuerdo al manual del
equipo para calibrar la solución amortiguadora seleccionada para la primera
lectura. 9.1.2 Enjuagar el electrodo con agua, secar y calibrar el Segundo
punto de calibración.
Introducir la punta del electrodo en la segunda solución amortiguadora y
proceder de acuerdo al manual del equipo para calibrar la segunda solución
amortiguadora seleccionada.
10.0 Desarrollo.
10.1 Poner a temperatura ambiente las muestras, no deben diferir por más de 2
ºC con la solución amortiguadora.
10.2 El potenciómetro cuenta con compensador de temperatura en caso de que
no fuese así tomar la temperatura con un termómetro calibrado.
10.2 Vaciar en un vaso de precipitado un volumen de 50 ml de cada muestra,
agregar una barra de agitación y poner en una parrilla de agitación.
10.3 Introducir el electrodo de manera que no toque el fondo para permitir la
agitación de la muestra con la barra magnética.
10.4 Repetir la medición con otro volumen igual de muestra, las lecturas no deben
diferir por < 0.1 unidades de pH.
10.5 Anotar y registrar el pH junto con la temperatura de la muestra.
11.0 Prevención de la contaminación.
11.1 Enjuagar muy bien el electrodo con agua
contaminación cruzada.
y secar para evitar la
11.2 Mantener las soluciones amortiguadoras en refrigeración para evitar el
crecimiento biológico.
11.3 Calibrar con soluciones amortiguadoras frescas.
439
1.0 Lavado de material para Daphnia Magna y nemátodo “Panagrellus
redivivus.
1.1 Lavar con detergente neutro libre de fosfatos y enjuagar dos veces con agua
de la llave.
1.2 Enjuagar el material con ácido nítrico (HNO3) al 30 % para eliminar residuos
metálicos. Enjuagar con agua desionizada y escurrir.
1.3 Enjuagar con acetona (C3H6O) para eliminar residuos orgánicos. Enjuagar con
agua desionizada. Dejar secar completamente.
1.4 Esta serie de lavados tienen que llevarse a cabo de 24 h a 48 h antes del
bioensayo, proteger el material del polvo.
1.5 Antes de utilizar el material que va a contener a los organismos, enjuagarlo
con agua reconstituida.
440
EXTRACCION DE CONSTITUYENTES TOXICOS ( PECT ) PARA LA
PRUEBA DE TOXICIDAD
CONTENIDO
1.0 Objetivo y Alcance.
2.0 Definiciones.
3.0 Referencias.
4.0 Equipos y materiales.
5.0 Reactivos
6.0 Preservación de muestras.
7.0 Control de Calidad.
8.0 Desarrollo.
441
1.0
Objetivo y Alcance
1.3 Objetivo.
Establecer el procedimiento para llevar a cabo la extracción
constituyentes tóxicos ( PECT ) para la prueba de Toxicidad.
de
1.4 Alcance.
Es aplicable a muestras con una concentración mayor a 0,5 % de sólidos a
las que una vez extraídas se les realizará la prueba de toxicidad aguda o
crónica.
2.0
Definiciones
2.1 Prueba de extracción. El procedimiento de laboratorio que permite
determinar la movilidad de los constituyentes de un residuo, que lo hacen
peligroso por su toxicidad al ambiente.
3.0 Referencias.
3.1 NOM-053-SEMARNAT- Que establece el procedimiento para llevar a
cabo la prueba de extracción para determinar los constituyentes que hacen a
un residuo peligroso por su toxicidad al ambiente.
3.2 USEPA METHOD 1311 Toxicity Characteristic Leaching Procedure
Revisión 0 Julio 1992
4.0 Equipos y materiales.
4.1 Equipo de agitación rotatorio.
El aparato de agitación debe ser capaz de hacer girar el vaso o recipiente de
extracción a 30 ± 2 r.p.m.
4.2 Recipientes de extracción.
Se necesitan frascos con suficiente capacidad para contener la muestra y el
reactivo de extracción No es necesario que estos frascos queden
completamente llenos, pueden ser de diferentes materiales como vidrio
borosilicato o plástico politetrafluoroetileno ( PTFE ).
4.3 Equipo de filtración.
Utilizar cualquier unidad de filtración capaz de sostener un filtro de fibra de
vidrio y resistir la presión para llevar a cabo la separación. Estas unidades de
filtración deben tener un volumen interno mínimo de 300 ml y deben estar
442
adaptadas para acomodar un filtro de 47 mm de diámetro como mínimo (se
recomienda una unidad de filtración que tenga una capacidad interna de 1.5 L
ó más y que estén equipados para dar cabida a filtros de 142 mm de
diámetro).
4.3.1 Materiales de construcción.
Los recipientes de extracción y los equipos de filtración deben estar hechos
de materiales inertes que no lixivien o absorban los componentes del residuo.
4.4 Filtros.
Los filtros deben de ser de fibra de vidrio, sin aglutinantes y tener un tamaño
efectivo de poro de 0.6 a 0.8 µm ó equivalente. No deben utilizarse prefiltros
Cuando se evalúa la movilidad de los metales, los filtros deben ser lavados
con ácido nítrico 1.0 N y posteriormente realizar tres enjuagues consecutivos
con agua (se recomienda un mínimo de 1L por enjuague). Los filtros de fibra
de vidrio son frágiles manejar con cuidado.
4.5 Medidor de pH: El medidor deberá cubrir el intervalo de medición de 0 a
14 U de pH a 25 ºC.
4.6 Balanza Analítica con sensibilidad de 0.1 mg
4.7 Vasos de Precipitado ó Matraces Erlenmeyer de Vidrio de 500 ml.
4.8 Vidrio reloj de diámetro adecuado para cubrir el vaso de precipitado o el
matraz Erlenmeyer.
4.9 Agitador magnético.
4.10 Parrilla con agitación / calentamiento.
4.11 Estufa con control de temperatura para trabajar de 100 +/- 5 ºC
4.12 Termómetro de 0 - 100 ºC
5.0 Reactivos.
5.1 Reactivos.
Los productos químicos utilizados son grado reactivo analítico a menos que
se indique otro grado. El agua utilizada debe entenderse que es agua
desionizada.
5.1.1 Acido Clorhídrico ( HCl) 1.0 N
5.1.2 Acido Nítrico ( HNO3) 1.0 N
5.1.3 Hidróxido de sodio (NaOH ) 1.0 N
5.1.4 Acido Acético Glacial ( CH3CH2COOH ).
443
5.2 Fluido de Extracción.
5.2.1 Fluido de Extracción # 1: Adicionar 5.7 ml de Acido Acético Glacial
(CH3CH2COOH) a 500 ml de agua, adicionar 64.3 ml de NaOH 1.0 N y
llevar a un volumen de un litro en matraz aforado. Cuando esta solución
esta correctamente preparada, el pH es 4.93 ± 0.05.
5.2.2 Fluido de Extracción # 2: Diluir 5.7 ml de Acido Acético Glacial
(CH3CH2COOH) en agua a un volumen de 1L. Cuando ésta solución está
correctamente preparada, el pH es de 2.88 ±0.05.
Los reactivos de extracción deben ser verificados frecuentemente. El pH
debe verificarse antes de utilizar el reactivo para asegurar que sea el
correcto. Si se encuentran impurezas o el pH no está dentro de los límites,
se debe desechar el reactivo y prepara uno nuevo.
6.0 Preservación de muestras.
6.1Las muestras y los extractos obtenidos deben ser preparados para el
análisis tan pronto como sea posible. Mantener en refrigeración a 4 ºC. Los
extractos del PECT deben prepararse para el análisis y analizarse tan
pronto como sea posible después de que se ha finalizado la extracción. Los
extractos para las determinaciones de toxicología se guardan en frascos de
vidrio o polietileno y se mantienen en refrigeración hasta su análisis.
7.0 Control de Calidad.
7.1 Se debe de preparar un blanco del fluido de extracción utilizado y tratarlo
igual que una muestra, para monitorear posible contaminación.
7.2 Se debe de analizar una muestra por duplicado por cada lote de
muestras o cada 20 muestras.
8.0 Desarrollo.
8.1 Evaluaciones preliminares.
Realizar las evaluaciones preliminares del PECT en una alícuota de la
muestra del residuo de un mínimo de 100 gramos de desechos. Esta
alícuota se emplea únicamente para las evaluaciones preliminares que
incluyen:
8.1.1 Determinación preliminar del porcentaje de sólidos.
Si el residuo no produce líquido cuando está sujeto a la presión de filtración
(es decir es 100 % sólido) continuar con el Inciso 8.1.3.
444
8.1.2 Si la muestra es líquida o polifásica, se requiere la separación
sólido-líquido para hacer la determinación preliminar del % de sólidos.
Esto involucra el equipo de filtración mencionado en el Inciso 8.3.
8.1.2.1 Pesar el filtro y el recipiente que recibirá el filtrado.
8.1.2.2 Ensamblar el porta filtros y colocar el filtro sobre el soporte y
asegurarlo.
8.1.2.3 Pesar una parte de la muestra del residuo (mínimo 100 g) y
registrar el peso.
8.1.2.4 Los residuos que sedimentan lentamente pueden centrifugarse
antes de la filtración. La centrifugación se utilizará como una ayuda de la
filtración. Si ésta es utilizada primero, el líquido debe ser decantado y
filtrado continuando con la filtración de la porción sólida.
8.1.2.5 Transferir cuantitativamente la muestra del residuo al equipo de
filtración. Verter la muestra en forma uniforme sobre la superficie del filtro.
Si la filtración de la muestra a 4 ºC reduce la cantidad de líquido extraído
sobre lo que debe ser extraído a temperatura ambiente, entonces dejar que
la muestra se estabilice a temperatura ambiente en el aparato antes de ser
filtrada.
Si más 1 % del peso de la muestra se ha adherido al recipiente utilizado
para transferir la muestra al aparato de filtración, determinar el peso de este
residuo y restarlo del peso de la muestra determinado en el inciso 8.1.2.3
para conocer el peso efectivo del residuo que se filtró.
Aplicar gradualmente la presión a través del filtro. Incrementar la presión
lentamente de 10 psi hasta 50 psi para que todo el líquido pase hasta que el flujo
del líquido haya cesado.
8.1.2.6 El material retenido en el filtro se define como la fase sólida del
residuo y el filtrado como la fase liquida.
Determinar el peso de la fase líquida restando el peso del recipiente vacío,
del peso total del recipiente con el filtrado. Determinar el peso de la fase
sólida de la muestra restando el peso de la fase líquida del peso total de la
muestra, según inciso 8.1.2.3 u 8.1.2.5.
Calcular el por ciento de sólidos como sigue:
Peso de sólido (8.1.2.6)
% de sólidos = ------------------------------------x 100
Peso Total de los desechos (8.1.2.3 o 8.1.2.5)
8.1.2.7 Si el porcentaje de sólidos determinado en el Inciso 8.1.2.6 es ≥
0.5 %, entonces continuar ya sea con el Inciso 8.2 para determinar si el
material sólido requiere reducción de tamaño de partícula o con el Inciso
8.1.3
8.1.2.8 Si el por ciento de sólidos determinado es menor que 0.5 %
continuar con 8.4.10
445
8.1.3 Determinación del por ciento de sólidos secos.
8.1.3.1 Quitar del aparato de filtración la fase sólida y el filtro.
8.1.3.2 Secar el filtro y la fase sólida a 100 ± 5 ºC, hasta que después de
ser pesados dos veces consecutivas no varíen en +/- 1.0%. Registrar el
peso final.
8.1.3.3 Calcular el porcentaje de sólidos secos de la siguiente manera:
(Peso del residuo seco + filtro) - Peso del filtro
% Sólidos = ---------------------------------------------- ---------------------x 100
Secos
Peso inicial del residuo (8.1.2.3 o 8.1.2.5)
8.1.3.3 Si el por ciento de sólidos secos es < 0.5 % continuar con 8.4.10.
Si el % de sólidos secos es ≥ 0.5 %, tomar una porción fresca del residuo,
determinar si la reducción de tamaño de la partícula es necesaria y
seleccionar el fluido de extracción adecuado ver 8.3
8.2 Determinar si el residuo requiere reducción de tamaño de partícula.
Evaluar el sólido para determinar el tamaño de la partícula. A menos que el
área superficial del sólido sea por gramo de material igual o mayor que 3.1
cm2 ó menor que 1,0 cm en su dimensión más angosta, se requiere la
reducción del tamaño de la partícula, debe ser capaz de pasar a través de
una malla estándar de 9,5 mm o 0.375 pulgadas si el área superficial es
menor o el tamaño de la partícula es más grande de lo señalado
anteriormente, preparar la porción sólida de los desechos para la
extracción, comprimiendo, cortando o triturando los desechos hasta obtener
un área superficial o tamaño de la partícula igual a la descrita
anteriormente.
8.3 Determinación del fluido de extracción adecuado:
8.3.1 Pesar una fracción de la fase sólida, reducir si es necesario a un
tamaño de partícula de aprox. 1 mm de diámetro o menos y transferir 5 g a
un matraz erlenmeyer de 250 mL o un vaso de precipitados.
8.3.2 Añadir 96,5 mL de agua, cubrir con un vidrio de reloj y agitar por cinco
minutos en una parrilla de agitación magnética, sacar y dejar sedimentar,
medir el pH, si es < 5 utilizar el fluido de extracción 1.
8.3.3 Si el pH es > 5 adicionar 3,5 ml de HCl 0,1 N, mezclar y cubrir con un
vidrio de reloj, calentar a 50 ºC y mantener la temperatura por 10 min.
8.3.4 Dejar la solución enfriar a temperatura ambiente y medir el pH, si es <
5 utilizar el fluido de extracción 1 y si es > 5 utilizar el fluido de extracción 2.
8.4 Determinación de constituyentes tóxicos.
446
8.4.1 Se recomienda un tamaño mínimo de muestra de 100 g.
8.4.2 Si el residuo no produce líquido, cuando se somete a filtración (100%
sólido) pesar una porción de la muestra (100 g ) y continuar con 8.1
8.4.3 Si la muestra es líquida o multifásica, se requiere una separación
líquido- sólido. Esto involucra el equipo de filtración descrito en 4.3.2 y
continuar con 8.3
8.4.4 Pesar el recipiente que recibirá el filtrado.
8.4.5 Ensamblar el portafiltro y colocar el filtro en el soporte y asegurarlo.
8.4.6 Pesar una fracción de muestra (100 g mínimo) Si el residuo contiene
menos del 0.5 % de sólidos secos, la porción líquida del residuo, después
de la filtración, se define como el extracto PECT. Por lo tanto, se debe filtrar
suficiente muestra para que la cantidad de líquido filtrado alcance para
realizar todos los análisis requeridos. Para residuos que contienen más del
0.5 % de sólidos secos, utilizar la información del % de sólidos obtenidos
conforme 8.1.1, para determinar el tamaño óptimo de la muestra ( 100 g
mínimo ) que se llevará a filtración.
8.4.7 Dejar sedimentar la fase sólida, los residuos que sedimenten
lentamente pueden centrifugarse antes de la filtración.
8.4.8 Transferir cuantitativamente la muestra del residuo ( fase líquida y
sólida ) al equipo de filtración, verter la muestra en forma uniforme sobre la
superficie del filtro, continuar como se indica en 8.1.2.5
8.4.9 El material en el portafiltro se define como la fase sólida del residuo, el
filtrado como la fase líquida, pesar el filtrado.
8.4.10 Si el residuo contiene menos del 0.5 % de sólidos secos continuar
con 8.7. Si el residuo contiene más del 0.5 de sólidos secos y fue necesaria
la reducción de tamaño de partícula, continuar con 8.4.11. Si el residuo
pasa un tamiz de 9.5 mm, transferir cuantitativamente el material sólido a un
frasco de extracción junto con el filtro (usado para separar la fase líquida
inicial de la fase sólida ) y continuar con 8.5
8.4.11 Preparar la porción sólida del residuo para extracción, como se
describe en 8.10.4.Cuando el tamaño de la partícula esté preparado
adecuadamente, transferir cuantitativamente el material sólido a un frasco
de extracción. Incluir el filtro utilizado para separar el líquido inicial de la
fase sólida.
8.5 Determinar la cantidad del fluido de extracción necesario como sigue:
447
Peso del fluido =
20 x % Sólidos x Peso de la muestra filtrada.
100
Agregar lentamente esta cantidad de fluido de extracción calculado al
recipiente extractor. Cerrar bien el vaso extractor (se recomienda utilizar
cinta de teflón para asegurar un sello hermético), asegurar el recipiente en
el aparato de agitación rotatorio y hacer girar a 30 ± 2 r.p.m. por 18 ± 2
horas. La temperatura ambiente debe mantenerse a 23 ± 2 ºC durante el
periodo de extracción.
Conforme continúa la agitación, la presión puede incrementarse dentro del
frasco extractor para algunos tipos de residuos (por ejemplo el carbonato de
calcio o residuos que contengan calcio, pueden permitir gases tales como el
dióxido de carbono). Para descargar el exceso de presión el frasco extractor
puede abrirse periódicamente (Por ejemplo; después de 15, 30 y 60
minutos) y ventearse en una campana.
8.6 Después de las 18 ±2 horas de extracción, separar el material en el
recipiente extractor en sus fases líquida y sólida, filtrando a través de un
filtro de fibra de vidrio nuevo. Para la filtración final del extracto PECT, si es
necesario cambiar el filtro de fibra de vidrio, para facilitar la extracción.
El filtrado obtenido es la muestra para evaluar toxicidad.
8.7 Preparación del extracto obtenido.
8.7.1 Si el residuo no contiene fase líquida fase inicial, el líquido filtrado
obtenido se define como el extracto PECT, y continuar con 8.8
8.7.2 Si los líquidos son compatibles, combinar el líquido filtrado con el
líquido inicial del residuo obtenido en 8.6. Este líquido combinado se define
como el extracto PECT y continuar con 8.8
8.7.3 Si la fase líquida inicial del residuo, obtenida en 8.4.8 no es o no
puede ser compatible con el líquido filtrado resultante en 8.6 no combinar
los líquidos, analizar por separado cada uno y combinar los resultados
matemáticamente, como se describe en 8.8.2
8.8 Después de colectar el extracto PECT, medir el pH y preservar el
extracto para análisis
8.8.2 Si las fases individuales van a ser analizadas separadamente,
determinar el volumen de la fase individual ( +/- 0.5 % ) realizar los análisis
requeridos y combinar los resultados matemáticamente, utilizando un
promedio volumen-peso, como se indica:
448
(V1) (C1) + (V2) (C2)
Concentración Final del Analito = -------------------------------V1 + V2
Donde:
V1= Volumen del primer extracto (L).
C1= La concentración del analito de interés en el primer extracto (mg/L).
V2= El volumen del segundo extracto (L).
C2= La concentración del analito de interés en el segundo extracto
(mg/L).
449