plantas trampa para plagas y proteccion de cultivos.

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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2 170 808
kInt. Cl. : A01G 13/00, A01H 5/00
11 Número de publicación:
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ESPAÑA
C12N 15/29, C12N 15/32
C12N 15/82
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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
12
kNúmero de solicitud europea: 95933201.6
kFecha de presentación: 14.09.1995
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 784 421
kFecha de publicación de la solicitud: 23.07.1997
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54 Tı́tulo: Plantas trampa para plagas y protección de cultivos.
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72 Inventor/es: Driver, John y
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74 Agente: Ponti Sales, Adelaida
30 Prioridad: 14.09.1994 US 309233
TREETECH MANAGEMENT, INC., doing
business as DRY CREEK LABORATORIES
1442 North Carpenter Road
Modesto, CA 95351, US
THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF
CALIFORNIA
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.08.2002
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
ES 2 170 808 T3
16.08.2002
Aviso:
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Dandekar, Abhaya M.
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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
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DESCRIPCION
Plantas trampa para plagas y protección de
cultivos.
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere al campo de
la tecnologı́a del DNA recombinante. En particular, se refiere a procedimientos para utilizar genes
que codifican proteı́nas pesticidas para controlar
plagas en plantas de cultivo importantes.
La protección contra gran variedad de plagas
que afectan a las industrias agrı́cola y silvicultora se basa plenamente en productos quı́micos
sintéticos. La utilización de plantas tratadas con
insecticidas sistémicos para inhibir la propagación
de virus de plantas se describe en Grey et al.,
Plant Disease Reporter 57 8 pp. 684-688. No obstante, la utilización de pesticidas quı́micos plantea ciertos problemas. Especialmente, muchos insectos de plagas desarrollan resistencia a los compuestos más utilizados. Además, la utilización generalizada de dichos compuestos ha conducido a
una preocupación sobre la contaminación ambiental. Muchos de estos compuestos tienen efectos
nocivos sobre otros organismos ajenos al objetivo
como pájaros y humanos. Los compuestos se pueden acumular en la cadena alimenticia y afectar
a los predadores naturales del insecto plaga.
Estos aspectos han provocado un aumento del
interés en estrategias de tratamiento de plagas
alternativas. Por ejemplo, se han utilizado genes de virus y bacterias que codifican proteı́nas
tóxicas para insectos y otras plagas. De estas
proteı́nas, la más utilizada es una proteı́na toxina
de una bacteria gram-positiva de suelo, Bacillus
thuringiensis (toxina Bt). Bacillus thuringiensis
produce una espora o un cristal proteı́nico o un
cristal que es tóxico en caso de ser ingerido por
un insecto huésped susceptible. La clonación y
la expresión de los genes de la toxina Bt se describe en la literatura (Schnepf, H. E. and Whitely,
H. R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 28932897 (1981)). Patentes U.S. 5.236.843, 5.26.166 y
5.135.867. Se han utilizado plantas transgénicas
que expresan esta proteı́na para controlar distintas plagas en plantas. WO 92/15690 describe
la obtención de plantas transgénicas resistentes
a nemátodos que expresan un gen inhibidor de
la proteinasa como el inhibidor de tripsina del
frı́jol(Cp Ti).
Sin embargo, la utilización de plantas
transgénicas en cultivos de alimentos plantea
otros problemas.
Por ejemplo, la oposición
de la sociedad y el establecimiento de normas
reguladoras que dificultan la producción y la
venta de alimentos obtenidos a partir de plantas
transgénicas. Además, en el caso de cultivos perennes, el coste de reemplazar los huertos, viñedos
y similares por cultivos transgénicos puede ser
prohibitivo.
Por consiguiente, existe la necesidad de realizar nuevas aproximaciones en la aplicación de
los avances en ingenierı́a genética de plantas para
controlar plagas. La presente invención se refiere
a estas y otras necesidades.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona un procedimiento para el control de plagas de insectos
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en una primera planta. El procedimiento comprende plantar una segunda planta adyacente a
la primera planta, en donde la segunda planta es
un huésped preferido para la plaga de insectos
y comprende un gen heterólogo insecticida. Se
hará referencia a esta segunda planta como planta
trampa para la plaga.
Un insecto plaga ejemplar es la polilla de la
manzana. Generalmente, el gen heterólogo pesticida codifica la toxina Bacillus thuringiensis efectiva contra las plagas de insectos lepidópteros.
Otro ejemplo de gen heterólogo pesticida es uno
que codifica un inhibidor de tripsina de frı́jol.
Generalmente, la segunda planta es un miembro de una especie diferente a la primera planta.
En algunas realizaciones, la segunda planta es una
planta no cultivada. Una planta trampa ejemplar
para la plaga es el manzano, para ser utilizado
en combinación con el nogal o el peral. La planta
trampa para la plaga se puede plantar en el mismo
campo que la primera planta.
También se reivindica un campo que comprende la planta de cultivo de interés y la planta
trampa para la plaga. La planta trampa para la
plaga es un huésped preferido para una plaga de
insectos de la planta de cultivo de interés y comprende un gen heterólogo insecticida.
Definiciones
Un “gen pesticida” es un polinucleótido que,
cuando se expresa en una célula vegetal, previene
la infección de la planta por una plaga. El gen
preferiblemente codifica una proteı́na que inhibe
directamente el desarrollo de la plaga en la planta
y/o es tóxica para la plaga. Un ejemplo de gen
pesticida de la invención es el gen de la toxina Bt.
Una “plaga que afecta a una planta” es un
organismo que interfiere negativamente sobre el
desarrollo normal de la planta. Una plaga de
una planta puede atacar cualquier órgano de la
planta, incluyendo hojas, raı́ces, flores, frutas y
otros. Las plagas de insectos que afectan plantas
que son objetivo especial de la presente invención
son aquellas que presentan caracterı́sticas en su
comportamiento según las cuales la plaga prefiere
una planta como huésped en lugar de otra.
Según se utiliza aquı́, una planta que es un
“huésped preferido” para una plaga que afecta
una planta en particular es una planta que atrae
más la plaga que a la planta de cultivo de interés. El huésped preferido puede ser un cultivo
diferente de la misma especie que la planta cultivada o puede ser de una especie diferente. El
huésped preferido puede ser una planta de cultivo o puede ser una planta salvaje o una especie
no cultivada. La razón por la cual el huésped
preferido ofrece una atracción preferente no es un
aspecto determinante y puede ser por cualquier
razón, por ejemplo, el tiempo de producción de las
hojas o flores del huésped preferido, o la ausencia
relativa de compuestos inhibidores en las hojas o
otros tejidos. La preferencia de una plaga por un
determinado huésped vegetal puede ser el resultado de relaciones evolutivas entre ambos organismos, como la presencia de atractores quı́micos
especı́ficos en la planta huésped.
Además, el grado con el que la plaga prefiere
el huésped preferido respecto a la planta de cultivo de interés no es determinante. No obstante,
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los procedimientos de la invención son más efectivos a medida que aumenta la diferencia en la
preferencia por cada una de las dos plantas.
Una “planta trampa para la plaga” es una
planta huésped preferida que contiene información genética de un gen pesticida.
Una “planta no cultivada” es una planta que
no es una variedad derivada de manera horticultural o agrı́cola de otra planta cultivada en el área
de utilización. Habitualmente, una planta no cultivada es una especie salvaje que puede o no estar relacionada con la planta de cultivo de interés.
Por ejemplo, el nogal negro de California se puede
utilizar como huésped preferido en los cultivos de
nogal ingles.
El término “adyacente” como se utiliza aquı́,
se refiere al espacio entre la planta trampa para
la plaga y la planta de cultivo de interés. La distancia exacta entre las dos plantas no es un aspecto crı́tico para la invención y dependerá, entre
otras cosas, de la planta de cultivo de interés, la
plaga que se quiere controlar, las caracterı́sticas
del suelo, y las condiciones climáticas del lugar
donde se utilizan las plantas. Se considera que
las dos plantas son adyacentes cuando la planta
trampa para la plaga está suficientemente cerca
de la planta de cultivo como para disminuir sustancialmente la población de la plaga sobre la
planta de cultivo. En algunos casos la planta
trampa para la plaga está en el mismo campo o
huerto donde crece la planta de cultivo. Alternativamente, la planta trampa para la plaga puede
estar plantada fuera del campo funcionando como
barrera contra el ataque de la plaga.
El término “expresión” se refiere a la transcripción y traducción de un gen estructural para
sintetizar una proteı́na.
El término “unido operativamente” se refiere
a la unión funcional entre el promotor y una segunda secuencia, en donde la secuencia del promotor inicia la transcripción del RNA correspondiente a la segunda secuencia.
El término “planta” incluye la totalidad de
la planta, órganos vegetales (por ejemplo hojas,
tallo, raı́ces, etc.), semillas y células vegetales. La
clase de plantas que se puede utilizar en el procedimiento de la invención es tan amplia como
la cantidad de plantas superiores que pueden ser
tratadas con técnicas de transformación, incluyendo tanto plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. Se incluyen plantas con distintos
niveles de ploidı́a, incluyendo las poliploides, las
diploides y las haploides.
El término “promotor” se refiere a una región
del DNA anterior al gen estructural que está involucrado en el reconocimiento y unión de la RNA
polimerasa y otras proteı́nas para iniciar la transcripción. Un “promotor vegetal” es un promotor
capaz de iniciar la transcripción en células vegetales.
Descripción de la realización preferida
La presente invención proporciona nuevos procedimientos para controlar una variedad de plagas
en plantas utilizando plantas transgénicas. Los
procedimientos controlan las plagas en una planta
de cultivo de interés utilizando plantas trampa
para la plaga transgénicas de una especie o variedad distinta, las cuales son el huésped preferido
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para la plaga a tratar, y por consiguiente atraen
preferiblemente la plaga. Las plantas trampa
para la plaga contienen la información genética
para codificar una proteı́na tóxica para la plaga,
la cual resulta en una disminución de la población
de la plaga en la planta de cultivo de interés.
El procedimiento de la presente invención se
puede utilizar para controlar un gran número de
plagas de insectos en plantas. Cualquier plaga de
insectos contra la cual se conozcan genes tóxicos,
o que se encuentren posteriormente, puede ser objetivo de los procedimientos de la invención. Se
han identificado y caracterizado un cierto número
de insectos plaga en plantas de cultivo. Por ejemplo, las plagas de insectos del orden Lepidoptera (mariposas, gusanos), Coleoptera (escarabajos), Diptera (moscas, mosquitos), y Orthoptera
(langostas, saltamontes, grillos) han sido ampliamente estudiados. Buenos ejemplos de insectos
plaga son el gusano de la manzana, la mosca
oriental de la fruta, la mosca de la manzana, la
mosca mediterránea de la fruta, el gusano del almendro, el gusano enrulador, el gusano del brote
del duraznero, la pulguilla de la patata, la mosca
blanca de la patata, la chinche lygus, la cotorrita,
el pulgón, la arañuela.
La invención también se puede utilizar para
controlar insectos que sirven como vectores para
patógenos de plantas como virus, hongos, bacterias y otros microorganismos. Algunos ejemplos
son los cicadelliae (“leaf hopper”), que son un vector de la infección del micoplasma en el cerezo, o
los psı́lidos, que propagan un micoplasma que destruye los perales. Otro ejemplo es la mosca blanca
de la patata, que propaga el amarilleo infeccioso
(“infectious yellows”) que afecta a los cultivos de
chole.
Construcción de los vectores de expresión
Los procedimientos necesarios para la expresión recombinante de los genes deseados en
plantas transgénicas son bien conocidos por los
expertos en la materia. En resumen, se introduce
en una planta un cassette de expresión que comprende un promotor apropiado, que está operativamente unido a un gen estructural que codifica la
proteı́na deseada. La construcción de los vectores
de expresión apropiados se lleva a cabo mediante
la utilización de técnicas estándar.
Generalmente, la nomenclatura y los procedimientos de laboratorio sobre la tecnologı́a del
DNA recombinante que se describen a continuación son bien conocidos y son utilizados habitualmente en la materia. Se utilizan técnicas
estándar para clonación, aislamiento de DNA
y RNA, amplificación y purificación. Generalmente, las reacciones enzimáticas que involucran
DNA ligasa, DNA polimerasa, endonucleasas de
restricción y similares, se realizan según las especificaciones del fabricante. Estas y otras técnicas
generalmente se realizan según Sambrook et al.,
Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
New York, (1989).
Los requisitos mı́nimos del vector son que
la secuencia de ácido nucleico deseada se introduzca en un estado relativamente intacto. Por
consiguiente, cualquier vector que transporte una
planta que contiene la secuencia de DNA introdu3
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cida deberı́a ser suficiente. La selección de los vectores y los procedimientos para construirlos son
habitualmente conocidos por los expertos en la
materia y se describen en referencias técnicas generales (ver, en general, Methods in Enzymology,
Vol. 153 (“Recombinant DNA Part D”), 1987,
Wu and Grossman Eds., Academic Press).
Los vectores recombinantes de la presente invención habitualmente comprenden un cassette
de expresión provisto de un promotor para iniciar
la transcripción de secuencias de polinucleótidos
deseadas en plantas. También se incluyen secuencias de origen bacteriano para permitir la
clonación del vector en un huésped bacteriano.
El vector preferiblemente contendrá origen de
replicación procariota con un amplio rango de
huéspedes. También serı́a incluido un marcador
de selección para permitir la selección de células
bacterianas que lleva la construcción deseada.
Los marcadores de selección procariotas apropiados incluyen resistencia a antibióticos como canamicina, gentamicina o tetraciclina.
En la construcción de combinaciones promotor heterólogo/gen estructural, el promotor
se sitúa, preferiblemente, aproximadamente a la
misma distancia del sitio de inicio de la transcripción heterólogo que del sitio de inicio de la
transcripción en su estado natural. No obstante,
como es conocido en la materia, pueden producirse algunas variaciones en esta distancia sin que
el promotor pierda su función.
El promotor puede ser “constitutivo” y dirigir la expresión del gen en todos los tejidos de
una planta regenerada. Tales promotores habitualmente son activos bajo la mayorı́a de condiciones ambientales y estados de desarrollo o de
diferenciación celular. Algunos ejemplos de promotores constitutivos son la región de inicio de la
transcripción 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el promotor 1’- o 2’- derivado del
T-DNA del Agrobacterium tumefaciens, y otras
regiones de inicio de la transcripción de varios genes de plantas conocidas para los expertos en la
materia.
Alternativamente, el promotor de la planta
puede dirigir la expresión del gen en un tejido especı́fico o puede estar sometido a un control ambiental o evolutivo concreto. Se hará referencia a
estos promotores como promotores “inducibles”.
Algunos ejemplos de condiciones ambientales que
pueden afectar la transcripción por parte de promotores inducibles incluyen las condiciones anaerobias y la presencia de luz.
Ejemplos de promotores bajo control evolutivo incluyen promotores que inician la transcripción solamente en algunos tejidos, como raı́ces,
frutas, semillas o flores. La utilización de un promotor órgano-especı́fico permite la expresión de
genes de los tejidos de interés de la planta. Por
ejemplo, un promotor especı́fico para la fruta, se
puede utilizar para expresar genes tóxicos para
flores, frutas o semillas para plagas que atacan
estos tejidos en concreto. Para una descripción
general de los promotores apropiados ver Okamuro, J. K. and Goldberg, R. B., Regulation of
plant gene expression: general principles in The
Biochemistry of plants: A Comprehensive Treatise Vol. 15 (1989).
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Para la expresión de polipéptidos en plantas,
el cassette de expresión recombinante contendrá,
además de las secuencias de polinucleótidos deseadas y el promotor, un sitio de inicio de la transcripción (si la secuencia que se va a transcribir
carece de uno), y una secuencia de finalización de
la transcripción. La región de finalización de la
transcripción se puede obtener del mismo gen que
el promotor de la secuencia o se puede obtener de
genes diferentes.
Si el mRNA codificado por el gen estructural tiene que ser traducido con eficiencia, generalmente también se añaden secuencias de poliadenilación en el vector de construcción (Alber
and Kawasaki, Mol. and Appl. Genet, 1:419-434,
1982). Las secuencias de poliadenilación incluyen, pero no están limitadas a la señal de octapina
sintasa de Agrobacterium (Gielen et al., Embo J.
3:835-846, 1984) o a la señal de nopalina sintasa
(Depicker et al., Mol. and Appl. Genet, 1:561573, 1982).
El vector habitualmente también contendrá
un gen marcador de selección mediante el cual
las células de planta transformadas se pueden
identificar en el cultivo. Generalmente el gen
marcador codifica resistencia a un antibiótico.
Estos marcadores incluyen resistencia al G418,
higromicina, bleomicina, canamicina y gentamicina. Después de transformar las células vegetales, aquellas células que tengan el vector se
identificarán por su capacidad de crecer en un
medio que contiene el antibiótico en particular.
Además, los vectores también pueden contener
un gen marcador identificable que codifica la enzima β-glucuronidasa (GUS) que se puede detectar visualmente en tejidos transgénicos y facilita
el muestreo de los transformantes de plantas.
El gen estructural pesticida en particular utilizado para inhibir plagas de una planta no es un
aspecto crı́tico para la invención. Algunos de estos genes son conocidos en la materia. Los genes
toxina microbianos más ampliamente utilizados
son derivados de la bacteria Bacillus thuringiensis. La clonación y la expresión de esta toxina Bt
se ha descrito para muchos genes. Los genes toxina de diferentes lı́neas de Bacillus thuringiensis
son efectivos contra diferentes insectos. Se han
descrito las toxinas Bt efectivas contra especies
del orden Lepidoptera (polillas y mariposas), Diptera (moscas y mosquitos) y Coleoptera (escarabajos). Las Patentes U.S. 5.236.843, 5.26.166
y 5135.867 describen genes toxina eficaces contra
especies del orden Lepidoptera. La Patente U.S.
5.236.843 describe un gen que codifica una toxina
activa contra los nemátodos.
Otros insecticidas son los que codifican inhibidores de proteinasa como el inhibidor de tripsina
del frı́jol (descrito en WO 92/15690), lipoxidasa
de la semilla de soja, polifenol oxidasa, α-amilasa
del trigo y lectinas de varias plantas diferentes.
Para una descripción de los genes apropiados,
véase Hilder et al., Genes for protecting transgenic crops from chewing and sap-sucking insect
pests in Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference on Pests and Diseases, 2:731-740
(1992).
Transformación de la planta
Las distintas construcciones DNA descritas
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anteriormente se pueden introducir en el genoma
de la planta deseada mediante varias técnicas
convencionales. Por ejemplo, la construcción
DNA se puede introducir directamente en el DNA
genómico de la célula vegetal mediante precipitación en polietilenglicol (Paszkowski et al.,
Embo J. 3:2717-2722 (1984)), electroporación y
microinyección de protoplastos de células vegetales (Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 82:5824 (1985)), o las construcciones DNA
se pueden introducir dentro del tejido de la planta
utilizando procedimientos balı́sticos, como el disparo de partı́culas de DNA (Klein et al., Nature
327:70-73 (1987)). Alternativamente, las construcciones DNA se pueden combinar con regiones flanqueantes de T-DNA apropiadas y introducirse dentro de un vector huésped convencional de Agrobacterium tumefaciens. Las funciones
de virulencia del huésped Agrobacterium tumefaciens dirigen la inserción de la construcción y
del gen(es) marcador adyacente dentro del DNA
de la célula de la planta cuando la célula es infectada por la bacteria. Para la revisión de los
procedimientos de transferencia de genes en cultivos de células de plantas ver Fisk, H.J. and
Dandekar, A.M., The introduction and expression
of transgenes in crop plants in Scientia Horticulturae 55:5-36 (1993) y Potrykus, CIBA Found.
Symp. 154:198 (1990).
Las técnicas de transformación mediadas por
Agrobacterium tumefaciens son las técnicas de
transferencia de genes más utilizadas habitualmente en plantas. Son técnicas bien descritas en
la literatura cientı́fica. Ver, por ejemplo, Horsch et al., Science 233:496-498 (1984), Fraley et
al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803 (1983),
y Hooykaas, Plant Mol. Biol. 13:327-336 (1989).
Todas las especies de planta que son un
huésped de planta natural para Agrobacterium
son transformables in vitro. La mayorı́a de especies dicotiledóneas se pueden transformar con
Agrobacterium. Las plantas monocotiledóneas,
y en concreto, los cereales, no son huéspedes
naturales de Agrobacterium. Existe la evidencia creciente de que ciertos monocotes se pueden transformar con Agrobacterium. Utilizando
nuevas aproximaciones experimentales, se pueden
transformar, ahora, especies de cereales como el
centeno (De la Peña et al., Nature 325:274-276
(1987)), el maı́z (Rhodes et al., Science 240:204207 (1988)), y el arroz (Shimamoto et al., Nature
338:274-276 (1989)).
Se ha descrito la transformación de un cierto
número de plantas leñosas utilizando Agrobacterium juntamente con otros procedimientos
(Shuerman, P. L. and Dandekar, A. M. Transformation of Temperature Crop Species: Progress
and Potentials in Scientia Horticulturae 55:101124 (1993)). Por ejemplo, James et al., Plant Cell
Rep. 7:658-661 (1989) describe la regeneración
y transformación de manzanos. También se han
descrito los procedimientos para el cultivo del tejido del manzano, que incluyen la micropropagación (Jones, O. P., Nature 262:392-393 (1976);
Zimmerman, R. H., Methods in Fruit Breeding,
pp. 124-135 (1983)) y la formación de brotes adventicios(James, D. J. Biotechnology and Genetic
Engineering Reviews, 5:33-79 (1987)).
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Después de la transformación, las células vegetales transformadas o las plantas que comprenden el DNA introducido se tienen que identificar.
Generalmente se utiliza un gen marcador seleccionable y/o identificable como los presentados anteriormente. Las células de planta transformadas se
pueden seleccionar mediante el crecimiento de las
células en el medio de cultivo que contiene el antibiótico apropiado. En algunos casos, se puede
utilizar la presencia de opinas si las plantas se
transforman con Agrobacterium.
Después de seleccionar las células transformadas se puede confirmar la expresión de los genes estructurales introducidos. Mediante procedimientos bien conocidos en la materia como la
hibridación Northern blot se puede conseguir una
detección sencilla del mRNA codificado por el
DNA insertado. La secuencia insertada se puede
identificar utilizando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y también la hibridación Southern blot. Véase, por ejemplo, Sambrook, supra.
Las células de planta transformadas (por
ejemplo, protoplastos) que derivan de cualquiera
de las técnicas de transformación anteriores se
pueden cultivar para regenerar una planta completa que posee el genotipo transformado y, por
consiguiente, el fenotipo deseado resistente a la
plaga. Dichas técnicas de regeneración se basan
en la manipulación de ciertas fitohormonas en un
medio de cultivo de crecimiento del tejido. La
regeneración de una planta a partir de protoplastos cultivados se describe en Evans et al., Protoplasts isolation and Culture, Handbook of Plant
Cell Culture, pp. 124-176, MacMillan Publishing
Company, New York (1983); y Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73,
CRC Press, Boca Raton (1985). La regeneración
también se puede obtener a partir del callo de la
planta, explantes, órganos, o partes de éstos. Dichas técnicas de regeneración se describen de manera general en Klee et al., Ann. Rev. of Plant
Phys. 38:467-486 (1987).
Un experto en la materia conoce que después
de que el cassette de expresión se incorpora de
manera estable en plantas transgénicas y se confirma su que es operativo, éste se puede introducir
dentro de otras plantas mediante cruce sexual. Se
pueden utilizar diversas técnicas de reproducción
estándar dependiendo de las especies que se quieran cruzar.
Plantas trampa para la plaga
La invención se utiliza para la producción de
cultivos de plantas trampa para plagas para cualquier planta susceptible de infectarse por dichas
plagas. La invención puede utilizar cualquier
planta siempre que ésta sea un huésped preferido
para la plaga y se pueda transformar y regenerar.
El motivo por el cual la planta trampa para la
plaga es un huésped preferido para la plaga no es
un aspecto determinante para la invención. Por
ejemplo, la planta trampa para la plaga puede
ser un cultivo diferente de la misma especie que
la planta que tiene que proteger. Si el primer cultivo produce flores o hojas cuando la plaga está
más activa, la planta trampa para la plaga atrae
y elimina la plaga.
Generalmente, la planta trampa para la plaga
es de una especie diferente que la de la planta
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de cultivo. Son conocidas las preferencias en
huéspedes de cada plaga y están bien documentadas en la literatura. Para la discusión sobre interacciones entre huéspedes de plagas ver Bernays,
E. A. and Chapman, R. F., Host-Plant Selection
by Phytophagous Insects (1994).
En la literatura están bien descritos los
huéspedes preferidos de algunas plagas en concreto. Generalmente, estas plantas se identifican como plantas a eliminar del área donde la
planta de cultivo está creciendo. Por ejemplo, generalmente se recomienda que, debido a que el
nogal de California es un huésped preferido de
la mosca oriental de la fruta, el nogal de California se elimine de los campos de nogal inglés
(Integrated Pest Management for Walnuts, 2nd
Ed., University of California, Statewide Integrated Pest Management Project, Publication 3270
pg. 45). Además, generalmente se recomienda
que los huéspedes de la chinche lygus (por ejemplo, el rábano salvaje y el garrofı́n) se eliminen
de los campos de melocotón, ciruela y nectarina para reducir la población reproductora (Peaches, Plums and Nectarine Growing and Handling for Fresh Market, University of California
Cooperative Extension, Division of Agriculture
and Natural Resources, Publication 3270). El
pulgón rosado del manzano pasa parte de su ciclo de vida en un huésped alterno, siendo el más
común el llantén menor, (Plantago lanceolata), en
inglés también conocido como “ribgrass”. Se recomienda que el llantén que crece dentro y cerca del
campo se elimine para suprimir el huésped de verano de esta plaga (Integrated Pest Management
for Apples and Pears, University of California,
Statewide Integrated Pest Management Project,
Publication 3340, pp. 124-126).
Otros ejemplos de combinaciones de especies
son la utilización del manzano como un huésped
más preferido que el nogal o el peral para la polilla
de la manzana; el arce como un huésped más preferido que el manzano para la mosca de la manzana; el membrillo como huésped preferido para
el gusano del brote del duraznero; la alfalfa, el
rábano salvaje y el garrofı́n como huéspedes preferidos para la chinche lygus; el cardo de búfalo
(Soanum rostratum), la dulcamara, las siucas, las
fisalias como huéspedes preferidos para la pulguilla de la patata; y el naranjo Mock (Philadelphus
pubescens) como huésped preferido para la mosca
mediterránea de la fruta.
Las plantas trampa para la plaga también se
pueden producir o manipular genéticamente para
aumentar su atracción para la plaga a tratar.
Por ejemplo, el aumento de los niveles de fagoestimulantes los cuales son nutrientes, especialmente azúcares, se puede utilizar para mejorar la
atracción.
Por consiguiente, la invención es útil para un
gran número de plantas cultivadas, que incluyen las especies de los géneros Trifolium,Medicago,Phaseolus, Pisum, Vigna, Glycine,Citrus,Linum,Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis,Brassica, Raphanus, Capsicum, Datura, Hyoscyamus,Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Cichorium, Helianthus, Chrysanthemum, Vitus, Lactuca,Asparagus, Cucumis, Cucurbita, Malus, Pyrus, Prunus, Rosa, Fragaria,
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Tarro, Ananas,Musa, Cocoa, Beta, Coffea, Gossypium,Thea,Dioscorea,Arachis, Citrullus, Juglans,Olea,Cannabis, Triticum,Hordeum, Avena,
Festuca,Sorghum, Oryza, Secale, y Zea.
Además, la invención se puede utilizar para
un número de especies no cultivadas. Algunos
ejemplos son el arce, el nogal negro de California,
el aligustre, el llantén menor, el rábano salvaje,
el garrofı́n, el cardo de búfalo, la dulcamara, las
siucas, las fisalias, la mostaza salvaje, las bayas
silvestres, y similares.
Los siguientes ejemplos ilustran, pero no limitan, la invención.
Ejemplo 1
Este ejemplo describe la producción de manzanos transgénicos que expresan la toxina Bt,
particularmente efectiva contra las especies lepidópteras. Estas plantas transgénicas son útiles
para el control de la polilla de la manzana en el
nogal.
Vectores para la introducción y la expresión de la
tolerancia a la plaga de insectos en el manzano
Dos vectores provistos por Calgene (Davis,
CA) se modifican mediante la introducción de
un gen que codifica GUS (β-glucuronidasa). Las
construcciones contienen un gen cry1Ac truncado
sintetizado quı́micamente. En uno de los vectores
el gen truncado sintetizado quı́micamente se modifica, además, (mediante Calgene) con la adición
de secuencias no codificantes 5’- para, además,
mejorar la eficiencia de traducción de este gen y,
por consiguiente, mejorar su expresión.
Además, los vectores se modifican mediante la
introducción del gen que codifica GUS y, por consiguiente, se crean dos nuevos vectores pDU92.67
y pDU92.63 que contienen las dos posibles orientaciones de GUS y el gen cry1Ac modificado. De
una manera semejante, el vector que comprende
el gen sin la modificación 5’ se modifica para dar
lugar a los vectores pDU92.710 y pDU92.15. Posteriormente, estos vectores binarios se introducen en tres lı́neas diferentes de Agrobacterium,
C58C1, EHA101 y AGL1 para crear un sistema
de entrega funcional.
Procedimiento de transformación del manzano
Los manzanos se transforman utilizando los
procedimientos descritos en James, D. J. and
Dandekar, A. M., Regeneration and transformation of apple (Malus pumila Mill.) in Plant tissue
culture manual: Fundamentals and applications,
B8:1-18 (1991).
Análisis del manzano transgénico
Después de la regeneración y la selección, brotes transgénicos putativos que representan eventos de transformación independientes se multiplican mediante micropropagación (cultivo de brotes). Para cada construcción utilizada se realizan varias transformaciones para obtener suficientes eventos de transformación independientes
(10-20). El análisis Northern de transferencia de
la construcción y la cuantificación de la actividad
de GUS se utilizan para analizar el nivel de expresión en cada uno de los transformantes. Se
encuentra que el nivel de GUS es un buen indicador de la transformación de la célula de planta.
Inicialmente, los eventos de transformación independientes se confirman mediante un análisis
PCR. Se extrae el DNA de las lı́neas individuales
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de brotes de manzano transformados y se utilizan
cebadores especı́ficos para GUS y genes marcadores APH y el gen de la toxina Bt. Se confirman los
productos PCR mediante un análisis de restricción enzimática por endonucleasa y hibridación
Southern blot con la correspondiente secuencia
del gen según técnicas estándar.
Eventualmente, los eventos de transformación
se verifican utilizando hibridación Southern de
transferencia. Este análisis implica la identificación de fragmentos T-DNA internos y la determinación del número de copias de las inserciones
mediante hibridación de las regiones del flanco
derecho como se describe anteriormente. Tanto
las pruebas del borde derecho como las de los
fragmentos internos se utilizan como se describe
anteriormente (Dandekar et al., Agrobacteriummediated transformation of somatic embryos as a
method for the production of transgenic plants in
J. Tissue Cult. Meth. 12:145-150 (1989); McGranahan et al., Improved efficiency of the walnut somatic embryo gene transfer system in Plant Cell
Rep. 8:512-516 (1990)) para diferenciar eventos
de transformación independientes y determinar
el número de copias del DNA insertado. Posteriormente, las plantas transgénicas provistas de
copias sencillas y aquellas que representan transformaciones independientes se utilizan para otros
experimentos.
Pruebas de efectividad de resistencia a la plaga
Posteriormente, se estudia la patologı́a del in-
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secto y se realizan bioensayos para determinar la
resistencia contra la especie del insecto a tratar,
la polilla de la manzana (CM). La susceptibilidad de CM frente a las preparaciones purificadas de las proteı́nas cristales insecticida (ICPs)
de (Bt) se determina previamente mediante los
experimentos de alimentación descritos anteriormente (Vail et al., Response of production and
postharvest walnut pests to Bacillus thuringiensis
insecticidal crystal protein fragments in Biological
Control 1:329-333 (1991)).
En primer lugar se realizan los bioensayos
sobre tejidos seleccionados obtenidos para determinar la mortalidad y para identificar clones
transgénicos que presentan una mortalidad entre
80 y 100 %. Posteriormente, éstos también se investigan mediante análisis cuantitativos para determinar la cantidad de proteı́na expresada utilizando Western blot y anticuerpos especı́ficos dirigidos hacia la proteı́na expresada. Las lı́neas
transgénicas que presentan una mortalidad baja
o nula se descartan basándose en los datos cualitativos.
Los ejemplos anteriores se proporcionan para
ilustrar la invención pero no limitan su campo de
aplicación. En las reivindicaciones se consideran
otras variantes de la invención conocidas para los
expertos en la materia. Todas las publicaciones,
patentes y solicitudes de patentes citadas en el
texto se incorporan con su referencia.
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REIVINDICACIONES
1. Procedimiento de control de una plaga de
insectos en una primera planta, comprendiendo
el procedimiento plantar una segunda planta adyacente a la primera planta, la segunda planta
siendo un huésped preferido para el insecto plaga
y comprendiendo un gen heterólogo insecticida.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
donde el insecto plaga es una polilla de la manzana.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en
donde el gen heterólogo insecticida codifica una
toxina Bacillus thuringiensis.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en
donde la toxina Bacillus thuringiensis es efectiva
contra plagas de insectos lepidópteros.
5. Procedimiento según la reivindicación 1,
en donde el gen heterólogo insecticida codifica un
inhibidor de tripsina de frı́jol.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, en
donde la segunda planta es un miembro de una
especie diferente que la primera planta.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en
donde la segunda planta es una planta no cultivada.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, en
donde la primera planta es un nogal.
9. Procedimiento según la reivindicación 1, en
donde la primera planta es un peral.
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10. Procedimiento según la reivindicación 1,
en donde la segunda planta es un manzano.
11. Procedimiento según la reivindicación 1,
en donde la segunda planta está plantada en el
mismo campo que la primera planta.
12. Campo que comprende la planta de cultivo de interés y una planta trampa para la plaga
de insectos, siendo la planta trampa para la plaga
un huésped preferido para una plaga de insectos
de la planta de cultivo de interés y que comprende
un gen heterólogo insecticida.
13. Campo según la reivindicación 12 en
donde la planta de cultivo y la planta trampa para
la plaga son de miembros de distintas especies.
14. Campo según la reivindicación 12 en
donde la planta de cultivo es un nogal y la planta
trampa para la plaga es un manzano.
15. Campo según la reivindicación 12 en
donde la planta de cultivo es un peral y la planta
trampa para la plaga es un manzano.
16. Campo según la reivindicación 12 en
donde el gen insecticida codifica la toxina Bacillus
thuringiensis.
17. Utilización de una planta transgénica
que comprende un gen heterólogo insecticida para
controlar una plaga de insectos en otra planta
plantada adyacente a la planta transgénica,
siendo la planta transgénica un huésped preferido
para la plaga de insectos.
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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva
del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD
2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación
del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del
7-10-1992, no producirán ningún efecto en España
en la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como tales.
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Esta información no prejuzga que la patente esté o
no incluı́da en la mencionada reserva.
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