PRÁCTICA 5 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

PRÁCTICA 5
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
más métodos.
- Estudiar la morfología de cada colonia.
Introducción
En la naturaleza, la mayoría de los microorganismos no se encuentran aislados, sino integrados
en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estudio de estos microorganismos y de sus propiedades, es necesario separar unos de otros y trabajar
con especies aisladas, obteniendo cultivos axénicos o puros.
Un cultivo axénico o puro es aquel que contiene
un sólo tipo de microorganismo y que procede
generalmente de una sola célula; el crecimiento
de ésta origina, en medio sólido, una masa de
células fácilmente visible que recibe el nombre de
colonia.
Para obtener cultivos axénicos o puros a partir de
una población microbiana mixta, se utilizan las
denominadas técnicas de aislamiento, que fueron
desarrolladas durante el siglo XIX. En un principio,
Lister utilizó diluciones seriadas en medio líquido
con esta finalidad, pero la presencia de contaminación, es decir, de microorganismos no deseados, dificultó el aislamiento. La escuela de Robert
Koch introdujo los medios sólidos, complementados con agar, y las placas de Petri en
Bacteriología, permitiendo así la separación física
de las colonias sobre la superficie del medio de
cultivo o en el interior del mismo.
El aspecto de las colonias sirve para diferenciar
distintas especies microbianas.
Objetivos
- Familiarizarse con el manejo de microorganismos y con las técnicas de aislamiento en placa de Petri.
- Obtener colonias separadas, utilizando uno o
Carga (1ª estría)
Material
Asa de siembra, cayado, pipeta graduada, placas
de Petri con medio de cultivo sólido y cultivo de
microorganismos.
Técnicas
Existen distintas técnicas que pueden utilizarse:
a) Extensión en superficie con cayado
Serie de
diluciones
conocidas de
la muestra
Cayado
Figura 5.1. Siembra por extensión en
superficie para recuento.
Depositar sobre la superficie de una placa con
agar nutritivo una gota ó 0,1 ml de una determinada dilución del cultivo de microorganismos problema y extenderlo con ayuda del cayado, previamente esterilizado, en todas las direcciones hasta
Primera diseminación
Segunda diseminación
(2ª estría)
(3ª estría)
Última diseminación
(4ª estría)
Figura 5.2. Técnica de aislamiento por estría en superficie.
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que esté completamente seco. Incubar la placa,
en posición invertida, a la temperatura deseada
(durante 24, 48 ó 72 horas) según el tipo de microorganismo. La posición invertida evitará que el
agua de condensación se deposite sobre la superficie del medio, dificultando la obtención de colonias aisladas.
Es una técnica usada para el aislamiento de colonias, que permite igualmente el recuento de bacterias viables en la muestra, si conocemos exactamente el volumen de muestra sembrado.
b) Estría múltiple en superficie
Con un asa de siembra, previamente esterilizada,
se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre un área pequeña de la
superficie de la placa con agar nutritivo, en forma
de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para
no dañar el agar.
Se flamea el asa, se enfría y después de rozar la
siembra realizada previamente, se extiende de
nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas
estrías. Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las
sucesivas siembras en estría. Se lleva la placa a
incubar, a la temperatura adecuada, siempre en
posición invertida.
Mediante esta técnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado número de bacterias.
c) Dilución en masa
En una placa de Petri vacía se deposita un
pequeño volumen conocido de muestra y a continuación se añade el medio de cultivo (agar nutritivo) fundido y atemperado aproximadamente a
45ºC. Se mezclan ambos por rotación suave de la
placa. De esta forma los microorganismos se distribuirán de forma homogénea en el medio de cultivo, permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar.
Otra variación de esta técnica consiste en inocular
Medio fundido
Medio
atemperado
fundido
Inóculo
Inóculo
atempera
calibrado
calibrado
Homogeneizar
Homogeneiz
Figura 5.3. Siembra por dilución en masa
o inclusión en agar.
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el medio de cultivo, fundido y atemperado, contenido en un tubo, con un determinado volumen de
la muestra. La homogeneización de la muestra y
el medio de cultivo se realiza por rotación del tubo
entre las manos, antes de verterlo sobre la placa.
En ambos casos, trás homogeneización, se dejan
enfriar las placas hasta que se solidifique el medio
y posteriormente se incuban a la temperatura adecuada (siempre en posición invertida).
Aunque con esta técnica se obtienen colonias aisladas, generalmente sólo se utiliza para determinar el número de microorganismos viables en una
muestra, cuando éstos son anaerobios facultativos o microaerófilos.
Resultados
a) Extensión en superficie: Tras el período de
incubación se examinarán las placas. Las colonias
aparecen sobre la superficie, distribuidas uniformemente si la siembra se ha realizado de forma
correcta. Podrán diferenciarse las colonias de
acuerdo a su tamaño, forma, color, textura, etc.
Esta técnica de siembra, además de permitir que
se distingan las colonias por su morfología, permite el recuento de microorganismos viables. La
expresión de este recuento se hace en "unidades
formadoras de colonias" (UFC) ya que cada una
procede de un sólo microorganismo (o de un
grupo de microorganismos, pues en algunos
casos éstos tienden a formar agregados). A partir
de las colonias aisladas, los microorganismos
pueden transferirse a otros medios de cultivo para
su estudio.
b) Por estría múltiple en superficie: Tras la incubación, se observarán las colonias aisladas en alguna región de la placa inoculada. Con esta técnica
se logra la separación de los microorganismos
que se encuentran
en un cultivo
mixto, o bien que
proceden
de
m u e s t r a s
homogéneas,
pero en las que
existe un elevado
número.
En las zonas
donde
existen
colonias aisladas
se puede estudiar Figura 5.4. Aislamiento
la morfología colo- por estría en superficie.
nial.
c) Dilución en masa: Aparecen las colonias distribuidas por toda la masa del agar. Aquellas que
están en la superficie tendrán distintas caracterís-
ticas, dependiendo del tipo microbiano, mientras
que las colonias que se desarrollan en el interior,
bajo la superficie del agar, tienen forma lenticular,
aunque los microorganismos que formen las distintas colonias sean de distinto tipo. Por tanto, las
colonias que aparecen en la profundidad del agar
son siempre biconvexas y no se diferencian unas
de otras por su morfología.
Figura 5.5.
Aislamiento por dilución en masa.
Forma
Borde
Puntiforme
Entero
Puntifor
me
Circular
Circular
Rizoide
Elevación
Superficie
Entero
Plana
Plana
o
LisaLisa
o rugosa
Ondulado
Elevada
Elevad
Mate
o
Mate o
brillante
Convexa
Convex
Seca o
cremosa
Seca
o
Ondulad
o
Rizoide
Lobulado
Irregular
Irregular
Filamentosa
Filamentos
a
Lobulad
o
Filamentoso
Filamentoso
Crateriforme
Crateriform
Invasiva oo
Invasiva
superficial
Acuminada
Acumina
d
Figura 5.6.
Aspectos más comunes de las diversas colonias microbianas aisladas sobre medio
sólido.
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PRÁCTICA 6
SIEMBRAS
Objetivos
- Aprender a inocular distintos medios de cultivo
contenidos en tubo: Caldo, agar inclinado y medio
semisólido sembrado en profundidad.
- Observar el crecimiento bacteriano en los distintos medios de cultivo.
- Comprobar la movilidad de determinados microorganismos.
c) En medio sólido (agar inclinado): Con el asa
de siembra estéril tomar los microorganismos de
la muestra e inocular el tubo realizando un movimiento de zig-zag en la superficie. El proceso se
inicia en el fondo y se va avanzando hacia arriba
por el área inclinada.
Incubar en estufa durante 28-48 horas a la temperatura más adecuada.
Siembra enen
Siembra
zig-zag
en
zig-zag
la
Material
Asa de siembra, hilo de siembra, pipetas Pasteur
o pipetas graduadas, suspensión de microorganismos y tubos con medio de cultivo líquido, sólido
inclinado y semisólido.
Asa de
siembra
Técnica
a) En medio líquido con asa: Transferir asépticamente, con el asa de siembra, una pequeña muestra de los microorganismos, desde el tubo que
contiene el material problema al tubo con medio
de cultivo estéril. Sumergir el asa en el líquido y
agitar para desprender y diluir la muestra. Incubar
el tubo recién sembrado en estufa, durante 24-48
horas a la temperatura óptima de crecimiento.
Flameado
Flameado
Muestra
Medio(agar
(agar inclinado)
Muestra Medio
Figura 6.2.
Siembra en un tubo de agar inclinado.
d) En medio semisólido: La siembra en este tipo
de medio, que contiene una proporción menor de
agar que los medios sólidos y que se envasa en
tubos, se lleva a cabo con un hilo de siembra esterilizado, con el cual se toma la muestra. El medio
queda inoculado al introducir el hilo en profundidad hasta el fondo del tubo, retirándolo posteriormente por la misma trayectoria utilizada al realizar
Punción
Muestra
Muestra
Inoculación
Inoculaci
Punción
limpia
limpia
Incubación
Incubació
Figura 6.1.
Inoculación de un caldo de cultivo
(ver también figura III, pág. 4).
Filamento
Filamento
b) En medio líquido con pipeta: Introducir asépticamente la pipeta Pasteur o la pipeta graduada
en el medio líquido que contiene los microorganismos y, aspirando de forma adecuada, sacar una
cantidad establecida de material que se transfiere
al tubo con medio de cultivo estéril. Incubar en
estufa durante 24-48 horas a la temperatura más
adecuada.
Muestra
Muestra
Medio (agar semisólido)
Medio (agar
Figura 6.3.
Inoculación de un medio semisólido por
picadura con hilo de siembra.
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la picadura. Una siembra con asa o con un cierto
movimiento de vaivén podría originar un patrón de
crecimiento que se interpretaría erróneamente
como movilidad bacteriana.
Incubar durante 24-48 horas a la temperatura óptima de crecimiento.
Resultados
a y b) En los cultivos líquidos
no tiene lugar la formación
de colonias, por lo tanto se
examinará la existencia de
enturbiamiento más o menos
intenso, la formación de una
película o velo sobre la
superficie, la aparición de
sedimento en el fondo del
tubo, etc. La utilización de
medios de cultivo líquidos
permite la obtención de una
población microbiana grande, con un elevado número
de microorganismos, para
ser utilizados posteriormente.
A
B
temperaturas de 4ºC.
d) En medio semisólido se podrá comprobar si el
microorganismo es o no móvil, ya que en el primer
caso se observará que el crecimiento difunde alrededor de la zona donde se hizo la picadura,
detectándose turbidez. Por eso es tan importante
que, cuando se inocula el medio de cultivo, no se
distorsione el agar y se vuelva a sacar el hilo por
el mismo sitio de inoculación. Los microorganismos inmóviles crecerán únicamente a lo largo de
la picadura.
Este tipo de siembra en picadura sirve, también,
como otro de método de conservación de microorganismos anaerobios facultativos.
1
2
3
Figura 6.4.
Aspecto de cultivos en agar
inclinado (A) y
semisólido (B)
c) En medio sólido (agar tras la
inclinado) se observará el incubación.
aspecto general del medio y
la aparición de crecimiento
sobre su superficie. Este tipo de siembra permite
el cultivo de microorganismos aerobios o anaerobios facultativos. Además, se utiliza para almacenar cultivos durante cortos períodos de tiempo, a
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Figura 6.5.
Prueba de movilidad en agar semisólido.
1. Microorganismo móvil.
2. Microorganismo inmóvil.
3. Tubo control sin inocular.