El gran potencial de las nuevas herramientas analíticas

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ikerketak
Nekazaritza
El gran potencial de
las nuevas herramientas
analíticas
En los últimos años, dentro del sector agrario vasco se ha generado una
demanda creciente en todo lo referente a la mejora de la calidad de los
productos y la racionalización de la producción. Como consecuencia, la analítica
orientada a satisfacer las necesidades del sector agrario está inmersa en un
proceso de sustitución de las técnicas convencionales por otras más modernas y
económicas.
TEXTO:
ESTIBALIZ ALONSO,
ALEX ARISTEGIETA ,
CARLOS GARBISU
(NEIKER – INSTITUTO
VASCO DE I+D AGRARIO
or ello, Neiker, como
agente dinamizador de
la analítica de muestras agrarias dentro de la
CAPV, lleva ya varios años
desarrollando una línea de
espectroscopía de infrarrojo
cercano (NIR) por reflectancia para poder mejorar así
la calidad de su oferta analítica en muchos tipos de
P
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sustrai.73
muestras (piensos, ensilados, materias primas, suelos, etc.).
Curiosamente, durante
la primera mitad del siglo
XX, apenas se prestó interés a la región del infrarrojo cercano del espectro electromagnético,
principalmente debido a la
presencia en sus espectros
de absorción de bandas
anchas, solapadas y de poca
intensidad, que complicaban sobremanera la asignación de bandas a estructu-
ras o grupos funcionales
específicos. No obstante, en
la segunda mitad de ese
mismo siglo y, sobre todo,
gracias a los trabajos pioneros de Karl Norris del
Departamento de
Agricultura de EEUU, se
demostró el gran potencial
analítico de esta técnica.
En los últimos años, debido
a mejoras en la instrumentación y al desarrollo de la
quimiometría (disciplina
que usa los métodos matemáticos y estadísticos apli-
cados a la Química
Analítica) y la informática,
la aplicación de la espectroscopía NIR al análisis de
muestras de múltiples sectores (e.g., agrario, alimentario, farmacéutico, petroquímico, textil, etc.) ha
sufrido una impresionante
expansión.
Entre las numerosas
ventajas que presenta la
espectroscopía NIR frente a
técnicas más convencionales, se pueden destacar las
siguientes:
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TIPOS DE VIBRACIONES MOLECULARES. EL SIGNO + INDICA DESPLAZAMIENTO DESDE LA
PÁGINA HACIA EL LECTOR; EL SIGNO – INDICA DESPLAZAMIENTO ALEJÁNDOSE DEL LECTOR.
REGIONES DEL ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO.
REPRESENTACIÓN DE LA INFORMACIÓN ESPECTRAL DE 375 MUESTRAS DE ENSILADOS DE
HIERBA.
INTERACCIÓN DE LA RADIACIÓN NIR CON LAS PARTÍCULAS SÓLIDAS DE UNA MUESTRA.
– es una técnica no
invasiva y no destructiva
de la muestra;
– las necesidades de
preparación de la muestra
previas a la analítica son
nulas o muy pequeñas;
– no utiliza reactivos
químicos ni produce residuo alguno (esto, además
de abaratar costes, como se
deriva del hecho de que no
hay que adquirir reactivos
ni pagar por la recogida de
residuos tóxicos y peligrosos, hace de esta técnica un
proceso muy respetuoso con
nuestro entorno medioambiental);
– el mantenimiento del
equipo es mínimo (se reduce a la sustitución de la
lámpara halógena de filamento de tungsteno una
vez finalizada su vida útil);
– una vez obtenida la
ecuación de predicción (ver
más adelante), permite
determinar de forma simultánea en la misma muestra
y en menos de 1 minuto
todos aquellos parámetros
analíticos para los que se
haya calibrado el equipo;
– hoy en día, existen en
el mercado equipos NIR
portátiles que permiten
analizar las muestras in
situ (por ej., en el campo,
invernadero, etc.), sin necesidad de transportarlas al
laboratorio.
En los últimos años,
Neiker ha obtenido diferentes ecuaciones/calibraciones
que cubren un rango considerable de las necesidades
analíticas de la Sección de
Nutrición Animal de nuestro Laboratorio de
Agrosistemas y Producción
Animal (ecuaciones para
muestras de ensilados,
materias primas, piensos,
etc.). Estas ecuaciones han
sido obtenidas de diversas
formas: algunas han sido
desarrolladas en el propio
NEIKER, a partir de los
datos obtenidos durante la
analítica de las diversas
muestras que llegan a
nuestro Centro; otras han
sido cedidas bajo convenio
por otros centros de investigación similares al nuestro; y, finalmente, algunas
ecuaciones han sido adquiridas comercialmente.
Asimismo, en este
momento, en Neiker estamos desarrollando de forma
activa ecuaciones/calibraciones para diferentes parámetros físico-químicos en
muestras de suelos. A este
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Es una técnica no invasiva y no destructiva de la muestra,
que no utiliza reactivos químicos ni produce residuo alguno.
Además, el mantenimiento del equipo es mínimo.
HISTOGRAMA DE VALORES LABORATORIALES PARA EL PARÁMETRO “PROTEÍNA” EN MUESTRAS DE SOJA.
respecto, cabe mencionar
que, aunque el suelo es sin
duda una matriz de gran
complejidad por su heterogeneidad espacial y temporal, esta tecnología permite
determinar un número
importante de propiedades
físico-químicas del suelo con
mucha precisión.
En cualquier caso, aunque el presente artículo no
pretende, en absoluto, realizar una revisión exhaustiva
de la espectroscopía NIR,
debido al gran interés que
esta técnica está suscitando
en el sector técnico de la
CAPV, nos parece interesante dar aquí unas nociones
básicas que permitan entender los fundamentos teóricos y los procedimientos
prácticos de la espectroscopía NIR.
Por consiguiente, el
objetivo del presente artículo es contribuir a la
difusión del gran potencial
analítico y de los principios
teóricos y prácticos de la
espectroscopía NIR, lógicamente en el contexto del
sector agrario.
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Fundamentos Teóricos
La región del infrarrojo
cercano, conocida habitualmente como NIR (del inglés
Near-Infrared), fue descubierta en 1800 por el astrónomo y compositor Sir
Frederick William Herschel
(1738-1822) durante un
experimento diseñado inicialmente para, mediante
un prisma, determinar la
contribución de cada uno
de los colores que componen la porción visible de la
luz solar dispersa en el
aumento de la temperatura
causado en diversas sustancias expuestas a dicha
radiación. En un ejemplo
de perspicacia e intuición
científica, además de en las
diversas zonas de la porción visible del espectro
electromagnético (violeta,
azul, verde, amarillo,
naranja, rojo), Herschel
colocó muestras más allá
del rojo y observó que
aumentaba la temperatura
de las sustancias allí
expuestas. Por ello, denominó a esta región “rayos
caloríficos”, más tarde,
conocidos como radiación
infrarroja.
Dentro del espectro
electromagnético (Figura
1), la radiación infrarroja
comprende la zona situada
infrarrojo medio (MIR o IR)
e infrarrojo lejano (FIR).
La zona NIR que nos ocupa
se encuentra localizada
entre el visible y el infrarrojo medio, cubriendo la
región entre 800 y 2500 nm
(4000 - 12500 cm-1).
La espectroscopía de
infrarrojo se emplea para
investigar las propiedades
vibracionales de una muestra. De hecho, la radiación
infrarroja, a diferencia de
las radiaciones visible y
ultravioleta, no tiene la
suficiente energía para producir transiciones electrónicas, y su absorción se
limita principalmente a
transiciones con pequeñas
diferencias de energía entre
diferentes estados vibracionales de una molécula.
Aplicando la mecánica
cuántica y el modelo del
oscilador anarmónico para
representar los enlaces químicos entre átomos dentro
REPRESENTACIÓN TRIDIMENSIONAL DE LA POBLACIÓN DE MUESTRAS. LAS MUESTRAS ANÓMALAS
(OUTLIERS) APARECEN EN ROSA.
desde aproximadamente los
800 a los 105 nm. Esta
región puede dividirse a su
vez en tres sub-regiones:
infrarrojo cercano (NIR),
de una molécula, se
demuestra que las bandas
de absorción que aparecen
en un espectro infrarrojo se
deben a transiciones cuan-
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tizadas vibracionales
entre niveles de energía
en los que el número
cuántico vibracional
cambia en una unidad
(banda fundamental) o
en más de una unidad
(sobretonos). Asimismo,
se observan bandas
como consecuencia de la
interacción de vibraciones diferentes (bandas
de combinación).
Las vibraciones pueden ser de dos tipos
principalmente
– tensión o elongación (“streching”): cambios en la distancia interatómica a lo largo del
eje del enlace. Pueden
ser simétricas o asimétricas.
– flexión (“bending”): cambios en el
ángulo de enlace.
Pueden ser simétricas en
el plano (balanceo,
“rocking”), asimétricas
en el plano (tijereteo,
“scissoring”), simétricas
fuera del plano (aleteo,
“wagging”), y asimétricas
fuera del plano (torsión,
“twisting”).
Las vibraciones moleculares originan bandas de
absorción fundamentales,
principalmente, en la zona
del MIR (400 - 4000 cm-1).
Por su parte, en la región
NIR, mayoritariamente se
observan bandas de absorción correspondientes a los
sobretonos y a combinaciones de vibraciones fundamentales. Las bandas más
frecuentes en un espectro
NIR son debidas a enlaces
que contienen átomos ligeros como C-H, N-H, O-H y
S-H debido a su mayor
anarmonicidad.
Finalmente, mencionar
que cuando la radiación
infrarroja interactúa con
una muestra, dicha radia-
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UN TÉCNICO TRABAJANDO CON EL EQUIPO NIR.
ción puede ser absorbida,
transmitida o reflejada. Si
la radiación atraviesa la
muestra, se habla de transmisión (se suele utilizar la
transmisión para muestras
líquidas), mientras que si
es reflejada se trabaja en
reflectancia (para muestras
sólidas). Esta reflectancia
puede ser especular que no
aporta información sobre la
composición de la muestra
y difusa que tiene lugar en
todas direcciones como consecuencia de los procesos
de absorción y dispersión
(Figura 3). Recientemente,
los nuevos equipos NIR
permiten trabajar en transflectancia, en la cual parte
de la radiación incidente es
reflejada y otra parte atraviesa la muestra para, posteriormente, ser reflejada
por un material colocado en
la cara opuesta de la muestra. Karl Norris fue el primero en demostrar que el
método más idóneo para
analizar muestras agrícolas
por NIR era la reflectancia
difusa.
Fundamentos prácticos
Dentro de este apartado, se
pretenden describir los
principales pasos metodológicos necesarios para la
obtención de la
ecuación/calibración y, posteriormente, la predicción
de los parámetros analíticos en las muestras objeto
de estudio (Figura 4).
Tanto para la calibración como para la predicción, la técnica NIR
comienza con la obtención
de un espectro de absorción
(entre 800 y 2500 nm)
durante el proceso de escaneado de la muestra
(Figura 5). Como se ha
mencionado anteriormente,
dicho espectro refleja las
transiciones cuantizadas
vibracionales producidas en
las moléculas como consecuencia de la interacción
entre la radiación emitida
por una lámpara halógena
de filamento de tungsteno y
la muestra.
Calibración
El objetivo de una calibración consiste en la obtención de ecuaciones predictivas que correlacionen la
información espectral con
los valores analíticos generados por métodos tradicionales de referencia.
Lógicamente, para la calisustrai
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La espectroscopía NIR, en sus cuatro años en NEIKER,
ha permitido dinamizar de forma considerable la analítica
de las muestras que llegan a la Sección de Nutrición Animal.
bración, es esencial seleccionar una población de
muestras que representen
la mayor heterogeneidad
del producto a calibrar.
Con la información
espectral de las muestras y
los valores analíticos de
laboratorio correspondientes a las mismas, se obtiene
el denominado “fichero de
calibración”. Los valores
analíticos pueden visualizarse gráficamente mediante un histograma (Figura
6), el cual nos permite comprobar si existen muestras
en todo el rango de referencia para cada constituyente
(fichero correcto), o, por el
contrario, aparecen zonas
vacías que puedan afectar
al cálculo de interpolación
(fichero incorrecto).
Asimismo, la representación espectral (Figura 5)
permite detectar anormalidades debidas, por ejemplo,
al mal encapsulamiento de
la muestra o a resultados
laboratoriales no correctos.
A partir de este punto,
la conversión de los datos
en información útil requiere el uso de herramientas
matemáticas y estadísticas
pertenecientes a la quimiometría que, inicialmente, se
utilizan para anular fuentes de variabilidad de la
señal (e.g., información
repetida sobre enlaces específicos en bandas de combinación y en regiones del
segundo y tercer sobretono,
humedad de la muestra,
tamaño de partícula, variaciones en el paso óptico
efectivo, etc.) mediante el
uso de derivadas, corrección de la desviación de la
línea base y de la dispersión causada por el tamaño
de partícula, etc. A este
respecto, la aplicación de
derivadas nos permite
aumentar la resolución
espectral y diferenciar así
picos solapados (Figura 7).
Posteriormente, se simplifica la información
espectral a través del centrado de la población
mediante un análisis de
componentes principales,
de mínimos cuadrados parciales, o similar. Después
del análisis de componentes
principales, el conjunto de
muestras aparece formando
un elipsoide, en el cual se
establece un radio que permitirá la detección de anómalos (“outliers”) utilizando la distancia de
Mahalanobis global (GH)
(se suele emplear un valor
de GH de 3) (Figura 8). La
casuística de este tipo de
muestras anómalas es cier-
tamente diversa: muestras
que pertenecen a una variedad distinta a las demás,
espectros recogidos en el
equipo sin estabilizar,
muestras con concentraciones fuera del rango seleccionado para la calibración,
encapsulamientos incorrectos, etc.
Durante la calibración,
es posible eliminar información redundante, identificando las muestras con
un espectro muy similar a
otras presentes en la
misma población, seleccionando así aquellas que
recogen la máxima variabilidad. Para ello, se emplea
el concepto de distancia
entre vecinos (NH, de
“neighborhood”), que mide
la semejanza entre muestras mediante el cálculo de
la distancia entre una
muestra y su vecino (normalmente, en este paso, se
establece un valor de NH
de 0,6). En el centro de la
población, muchas muestras son vecinas, mientras
que en los extremos las
muestras tienen un número
menor de vecinos.
Una vez eliminada la
información redundante, se
procede al cálculo de la
ecuación que nos permitirá
correlacionar los valores
laboratoriales con la información espectral NIR, y
obtener así el modelo de
calibración necesario para
la futura predicción de
muestras desconocidas.
Para este proceso, se pueden utilizar diferentes
métodos de regresión multivariante como PCR
(“principal component
regression”), PLS (“partial
least squares”), MPLS
(“modified partial least
squares”), etc.
La fiabilidad del modelo
de calibración se evalúa inicialmente mediante un proceso de validación cruzada,
en el que se calculan distintas ecuaciones y se procede
a seleccionar aquella que
mejor predice las muestras
(la que tiene un valor más
alto del coeficiente de
correlación y más bajo del
error estándar de validación cruzada).
Esta ecuación se valida
nuevamente con muestras
externas no implicadas en
el desarrollo de la calibración, utilizando para ello
diversos estadísticos (e.g.,
desviación estándar del
conjunto laboratorial, error
estándar de predicción,
etc.). Se considera buena
práctica de laboratorio
ampliar y actualizar la
REPRESENTACIÓN DE LA INFORMACIÓN ESPECTRAL SIN TRATAMIENTOS MATEMÁTICOS (IZDA) Y TRAS LA APLICACIÓN DE LA PRIMERA (CENTRO) Y SEGUNDA (DCHA) DERIVADA.
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ecuación, con una periodicidad anual, hasta alcanzar
una robustez óptima (i.e.,
un 95% de predicción).
Análisis predictivo
El objetivo final de todo
proceso de calibración NIR
es el desarrollo de un método de trabajo de rutina que
permita predecir valores de
parámetros analíticos sin
necesidad de analizar las
muestras en el laboratorio
por los métodos tradicionales. Para ello, una vez obtenida una ecuación robusta,
sólo es necesario escanear
una muestra y, a partir de
la información espectral
generada, el equipo predecirá todos los parámetros
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para los que se haya calibrado el equipo. En este
paso, el porcentaje de predicción NIR está condicionado por los valores de los
estadísticos GH (GH<3
indica que la muestra pertenece a la población) y NH
(NH<1 indica que la muestra tiene vecinos).
Ejemplos en NEIKER
La espectroscopía NIR, en
sus cuatro años en NEI-
KER, ha permitido dinamizar de forma considerable
la analítica de las muestras
que llegan a la Sección de
Nutrición Animal de nuestro Laboratorio de
Agrosistemas y Producción
Animal.
A modo de ejemplo,
cabe reseñar el éxito en el
empleo de la espectroscopía
NIR en la analítica de las
muestras de ensilados de
hierba procedentes del
PRODUCTO
N.º MUESTRAS
GH GLOBAL
Ensilado de hierba
376
Pienso
117
Soja
182
Concurso de Explotaciones
Ganaderas de Euskadi que
se lleva a cabo anualmente.
En concreto, en la edición
del año pasado 2004, la
ecuación NIR consiguió
predecir de forma efectiva
el 97% de las muestras que
llegaron a NEIKER (de un
total de 376 ensilados de
hierba). Esto quiere decir
que, tras el procesamiento
previo de las muestras
(secado y molienda), en
menos de un minuto por
muestra, nuestra ecuación
nos predijo de forma simultánea un número considerable de parámetros analíticos (e.g., materia
orgánica, proteína bruta,
fibras ácido y neutro detergente, pH, nitrógeno amoniacal, digestibilidad, etc.)
en el 97% de las muestras
de ensilados de hierba recibidas (Tabla 1).
Análogamente, disponemos de ecuaciones para
piensos y materias primas
(cereales, salvados, maíz,
harinas, alfalfa, etc.), algunas ya validadas y otras
todavía en proceso de validación con muestras externas (Tabla 1). Esto nos
permitirá, en un breve
plazo de tiempo, reducir
sustancialmente el tiempo
de respuesta analítica en
Neiker.
Nuestros resultados
confirman, sin duda, el
enorme potencial de la
espectroscopía NIR como
herramienta analítica alternativa a los métodos tradicionales para muestras del
sector agrario.
NH GLOBAL
% PREDICCIÓN NIR
0,86
0,56
97
1,19
0,41
98
1,72
0,97
90
RESULTADOS DE ANÁLISIS PREDICTIVOS NIR PARA ALGUNOS ALIMENTOS DE CONSUMO ANIMAL CON LAS ECUACIONES DE NEIKER.
sustrai
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