“MANUAL PARA INMUNOHEMATOLOGIA”

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA
DE MEXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES
CUAUTITLAN
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA INMONOLOGÍA.
BANCO DE SANGRE
TRABAJO PROFESIONAL
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE:
QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGA
P R E S E N T A:
VIANEY HERNÁNDEZ SALINAS
ASESORA: QFB. MARTHA PATRICIA CAMPOS PEÓN
CUAUTITLAN IZCALLI, EDO. DE MEX.
DEDICATORIA
2009
LE DOY LAS GRACIAS A TODA LA GENTE QUE ME APOYO EN LA REALIZACIÓN
DE ESTE TRABAJO POFESIONAL
A MI FAMILIA
EDWIIN MI ESPOSO, POR TODO SU AMOR, SUSTENTO Y COMPRENSIÓN
SEBASTIAN MI ADORADO HIJO, POR DARME LAS FUERZAS PARA CONTINUAR
A MIS PADRES
MARÍA GRISELDA POR SU RECUERDO
OSCAR POR SU EJEMPLO
A MIS HERMANAS
NUBIA Y PAOLA POR SU CARIÑO
A BENIGNO, MINERVA, IRED, IRVING Y DELFINA POR SU PREOCUPACIÓN
PROFESORES
QFB MARTHA PATRICIA CAMPOS PEÓN MI ASESORA, POR TODA LA PACIENCIA Y ENSEÑANZA
DR. ANDRÉS ROMERO, DR. VÍCTOR ZENDEJAS, QFB. GUADALUPE REBOLLAR Y QFB. LADISLAO
PALOMAR POR BRINDARME SU VALIOSO TIEMPO Y EJEMPLO
AL INCMNSZ
POR PERMITIRME SER PARTE DE SU GENTE
“MANUAL DE PROCEDIMIENTOS
PARA INMUNOHEMATOLOGÍA
BANCO DE SANGRE”
ÍNDICE
Página
Generalidades
I.
Prólogo
I.I. Introducción
III. Objetivo, Meta y Alcance
IV. Mensaje del Usurio
V. Marco Jurídico
VI. Seguridad de las Muestras
VII. Definiciones
VIII. Instalaciones y Procedimientos
1
2
7
8
9
10
11
12
TEMA 1. CONTROL DE CALIDAD DE REACTIVOS
1. 1 Responsabilidades
1. 2 Aplicación clínica
1. 3 Suministros
1. 4 Reactivos
1. 5 Equipo necesario
1. 6 Procedimiento del ensayo
1. 7 Marcado y empaque
1. 8 Formatos, referencias y bibliografía
18
18
18
18
19
20
23
24
TEMA 2. GRUPO SANGUINEO ABO AUTOMATIZADO
2. 1 Responsabilidades
2. 2 Principio
2. 3 Aplicación clínica
2. 4 Recolección de la muestra
2. 5 Factores de rechazo
2. 6 Condiciones de manejo y almacenamiento
2. 7 Reactivos
2. 8 Control de calidad
2. 9 Procedimiento del ensayo
2. 10 Resultados
2. 11 Interferencias y limitaciones del método
2. 12 Formatos, referencias y bibliografía
25
25
27
28
29
30
30
31
33
34
34
35
TEMA 3. GRUPO SANGUINEO Rh
Página
3. 1 Responsabilidades
3. 2 Principio
3. 3 Recolección de la muestra
3. 4 Reactivos
3. 5 Control de calidad
3. 6 Equipo necesario
3. 7 Procedimiento del ensayo
3. 8 Resultados
3. 9 Formatos, referencias y bibliografía
36
36
37
39
39
41
41
42
43
TEMA 4. PRUEBAS PRETRANSFUSIONALES
4. 1 Responsabilidades
4. 2 Principio
4. 3 Recolección de la muestra
4. 4 Reactivos
4. 5 Equipo necesario
4. 6 Procedimiento del ensayo
4. 7 Formatos, referencias y bibliografía
44
44
45
47
47
48
50
TEMA 5. ANTICUERPOS IRREGULARES SU IMPORTANCIA EN
MEDICINA TRANSFUSIONAL
5. 1 Panel de 10 células
5. 2 Formatos, referencias y bibliografía
57
58
TEMA 6. RASTREO DE ANTICUERPOS IRREGULARES
MÉTODO LION EN TUBO
Página
6. 1 Responsabilidades
6. 2 Principio
6. 3 Recolección de la muestra
6. 4 Reactivos
6. 5 Equipo necesario
6. 6 Procedimiento del ensayo
6. 7 Resultados
6. 8 Interferencias y limitaciones del método
6. 9 Formatos, referencias y bibliografia
59
59
60
62
65
65
65
68
69
TEMA 7. RASTREO DE ANTICUERPOS IRREGULARES
MÉTODO CON ALBÚMINA
7. 1 Responsabilidades
7. 2 Principio
7. 3 Recolección de la muestra
7. 4 Reactivos
7. 5 Equipo necesario
7. 6 Resultados
7. 7 Interferencias y limitaciones del método
7. 8 Formatos, referencias y bibliografia
70
70
72
74
75
76
76
78
TEMA 8. PRUEBA DE COOMBS
Página
8. 1 Responsabilidades
8. 2 Principio
8. 3 Recolección de la muestra
8. 4 Reactivos
8. 5 Control de calidad
8. 6 Equipo necesario
8. 7 Procedimiento del ensayo
8. 8 Resultados
8. 9 Formatos, referencias y bibliografia
79
79
81
83
84
85
85
89
90
TEMA 9. PROCEDIMIENTO PARA CRIOPRESERVACIÓN DE CÉLULAS
PROGENITORAS HEMATOPOYÉTICAS
9. 1 Propósito y alcance
9. 2 Introducción
9. 3 Instrucciones y procedimiento
9. 4 Material y equipo requerido para criopreservar CPH
9. 5 Espécimen a criopreservar
9. 6 Procedimientos previos a la criopreservación de CPH
9. 7 Procedimiento para criopreservar
9. 8 Procedimiento para determinar el No. De CMN de las CPH
9. 9 Procedimiento para determinar la viabilidad celular de las CPH
9.10 Limpieza y asepsia de la campana de flujo laminar
9.11 Verificación de la esterilidad del proceso
9.12 Procedimiento para descongelar CPH criopreservadas
9.13 Abreviaturas
9.14 Formatos, referencias y bibliografia
91
92
100
101
103
105
113
114
115
116
116
120
127
ÍNDICE DE TABLAS
Página
TABLA 1. Avidez
TABLA 2. Especificidad
TABLA 3. Titulo de reactivos
TABLA 4. Sistema de grupo sanguíneo ABO
TABLA 5. Tipo y volumen de muestra requerida
TABLA 6. Identificación del control
TABLA 7. Tipo y volumen de muestra requerida
TABLA 8. Identificación del control
TABLA 9. Tipo y volumen de muestra requerida
TABLA 10. Tipo y volumen de muestra requerida
TABLA 11. Identificación del control
TABLA 12. Tipo y volumen de muestra requerida
TABLA 13. Tipo y volumen de muestra requerida
TABLA 14. Identificación del control
TABLA 15. Volumen mínimo y máximo al criopreservar CPH
TABLA 16. Valores de DMSO – plasma para la medición exacta
Del DMSO al 20 %
20
21
22
25
29
31
37
39
45
60
63
72
82
84
105
108
ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA 1. Tarjeta de gel
FIGURA 2. Tarjeta de gel para grupo sanguíneo ABO y Rh
FIGURA 3. Tarjeta dianagel
FIGURA 4. Ejemplo de procedimiento
FIGURAS 5 Y 6. Preparación de suspensión de eritrocitos
FIGURA 7. Albúmina al 22%
FIGURA 8. Suero de Coombs
FIGURA 9. Perfil de la temperatura durante el proceso de Congelamiento
FIGURA 10. Esquema de la localización dentro del contenedor de N2 (l)
FIGURA 11. Esquema de la localización dentro del marco metálico (RACK)
27
28
30
42
47
71
80
98
111
111
ÍNDICE DE FORMATOS
Página
FORMATO I. Material necesario para la Criopreservación de CPH
FORMATO II. Registro del procedimiento de Criopreservación de CPH
FORMATO III. Registro de temperatura y nivel de N2 (l)
FORMATO IV. Registro del contenedor de N2 (l)
cilindros Infra
121
123
125
126
I. PRÓLOGO
El proceso de la etapa universitaria es un proceso complicado, en la que en muchas
ocasiones hay que dedicar parte de nuestro tiempo libre a las actividades que engloban
una licenciatura del área de ciencias de la salud. Después de concluir el 100 % de
créditos, los estudiantes egresados de licenciatura tienen que realizar un procedimiento
de gran importancia, llamado Titulación, con la cual se da por concluida la etapa de la
carrera. Es gracias a los avances que han realizado en el departamento de exámenes
profesionales al ampliar las opciones de titulación que permitan al alumnado concluir
con dicho proceso. Mi alternativa es la de Trabajo Profesional, es de gran ayuda en mi
situación personal, que desde antes de concluir mis estudios superiores, me incorpore al
área laboral, lo que desde luego obtener el grado, me permitirá seguir avanzando en
estudios posteriores que desee realizar sin dejar de mencionar en mi área de trabajo.
En la actualidad hay que estar bien preparados para enfrentar la problemática que se
nos presenta a los que concluimos la trayectoria, pues las oportunidades son escasas, y
en gran medida de difícil acceso, es por ello que para formar parte, del área del Banco
de Sangre de una Institución de prestigio como es el Instituto Nacional de Ciencias
Medicas y Nutrición Salvador Zubirán, que es mi caso particular, no solo hay que
mostrar lo aprendido durante la formación académica, que considero la mejor carta de
presentación, además es necesario agotar todas las herramientas con las que se cuenta
en la actualidad, como el conocer un segundo idioma, como el ingles, el manejo de
computadora e Internet entre otros.
II. INTRODUCCIÓN
La realización de un examen de laboratorio se lleva a cabo en 3 etapas igualmente
importantes que son, en el siguiente orden: etapas pre-analítica, analítica y postanalítica.
Este documento se refiere a la segunda de ellas; la etapa analítica.
En el Servicio de Medicina Transfusional se ha enfatizado la necesidad de metodologías
exactas y precisas, para realizar las pruebas pretransfusionales en el menor tiempo
posible para coadyuvar a la salud del paciente.
La altamente sofisticada y bien controlada tecnología actual de laboratorio es menos útil
si las muestras a las que les practicarán los análisis llegan al laboratorio con errores
debidos a mala identificación de las muestras o a técnicas de recolección deficientes.
Hoy en día es más probable que los errores ocurran durante la toma y manejo de las
muestras, que en el propio procedimiento de laboratorio.
Algunos estudios demuestran que el 8% de los errores al rotular la muestra con el
nombre, edad, sexo y número de identificación del paciente no son detectados a pesar de
los extensos procedimientos de revisión en manuales.
Los errores sistemáticos son difíciles de detectar y controlar. El uso de este manual
podría ayudar a minimizar muchos de estos problemas.
Uno de los factores que influye en la atención médica que se otorga, es la disponibilidad
de sangre y sus derivados en las cantidades necesarias y con las características de
calidad y seguridad que garanticen, el cumplimiento de las normas de salud vigentes.
Una certificación, en general, asegura la calidad de un producto, de un organismo o de
una persona. Pone de manifiesto que se poseen los niveles de competencia para ejercer
correctamente y dar adecuadamente las prestaciones que se le suponen. La certificación
es el conjunto de pruebas que permiten la obtención de un certificado que da fe de la
calificación de un profesional en un momento dado de su carrera.
La Certificación asegura a un profesional que posee determinados niveles de
conocimiento y de habilidades que le permiten ejercer su profesión en las mejores
condiciones.
No es un diploma académico ni sustituye a ningún título. No es para aquellos que
empiezan su vida profesional, sino para los que ya están trabajando. Por eso, sólo
pueden ser candidatos aquellas personas que en la actualidad sean profesionales que
tengan una experiencia de al menos dos años. Al margen de consideraciones
académicas, valora, sobre todo, el grado de adecuación a los requerimientos de la
práctica profesional y sus perspectivas de desarrollo. Además, dota a la profesión de una
herramienta de valoración de los niveles de competencia en el conjunto del sector,
clarifica, ayuda en la definición de los perfiles de los candidatos a un puesto de trabajo,
aportando por ello elementos de mayor transparencia y seguridad en el funcionamiento
del mercado laboral.
El Banco de Sangre es la unidad operativa, responsable de la disposición de productos
sanguíneos con oportunidad y en óptimas condiciones, para la realización de los
diferentes procedimientos médicos que se les prescriben a los pacientes en los servicios
asistenciales. En casi todos se lleva a cabo la recolección, conservación,distribución de
la sangre y sus compuestos.
La participación de los donadores voluntarios es
fundamental para mantener un número suficiente de unidades sanguíneas, tan necesarias
en la atención a pacientes.
“Tiene el compromiso de cubrir los requerimientos de sangre de pacientes, donadores y
médicos, mediante el mejoramiento continuo de los procesos y tecnología desarrollada,
y aplicados por personal altamente calificado”
La certificación es un requisito fundamental en la práctica médica, el tener acceso a un
Banco de Sangre que asegure la credibilidad de los resultados y que el producto
satisfaga las necesidades y expectativas de servicio de médicos y pacientes,
disminuyendo al mínimo el porcentaje de error, por lo que es indispensable que
dispongan de un sistema de garantía de la calidad, atendiendo a su enorme
responsabilidad sanitaria y social.
“La calidad en estos, no puede ser menospreciada y el objetivo de aplicar un sistema de
gestión de la calidad a través de las Normas Internacionales de Estandarización (ISO),
ayudará a sistematizar el trabajo, cumpliendo estrictamente los estándares”.
Por lo anterior, todo el personal que trabaja en este lugar y en especial los responsables
de gestión y dirección, deben asegurarse que se cumpla con los requisitos de calidad,
normatividad que se ofrezcan productos válidos a los enfermos, así como mejorar la
seguridad de los productos, la productividad y los costos, tras obtener la Certificación
de la Calidad ISO 9001-2000.
La certificación, es un logro importante y trascendental, el cual nos impulsará a
continuar con una mejora constante y ascendente del servicio que prestamos para
beneficio de los pacientes, y claro, sin olvidar a los donadores.
En la actualidad, el implementar un sistema de gestión de la calidad, resulta
indispensable, para contar con servicios de excelencia, aún cuando el proceso que se
lleva a cabo en una época especialmente difícil donde los recursos materiales son
escasos y donde no mucha gente piensa en trabajo en equipo y en superación.
SANGRE
La sangre es un tejido líquido que recorre el organismo transportando células, y todos
los elementos necesarios para realizar las funciones vitales (respiración, síntesis,
defender de agresiones) todo un conjunto de funciones complejas e importantes para la
vida. La cantidad en una persona está relacionada con su edad, peso, sexo y estatura, en
un adulto se considera que hay entre 4.5 y 6 litros. Todos los órganos del cuerpo
humano funcionan gracias a ésta que circula por arterias, venas y capilares.
Está formada por diversos componentes:
 GLÓBULOS ROJOS O HEMATÍES
Son las células sanguíneas más numerosas y la hemoglobina que contienen es la
responsable de su color rojo. Se forman en la médula ósea, que se halla dentro de los
huesos del esqueleto, desde donde son liberados al torrente sanguíneo.
Su función es transportar el oxígeno desde los pulmones a los diferentes tejidos del
cuerpo para que las células respiren, y también eliminan los residuos producidos por
la actividad celular (p.ej. anhídrido carbónico).
 GLÓBULOS BLANCOS O LEUCOCITOS
Son los encargados de proteger al organismo contra los diferentes tipos de
microbios. Cuando hay una infección aumenta su número para mejorar las defensas.
Unos se forman en la médula ósea y otros en el sistema linfático (bazo, ganglios,
etc).
 PLAQUETAS
Son las células sanguíneas más pequeñas. Se producen también en la médula ósea y
viven unos 6-7 días. Intervienen cuando se produce rotura, se adhieren rápidamente
en ese lugar para que cese la hemorragia, dando tiempo a la formación del coágulo
definitivo.
 PLASMA
Es un líquido compuesto de agua, proteínas, sales minerales y otras sustancias
necesarias para el funcionamiento normal del organismo y en donde se encuentran
"nadando" las células sanguíneas.
Entre las sustancias de importancia que transporta el plasma están las siguientes.

La Albúmina. Es una proteína que ayuda a mantener el agua del plasma en una
proporción equilibrada.

Las Globulinas. Son los anticuerpos encargados de la defensa de nuestro
organismo frente a las infecciones. Su disminución acarreará una disminución de
las defensas.

Factores de Coagulación. Son imprescindibles para evitar las hemorragias. La
ausencia de algún factor de coagulación puede ocasionar trastornos
hemorrágicos ya que se dificulta la formación del coágulo.

Otras proteínas transportan sustancias necesarias (grasas, azúcares, minerales,
entre otras) para el normal funcionamiento de las células.
III. OBJETIVO
Este manual tiene como objetivo principal, contener las políticas y ensayos
inmunohematológicos, como una estandarizada de procedimientos con el fin de obtener
resultados óptimos en menor tiempo, recopilados a través de la experiencia laboral para
dar
respuesta inmediata a las necesidades de los pacientes que requieren una
transfusión segura y de calidad.
METAS
Lograr la efectividad de los Servicios de Medicina Transfusional acorde con las
necesidades de nuestra población en aras de un desarrollo sustentable.
ALCANCE
Aplica a todo el personal que labora en el laboratorio de inmunohematología, así como
las relacionadas con el área afín.
IV. MENSAJE DEL USUARIO
Este documento ha sido elaborado con el objeto de uniformar las actividades y
procedimientos relacionados con el laboratorio de inmunohematología.
Para su preparación se han tomado como base, el manual de procedimientos operativos
(técnicas), el manual de la AABB (American Association of Blood Banks) de los
Estados Unidos de Norte América y los insertos de reactivos del fabricante, además de
referencias bibliográficas.
El documento incluye el protocolo completo de los pasos que deben seguirse en el
servicio de inmunohematología del Banco de Sangre, para llevar a cabo las pruebas
solicitadas.
Describe
además las instalaciones en donde se llevan a cabo estas pruebas
(pretransfusionales) tanto en pacientes externos como hospitalizados, así como el
procedimiento para llevar a cabo las pruebas pretransfusionales.
Finalmente se presenta un programa para el entrenamiento del personal que realiza estas
pruebas pretransfusionales.
Con la implementación de estas prácticas se busca la estandarización en la realización
de estas técnicas en el menor tiempo posible para beneficio del paciente.
V. MARCO JURÍDICO
Constitución Política de los Estados Unidos Mexicanos.
D.O.F. 5-II-1997, sus Reformas y adiciones.
Ley Orgánica de la Administración Pública Federal
D.O.F. 29-XII-1976 y sus Reformas.
Ley General de Salud.
D.O.F. 7-II-1984 y sus reformas.
Ley Federal de Entidades Paraestatales
D.O.F 4-II-1998 y sus Reformas.
Ley para el Fomento de la Investigación Científica y Tecnológica.
D.O.F. 21-V-1999
Ley de los Institutos Nacionales de Salud.
D.O.F. 26-V-2000
REGLAMENTOS
Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Prestación de Servicios de
Atención Médica.
D.O.F. 14-V-1986
Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud.
D.O.F. 6-I-1987
Reglamento de la Ley Federal de Entidades Paraestatales.
D.O.F. 7-IV-1995
Decretos por el que se aprueba el Programa de Reforma del Sector Salud 1995-2000.
D.O.F. 11-III-1996
Decreto por el que se reforma la Ley General de Salud.
D.O.F. 26-V-2000
NORMAS OFICIALES MEXICANAS
Norma Oficial Mexicana NOM-003-SSA2-1993 para la disposición de sangre humana y
sus componentes D.O.F. 16-I-1995.
NOM – 087 – SSA2.
VI. SEGURIDAD DE LAS MUESTRAS
Al trabajar las muestras de sangre deben observarse “las precauciones universales”.
Todo espécimen pudiera estar infectado con los virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH) o de la Hepatitis B, entre otras.
VII. DEFINICIONES
En el contexto de esta publicación, los términos listados abajo se definen como sigue:
(1) Espécimen o muestra de un paciente: Un volumen de sangre colectada
adecuadamente, para realizar una o más pruebas de laboratorio. Regularmente es una
alícuota de sangre anticoagulada, de plasma, o suero.
(2) BBS: Blood Bank Sofá 2000 es un software de administración en Medicina
Transfusional vanguardista para la administración del Servicio, que permite un registro
confiable, de donadores y receptores de sangre humana.
(3) Rastreo de anticuerpos irregulares: Prueba que se realiza de rutina a todos los tubos
primarios que llegan al Servicio.
(4)Identificación de anticuerpos irregulares: Prueba que se realiza a los sueros que
resulten con rastreo positivo.
VII. INSTALACIONES Y PROCEDIMIENTOS
Aquí se describen cuales son los sitios potenciales en donde se pueden realizar las
pruebas pre - transfusionales:
 MESA DE PRUEBAS CRUZADAS
Aquí se realizan todas las pruebas pretransfusionales a los pacientes, cuenten o no con
registro del Instituto, a quienes sus médicos tratantes les hayan solicitado concentrados
eritrocitarios,
plasma
fresco
congelado,
plasma
envejecido,
crioprecipitados
concentrados plaquetarios y/o plaquetaféresis.
No hay programación de citas, en este mismo sitio se trabajan muestras urgentes y
ordinarias así como las cirugías electivas, inmediatamente después de terminar las
pruebas pretransfusionales del paciente utilizamos el sistema BBS para ingresarlos.
Eventualmente, también acuden al laboratorio de inmunohematología pacientes
ambulatorios que son referidos de otras Instituciones públicas y/o por médicos
particulares.
El acceso es por la puerta número 4 del INCMNSZ que da a la calle Martín de la Cruz
S/N ubicada entre Vasco de Quiroga y Viaducto Tlalpan. Tiene un horario de
funcionamiento de 7:00 hr. a 18:00 hr. por la puerta 2 después de esta hora.
Esta Unidad fue inaugurada en enero de 1995. Cuenta con rampas de acceso e
instalaciones para discapacitados, un mostrador de registro para los pacientes así como
sala de espera y sanitarios.
A continuación se describirán las instalaciones con que cuenta, así como algunos
procedimientos.
Flujo de atención al personal que trae las muestras.
Los pasos que deben seguir al llegar al laboratorio de inmunohematología son:
1) Entregar al químico o técnico responsable de la mesa solicitud y tubo piloto.
2) Esperar a que ambo sean revisados.
3) Si los datos son correctos se le indicará que registre su solicitud en la libreta
de “control de unidades y sus componentes”.
4) Una vez concluidos los pasos anteriores el químico responsable informará al
mensajero en cuanto tiempo estarán listas sus pruebas pretransfusionales.
5) Para la realización de pruebas pretransfusionales ver la Pág. 48.
 MESA DE GRUPOS SANGUÍNEOS DE DONADORES
Muestras para grupo sanguíneo AB0 y Rh.
En caso de que sean donadores:
1) El químico o técnico responsable de realizar grupos sanguíneos recoge las muestras
en el área de donadores. Son dos tubos por donador uno para biometría hemática y
grupo sanguíneo y otro para serología.
2) Los estos deben contener los siguientes datos: nombre completo y número de
predonante, fecha, nombre del estudio (ej. B-H., Historia clínica etc.)
3) Para ver la realización de grupos sanguíneos refiérase a la pagina 33.
SITUACIONES ESPECIALES
Paso 1: Revisar la solicitud de laboratorio
Cada una de ellas para exámenes de laboratorio debe ser introducida en el sistema de
software para poder identificar y obtener la hoja de trabajo, etiquetas, y otros
suministros de cada paciente.
Debe contener por lo menos la siguiente información:

Nombre completo del paciente

Número de expediente o de registro

Fecha

Nombre del médico

Ubicación del paciente

Hemoderivados solicitados

Antecedentes transfusionales
Paso 2: En caso de errores
Si hay errores en la solicitud o tubo piloto tales como:

Apellidos mal escritos

Registros diferentes

Tachones o enmendaduras
Entonces la muestra no será procesada, salvo la autorización por escrito del jefe de
Servicio de Medicina Transfusional o por el médico residente a cargo del paciente.
Paso 3: Reacciones Transfusionales
La mayoría de las reacciones transfusionales en este instituto (cerca de 98%) se deben a
leucocitos y a medicamentos, sin embargo cuando estas se presentan, estos son los
pasos a seguir en el laboratorio de inmunohematología:

El médico tratante o enfermera a cargo deberá enviar un tubo piloto y una
biometría hemática al laboratorio.

Aquí se le realizaran de nueva cuenta las pruebas pretransfusionales, qué además
incluyen un Coombs directo con la finalidad de saber si el paciente está
hemolizando.

Una vez que se constató el motivo de la reacción y se tiene la certeza de que la
reacción transfusional no fue por incompatibilidad AB0 se puede transfundir
nuevamente al paciente si así lo requiere.

Para la realización de reacciones transfusionales ver manual de procedimientos
operativos.
INTERFERENCIAS Y LIMITACIONES DEL MÉTODO
FACTORES QUE AFECTAN LOS RESULTADOS DE LABORATORIO

Muestras lipémicas

Muestras hemolizadas

Muestras coaguladas

Muestras insuficientes (menos de 4.5mL de volumen)

Reactivos que presentan turbidez o hemólisis
Las que presenten uno o más de los factores arriba mencionados solo se procesaran
previa autorización del jefe de servicio.
A los resultados de laboratorio inesperados y no buscados se les llama frecuentemente
“errores de laboratorio”. Aún cuando los procedimientos analíticos hayan sido
realizados en forma correcta y precisa, diversas variables pueden afectar los resultados.
El conocimiento de éstas y la estandarización de los procedimientos de las pruebas de
laboratorio son esenciales para la correcta interpretación y el uso óptimo de los datos.
Las principales causas pueden estar relacionadas a factores no analíticos tales como la
toma, manejo y transporte de las muestras.
Los factores no biológicos, como la inadecuada identificación del paciente, y factores
biológicos, como la postura del paciente y la hora de la toma de la muestra, contribuyen
juntos al “error del laboratorio” total.
PROGRAMA DE ENTRENAMIENTO
Se puede pensar, inicialmente, que cualquier individuo inteligente puede llevar a cabo
las pruebas del laboratorio de inmunohematología. Sin embargo, aquellos que están
familiarizados con esté saben que eso no es verdad. La Medicina Transfusional es un
procedimiento complejo que requiere conocimientos y experiencia para realizarlo
correctamente. Por esta razón, una institución debe establecer criterios para la selección
adecuada del personal.
El programa de entrenamiento debe contener instrucciones didácticas y entrenamiento
empírico.
OBJETIVOS DEL PROGRAMA DE ENTRENAMIENTO
Después del entrenamiento, el entrenado debe ser capaz de realizar las siguientes
tareas:

Realizar grupos sanguíneos AB0.

Realizar pruebas pretransfusionales y describir como se llevan a cabo, así como
del rastreo de anticuerpos irregulares fuera del sistema Rho y Coombs directo.

Identificar los diferentes formatos y solicitudes asociados
Medicina Transfusional.
al Servicio de

Fraccionar hemoderivados a partir de sangre total, como Concentrados de
Eritrocitos,
Plasma
Fresco
Congelado,
Concentrado
Plaquetario,
Crioprecipitados, y Plasma sin factor VIII. Etiquetado, almacenamiento y
distribución de todos los componentes sanguíneos obtenidos en esta área.

Llevar a cabo el control de calidad de reactivos de forma manual y
automatizada.

Conocer perfectamente cada una de las áreas del servicio.

Identificar cada uno de los equipos de refrigeración y saber que producto se
almacena en ellos.

Saber a qué temperatura se deben almacenar cada uno de los hemoderivados ya
fraccionados.

Saber a qué temperaturas se conservan cada uno de los insumos y reactivos que
son utilizados rutinariamente en el laboratorio de inmunohematología.

Saber utilizar el software de administración.
CONTROL DE CALIDAD
De manera rutinaria se realizan pruebas de especificidad y avidez a los sueros
hemoclasificadores y potencia al abrir el lote.
Al equipo automatizado también se le realiza de forma rutinaria
un rastreo de
anticuerpos irregulares con dos muestras conocidas una negativa y otra con rastreo
positivo.
En el caso de grupos sanguíneos se lleva a cabo evaluando tres muestras de individuos
con grupos sanguíneos previamente conocido.
FASE PRE – ANALÍTICA
TEMA 1. CONTROL DE CALIDAD DE REACTIVOS
1.1 RESPONSABILIDADES
 Es responsabilidad del Jefe de Medicina Transfusional y del Coordinador (a) el
proporcionar éste documento al personal de nuevo ingreso y a todo aquel que lo
requiera.
 Es responsabilidad de todo el personal de inmunohematología conocer y seguir este
procedimiento.
1.2 APLICACIÓN CLÍNICA
En Medicina Transfusional es primordial ya que esté es la base de todo inmunoensayo y
se lleva a cabo de manera habitual. Cada día se hacen pruebas de especificidad, avidez
y potencia al abrir el lote de los sueros hemoclasificadores.
1.3 SUMINISTROS
La siguiente lista describe los suministros que deben estar disponibles en el laboratorio
de para llevarlo a cabo manera habitual.
1.4 REACTIVOS

Antisueros hemoclasificadores tienen las siguientes características: Caducidad
mínima de un año, con certificación ISO 9001, FDA o mayor

Eritrocitos con fenotipo conocido al 3-5% caducidad de 3 a 4 semanas

Tarjetas con gel sephadex para pruebas cruzadas, grupos sanguíneos y fenotipos

Solución salina fisiológica al 0.9%

Solución I (diana sol I)

Solución II (diana sol II)

Solución de lavado A (diana fluid A)

Solución de lavado B (diana fluid B)
1.5 EQUIPO NECESARIO
MATERIAL DE VIDRIO

Pipetas Pasteur

Tubos de 12x75 mm

Frascos goteros estériles
EQUIPOS

Centrifugas de mesa

Incubador de calor seco
OTROS

Guantes: Son de látex, no estériles. Si algún trabajador es susceptible de
desarrollar dermatitis al usarlos por largos períodos de tiempo, debe intentar usar
de vinil u otro tipo de plástico.

Contenedores desechables para punzo-cortantes:
En este sitio debe haber disponibles contenedores desechables para material punzocortante en el cual se coloca el material de vidrio usado que se haya roto. Están
fabricados de plástico rígido y tienen una pestaña para desatornillar la aguja.
Además están claramente marcados como residió bio – peligrosos, de acuerdo con la
NOM – 087 – SSA.

Bulbos de hule o látex

Gogles
1.6 PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
 AVIDEZ
La avidez de los reactivos hemoclasificadores para determinar grupos sanguíneos del
sistema ABO, en la prueba en placa y a temperatura ambiente, debe ser tal, que la
aglutinación de los eritrocitos del tipo correspondiente se inicie en el tiempo máximo
que se específica para cada subgrupo, contados a partir del momento en que se ponen en
contacto suero y eritrocitos y el tamaño de los cúmulos aglutinados no debe ser menor a
1mm de diámetro.
TABLA 1. AVIDEZ
SUERO
Anti - A
Anti - B
Anti - AB
GRUPO
SANGUÍNEO O
SUBGRUPO DE LOS
ERITROCITOS
ENSAYADOS
A1
A2
A1B
A2B
NÚMERO DE
ESPECIMENES
AL AZAR EN
PRUEBAS
2
2
1
2
15
20
15
30
B
A1B
A2B
3
1
1
15
15
15
A1
A2
B
2
2
3
15
20
15
Anti - D
TIEMPO MÁXIMO
EN SEGUNDOS
PARA QUE INICIE
LA AGLUTINACIÓN
R1r
Rrª
30
0
 ESPECIFICIDAD
El producto debe estar libre de aglutininas diferentes a las especificadas en la etiqueta y
libre de efectos o substancias indeseables tales como la presencia de hemolisinas o la
tendencia a producir el fenómeno de rouleaux.
Este control se lleva a cabo de manera habitual y se hace como una determinación de
grupo sanguíneo ABO en tubo con eritrocitos con fenotipos conocido al 3-5%.

Lavar con solución salina fisiológica al 0.9% eritrocitos del grupo O, A, B y A2
y variantes débiles del grupo A.

Preparar una suspensión salina del 3-5% de cada uno de los eritrocitos.

Colocar igual volumen de la suspensión de eritrocitos y del reactivo, en un tubo
de tamaño adecuado (los eritrocitos deben lavarse tres veces y resuspender en
solución salina fisiológica al 0.9 % para obtener la suspensión del 3-5%).

Centrifugar 30 segundos de 3000 a 3500 rpm.

Leer. Los reactivos deberán contener únicamente las aglutininas especificadas
en la etiqueta.
TABLA 2. ESPECIFICIDAD
CÉLULAS CONOCIDAS
SUERO
A1
A2
B
0
Anti - A
4+
4+
0
0
Anti - B
0
0
4+
0
Anti - AB
4+
4+
4+
0
Anti - D
R1r
Rr
4+
0
 POTENCIA
El titulo mínimo de los reactivos hemoclasificadores aceptable para cada grupo o
subgrupo de eritrocitos por prueba, se indica en la siguiente tabla:
TABLA 3. TITULO DE REACTIVOS
SUERO
GRUPO
SANGUÍNEO O
SUBGRUPO DE LOS
ERITROCITOS DE
PRUEBA
A1
A2
A1B
A2B
B
A2 B
A1
NÚMERO DE
ESPECIMENES
PROBADOS
TIEMPO MÁXIMO EN
SEGUNDOS PARA QUE
INICIE LA
AGLUTINACIÓN
2
2
2
3
2
2
2
256
128
128
8
256
128
256
Anti - AB
A2
B
2
2
64
256
Anti - D
R1r
Rrr
2
2
64
0
Anti - A
Anti - B
 TITULO

Hacer diluciones dobles seriadas de los reactivos hemoclasificadores
en
solución salina fisiológica al 9%.

Colocar tubos de ensaye de 12x75 mm en una gradilla y agregar igual volumen
de la dilución del suero y de la suspensión de eritrocitos a cada tubo y mezclar.

Centrifugar 30 segundos de 3000 a 3500 rpm.

Resuspender suavemente las células y bajo iluminación apropiada leer
microscópicamente sin demora.

Los títulos de aglutinación se realizan siempre por duplicado y deberán ser
reproducibles. Si existen diferencias en las lecturas de dos tubos con la misma
dilución del suero, deberá repetirse la prueba.

Lecturas. Los sueros sin diluir más los eritrocitos no se consideran diluciones.
La aglutinación se lee en los tubos con suero que se ha diluido antes de la
adición de la suspensión de eritrocitos.
1.7 MARCADO Y EMPAQUE
Las etiquetas en el envase primario
y secundario deben contener la siguiente
información:

Nombre del producto

Nombre y domicilio del fabricante y distribuidor

Número de lote

Número de registro de la SSA

Fecha de expiración

Temperatura de almacenaje

Volumen
Debe cumplir con las especificaciones señaladas en la NOM- 008-SCFI-1993.
1.8 FORMATOS, REFERENCIAS Y BIBLIOGRAFÍA

Asociación Argentina de Hemoterapia e Inmunología. 2004. Manual Técnico.
Ed. Biomote. Argentina. p. 22, 23, 25,25.

Documento M29-T de la NCCLS.1997. Protección de los Trabajadores de
Laboratorio de Enfermedades Infecciosas Transmitidas por sangre, líquidos
corporales y tejidos. p.15,16.

Documento H18-A de la NCCLS. NOM-003 –SSA2-1993. Procedimientos Para
el Manejo y Proceso de Muestras de Sangre. p. 12, 14, 15,16.

Documento M29-T de la NCCLS 2000, Protección de los trabajadores de
laboratorio de enfermedades infecciosas transmitidas por sangre, líquidos
corporales y tejidos. p. 210 – 216.

Manual de Procedimientos Operativos

Norma Oficial Mexicana NOM-003-SSA2-1993. Para la disposición de sangre
humana y sus componentes D.O.F. 16-I-1. p. 102,103, 105 – 114.

NOM-008-SCFI-1993.
FASE ANALÍTICA
TEMA 2. GRUPO SANGUÍNEO ABO AUTOMATIZADO
2.1 RESPONSABILIDADES

El Coordinador de Inmunohematología debe asegurarse que este procedimiento se
cumpla.

Es responsabilidad de los químicos y técnicos laboratoristas cumplir con lo descrito
en este procedimiento.
2.2 PRINCIPIO
La determinación de los grupos sanguíneos se realiza mediante una reacción antígenoanticuerpo.
El sistema de grupos sanguíneos ABO es único en cuanto a que una persona que
carezca de los antígenos A y/o B en los eritrocitos, regularmente tiene anticuerpos en el
suero dirigidos al antígeno o antígenos faltantes.
TABLA 4. SISTEMA DE GRUPO SANGUÍNEO ABO
GRUPO SANGUÍNEO
ANTIGENOS
ANTICUERPOS PRESENTES
PRESENTES EN LOS
EN SUERO
GLOBULOS ROJOS
O
Ninguno
Anti - A y Anti - B
A
A
Anti - B
B
B
Anti - A
AB
AyB
Ninguno
Para realizar el grupo sanguíneo de una persona se prueban directamente los eritrocitos
con reactivo Anti-A, y Anti-B ( prueba con eritrocitos
o prueba directa). La
confirmación de los resultados se hace utilizando eritrocitos de grupo A y B ( prueba
sérica o prueba inversa ). Algunas pruebas adicionales facilitan la identificación de
subgrupos por ejemplo: La distinción serológica de las células A1 y A2 utilizan lectina
de las semillas de Dolichos biflorus.
En la dilución apropiada, esta lectina reacciona como Anti-A1 y aglutina los eritrocitos
A1, pero no los A2. El 80% de los individuos del grupo A o AB posee globulos rojos
que se aglutinan en presencia de anti-A1 y, por lo tanto, se clasifica como A1 o A1 B.
El 20% restante, con eritrocitos que se aglutinan en presencia de Anti-A, pero no de
anti-A1, se clasifican como A2 o A2 B.
PRINCIPIO DEL MÉTODO
La tecnología de microtipificación en gel se basa en la separación por tamaño de los
eritrocitos aglutinados, durante un proceso de centrifugación en un gel poroso.
Los eritrocitos van perdiendo elasticidad en sus membranas de forma que los
aglutinados grandes quedan atrapados en la zona superior y los pequeños se distribuyen
a lo largo de la columna. Las tarjetas tienen 8 columnas compuestas por un gel de
sephadex que sirve como soporte para evitar que los eritrocitos aglutinados crucen
hasta el fondo del pocillo, de tal forma que solo los eritrocitos libres podrán migrar
formando un pequeño botón al final del pocillo.
FIGURA 1. TARJETA DE GEL
Tarjetas de Gel
Cámara de Reacción
Sobrenadante
Gel de Sephadex o
Poliacrilamida
2.3 APLICACIÓN CLÍNICA
El sistema de grupo ABO sigue siendo el más significativo en Medicina Transfusional.
Es el único en el cual el suero de la mayoría de las personas no expuestas a eritrocitos
humanos poseen anticuerpos recíprocos constantes y previsibles.
A causa de estos anticuerpos, la transfusión de sangre ABO incompatible podría
provocar hemólisis intravascular grave, así como también las otras manifestaciones de
las reacciones hemolíticas transfusionales agudas. Las pruebas de detección de la
incompatibilidad ABO entre los receptores y donantes constituyen la base de los
estudios pretransfusionales.
FIGURA 2. TARJETA DE GEL PARA GRUPO SANGUÍNEO ABO Y Rh
2.4 RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA
PREPARACIÓN DEL PACIENTE

No es necesario el ayuno del paciente y/o donante para la realización de este
estudio
TIPO DE MUESTRA:

Suero

Eritrocitos
VOLUMEN REQUERIDO:

Sangre total: Óptimo, 7 mL
Mínimo 4 mL
TABLA 5. TIPO Y VOLUMEN DE MUESTRA REQUERIDO
VOLUMEN
TIPO DE
MUESTRA
Óptimo
Mínimo
4.0 mL
1.0 mL
3.0 mL
0.5 mL
Suero
Eritrocitos (3-5%)
RECIPIENTE DE RECOLECCIÓN
La muestra debe ser recolectada en un tubo con tapón morado que contiene
anticoagulante (EDTA), o en un tubo sin anticoagulante con datos especiales para el
Servicio de Medicina Transfusional.
IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA
La muestra debe estar perfectamente identificada, conteniendo en la etiqueta nombre
completo, número de registro, fecha de la toma, y ubicación del paciente en caso de no
pertenecer a la consulta externa.
2.5 FACTORES DE RECHAZO
Las muestras deben ser rechazadas si cumplen con por lo menos uno de los siguientes
puntos:

Presencia de macro partículas

Muestras mal etiquetadas

Volumen insuficiente

Muestras coaguladas
Cuando una muestra es rechazada, el coordinador y/o responsable de área (o el
responsable del turno) deberá dar aviso al médico encargado del servicio (o al MIP),
solicitando una nueva muestra o cancelando el análisis y llenar un reporte de productos
no conformes (FR-AC-05) como se establece en el procedimiento general de control de
producto no conforme (PG-AC-04).
2.6 CONDICIONES DE MANEJO Y ALMACENAMIENTO
La muestra debe estar contenida en tubos siempre cerrados y en posición vertical. Se
recomienda separar físicamente el suero de las células dentro de las 2 horas siguientes a
la recolección de la muestra. El análisis se realiza dentro de la primera hora de llegada
de la muestra. Después del análisis se almacenan durante las primeras 72 hrs. entre 2ºC
y 8ºC. Si la muestra requiere salir del laboratorio debe ser colocada en contenedores
rígidos de plástico perfectamente bien cerrados, los cuales deben de proporcionarle
seguridad y facilidad de transporte a la muestra. Las tarjetas diana donors/ donantes
deben almacenarse cerrados entre 2°C y 8°C.
Las condiciones de almacenamiento distintas a las recomendadas pueden producir
resultados erróneos.

Estabilidad de las tarjetas diana en gel.
El reactivo es estable hasta la fecha de caducidad que aparece en la etiqueta si se
almacena entre 2°C y 8°C. No congelar.
2.7 REACTIVOS
MATERIALES
FIGURA 3. TARJETAS DIANAGEL DONORS/ DONANTES
FORMA AUTOMATIZADA
INGREDIENTES ACTIVOS

Tarjetas diana en gel Anti-A (marca Grifols)

Tarjetas diana en gel Anti-B (marca Grifols)

Tarjetas diana en gel Anti-AB (marca Grifols)

Todos los reactivos deben utilizarse de acuerdo con las instrucciones del
fabricante.
PREPARACIÓN

Previa centrifugación de las tarjetas de reactivos dianagel donors/donantes
FORMA AUTOMATIZADA:

No requiere de preparación
ACEPTABILIDAD

La aceptabilidad de un reactivo está determinada por los resultados obtenidos en
el control de calidad
2.8 CONTROL DE CALIDAD
TABLA 6. IDENTIFICACIÓN DEL CONTROL
NOMBRE DEL
CONTROL
PRUEBA DIRECTA
reactivo:
Anti - A
Anti - B
Anti-AB
Anti - D
PRUEBA INDIRECTA
Células al 3-5 % :
Células A1
Células A2
Células B
Células O
NIVEL
TIPO DE MUESTRA
I
Antisueros, tarjetas
II
Eritrocitos
PREPARACIÓN DEL CONTROL
No requiere preparación
FRECUENCIA DE USO DE CONTROLES
Deben analizarse los 2 niveles de controles todos los días que se procese el analito
ACEPTABILIDAD Y ACCIONES CORRECTIVAS
En caso de que una corrida sea rechazada, debe repetirse el ensayo, si después de ello no
se corrigen los valores, deben indagarse las posibles causas de error, como pueden ser
entre otros factores: almacenamiento inadecuado del reactivo, muestras de sangres
viejas, suspensiones muy diluidas o muy concentradas, tiempo y temperatura de
incubación inapropiada.
Si al observar estos detalles persiste, debe buscarse alguna falla sencilla en el equipo, si
el continua lo conveniente es dar aviso al servicio técnico especializado del proveedor
del instrumento.
REGISTRO Y ALMACENAMIENTO DE LOS DATOS DE CONTROL DE
CALIDAD
El Sistema Operativo del equipo Wadiana
tiene la capacidad de almacenar los
resultados de Control de Calidad obtenidos cada vez que este se procese. De esta
manera, se puede observar en pantalla el valor obtenido.
ALTERNATIVAS EN AUSENCIA DE CONTROLES COMERCIALES
En caso de no contar con controles comerciales debe usarse una muestra de eritrocitos y
de sueros de los grupos A, B, AB, Rh, O.
EQUIPO NECESARIO

Centrífuga

Guantes desechables

Gradillas

Sistema Wadiana

Solución salina fisiológica al 0.9%

Bulbo de hule

Pipetas Pasteur
2.9 PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
Una vez recibida la muestra debe ser centrifugada durante 5 minutos a 3500 rpm.
Las muestras de suero deben ser procesadas sin ningún tratamiento previo y conforme
lo especificado según el Manual del Sistema Wadiana.
PROCEDIMIENTO
1. Muestra tomada en tubo con tapón morado con anticoagulante (EDTA).
2. Centrifugar la muestra durante 5 minutos a 3000-3500 rpm.
3. Colocar el reactivo diana sol. 1 en la posición num. 9 del Sistema Wadiana.
4. Posteriormente colocar las tarjetas diana gel donors/ donantes.
5. Verificar las soluciones de lavado 1, 2.
6. Especificar en el equipo que prueba se va a realizar (grupo sanguíneo).
7. Identificar la muestra (nombre completo).
8. Realizar el inicio de la prueba.
Nota: el tiempo de análisis es de 10 minutos.
2.10 RESULTADOS
REPORTE DE RESULTADOS:
Los resultados obtenidos del equipo pueden ser capturados manualmente o transmitidos
al Sistema del Paciente Ambulatorio (SIPAM) y/o en el programa Blood Bank y son
validados y liberados por el responsable de turno.
En la validación de los resultados se revisa que los resultados obtenidos sean
congruentes y que no queden espacios libres en la pantalla sin capturar.
CRITERIOS DE REPETICIÓN
Deben repetirse ensayos discrepantes.
VALORES CRÍTICOS
No están establecidos los valores críticos para estos análisis.
2.11 INTERFERENCIAS Y LIMITACIONES DEL MÉTODO
La empresa LICON analizó las siguientes sustancias para determinar su interferencia
con esta metodología.
Entre las sustancias que causan interferencia se encuentran: muestras viejas, muestras
hemolizádas, que la dilución de eritrocitos que hacemos para nuestro análisis estén muy
concentradas o muy diluidas, reactivo mal almacenado, caducado, etc.
2.12 FORMATOS, REFERENCIAS Y BIBLIOGRAFÍA

Brecher ME. 2002. Technical Manual. Fourteenth edition. Maryland, USA:
American Association of Blood Banks; p. 230,235.

Malvasi Graciela N.2003. Técnicas de Diagnóstico y Seguimiento en el
Laboratorio de Inmunoserología - Guía De Trabajos Prácticos. p. 35, 45,47-49.

Malvasi Graciela N. 2006. Técnicas de Diagnóstico y Seguimiento n l
Laboratorio de Inmunoserología – Guía De Trabajos Prácticos. p. 82, 84, 98,
102,103,105.

Ivan Roitt. Jonathan Brostoff. David Male. 1997. Inmunologíc. 4ª Edición.
Harcourt. p. 215,233- 235

Mandell-Douglas Bennet. 1991. Enfermedades Infecciosas. Ed. Médica
Panamericana. p. 33, 37, 48, 59,60.

Manual ABB. p. 350.

Manual del Sistema Wadiana de LICON.

Mollison PL, Engelfriet CP, Contreras M.1997. Blood Tranfusion in Clinical
Medicine. Tenth edition. London, UK: Blackwell Science; p.507, 508,509-512.

Norma Oficial Mexicana NOM-003-SSA2-1993. Para la Disposición de Sangre
Humana y sus Componentes D.O.F. p.16-I-1995.

Reporte de control de producto no conforme (FR-AC-05)
TEMA 3. GRUPO SANGUÍNEO Rh
3.1 RESPONSABILIDADES
El Coordinador de Inmunohematología debe asegurarse que este procedimiento se
cumpla.
Es responsabilidad de los químicos y técnicos laboratoristas cumplir con lo descrito en
este procedimiento.
3.2 PRINCIPIO
El antigeno D es altamente inmunogénico y se ha reportado que estimula la producción
de anti-D en un 50-85% en individuos D negativos que han sido expuestos a sangre D
postiva . Los anticuerpos Anti-D tienen importancia considerable ya que pueden
originar la severa enfermedad Hemolítica del Recién Nacido (HDN) y reacciones
hemolíticas trasfuncionales.
El antígeno D y la forma débil del antigeno D
(denominado Du) son comúnmente considerados en la selección rutinaria de sangre para
transfusión.
La detección óptima de células D débiles por anti-D requiere la aplicación de una
prueba indirecta de antiglobulina. El término comúnmente utilizado. Rh (+) y Rh (-) se
requiere específicamente a la presencia y ausencia del antígeno D.
DESCRIPCION DEL MÉTODO :
El reactivo hemoagrupador en esta prueba se basa en el principio de la
hemoaglutinación.
La incubación de células rojas a probar con el reactivo hemoagrupador Anti-D origina
una reacción específica antigeno – anticuerpo si el antígeno D correspondiente está
presente en las células prueba, la detección visible de la reacción se observa por
aglutinación de las mismas.
La no-aglutinación indica un resultado negativo, y dentro de las limitaciones de esta
prueba, indica la ausencia del antigeno D correspondiente.
3.3 RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA
PREPARACIÓN DEL PACIENTE

No es necesario el ayuno del paciente y/o donante para la realización de este
estudio
TIPO DE MUESTRA

Suero

Eritrocitos
TABLA 7. TIPO Y VOLUMEN REQUERIDO
VOLUMEN
TIPO DE MUESTRA
Óptimo
Mínimo
Suero
4.0 mL
1.0 mL
Eritrocitos (3-5%)
3.0 mL
0.5 mL
RECIPIENTE DE RECOLECCIÓN
La muestra debe ser recolectada en un tubo sin anticoagulante con datos especiales para
el Servicio de Medicina Transfusional.
IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA
La muestra debe estar perfectamente identificada, conteniendo en la etiqueta nombre
completo, número de registro, fecha de la toma, y ubicación del paciente en caso de no
pertenecer a la consulta externa.
FACTORES DE RECHAZO
Las muestras deben ser rechazadas si cumplen con por lo menos uno de los siguientes
puntos:

Presencia de macro partículas

Muestras mal etiquetadas

Volumen insuficiente
Cuando una muestra es rechazada, el Coordinador y/o responsable de área (o el
responsable del turno) en turno da aviso al médico encargado del servicio (o al MIP),
solicitando nueva muestra o cancelando el análisis y llenar un reporte de productos no
conformes (FR-AC-05) como se establece en el procedimiento general de control de
producto no conforme (PG-AC-04).
La muestra debe estar contenida en tubos siempre cerrados y en posición vertical. Se
recomienda separar físicamente el suero de las células dentro de las 2 horas siguientes a
la recolección de la muestra. El análisis se realiza dentro de las dos primeras horas de
llegada la muestra.
Después del análisis se almacenan durante las primeras 72 hrs. entre 2ºC y 8ºC.
Si la muestra requiere salir del laboratorio debe ser colocada en contenedores rígidos de
plástico perfectamente bien cerrados, los cuales deben de proporcionarle seguridad y
facilidad de transporte a la muestra.
3.4 REACTIVOS
FORMA AUTOMATIZADA
INGREDIENTES ACTIVOS

Tarjetas dianagel donnors/ donantes (marca Grifols)

Tarjetas Coombs (marca Grifols)

Tarjetas phenotype Rh
PREPARACIÓN
Previa centrifugación de las tarjetas de reactivos dianagel donors/donantes
FORMA AUTOMATIZADA: No requiere preparación
3.5 CONTROL DE CALIDAD
TABLA 8. IDENTIFICACIÓN DEL CONTROL
NOMBRE DEL
CONTROL
NIVEL
TIPO DE MUESTRA
Control R 1R 1 positivo
I
Suero
Control rr negativa
II
Suero
PREPARACIÓN DEL CONTROL

No requiere preparación
FRECUENCIA DE USO DE CONTROLES

Deben analizarse los 2 niveles de controles todos los días que se procese el
analito.
ALMACENAMIENTO
Almacenar los frascos goteros sin abrir entre 2oC y 4oC. Una vez abiertos, los controles
que se utilizarán en un plazo de 30 días pueden almacenarse entre 2oC y 8oC de uso de
los controles.
LÍMITES DE ACEPTABILIDAD Y ACCIONES CORRECTIVAS
En caso de que una corrida sea rechazada, debe repetirse el ensayo, si después de ello no
se corrigen los valores, deben indagarse las posibles causas de error, como pueden ser
entre otros factores: reactivo, sol.1, sol.2, mal almacenamiento del reactivo.
Si al observar estos detalles persiste, debe buscarse alguna falla sencilla en el equipo, si
continua lo conveniente es dar aviso al servicio técnico especializado del proveedor del
instrumento.
REGISTRO Y ALMACENAMIENTO DE LOS DATOS DE CONTROL DE
CALIDAD
El Sistema Wadiana tiene la capacidad de almacenar los resultados de Control de
Calidad obtenidos cada vez que se procesa un control. De esta manera, se pueden
observar en pantalla el valor obtenido.
EVALUACIÓN EXTERNA DE LA CALIDAD
Panel del Centro Nacional Siglo XXI.
ALTERNATIVAS EN AUSENCIA DE CONTROLES COMERCIALES
En caso de no contar con controles comerciales debe usarse una muestra de suero de un
paciente normal y otra de un paciente patológico alto.
3.6 EQUIPO NECESARIO

Centrífuga

Guantes desechables

Gradillas

Sistema Wadiana

Solución salina fisiológica al 0.9%

Bulbo de hule

Pipetas Pasteur
3.7 PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
Una vez recibida la muestra deben ser centrifugadas durante 5 minutos a 3000 rpm.
Las muestras de suero deben ser procesadas sin ningún tratamiento previo y conforme
lo especificado según el Manual del Sistema Wadiana.
PROCEDIMIENTO:
1. Muestra tomada en tubo con tapón morado con anticoagulante (EDTA).
2. Centrifugar la muestra durante 5 minutos a 3000-3500 rpm.
3. Colocar el reactivo diana sol.1 en la posición núm. 9 del sistema Wadiana.
4. Posteriormente colocar las tarjetas dianagel donors/ donantes.
5. Verificar las soluciones de lavado 1, 2.
6. Especificar en el equipo qué prueba se va a realizar (grupo sanguíneo).
7. Identificar la muestra (nombre completo).
8. Realizar el inicio de la prueba.
FIGURA 4. EJEMPLO DE PROCEDIMIENTO
Nota: El tiempo de análisis es de 10 minutos.
3.8 RESULTADOS
REPORTE DE RESULTADOS
Los resultados obtenidos del equipo pueden ser capturados manualmente o transmitidos
al Sistema del Paciente Ambulatorio (SIPAM) y/o en el Programa Blood Bank y son
validados y liberados por el responsable de turno.
CRITERIOS DE REPETICIÓN

Deben repetirse ensayos discrepantes.
VALORES CRÍTICOS

No están establecidos los valores críticos para estos análisis.
3.9 FORMATOS, REFERENCIAS Y BIBLIOGRAFÍA

De Jesús Linares G. 2001. Inmunohematología y Transfusión. Ed.Viamonte;
p. 72- 75,235-239.

Graciela N. Malvasi. 2003. Pruebas de Laboratorio en el Estudio de Anemias
Hemolíticas. p. 25,25.

John G.Kelton. 20000. Transfusión Sanguínea. Ed. DOYMA. Barcelona España;
p. 56, 58, 59, 310, 311, 316, 317, 318.

Manual del Sistema Wadiana de LICON, insertos de los antisueros.

Radillo-González A. 1999. Medicina Transfusional. México. Prado; p. 88,89,
302,303, 3309-313.

Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Investigación para la
Salud D.O.F. 6-I-1987

Reporte de control de producto no conforme (FR-AC-05).

Rodríguez-Moyado H, Quintanar-García E, Mejía- Arreguí MH. 20004. El
Banco de Sangre y la Medicina Transfusional. Primera edición. México,
Editorial Panamericana; p. 433-436,502-507.

Vives L, Aguilar J, Aguilar L. 1997. Manual de Técnicas de Laboratorio en
Inmunohematología. Segunda edición. Barcelona, España: Masson; p. 105-112.
TEMA 4. PRUEBAS PRETRANSFUSIONALES
4.1 RESPONSABILIDADES
El Coordinador de medicina transfusional debe asegurarse que este procedimiento se
cumpla.
Es responsabilidad de los químicos y técnicos laboratoristas cumplir con lo descrito en
este procedimiento.
4.2 PRINCIPIO
La selección de la compatibilidad del donante y receptor en la transfusión, se basa en la
compatibilidad de los grupos sanguíneos ABO y Rh, es decir, en la comprobación de la
ausencia de anticuerpos preformados contra los antígenos de las células del donante en
el suero del receptor
(lo que se denomina prueba cruzada).
Esta incluye técnicas que permiten demostrar la ausencia de anticuerpos específicos
regulares e irregulares de importancia clínica en el suero del receptor.
PRUEBA MAYOR (anticuerpos en el suero del receptor, contra los eritrocitos del
donador).
(PRUEBA MENOR) particularmente cuando se pretenda transfundir sangre total
proveniente de donador con antecedentes de aloinmunización
(embarazos o
transfusiones previas).
La prueba menor ha sido eliminada en algunos bancos de sangre, ya que rutinariamente
a los donadores de sangre se les realiza determinaciones serológicas de los anticuerpos
más comunes.
La presencia de anticuerpos de baja incidencia en el plasma de los mismos,
probablemente no cause una reacción transfusional al ser diluidos en el plasma del
receptor.
Desde la introducción de la prueba por Ottenberg en 1908, se han realizado muchas
modificaciones, con la finalidad de proveer al paciente el máximo de seguridad y
beneficio realizándose modificaciones en los medios de reacción, en la temperatura y en
el periodo de incubación, seleccionando procedimientos con el menor costo y un
mínimo de detecciones de incompatibilidad in vitro que no tendrán un mayor
significado in vivo, por esta razón la incubación de la prueba a temperatura ambiente
está siendo eliminada.
APLICACIÓN CLÍNICA
Valoración de la prescripción (indicación) de la transfusión. Es obligación del médico
responsable del banco de sangre valorar cada una de las solicitudes recibidas, ya que en
muchos casos se encuentra que la indicación de la transfusión no está justificada.
4.3 RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA

Suero del receptor y Eritrocitos de donador.
TABLA 9. TIPO Y VOLUMEN REQUERIDO
TIPO DE MUESTRA
VOLUMEN
Suero
2 Gotas
Eritrocitos
1 Gota
RECIPIENTE DE RECOLECCIÓN
En un tubo con tapón morado con anticoagulante EDTA que proporciona el banco de
sangre.
IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA
La muestra debe estar perfectamente identificada, conteniendo en la etiqueta nombre
completo, número de registro, cama del paciente, fecha de la toma.
FACTORES DE RECHAZO
Las muestras deben ser rechazadas si cumplen con por lo menos uno de los siguientes
puntos:

Muestra coagulada

Muestra hemolizada

Muestra mal etiquetada

Volumen insuficiente
CONDICIONES DE MANEJO Y ALMACENAMIENTO
La muestra debe estar contenida en tubos siempre cerrados y en posición vertical. Se
recomienda separar físicamente el suero de las células dentro de las 2 horas siguientes a
la recolección de la muestra. Si no se analizan las muestras de suero dentro de las
primeras 8 horas, deben almacenarse entre 2ºC y 8ºC.
La muestra debe ser manipulada sólo por personal autorizado. Debe ser transportada
bien cerrada y en posición vertical, en gradillas de tamaño adecuado al tubo, o en su
defecto a través de un sistema de transporte neumático.
Si la muestra requiere salir del laboratorio debe ser colocada en contenedores rígidos de
plástico perfectamente bien cerrados, los cuales deben de proporcionarle seguridad y
facilidad de transporte a la muestra.
4.4 REACTIVOS
1. Solución salina fisiológica al 0.9%
2. Glóbulos rojos del donante, en suspensión al 3- 5% en solución fisiológica 0.9%
FIGURAS 5 Y 6. PREPARACION DE SUSPENSION DE ERITROCITOS
3. Suero del paciente (obtenido en los tres días previos a la transfusión, sí el paciente se
encuentra dentro de la ventana de inestabilidad serológica).
4.5 EQUIPO NECESARIO

Centrífuga

Guantes desechables

Gradillas

Solución salina
Albúmina, LISS, PEG ( polietilenglicol )

Antiglobulina humana (poli inespecífico IgG – C3).
4.6 PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
Una vez recibida la muestra de sangre debe ser centrifugada durante 5 minutos a 3500
rpm.
La prueba cruzada puede ser dividida en tres fases:
FASE I. SALINA RÁPIDA:
1. Coloque 2 gotas de suero del paciente en un tubo de 12 x 75 mm previamente
etiquetado.
2. Añada 1 gota de la suspensión de células de glóbulos rojos de la unidad a ser
transfundida.
3. Mezclar y centrifugar durante 30 segundos a 3500 rpm.
4. Observar en busca de hemólisis, resuspender con suavidad las células y
examinar la presencia de aglutinación. En general no se requieren lecturas
microscópicas.
5. Leer, interpretar y registrar los resultados de la prueba.
FASE II. 37°C:
La prueba continua incubándose a 37°C utilizando algunos de los medios de
reacción entre los cuales podemos mencionar:
ALBUMINA solución al 22% : Añadir 3 gotas e incubar por lo menos 30
minutos, centrifugar 30 segundos y leer, después se realizan tres lavados con
solución salina fisiológica al 0.9% y llevar el procedimiento hasta la fase de
Coombs.
La albúmina
podría influir en el segundo estadio
de la aglutinación, por
reducción de la carga negativa neta de los eritrocitos o alteración de la tensión
superficial intercelular, favoreciendo así la aglutinación de las células
recubiertas de anticuerpos.
PEG (polietilenglicol). Añadir 2 gotas e incubar por lo menos 15 minutos con
este reactivo no se centrifuga se procede a realizar los lavados tres veces con
solución salina fisiológica al 0.9%.
FASE III. ANTIGLOBULINA HUMANA:

Proceder a
añadir 2 gotas de anti gamma – globulina humana
(Anti IgG - C3d) a cada botón lavado de células, mezcle bien y centrifugue por
15 segundos a 3500 rpm.

Resuspender las células mediante una agitación suave. Lea macroscópicamente
(Si es necesario) para la aglutinación y anote los resultados.

Si el botón se disuelve la prueba es negativa o prueba compatible.

Si hay aglutinación la prueba es positiva o prueba incompatible.
4.7 FORMATOS, REFERENCIAS Y BIBLIOGRAFÍA

Banco Central de Sangre, Centro Médico Nacional Siglo XXI
2002. Instituto Mexicano del Seguro Social. Editorial Prado. p. 103- 115.

Brecher ME. 2002. Technical Manual. Fourteenth edition. Maryland, USA:
American Association of Blood Banks; p. 253-263.

De Jesús Linares G. 2001. Inmunohematología y Transfusión. Ed.Viamonte;
p. 62, 63, 65, 66, 219, 220.

Malvasi Graciela N. 2003. Pruebas de Laboratorio en el Estudio de Anemias
Hemolíticas. p. 210 - 215.

Mejía-Arreguí
MH.
2004.
Resolución
de
Problemas
Transfusionales
Relacionados con Concentrados Eritrocitarios. Gac. Med. Mex. 2004; 140
(Supl 3); p. 25-p34.

Mollison PL, Engelfriet CP, Contreras M.1997. Blood Tranfusion Cinical
Medicine. Tenth edition. London, UK: Blackwell Science; p. 97-102, 244 -251.

Radillo-González A. 1999. Medicina Transfusional. México. Prado; p. 137-147,
266.

Rodríguez-Moyado H, Quintanar-García E, Mejía- Arreguí MH. 20004. El
Banco de Sangre y la Medicina Transfusional. Primera edición. México,
Editorial Panamericana; p. 159-160.
TEMA
5.
ANTICUERPOS
IRREGULARES,
SU
IMPORTANCIA
EN
MEDICINA TRANSFUSIONAL
La Medicina Transfusional es una herramienta muy importante en las áreas de la
salud.
Los concentrados sanguíneos funcionan como un mecanismo auxiliar en el proceso
respiratorio de pacientes a quienes una condición patológica les impide elaborar
eficientemente sus propias células sanguíneas, o bien, en pacientes con pérdida
sanguínea grave en quienes el vital líquido es requerido para recuperar o mantener el
equilibrio del cuerpo. No obstante en su utilidad, se reconocen efectos nocivos
ocasionados por reacciones transfusionales, cuya aparición puede ser inmediata o tardía.
El efecto inmediato va de leve a grave y se puede manifestar en forma de urticaria,
fiebre o choque anafiláctico. Se atribuye a factores tales como la contaminación
bacteriana del componente transfundido o la respuesta inmune debida a la introducción
de un antígeno desconocido por el paciente, se debe a anticuerpos contra las diferentes
células sanguíneas, de tal forma que se identifican anticuerpos contra antígeno,
componentes leucocitarios, plaquetarios, eritrocitarios o del sistema HLA.
Entre los anticuerpos antieritrocitos el más nocivo es el que provoca la incompatibilidad
por sistema ABO: ha ocasionado aproximadamente 40 % de las muertes por
incompatibilidad. Los generadores de este problema son la confusión al asignar la bolsa
de sangre al receptor y el etiquetado equivocado de las muestras para las pruebas
pretransfusionales.
Para conocer la naturaleza de los anticuerpos presentes en una reacción transfusional es
muy importante disponer de todos los antecedentes que afectan o provocan la
producción de los mismos, como los que se ocasionan después de la transfusión y,
cuando se habla de mujeres, los gineco obstétricos, para indagar respecto a una probable
enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN).
Las que son tardías los efectos son adversos producidos por la transmisión de
microorganismos contenidos en la sangre del donador. Desde el punto de vista de la
inmunohematología, los anticuerpos contra antígenos sanguíneos se clasifican como
sigue:
 Anticuerpos contra los propios antígenos del individuo: autoanticuerpos
contra antígenos, eritrocitos y plaquetas, y los producidos en enfermedades
autoinmunes, como las de la colágena. En este contexto podemos considerar
a los anticuerpos autoinmunes como anticuerpos irregulares o adquiridos, y
dividir a los aloanticuerpos de la siguiente forma:
 Regulares naturales: los producidos contra el sistema ABO (anti-A y anti-B).
 Irregulares naturales: anti A1, anti-M, anti-N, anti-P1. anti-E, entre otros.
 Irregulares adquiridos o inmunes: antisistema Rh Hr (anti-D, anti-c, anti-C, y
otros), anti-Kell, anti-Duffy. En este contexto, los anticuerpos del sistema
ABO aparecen una vez que el individuo entra en contacto con el medio
ambiente donde se encuentran microorganismos como algunas bacterias
coliformes que contienen sustancias químicas con estructuras parecidas a las
de este sistema.
Por anticuerpos regulares debemos identificar a los que existen en todos los individuos
y que éstos tendrán durante toda su vida. Los anticuerpos irregulares son los que no
están de esa manera, aunque en el caso de los naturales no se conoce a ciencia cierta qué
o cómo se induce su producción.
Los adquiridos se conocen también como inmunes y son el resultado de la exposición a
antígenos desconocidos por el individuo al momento de la transfusión o en las mujeres
por el embarazo; estos anticuerpos son dirigidos contra antígenos de sistemas diferentes
al ABO. Los anticuerpos naturales regulares son preferentemente inmunoglobulinas de
la clase IgM, las cuales fijan de manera tan eficiente el complemento que pueden
provocar lisis intravascular y ocasionar insuficiencia renal o incluso la muerte del
paciente.
Los anticuerpos adquiridos o inmunes son generalmente inmunoglobulinas IgG, las
cuales producen hemólisis extravascular en el bazo o en el hígado mediante fagocitosis
del complejo eritrocito anticuerpo.
Los aloanticuerpos irregulares (adquiridos) más comunes en nuestra población son los
que involucran a los sistemas MNSs, P1, Kidd (Jka, Jkb), Duffy (Fya, Fyb), Kell, Lewis y
Diego.
De acuerdo con la temperatura óptima de reacción, estos anticuerpos se dividen en
anticuerpos fríos y anticuerpos calientes.
Los anticuerpos fríos van dirigidos contra los sistemas MN, Lewis y P1, con óptima
reacción a temperaturas entre 4°C y 22°C; estos son generalmente inmunoglobulinas
tipo IgM y ocasionalmente tipo IgG, y debido a esa temperatura de reacción carecen de
importancia clínica salvo que su reacción ocurra también a 37°C, es decir, que actúen
como anticuerpos calientes.
Entre estos sólo los dirigidos contra los antígenos M y N han sido asociados con EHRN,
cuya severidad va desde leve a moderada. Los llamados anticuerpos calientes tienen una
temperatura óptima de reacción a 37°C, a veces visible pero en otras ocasiones sólo
evidente hasta agregar anti gamma globulina humana (suero de Coombs). Estos tienen
una relevante importancia clínica ya que se les asocia con reacciones transfusionales de
intensidad moderada a severa, que pueden ocasionar la muerte; además, son causantes
de
hemólisis
en
los
recién
nacidos,
quienes
en
ocasiones
requieren
exsanguinotransfusión.
El laboratorio clínico funciona como un servicio de apoyo muy importante en la
medicina transfusional para la terapéutica, por lo que se ha desarrollado el área de
inmunohematología cuyo valor radica en la identificación de los anticuerpos irregulares
derivados de los procesos de inmunización, sean transfusiones, por embarazos o de
naturaleza autoinmune.
Para un óptimo funcionamiento de esta área del laboratorio es importante conocer las
características ya descritas del comportamiento de los anticuerpos, así como otras más:

La afectación que sufren por el efecto de medios de baja fuerza iónica (LISS,
polietilenglicol y otros), por el de productos químicos o enzimas (ficina, tripsina,
quimiotripsina, ditiotreitol, papaína, stalidasa, bromelasa, y otras) o de otras
sustancias. De esta manera conocemos que algunos anticuerpos de este tipo se
ven afectados o son destruidos.
Las reacciones antígeno-anticuerpo pueden observarse in vitro mediante:

Hemólisis: La unión se traduce en lisis de los eritrocitos en presencia del
complemento (siempre que el anticoagulante empleado no capture los iones Ca y
Mg necesarios para la activación del complemento).

Aglutinación: Los anticuerpos que reaccionan en medio salino se conocen como
completos o aglutinantes (comúnmente tipo IgM). Como ya se comentó, existen
diferentes elementos que influyen en la reacción antígeno anticuerpo y que
deben conocerse para utilizarlos adecuadamente en la búsqueda de anticuerpos
irregulares:
a) Aglutinación en medio macromolecular: Hay anticuerpos que aglutinan mejor cuando
se suspenden en una solución de macromoléculas (albúmina, dextrán, gelatina,
polivinilpirrolidona); aquí la albúmina en concentración de 22% a 30% incrementa la
constante dieléctrica del agua, lo que disminuye el potencial zeta. Hay evidencia de que
el dextrán y el PVP potencializan la reacción con puentes de polímeros.
b) Prueba de Coombs: Este procedimiento es útil para poner de manifiesto anticuerpos
incompletos o sensibilizantes.
c) Soluciones de baja fuerza iónica: Reducen la barrera electrostática facilitando la
reacción antígeno anticuerpo.
d) Enzimas: Potencializan la reacción antígeno anticuerpo reduciendo la superficie de
carga y removiendo estructuras que interfieren en el acceso de las moléculas del
anticuerpo.
e) Centrifugación: Acelera la reacción antígeno anticuerpo, por la fuerza que produce la
misma.
f) Temperatura: Afecta la reacción antígeno-anticuerpo de acuerdo con la temperatura
óptima de reacción: 4ºC a 22ºC para los fríos, o 37ºC para los calientes.
g) Proporción de antígeno y anticuerpo: Es importante en la búsqueda de la zona de
equivalencia de la reacción antígeno-anticuerpo. Es fundamental tener un panel de
células (eritrocitos) donde estos importantes fenotipos ya hayan sido tipificados para
usarlos en la identificación del anticuerpo correspondiente.
En el Servicio de Inmunohematología, se emplean las técnicas siguientes para la
identificación de anticuerpos irregulares de forma manual:
 Técnica salina: previamente lavados, los eritrocitos del panel de fenotipo
conocido o de la sangre de donación se ponen en contacto con el suero problema
a razón de una gota de células resuspendidas de 2 a 3 % por dos del suero
problema. Para iniciar el proceso se centrifugan y se leen; posteriormente se
incuban a una temperatura de 22°C durante media hora a una hora cuando se
sospecha una enfermedad por anticuerpos fríos de tipo autoinmune; centrifugar y
leer para descartar o confirmar este diagnóstico.
El siguiente paso es incubar a 37°C por 30 minutos, empleando el mayor
tiempo cuando se sospecha sensibilización por transfusión o embarazos previos.
Centrifugar, leer y finalmente lavar los eritrocitos tres veces con solución salina
fisiológica 0.9% para retirar totalmente las proteínas séricas y al final agregar suero de
Coombs; centrifugar y leer.
 Técnica en solución salina de baja fuerza iónica o LISS (low ionic strenghsaline): Los eritrocitos previamente lavados y suspendidos en una dilución entre
2 y 3 %, se lavan una vez con dos a tres gotas de solución de LISS, se decantan a
sequedad y se agregan dos gotas de LISS más dos gotas del suero problema;
homogenizar y agregar dos gotas más de LISS, incubar por 15 minutos a 37°C,
lavar nuevamente tres veces con solución salina y agregar suero de Coombs;
centrifugar y leer.
 Técnica enzimática con bromelina (bromelasa): Por el fuerte efecto que tiene
esta enzima sobre los eritrocitos, los tiempos de incubación se reducen. El
procedimiento es de la siguiente forma: a los eritrocitos lavados se les agrega el
suero problema en la proporción ya descrita más una gota de la enzima
(bromelina); se incuban, centrifugan y se leen.
 Después se incuban a 37°C por 15 minutos; se centrifugan y se leen. Para
finalizar, se lavan en la forma ya mencionada y se les agrega suero de Coombs;
se centrifugan y se leen.
 Técnica en albúmina: En esta técnica se procede de forma parecida a la salina,
sólo que se omite el paso de la incubación a 22°C, respetándose también los
tiempos de incubación. Como reactivo adicional se agrega en cada tubo dos
gotas de solución albuminosa al 22%. Todas las pruebas se fundamentan en las
características mencionadas previamente para las reacciones antígenoanticuerpo. En cualquier técnica los resultados se deben anotar inmediatamente e
interpretar en conjunto al final.
5.1 PANEL DE 10 CÉLULAS
Se elaboran células de donantes con fenotipo conocido en el que se han incluido los
más comunes de nuestra población. Éste consta generalmente de grupos sanguíneo O,
factor RhOD positivo y de factor RhOD negativo; de cuatro donadores para
determinación de grupo en el sistema ABO (A1, A2,B, O); de dos donadores grupo O
para diferenciación de factor RhO D (una factor positivo y otra factor negativo); células
de un donador grupo O, las cuales serán sensibilizadas, es decir, se les pegará un
anticuerpo de naturaleza IgG, generalmente un anti-D, y otras del mismo grupo O sin
sensibilizar que funcionan como control negativo; éstas dos últimas servirán para
controlar el suero de Coombs.
Debe trabajarse con sumo cuidado teniendo siempre en cuenta que de nuestro trabajo
depende la vida de muchos pacientes, y que nosotros podríamos ser la causa de una
pronta recuperación o de una complicación mayor. Nos corresponde poner nuestro
mayor empeño para obtener resultados óptimos; Por eso, cada técnica debe ser trabajada
de acuerdo con los parámetros establecidos, por ejemplo: el sistema Duffy es sensible a
los medios de baja fuerza iónica y susceptible de ser destruido por algunas enzimas, lo
que pudiera conducir a resultados erróneos. La importancia de la albúmina, radica en
que puede magnificar reacciones del sistema Rh-Hr, sin embargo, la técnica más
empleada es la salina, ya que nos permite observar adecuadamente las reacciones y nos
apoya en las otras técnicas, sobre todo cuando se observa más de una población de
anticuerpos antieritrocitos, además de ser altamente confiable.
Para reacciones in vitro y dado que el sistema de complemento en algunas reacciones
antígeno-anticuerpo es imprescindible, se recomienda que se trabaje con muestras
frescas para no permitir que éste se consuma hasta desaparecer.
Cabe aclarar que los factores del complemento son proteínas que actúan en cascada e
interactúan con los anticuerpos antieritrocitarios, ya sea para la lisis del complejo
mencionado (C9) o para facilitar la función de las células fagocíticas (C3).
5.2 FORMATOS, REFERENCIAS Y BIBLIOGRAFÍA

Brecher ME. 2002. Technical Manual. Fourteenth edition. Maryland, USA:
American Association of Blood Banks; p. 253-263.

De Jesús Linares G. 2001. Inmunohematología y Transfusión. Ed.Viamonte;
p. 62, 63,65, 66, 219, 220.

Kelton G. John. 20000. Transfusión Sanguínea. Ed. DOYMA. Barcelona
España; p. 56, 58, 59, 310, 311, 316, 317, 318.

Malvasi N. Graciela. 2003. Pruebas De Laboratorio en el Estudio de Anemias
Hemolíticas.

Mejía-Arreguí MH. 20004. Resolución de Problemas Transfusionales

N Malvasi Graciela. 2006. Técnicas de Diagnóstico y Seguimiento en el
Laboratorio de Inmunoserología – Guía De Trabajos Prácticos. p. 12, 14, 18,19.

Radillo-González A. 1999. Medicina Transfusional. México. Prado; p.137-147,
266.

Relacionados con Concentrados Eritrocitarios. Gac Med Mex 2004; 140
25 - 34.

Rodríguez-Moyado H, Quintanar-García E, Mejía- Arreguí MH. 20004. El
Banco de Sangre y la Medicina Transfusional. Primera edición. México,
Editorial Panamericana; p. 159-160.

Roitt Ivan. Jonathan Brostoff. David Male. 1997. Inmunología. 4ª Edición.
Harcourt. p. 156, 157, 159.
TEMA 6. RASTREO DE ANTICUERPOS IRREGULARES
(MÉTODO LO-ION EN TUBO)
6.1 RESPONSABILIDADES
El Coordinador de Medicina Transfusional debe asegurar que este procedimiento se
cumpla.
Es responsabilidad de los químicos y técnicos laboratoristas cumplir con lo descrito en
este procedimiento.
6.2 PRINCIPIO
El uso de gamma LO-ION, en lugar de las soluciones de albúmina bovina para los
procedimientos de anticuerpos, crea un ambiente de baja fuerza iónica que incrementa
la proporción del anticuerpo captado durante la incubación y así es mayor la reactividad,
ya sea como hemoaglutinación directa o en pruebas de antiglobulina indirecta. Al
mismo tiempo, la incorporación de compuestos de alto peso molecular incrementa la
habilidad de muchos anticuerpos para dar reacciones de aglutinación directas con las
células que posean el antígeno apropiado.
Aplicación clínica
Este estudio consiste en el rastreo que permite identificar a los pacientes que presentan
en su suero anticuerpos antieritrocitarios dirigidos contra antígenos que no son del
sistema ABO.
Esta prueba está indicada como parte de las pruebas de compatibilidad sanguínea
pretransfusional, en mujeres Rh negativo, como parte del estudio de la EHRN, en
estudios de la anemia hemolítica autoinmune, entre otras más.
6.3 RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA
Preparación del paciente:

Ayuno necesario de 8 horas
Tipo de muestra:

Sangre total
TABLA 10. TIPO Y VOLUMEN REQUERIDO
VOLUMEN
TIPO DE MUESTRA
Óptimo
Mínimo
7.0 mL
5.0 mL
Sangre total
RECIPIENTE DE RECOLECCIÓN
La sangre debe ser recolectada en un tubo de BH. Proporcionado por el Servicio de
Medicina Transfusional con la etiqueta correspondiente.
IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA
La muestra debe estar perfectamente identificada, conteniendo en la etiqueta nombre
completo del paciente, número de registro, fecha de la toma y ubicación exacta,
indicando servicio y número de cama.
FACTORES DE RECHAZO
Las muestras deben ser rechazadas si cumplen con por lo menos uno de los siguientes
puntos:

Muestras lipémicas o hemolizadas

Presencia de macro partículas

Muestras sobre etiquetadas

Muestras con etiquetas tachadas o corregidas

Volumen insuficiente

Recipiente distinto al proporcionado
Cuando una muestra es rechazada, el Coordinador y/o responsable de área (o el
responsable del turno) debe comunicar al médico encargado del servicio (o al MIP),
solicitando nueva muestra o cancelando el análisis y llenar un reporte de producto no
conforme (FR-AC-05) como se establece en el procedimiento general de control de
producto no conforme (PG-AC-04).
CONDICIONES DE MANEJO Y ALMACENAMIENTO
La sangre se extrae por una técnica aséptica, mediante una punción limpia y sin
problemas de toma. Se coloca en el tubo proporcionado por el Servicio de Medicina
Transfusional, correctamente etiquetado. Debe de centrifugarse inmediatamente y ser
procesada en ese mismo día. Después de terminar los estudios la muestra se debe de
conservar y almacenar en su tubo original debidamente tapado y en refrigeración entre
2ºC y 8ºC por un tiempo no mayor de 72 horas.
La muestra debe ser manipulada sólo por personal autorizado. Debe ser transportada
bien cerrada y en posición vertical, en gradillas de tamaño adecuado al tubo, o en su
defecto a través de un sistema de transporte neumático.
Si ésta requiere salir del laboratorio debe ser colocada en contenedores rígidos de
plástico perfectamente cerrados, los cuales deben de proporcionarle seguridad y
facilidad de transporte.
6.4 REACTIVOS
MATERIALES

Pipetas Pasteur

Tubos de ensaye de 12 x 75 ó 10 x 75 mm

Bulbos

Gradillas

Marcador con tinta indeleble

Pluma (tinta azul o negra)

Papel parafilm

Cronómetro

Contenedor de plástico con hipoclorito de sodio al 5 % en cantidad suficiente

Contenedor desechable de punzo cortantes

Libreta de pruebas de Banco de Sangre

Reactivo de células rojas para la detección de anticuerpos

Solución salina fisiológica al 0.9 %

Reactivo de anti-IgG, C3d (suero de Coombs)

Reactivo de células rojas sensibilizadas

Reactivo de células rojas no sensibilizadas

Reactivo de Gamma LO-ION
PREPARACIÓN
Los eritrocitos del panel se preparan cada vez que se utilicen realizando tres lavados con
solución salina fisiológica al 0.9 % y resuspender es ésta a una concentración
aproximada de 3% a 5%. De igual manera se preparan los eritrocitos sensibilizados y no
sensibilizados, proporcionados en el mismo.
ACEPTABILIDAD
La aceptabilidad de un reactivo está determinada por los resultados obtenidos en el
control de calidad.
ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
Las condiciones de almacenamiento distintas a las recomendadas pueden producir
resultados erróneos.
El reactivo es estable hasta la fecha de caducidad que aparece en la etiqueta si se
almacena entre 2°C y 8°C. No congelar.
CONTROL DE CALIDAD
TABLA 11. IDENTIFICACIÓN DEL CONTROL
NOMBRE DEL
CONTROL
NIVEL
TIPO DE MUESTRA
Suero No. 1
5 mL
Suero
Suero No. 2
5 mL
Suero
Células sensibilizadas
10 mL
Células
Auto testigo
No aplica
Suero-células
PREPARACIÓN DEL CONTROL
No requiere preparación
FRECUENCIA DE USO DE CONTROLES
Los sueros control se analizan al inicio de cada lote de eritrocitos del panel 10 Siglo
XXI.
Para los reactivos de Inmunohematología es diario al inicio del día.
ALMACENAMIENTO
Almacenar los frascos sin abrir entre 2oC y 8oC.
PROCEDIMIENTO DE USO DE LOS CONTROLES
Los controles de sueros conocidos proporcionados se procesan de la misma manera que
cualquier muestra de pacientes, realizando el procedimiento descrito.
LÍMITES DE ACEPTABILIDAD Y ACCIONES CORRECTIVAS
La aceptabilidad de la prueba se basa en que los resultados del control de calidad se
cumplan de acuerdo a los procedimientos descritos.
Las acciones correctivas necesarias serán tomadas por el coordinador del área.
REGISTRO Y ALMACENAMIENTO DE LOS DATOS DE CONTROL DE
CALIDAD
Todos los datos obtenidos del control de calidad se registran en los formatos
correspondientes.
ALTERNATIVAS EN AUSENCIA DE CONTROLES COMERCIALES
En caso de no contar con controles comerciales se puede utilizar muestras de sueros ya
conocidos y caracterizados plenamente en el laboratorio, tanto de un paciente con
anticuerpos irregulares positivos como uno con anticuerpos irregulares negativos.
Los sueros son congelados en alícuotas de 200µL cada una de ellas será procesada con
la frecuencia y aceptabilidad de un control.
6.5 EQUIPO NECESARIO

Centrifuga clínica

Centrifuga serológica Clay Adams

Baño María

Guantes desechables

Gradillas

Lentes de seguridad
6.6 PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
PREPARACIÓN DE LA SUSPENSIÓN DE ERITROCITOS DE LA MUESTRA Y
DEL PANEL (3-5 %).

Tomar 4 gotas del concentrado eritrocitario de la muestra y de cada célula del
panel 10 y colocarlos en un tubo de vidrio, previamente identificados

Adicionar solución salina fisiológica al 0.9 % hasta que esté lleno el tubo y
homogenizar completamente

Centrifugar durante 1 minuto

Decantar el sobrenadante

Repetir el lavado dos veces más

En el último lavado, quitar el exceso de solución salina

Con pipeta Pasteur, tomar una gota del concentrado eritrocitario, trasvasarlo en
otro tubo de vidrio debidamente identificado y agregar 24 gotas de solución
salina fisiologíca al 0.9 % y homogenizar.
MÉTODO
a) Preparar una serie de 10 tubos identificados con el número de cada célula del
Panel 10 . Incluir un autotestigo
b) Con pipeta Pasteur agregar 2 gotas de suero de la muestra en cada tubo
c) Agregar una gota de la suspensión de eritrocitos de cada célula del panel a cada
tubo correspondiente
d) Agregar una gota de la suspensión de eritrocitos del paciente en el tubo
autotestigo
e) Mezclar y centrifugar 30 segundos a 3500 rpm
f) Resuspender suavemente el botón de células, tubo por tubo. Leer y anotar si
existe o no aglutinación
g) Agregar a cada tubo dos gotas de LO-ION mezclar y centrifugar 30 segundos a
3500 rpm
h) Observar tubo por tubo si existe hemólisis. Leer y registrar la presencia de
hemólisis
i) Resuspender completamente el botón de células mediante agitación suave e
incubar a 37°C durante 10 minutos (máximo 30 minutos)
j) Luego de la incubación, lavar en tres ocasiones con solución salina fisiológica al
0.9 %, centrifugando durante 1 minutos en cada lavado
k) Eliminar el exceso de solución salina fisiológica al 0.9 % en el último lavado y
agregar dos gotas de suero de Coombs a cada tubo, se mezcla suavemente y se
centrifuga durante 30 segundos a 3500 rpm
l) Se resuspende suavemente el botón de células a contraluz tubo por tubo y leer la
aglutinación. Registrar los resultados
m) En los tubos en donde no se observó aglutinación con el suero de Coombs,
agregar una gota de células rojas sensibilizadas, mezclar suavemente y
centrifugar durante 30 segundos a 3500 rpm
n) Después de la centrifugación resuspender el botón de células por agitación suave
y leer a contraluz la aglutinación, tubo por tubo. Registrar los resultados
o) El registro de todos los datos y observaciones realizados durante la prueba se
harán en la libreta de registro de estudios del Banco de Sangre con el formato y
organización establecidos.
6.7 RESULTADOS
CÁLCULOS Y CONVERSIONES
Con los datos obtenidos al final de la prueba se realiza la lectura mediante comparación
con la carta de identificación de anticuerpos correspondiente proporcionada en el Panel
10 para la identificación de él o los anticuerpos encontrados.
REPORTE DE RESULTADOS
Los resultados obtenidos pueden ser capturados manualmente en el formato
correspondiente ya establecido o transmitidos al Sistema del Paciente Ambulatorio
(SIPAM) vía electrónica (interfase) y son validados y liberados por el Coordinador de
Medicina Transfusional o el responsable de turno.
En la validación de los resultados se revisa que los resultados obtenidos sean
congruentes y que no queden espacios libres en la pantalla sin capturar.
Una vez que los resultados son liberados en el SIPAM, son impresos durante la noche
en el departamento de archivo clínico y son archivados en el expediente del paciente.
INTERVALOS DE REFERENCIA
Los intervalos de referencia para la identificación de anticuerpos irregulares son:

NEGATIVO

POSITIVO. Nombre del anticuerpo identificado.
CRITERIOS DE REPETICIÓN

Cuando se tenga el antecedente de que esta misma prueba ha resultado positiva
anteriormente en el paciente.

Cuando la discrepancia obtenida en el estudio, pudiera ser debida a la aplicación
de la gamma-globulina anti-D en mujeres Rh negativo en un periodo anterior no
mayor de tres meses.

Cuando después de un resultado negativo en la fase de Coombs, no se observe
aglutinación con las células de control de Coombs (células sensibilizadas)
después de la centrifugación.
6.8 INTERFERENCIAS Y LIMITACIONES DEL MÉTODO

Factores como materiales contaminados, tiempo o temperatura inadecuada o
examinación de la aglutinación impropia pueden dar resultados falsos.

La utilización de plasmas o sueros viejos para las pruebas, puede ocasionar
fallas en la detección de anticuerpos dependientes de complemento.

El suero o plasma de prueba puede contener un anticuerpo dirigido a un antígeno
no representado en el reactivo de células, o bien, puede contener un anticuerpo
que es muy débil para ser detectado mediante los medios y/o métodos de prueba
empleados.

En casos raros la presencia en el suero o plasma de anticuerpos dirigidos a un
antibiótico puede causar reacciones falsas. Se ha reportado anticuerpos para la
Neomicina y el Cloranfenicol.

Las fases de lavado de las pruebas deben de ser llevadas a cabo sin interrupción,
y el resultado final debe ser interpretado inmediatamente que se termine con la
prueba.

La prueba de Control de Coombs no nos da una absoluta seguridad de que no se
presenten resultados falsos al realizar las pruebas. Pueden ocurrir sin ser
detectados errores debido a la inadecuada agitación, incubación, etc.
6.9 FORMATOS, REFERENCIAS Y BIBLIOGRAFÍA

Brecher ME. 2002. Technical Manual. Fourteenth edition. Maryland, USA:
American Association of Blood Banks; p. 233-244.

Burtis Carl A., 1996. Fundamentals of clinical chemistry, 4ª ed. Ed. W.B.
Saunders Company, U.S.A: p. 351-359.

De Jesús Linares G. 2001. Inmunohematología y Transfusión. Ed.Viamonte;
p. 62, 63,65, 66, 219, 220.

G.Kelton John. 2000. Transfusión Sanguinea. Ed. DOYMA. Barcelona España;
p. 46, 48, 69, 210, 451, 456, 457, 518.

Mandell-Douglas Bennet. 1991. Enfermedades Infecciosas. Ed. Médica
Panamericana. p. 73, 77, 78, 79,80.

Mollison PL, Engelfriet CP, Contreras M.1997. Blood Tranfusion in Cinical
Medicine. Tenth edition. London, UK: Blackwell Science; p. 205, 206,208,
319,322.

Malvasi Graciela. 2003. Técnicas de Diagnóstico y Seguimiento en el
Laboratorio de Inmunoserología - Guía De Trabajos Prácticos. p. 45,47, 72, 73,
77, 78,79.

Radillo-González A. 1999. Medicina Transfusional. México. Prado; p. 17-47,
48, 66.

Reporte de control de producto no conforme (FR-AC-05).
TEMA 7. RASTREO DE ANTICUERPOS IRREGULARES
(MÉTODO CON ALBUMINA)
7.1 RESPONSABILIDADES
El Coordinador debe asegurar que este procedimiento se cumpla.
Es responsabilidad de los químicos y técnicos laboratoristas cumplir con lo descrito en
este procedimiento.
7.2 PRINCIPIO
La habilidad de los anticuerpos de los grupos sanguíneos de producir una aglutinación
directa de las células rojas sanguíneas antígeno-positivas, depende de la distancia de
separación del puente de las células en suspensión, los anticuerpos IgG, son incapaces
de ligar el espacio entre las células rojas suspendidas en una solución electrolítica;
existen varias teorías que pueden explicar la habilidad de potencialidad de la albúmina
en la aglutinación directa por IgG. La descrita por Pollack y colaboradores en la que
explican que la albúmina reduce el potencial zeta por disposición de algunos sistemas
de pruebas, realmente liga algunos anticuerpos Rh incompletos para que produzcan una
reacción en las pruebas de aglutinación directa. La presencia de albúmina bovina
también ha sido reportada para mejorar la sensibilidad de la prueba de aglutinación
indirecta para un gran número de anticuerpos específicos de los grupos sanguíneos.
DESCRIPCION DEL REACTIVO
La albúmina es preparada de suero o plasma bovino, y está disponible en solución al
22 % o al 30 %, se adiciona azida de sodio a una concentración de 0.1% como
conservador. El pH es de 3.3 +/ - 0.1. Estos productos generalmente no contienen
caprilato de sodio, una solución de ácido graso, que es usada como estabilizador durante
el tratamiento caliente como una parte en el proceso de fabricación.
En algunas ocasiones los aditivos del sistema de prueba que contienen caprilatos pueden
causar resultados falsos - positivos.
FIGURA 7. ALBÚMINA BOVINA POLIMERIZADA 22%
Cuando el suero de pacientes contiene anticuerpos para caprilato o algunos otros con
una cadena corta de ácidos grasos, la formación de los complejos albúmina inmunoglobulina causa aglutinación de algunas células rojas sanguíneas.
Esta aglutinación es algunas veces vistas solo en la fase de antiglobulina pero es
observada ocasionalmente en la prueba después de la incubación a 37oC.
Esta causa puede ser sospechosa si un suero da positivo con todas las células
(incluyendo el control).
Mantenga a 1oC - 8oC cuando no se use. No se congele, mantenga su esterilidad, no se
use si esta marcadamente turbio.
APLICACIÓN CLÍNICA

Para la potencialización de anticuerpos incompletos en los procedimientos en
la detección de anticuerpos.
PREPARACIÓN DEL PACIENTE

No se necesita preparación especial del paciente
CONDICIONES DE LA MUESTRA

Muestras no contaminadas, muestras sanguíneas viejas
TIPO DE MUESTRA

Suero, Plasma o células rojas
TABLA 12. TIPO Y VOLUMEN REQUERIDO
VOLUMEN
TIPO DE
MUESTRA
Suero
Óptimo
Mínimo
1.0 mL
0.5 mL
7.3 RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA
La sangre se extrae por una técnica aséptica y el suero es separado para ser probado tan
pronto como sea posible.
IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA
La muestra debe estar perfectamente identificada, conteniendo en la etiqueta nombre
completo, número de registro, fecha de la toma, iniciales del flebotomista y ubicación
del paciente en caso de no pertenecer a la consulta externa.
FACTORES DE RECHAZO
Las muestras deben ser rechazadas si cumplen con por lo menos uno de los siguientes
puntos:

Muestras lipémicas

Presencia de macro partículas

Muestras mal etiquetadas

Volumen insuficiente
Cuando una muestra es rechazada, el Coordinador y/o responsable de área (o el
responsable del turno) debe comunicar al médico encargado del servicio (o al MIP),
solicitando nueva muestra o cancelando el análisis y llenar un reporte de producto no
conforme (FR-AC-05) como se establece en el procedimiento general de control de
producto no conforme (PG-AC-04).
CONDICIONES DE MANEJO Y ALMACENAMIENTO
El suero es separado para ser usado tan pronto como sea posible, si la prueba se dilata,
las muestras para la identificación de anticuerpos, deben conservarse de 2oC a 8oC por
un tiempo no mayor de 48 horas. El suero puede mantenerse por un tiempo mayor de 48
horas. El plasma de muestras anticuaguladas puede usarse si se desea, pero el operador
debe estar enterado que esto puede dar resultados falsos o detectar anticuerpos
dependientes de complementos. Si son requeridas células rojas para la prueba se pueden
obtener las muestras utilizando EDTA, heparina u oxalato y éstas deben ser probadas
antes de 48 horas. Las células rojas sanguíneas de muestras coaguladas pueden ser
probadas dentro de 21 días después de su recolección. Las células rojas de donadores
unitarios deben ser probadas hasta antes de la fecha de caducidad.
7.4 REACTIVOS

Reactivo de células sanguíneas para la detección e identificación de
anticuerpos antiglobulina humana

Células control Coombs

Albúmina bovina al 22%
MATERIALES

Tubos para prueba de 10 x 75 mm

Pipetas

Solución salina fisiológica 0.9 %

Baño María a 37°C

Centrifuga

Cronómetro
PREPARACIÓN
La albúmina es preparada de suero o plasma bovino, y está disponible en solución al
22 % o al 30 %, adicionada con azida de sodio una concentración de 0.1% como
conservador. El pH es de 3.3 +/ - 0.1.
ACEPTABILIDAD
La aceptabilidad de un reactivo está determinada por los resultados obtenidos en el
control de calidad.
ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
Los cartuchos de reactivo deben almacenarse cerrados entre 1°C y 8°C, no se congelan,
mantenga su esterilidad, no se use si esta marcadamente turbio.
Las condiciones de almacenamiento distintas a las recomendadas pueden producir
resultados erróneos.
El reactivo es estable hasta la fecha de caducidad.
7.5 EQUIPO NECESARIO

Centrífuga

Guantes desechables

Gradillas
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO

Colocar dos gotas del suero del receptor en tres tubos marcados I, II y AC
(autocontrol)

Agregar una gota de las células I, II y AC a sus respectivos tubos

Añadir tres gotas de albúmina al 22% a cada uno de los tubos

Incubar 30 minutos a 37°C

Centrifugar 30 segundos a 3500 rpm

Examinar la hemólisis y reconocer si se presenta

Resuspender las células agitando suavemente con la mano
Lavar los tubos tres veces con solución salina fisiológica 0.9% llenando completamente
el tubo y decantando con cuidado la solución salina entre lavado y lavado; y
resuspender las células perfectamente cuando se adicione la solución salina fisiológica
para el siguiente lavado.

Decantar la salina fisiológica 0.9 % completamente en el último lavado

Añadir una o dos gotas de anti – globulina humana en el botón seco de células

Mezclar bien centrifugar
Un minuto 1000 rpm
15 segundos a 3500 rpm
El tiempo apropiado dependiendo de la calibración de la centrifuga

Resuspender las células con un movimiento suave

Leer la aglutinación y anotar los resultados de la prueba.
7.6 REPORTE DE RESULTADOS
Si no hay aglutinación o hemólisis en la prueba del paciente y el donador pueden ser
considerados compatibles. Esto está sujeto a la apariencia de la aglutinación
comparativa de las células control de Coombs.
CRITERIOS DE REPETICIÓN
Si las células control de Coombs no aglutinan, la prueba compatible debe repetirse.
7.7 INTERFERENCIAS Y LIMITACIONES DEL MÉTODO
No todas las soluciones de albúmina bovina son igualmente efectivas en su habilidad
para una aglutinación potencial por anticuerpos Rh incompletos. Un procedimiento de
control cualitativo apropiado puede ser seleccionando un anticuerpo incompleto
débilmente reaccionante para usarse sobre una base para confirmar la habilidad
potencial de albúmina bovina. El suero seleccionado debe ser probado contra células
positivas y negativas para el antígeno relevante. La prueba contra células negativas
provee seguridad de que la misma albúmina no acumula células rojas sanguíneas
humanas normales.
Otros factores que pueden dar resultados falsos incluyen los siguientes:

Contaminación de las muestras sanguíneas reactivas y/o materiales adicionales

Muestras sanguíneas viejas, las pruebas pueden dar reacciones más débiles que
las que se obtienen con muestras frescas

Una concentración mayor de la suspensión de células

Inadecuada incubación de tiempo o temperatura

Centrifugación inadecuada. Una excesiva centrifugación puede tener dificultad
en resuspender el botón celular en la prueba en tubo; un botón no muy claro y
fácilmente dispersarse la aglutinación

Una lectura inadecuada de la aglutinación.
7.8 FORMATOS, REFERENCIAS Y BIBLIOGRAFÍA

Inserto de la prueba de Albúmina Bobina 22% o 30 %.

Mollison PL, Engelfriet CP, Contreras M.1997. Blood Tranfusion in Cinical
Medicine. Tenth edition. London, UK: Blackwell Science; p. 403, 404, 423, 425.
436, 441.

Malvasi Graciela. 20006. Técnicas de Diagnóstico y Seguimiento en el
Laboratorio De Inmunoserología – Guía De Trabajos Prácticos. p. 42, 43, 44,
45, 67, 68,71.

Norma Oficial Mexicana NOM-003-SSA2-1993. Para la disposición de sangre
humana y sus componentes D.O.F. 16-I-1995.

Vives L, Aguilar J, Aguilar L. 1997. Manual de Técnicas de Laboratorio en
Inmunohematología. Segunda edición. Barcelona, España: Masson; p. 204, 308,
309,310.
TEMA 8. PRUEBA DE COOMBS
8.1 RESPONSABILIDADES

El Coordinador de inmunohematología debe asegurar que este procedimiento se
cumpla.

Es responsabilidad de los químicos y técnicos laboratoristas cumplir con lo descrito
en este procedimiento.
8.2 PRINCIPIO
La reacción de Antiglobulina, fue descrita por Moreshi. En 1908, y fue aplicado por
Coombs y sus colaboradores en 1945 en la serología de grupos sanguíneos. Cuando se
utiliza el suero de animales inmunizados con proteína humana en la detección de los
llamados anticuerpos incompletos, la capacidad del suero antiglobulina para reaccionar
con componentes del complemento humana unidos a los glóbulos rojos fue reportado
en 1957 por Dacie y sus colaboradores.
La prueba de antiglobulina Coombs es un procedimiento importante para la detección
de inmunoglobulina y/o complemento unido a los glóbulos rojos. La prueba de
antiglobulina directa se utiliza para demostrar los anticuerpos y/o complemento unido a
los glóbulos rojos in vivo, y la prueba de antiglobulina indirecta después de la
incubación del suero y los glóbulos rojos, demuestran los anticuerpos y/o complemento
unido in vitro.
Cuando los anticuerpos incompletos (usualmente IgG) entran en contacto con los
glóbulos rojos que poseen los antígenos apropiados, éstos se unirán a la superficie de las
células y permanecerán unidos durante la serie de lavados con solución salina
fisiológica 0.9% para eliminar la proteína humana unida. Se puede detectar entonces la
presencia de la proteína resultante a través de una prueba de lavado de células con un
reactivo hecho de suero de conejo inmunizado con la proteína humana adecuada, o de
anticuerpos monoclonales secretados por hibridomas derivadas de ratón inmunizado y
de un cultivo medio fluido.
La aglutinación de glóbulos rojos por Anti-IgG en la prueba de antiglobulina directa e
indirecta, indica que las células están cubiertas con anticuerpos.
Algunos reportes sugieren que el IgG puede fallar ocasionalmente en la detección de
anticuerpos que se demuestren por el uso de un reactivo de antiglobulina humana poli
específica y los anticuerpos no detectados por Anti-IgG pueden ser clínicamente
significativos en algunos casos. El usuario debe ser consiente que la información
científica actual no es completamente un soporte para el uso excesivo de Anti-IgG para
pruebas de rastreo de anticuerpos y para pruebas de compatibilidad.
Un paso crucial en el procedimiento de la prueba de antiglobulina son los lavados de
células antes de añadir la antiglobulina humana. Los lavados eliminan la proteína
humana unida, que de otra manera pudieran neutralizarla.
DESCRIPCIÓN DEL REACTIVO
Anti-globulina humana, Anti-IgG,
Gamma Clone (verde o incoloro) contiene un
anticuerpo murino monoclonal IgM secretado por hibridomas de la línea celular 16H8
cultivada en un medio fluido, este anticuerpo está destinado para reaccionar con un
epítope en el dominio CH3 de la región Fc de IgG humano.
FIGURA 8. SUERO DE COOMBS MONOCLONAL-POLIESPECÍFICO
(ANTI-IgG,-C3D)
El sobrenadante del cultivo del tejido que contiene el anticuerpo monoclonal se diluye
en una solución amortiguadora apropiada para facilitar la resuspensión del botón de
células después de la centrifugación.
El producto final se ajusta a un pH 7.0 + 0.1 y contiene azida de sodio a una
concentración final de 0.1% como conservador. Advertencia: La azida de sodio puede
reaccionar con las tuberías de plomo y cobre formando azidas metálicas explosivas.
Enjuague con un gran volumen de agua para prevenir la formación de azidas explosivas.
El Gamma-Clone Anti-IgG Verde contiene una mezcla de Acid Blue #1 y Acid Yellow
#23. Estos reactivos de diagnóstico están destinados para utilizarse como se indica en
cualquiera de los métodos descritos en este instructivo. No se diluye. No se use después
de la fecha de caducidad. Manténgase de 1°C a 8°C cuando no se use. No se congele.
Tenga cuidado de mantener la esterilidad. No se use si está turbio. Precaución: No
pipetee este producto con la boca.
8.3 RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA
PREPARACIÓN DEL PACIENTE
No se requiere una preparación previa del paciente para obtener la muestra. La sangre
debe obtenerse por medio de una técnica aséptica, y preferentemente debe probarse
mientras esté fresca. Si ocurre un retraso en la prueba, la muestra debe conservarse de
1°C a 8°C.
Para la prueba de antiglobulina directa se debe extraer la sangre con o sin anticoagulante
cuando se va a realizar la prueba con Anti-IgG.
TIPO DE MUESTRA
Suero, eritrocitos
TABLA 13. TIPO Y VOLUMEN REQUERIDO
VOLUMEN
TIPO DE MUESTRA
Óptimo
Mínimo
4.0 mL
2.0 mL
Suero
RECIPIENTE DE RECOLECCIÓN

La muestra debe ser tomada en un tubo vacutainer con EDTA.
IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA
La muestra debe estar perfectamente identificada, conteniendo en la etiqueta nombre
completo, número de registro, fecha de la toma, iniciales del flebotomista y ubicación
del paciente en caso de no pertenecer a la consulta externa.
FACTORES DE RECHAZO
Las muestras deben ser rechazadas si cumplen con por lo menos uno de los siguientes
puntos:

Muestras lipémicas

Presencia de macro partículas

Muestras mal etiquetadas

Volumen insuficiente
Cuando una muestra es rechazada, el Coordinador y/o responsable de área (o el
responsable del turno) debe comunicar al médico encargado del servicio (o al MIP),
solicitando nueva muestra o cancelando el análisis y llenar un reporte de producto no
conforme (FR-AC-05) como se establece en el procedimiento general de control de
producto no conforme (PG-AC-04).
CONDICIONES DE MANEJO Y ALMACENAMIENTO
La muestra debe estar contenida en tubos siempre cerrados y en posición vertical. Se
recomienda separar físicamente el plasma de las células dentro de las 2 horas siguientes
a la recolección de la muestra.
Si no se analizan las muestras de suero dentro de las primeras 8 horas, deben
almacenarse entre 2oC y 8ºC. Si no se analizan las muestras dentro de las primeras 72
horas, deben congelarse entre –15oC y –20oC.
8.4 REACTIVOS
INGREDIENTES ACTIVOS

Suero de Coombs Poliespecifico
PREPARACIÓN

No requiere de preparación
ACEPTABILIDAD

La aceptabilidad de un reactivo está determinada por los resultados obtenidos en
el control de calidad.
ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD

Los frascos goteros de reactivo deben almacenarse cerrados entre 2oC y 8°C.
8.5 CONTROL DE CALIDAD
TABLA 14. IDENTIFICACIÓN DEL CONTROL
NOMBRE DEL
CONTROL
NIVEL
TIPO DE MUESTRA
Eritrocito sensibilizados
1
Eritrocitos
Eritrocitos no sensibilizados
2
Eritrocitos
PREPARACIÓN DEL CONTROL

No requiere preparación
FRECUENCIA DE USO DE CONTROLES

En cada corrida de una muestra se realiza el control de calidad
ALMACENAMIENTO

Se almacena de 2oC - 8°C
PROCEDIMIENTO DE USO DE LOS CONTROLES

Se maneja de la misma manera que una muestra problema
LÍMITES DE ACEPTABILIDAD Y ACCIONES CORRECTIVAS

Se acepta cuando pasa el control de calidad

En caso de que una corrida sea rechazada, debe repetirse el ensayo
REGISTRO Y ALMACENAMIENTO DE LOS DATOS DE CONTROL DE
CALIDAD

Se registra en la bitácora de control de calidad
EVALUACIÓN EXTERNA DE LA CALIDAD

Células del panel del siglo XXI en muestras de suero.
ALTERNATIVAS EN AUSENCIA DE CONTROLES COMERCIALES

En caso de no contar con controles comerciales debe usarse una muestra de
suero de un paciente normal y otra de un paciente patológico alto.

Los sueros son congelados en alícuotas de 200 µL; cada una de ellas será
procesada con la frecuencia y aceptabilidad de un control.
8.6 EQUIPO NECESARIO

Centrífuga

Guantes desechables

Gradillas

Tubos de ensaye de 12X 75 mm
8.7 PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
Una vez recibida la muestra de suero debe ser centrifugada durante 5 minutos a 3500
rpm.
Para la detección de glóbulos rojos sensibilizados in vitro
Este procedimiento puede ser utilizado para la detección e identificación de anticuerpos
inesperados y para pruebas de compatibilidad.
Cuando se prueban los glóbulos rojos con reactivos específicos para el uso de pruebas
de antiglobulina indirecta (incluyendo Anti-D en la prueba para D débil), realice la
prueba de acuerdo con el procedimiento explicado en el inserto para el uso del reactivo
en particular.
En el caso de las pruebas para la detección de anticuerpos inesperados, siga las
instrucciones dadas para los reactivos de glóbulos rojos o para cualquier aditivo que se
utilice.
En cualquiera de los casos revise estas instrucciones dadas para la fase de
antiglobulina.
Note que las células conocidas que tengan una prueba de antiglobulina directa positiva,
no pueden usarse en la prueba de antiglobulina indirecta.
1.- Por cada muestra a probar, etiqueta un pequeño tubo de prueba 12 x 75 mm ó 10 x
75 mm, si va a realizar una prueba a temperatura ambiente, se deberá preparar el juego
de tubos por duplicado.
2.- Colocar 2 o 3 gotas del suero en cada tubo.
3.- Añada una gota de la suspensión de células a cada tubo. Las células deben ser
lavadas por lo menos una vez y resuspenderse en salina fisiológica a una concentración
de 3-5%. El reactivo de glóbulos rojos se puede utilizar directamente del frasco.
Alternativamente pueden prepararse en la forma recomendada por el fabricante, o por
medio de un procedimiento que sea efectivo para el usuario. Si utiliza un procedimiento
de baja fuerza iónica en el que las células están resuspendidas en una solución de baja
fuerza iónica revise las instrucciones del fabricante, las cuales toman preferencia sobre
este paso.
4.- Si se utiliza un aditivo como Albúmina Bovina al 22% ó 30% un aditivo de baja
fuerza iónica, como Gamma LO-ION, Gamma PeG, añádalo de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Note que este paso no es aplicable si las células fueron
resuspendidas en la solución de Baja Fuerza Iónica (LISS) en el paso 3.
5.- Mezcle y centrifugue el tiempo apropiado a la calibración de la centrífuga
Nota: La fuerza centrífuga aplicada a las mezclas de suero y células es la mínima
requerida para producir un botón compacto de células y un sobrenadante claro. Una
centrifugación excesiva dificulta la resuspensión del botón de células, asimismo una
centrifugación inadecuada puede producir una aglutinación que se dispersa fácilmente.
Cada laboratorio debe calibrar sus propias centrífugas para determinar el tiempo óptimo
y velocidades de centrifugación para los diferentes sistemas de prueba.
Como una guía, un minuto a 1000 rpm, es usualmente adecuado tanto para pruebas con
salina rapida como con albúmina. A 3500 rpm las pruebas de solución salina fisiologica
0.9% usualmente requieren 15 segundos, mientras las pruebas de albúmina requieren 30
segundos por la mayor viscosidad de la mezcla de prueba.
6.- Examine para hemólisis y registre si hubiere. Nota: Asumiendo la ausencia de
contaminación bacteriana o química, la hemólisis puede indicar una reacción
antígeno/anticuerpo. Algunos anticuerpos capaces de producir hemólisis tienen
especificidad en el grupo AB, Lewis, Kidd o sistema Vel.
7.- Resuspenda las células por medio de una agitación suave y registre el resultado.
8.- Incube las muestras con solución salina fisiólogica al 0.9% (si se realizaron) por 15
minutos a temperatura ambiente (23°C ± 3°C) y los otros tubos por 15 minutos (o de
acuerdo a las instrucciones del fabricante) a 37°C ± 1°C.
9.- Mezcle y centrifugue el tiempo apropiado a la calibración de la centrifuga.
10.- Repita los pasos 6 y 7, registrando los resultados apropiadamente (ej “37°C salina”,
“37°C albúmina”, “37°C LO-ION”.
11.- Descarte los tubos etiquetados para las pruebas con solución salina fisiológica 0.9
% a temperatura ambiente si se realizaron.
12.- Lave las células de todos los tubos incubados a 37°C por lo menos 3 veces con los
tubos llenos de salina, teniendo cuidado de decantar la solucion salina fisiologica entre
los lavados y resuspender las células por completo cuando se le añada la solucion salina
fisiológica para la siguiente lavada.
13.- Decante la solución salina fisiológica 0.9% completamente en seguida de la última
lavada.
14.- Añada 1 ó 2 gotas de Gamma Clone Anti-IgG, verde o incoloro, al botón de
células y mezcle.
15.- Centrifugue inmediatamente por:
a) 1 minuto a 1000 rpm ó
b) 15 segundos a 3500 rpm o
c) El tiempo apropiado de acuerdo a la calibración de la centrífuga.
16. Resuspenda las células mediante agitación suave, observar la aglutinación y registre
los resultados de la prueba.
17.- Confirme las pruebas negativas como se explica en el paso 8, en el procedimiento
de la prueba de antiglobulina directa. Si la centrifugación del tubo, como en el paso 15
se retrasa más de un minuto desde la adición del Gamma Clone Anti-IgG para lavar el
botón, la prueba debe repetirse, aún cuando la prueba de control de Coombs de un
resultado positivo.
8.8 RESULTADOS
Se entregan aproximadamente en las dos primeras horas
Reporte de resultados
Los resultados obtenidos del equipo pueden ser capturados manualmente o transmitidos
al Sistema del paciente Ambulatorio (SIPAM) vía electrónica (interface) y son
validados y liberados por el Coordinador de Químico o el responsable de turno.
8.9 FORMATOS, REFERENCIAS Y BIBLIOGRAFÍA

Anderson - Cockayne. 1993. Química Clínica. Editorial interamericana Mc
Graw. p. 54, 57.66, 68,69.

Brecher ME. 2002. Technical Manual. Fourteenth edition. Maryland, USA:
American Association of Blood Banks; p. 504,505,506,545,546, 563,564.

De Jesús Linares G. 2001. Inmunohematología y Transfusión. Ed.Viamonte; p.
50,51, 62,63,64,77,78.

Inserto para la prueba de Coombs, laboratorios Gamma.

Malvasi Graciela. 20006. Técnicas de Diagnóstico y Seguimiento en el
Laboratorio de Inmunoserología – Guía De Trabajos Prácticos. p. 21, 25, 32,45.

Radillo-González A. 1999. Medicina Transfusional. México. Prado; p. 137-147,
266.

Rodríguez-Moyado H, Quintanar-García E, Mejía- Arreguí MH. 20004. El
Banco de Sangre y la Medicina Transfusional. Primera edición. México,
Editorial Panamericana; p. 177, 178-181.

Vives L, Aguilar J, Aguilar L. 1997. Manual de Técnicas de Laboratorio en
Inmunohematología. Segunda edición. Barcelona, España: Masson; p. 445-471.
TEMA 9. PROCEDIMIENTO PARA
CRIOPRESERVACIÓN DE
CÉLULAS PROGENITORAS HEMATOPOYÉTICAS
9.1 PROPÓSITO Y ALCANCE
PROPÓSITO
Criopreservar las Células Progenitoras Hematopoyéticas (CPH) provenientes de sangre
periférica movilizada y de Médula Ósea, obtenidas mediante procedimientos de
Aféresis y en el quirófano, respectivamente; conservando su viabilidad, esterilidad y
funcionalidad, para ser transplantadas posteriormente en pacientes con anomalías
hematológicas.
ALCANCE
Todos los usuarios podrán seguir este procedimiento para la criopreservación y el
transplante de CPH.
9.2 INTRODUCCIÓN
ANTECEDENTES
Los transplantes de Células Progenitoras Hematopoyéticas (CPH) se consideran, hoy
día, el tratamiento de elección para una gran variedad de enfermedades tanto malignas
como no malignas. El uso de estas en su forma autóloga tiene como objetivo restablecer
las funciones hematopoyéticas en pacientes sometidos a altas dosis de quimioterapia,
radioterapia, o ambas, y por tal motivo, la conservación de los precursores
hematopoyéticos a temperaturas bajas y en condiciones óptimas garantizan su
almacenamiento durante el tiempo que sea necesario, con la mínima pérdida de sus
capacidades de autorregulación y diferenciación.
Por lo anterior, los bancos de sangre o el Servicio de Medicina Transfusional son los
responsables de recolectarlas y procesarlas, y deberán de contar con manuales de
procedimientos actualizados para mantener un sistema de calidad, y asegurar que los
procedimientos, el almacenamiento y la distribución de los productos se ajusten a los
requerimientos y lineamientos internacionales para satisfacer las necesidades de
atención a los pacientes.
CONDICIONES GENERALES PARA LA PRESERVACIÓN DE LA ULTRA
ESTRUCTURA Y FUNCIÓN CELULAR
La resistencia al frío –y al congelamiento– depende de un gran número de diferentes
factores. En primer lugar el descenso repentino de la temperatura puede tener un efecto
adverso en ciertas células: una forma de choque térmico, que puede ocurrir tanto por
arriba y por debajo del punto de congelamiento. También, la formación de cristales de
hielo, dentro y fuera de las células pueden acarrear un gran daño físico.
Otra consecuencia de la formación del hielo es un cambio del medio ambiente
extracelular, en donde el congelamiento del agua tiene como resultado un incremento en
la concentración de sales de la solución, elevándose a un nivel específico que
corresponde al punto eutéctico (eutéctico, a adj. Dícese de una mezcla de cuerpos
sólidos, cuya fusión se realiza a una temperatura constante, como la de los cuerpos
puros. © El Pequeño Larousse Interactivo, 2000).
Un incremento tal en la concentración de los electrolitos permite la deshidratación
celular. Es de notar que las células que son más resistentes, son las mismas que son más
resistentes en bajar su temperatura.
CHOQUE TÉRMICO
El choque térmico puede ocurrir cuando ciertas células son enfriadas repentinamente,
incluso en la ausencia de cristalización. El rango crítico oscila entre +15ºC y 0ºC,
aunque también puede ocurrir entre 0ºC y -80ºC. El choque térmico comienza en la
membrana como un resultado de:

Contracción diferencial de varios componentes de la membrana

Rompimiento mecánico

Cambios conformacionales en la topografía de la membrana
El daño infligido no depende significativamente del perfil catiónico en el fluido
extracelular, sin embargo, el perfil aniónico es mucho más importante. Los aniones más
importantes, del menos dañino al más dañino, son el acetato, cloruro, nitrato, yoduro y
sulfato.
El choque térmico pude ser minimizado por:

Agentes crioprotectores

La presencia de ciertos fosfolípidos (fosfatidil serina)

Enfriamiento lento

Acondicionamiento previo en medios con alta concentración de sales.
UMBRAL DE DESHIDRATACIÓN
La mayoría de las células de los vertebrados son susceptibles incluso a una
deshidratación parcial (tanto a una temperatura normal o baja). Dependiendo del tipo
celular específico y de la especie, las células no pueden tolerar la pérdida de más del 20
al 80% de su línea basal de contenido de agua, estableciéndose así un límite del umbral
de deshidratación, en el cual las estructuras celulares sufren un daño irreversible.
La correlación entre la resistencia de las células a la deshidratación y su resistencia a las
bajas temperaturas es un reflejo de los efectos en el balance iónico. Esto es, el
incremento en la concentración de sales que acompaña a la cristalización es el
responsable de los efectos más dañinos.
El incremento en la concentración de sales induce la precipitación de proteínas dañando
la estructura lipoproteíca de la membrana. Al mismo tiempo, la cristalización de los
amortiguadores electrolíticos puede inducir grandes cambios del pH. El incremento en
la concentración de ciertos iones y compuestos tiene efectos tóxicos en el interior
celular.
El congelamiento también puede afectar la naturaleza coloidal del medio intracelular, un
efecto que puede ser reversible o irreversible. El sistema coloidal puede separse en dos
fases distintas con moléculas de agua asociadas, siendo eliminadas de las
macromoléculas orgánicas de tal manera que posteriormente se agregan y se vuelven
vitrificadas.
VELOCIDAD DE CONGELAMIENTO Y CALENTAMIENTO
El método ideal del congelamiento y la velocidad óptima de enfriamiento dependen de
varios factores conflictivos, muchos de los cuales son pobremente entendidos. Las
condiciones ideales son a menudo determinadas por pruebas de ensayo y error, dando
como resultado protocolos, en donde se establece la velocidad del enfriamiento; sí la
temperatura debería de ser disminuida en intervalos de tiempo; qué agente crioprotector
es empleado; etc. El objetivo es prevenir el choque térmico, los efectos adversos de la
excesiva concentración de sales, y el daño al medio coloidal de la célula. En las
velocidades de enfriamiento para uso rutinario, la cristalización y el inicio (seeding)
siempre comienzan en el compartimiento extracelular.
La extensión del tiempo de las células durante el punto eutéctico, por ejemplo, el
tiempo transcurrido en que son expuestas a una alta concentración de sales

La velocidad de congelamiento intracelular

El tamaño y la forma de cualquier cristal de hielo formado
Si el enfriamiento es lento, el crecimiento de los cristales de hielo en el compartimiento
extracelular es tal que las células se contraen y son expuestas a altas concentraciones de
sales.
Subsecuentemente, la fase líquida se congela a la temperatura eutéctica. Si el
enfriamiento es muy rápido, el agua en el interior de las células forma pequeños
cristales de forma irregular que son relativamente inestables. Si las células son
descongeladas subsecuentemente muy lentamente, estos cristales se agregarán a una
forma más grande, formando cristales más estables, los cuales pueden causar daño. El
incremento en la concentración de sales que acompaña al proceso de congelamiento
causa contracción celular, y si continúa por encima de cierto umbral, permite la
permeabilización de iones en la membrana. Por ello, la viabilidad celular depende de la
velocidad de enfriamiento. La mayor sobrevida a una cierta velocidad disminuirá
conforme esta velocidad se incrementa. La velocidad ideal es disminuyendo lentamente
la temperatura, que permita a las células perder suficiente agua para prevenir el
congelamiento intracelular prematuro. Sin embargo, si la velocidad es demasiado lenta,
las células serán expuestas a altas concentraciones de sales por un largo periodo de
tiempo. Además, el rango ideal de enfriamiento depende del volumen crítico de las
células que es definido por:

La permeabilidad de la membrana celular al agua

El área de la superficie de la membrana
El factor principal que causa la perdida de la viabilidad es la formación de cristales de
hielo intracelular, y especialmente la agregación de estos cristales durante el
descongelamiento. A una velocidad lenta de enfriamiento la alta concentración de sales
resultante ejerce efectos adversos cuando el agua intracelular - que tiene un alto
potencial químico - difunde hacia el exterior celular y se congela en el compartimiento
extracelular.
Los porcentajes más altos de sobrevida son obtenidos en una variedad de velocidades de
enfriamiento referida como la zona de transición, en el cual el efecto de ambos
mecanismos es mínimo.
FENÓMENO A TEMPERATURAS BAJAS
Hay un gran consenso de información acerca de los cambios biofísicos y bioquímicos
que ocurren en las células vivientes en temperaturas inferiores a los 0ºC. Se puede
concluir que, a no ser que la temperatura de almacenamiento sea demasiada baja,
algunas células continuarán viviendo y su tiempo de sobrevida dependerá de su radio
metabólico residual que será lentamente desacelerado a una mayor o menor extensión.
A temperaturas entre 0ºC y -40ºC, que no es lo suficientemente baja para la
preservación eficientemente de ciertos tipos celulares, la difusión procede y esto puede
modificar el balance iónico en el medio. A temperaturas más bajas, estas soluciones de
electrolitos son solidificados en eutécticos.
La estructura cristalina del hielo puede cambiar también (con el crecimiento de cristales
o recristalización) provocando un serio daño físico a estructuras biológicas importantes.
PRESERVACIÓN A TEMPERATURAS BAJAS
En el mundo de los seres vivos, la temperatura de -70ºC es considerada el umbral de
temperatura más bajo en el cuál ningún proceso vital está permitido. Cuando se
contempla el almacenamiento a largo o muy largo plazo, temperaturas por debajo de
este umbral deben ser empleadas.
Muchos investigadores, conservan células almacenadas en presencia de algún agente
crioprotector (por ejemplo, Dimetilsulfóxido [DMSO] o glicerol), para prevenir
cualquier daño, al momento en que son almacenadas a temperaturas inferiores de 130ºC. En la práctica, es difícil creer que cualquier proceso dañino puede ocurrir
todavía a esta temperatura en la cual el agua es vitrificada. Algunas células
particularmente lábiles, deben almacenarse a temperaturas extremadamente bajas de 196ºC, como es el caso del nitrógeno liquido N2 (l).
MEDICIÓN DE LA TEMPERATURA
Debido a que la velocidad de congelamiento y descongelamiento pueden tener un mayor
impacto en la viabilidad de las células y tejidos, deben de ser medidas en una forma
cuantitativa. La mejor manera de realizarlo es generar una curva completa que describa
el proceso de congelamiento y descongelamiento. Para esto, debe realizarse lo siguiente:
1. El enfriamiento antes de que el congelamiento inicie
2. El tiempo de súper-enfriamiento y sus parámetros
3. El inicio de la cristalización y la duración de la meseta de la fase de transición
4. El rango en el cual la temperatura desciende después de la fase de transición
Esta curva es referida como el perfil de la temperatura del sistema en consideración y
puede ser normalizada a una referencia medible para su fácil manipulación. El
parámetro más fácil de estimar en el rango de enfriamiento, es el tiempo en que la
temperatura cae desde 5ºC, (al punto en el cual la mayor parte del cambio de fase o
eutéctico procede, con su correspondiente liberación del calor latente de fusión) hasta 50ºC. Sobre este rango, la temperatura tiende a volverse lineal en función del tiempo.
Ver figura 1.
(*) Súper-enfriamiento: Durante el proceso de congelamiento, el súper-enfriamiento
constituye una fase importante y crítica del perfil de temperatura. En términos prácticos,
la manera en que una solución es enfriada por debajo de su punto de congelación puede
determinar cómo ocurrirá el inicio de la formación de cristales de hielo y por ende la
forma de cristalización.
FIGURA 9. PERFIL DE LA TEMPERATURA DURANTE EL PROCESO DE
CONGELAMIENTO CONTROLADO.
Congelamiento ideal
Incremento en la
velocidad de enfriamiento
AGENTES CRIOPROTECTORES
Las causas principales de la destrucción celular son la formación de hielo intracelular, y
la exposición a altas concentraciones de sales. El éxito durante el congelamiento
depende en mantener un volumen de agua suficiente en la fase líquida, tanto en los
compartimientos intracelular y extracelular, para mantener los electrolitos en solución.
El inicio y la subsecuente cristalización pueden ser inhibidas por la inactivación del
punto del potencial de condensación por medio de un envenenamiento químico. Los
agentes usados para este fin son capaces de unirse a las moléculas del agua a través de
puentes de hidrógeno y son llamados como crioprotectores, son muy diversos en su
estructura química pero todos actúan de la misma forma.
Cualquiera que sea su estructura, todos son muy solubles en agua y por su capacidad de
formar puentes de hidrógeno con las moléculas de agua, disminuyen el punto de
congelamiento de cualquier solución en la cual son incluidos.
La segunda propiedad importante de estos agentes es de que no son tóxicos a las
células. La toxicidad en este caso es muy difícil de definir a consecuencia de las
condiciones externas, tan opuestas a la naturaleza del producto en sí mismo. En la
práctica, la toxicidad depende de la concentración del agente crioprotector, la tonicidad
del medio, y de cómo las células están en contacto con el agente.
Las demás variables que determinan la extensión a la cual un aditivo en particular será
capaz de proteger a las células de un sistema biológico dado, dependen de factores tales
como el peso molecular del compuesto y su habilidad de atravesar la membrana celular.
En términos generales los agentes crioprotectores modulan las propiedades eutécticas de
una solución de tal manera que la cantidad de hielo formado y en consecuencia, la
concentración de sales es reducida. Por disminuir el punto de congelamiento del fluido
extracelular, inhiben el flujo de agua intracelular, previniendo así la disminución del
volumen celular a su mínimo volumen crítico. Por reducir la retracción celular, estos
agentes atenúan la hiperconcentración del fluido intracelular y por ello inhiben la
precipitación de las proteínas.
En la práctica, una solución salina isotónica (9 gramos de NaCl por litro) en presencia
de 1% de DMSO alcanzará una concentración de 50 g/L a una temperatura de -5ºC. En
presencia de 5% de DMSO, esta concentración no será alcanzada hasta que la
temperatura haya descendido a -20ºC y a una concentración de 10% del crioprotectante
no se alcanzará hasta los -50ºC.
La cantidad del daño inducido en las células durante el congelamiento depende de dos
factores conflictivos, y ambos dependen de la velocidad de enfriamiento: a velocidades
que son demasiado lentas, altas concentraciones de sales serán generadas, a velocidades
que son demasiado rápidas, el hielo se formará en el interior de las células. La máxima
viabilidad es obtenida por el enfriamiento a una velocidad, en la zona de transición, en
el cual el efecto combinado de ambos mecanismos es minimizado.
Como regla general, el agente crioprotector parece proteger a las células a velocidades
de enfriamiento lento en el cual el daño asociado con los efectos de la solución
predominan. Basadas en observaciones empíricas, se ha demostrado que el resultado de
incrementar la concentración de un agente crioprotector (por ejemplo, glicerol o
DMSO) en la suspensión celular siendo enfriada a diferentes velocidades, es trasladar el
radio óptimo más inferior acoplado con un incremento del rango general de sobrevida, y
se ha documentado que los problemas asociados con el congelamiento intracelular no
son afectados por la presencia del agente crioprotector.
Con referencia a la noción de la zona de transición descrita anteriormente, se pude decir
que el agente crioprotector presente durante el congelamiento, traslada la zona entera en
la dirección de rangos más bajos por disminuir el umbral asociado con el daño causado
por la combinación de las altas concentraciones de sales y del hielo intracelular.
9.3 INSTRUCCIONES Y PROCEDIMIENTO
Los principales factores que se deben tener en cuenta con el procedimiento de
criopreservación son: la concentración celular, el medio crioprotector, el programa de
congelamiento y el sistema de almacenamiento.
La suspensión celular inicial de una muestra de CPH obtenida de sangre periférica
movilizada no debe de exceder de 2-3 x 10 7 células por mililitro.
El medio crioprotector puede variar, pero es recomendable que contenga una fuente
nutritiva, que puede ser albúmina humana, suero o plasma autólogo u homólogo, en una
concentración final de al menos 10%. El agente crioprotector de elección es el DMSO a
una concentración final del 10%, la adición debe de realizarse lentamente y a una
temperatura de 4ºC. Para tal efecto, se procede a preparar la solución crioprotectora con
DMSO al 20%, adicionando un volumen igual de la cosecha de CPH y de la solución
crioprotectora, resultando una concentración final al 10% y siempre manteniendo a una
temperatura de 4ºC.
Una vez terminada la mezcla, se transfiere a una bolsa de congelamiento que debe estar
constituida por un material plástico no lipofílico (poliolefina o teflón-kapton) para evitar
el daño a las membranas celulares, y además debe de ser lo suficientemente resistente a
bajas temperaturas (-196ºC). La bolsa se introduce en un soporte de aluminio que
mantenga comprimidas ambas superficies, proporcionando así un espesor y forma
homogénea de la muestra que facilite un correcto intercambio de calor.
El programa de congelación puede variar, pero en términos generales debe incluir
primero una fase de estabilización a una temperatura de 4ºC, seguida de un descenso
constante de la misma a un ritmo de 1-2ºC/min. En el momento previo al punto
eutéctico, se debe inducir un descenso prolongado de la temperatura de la cámara para
compensar la liberación del calor latente de fusión.
Una vez superada la fase de transición, el ritmo de enfriamiento debe permanecer
constante entre 1-2 ºC/min.
Las células congeladas pueden almacenarse en un contenedor de N2 (l), en su fase
líquida, donde la temperatura se mantiene constante a –196ºC. Si la muestra se mantiene
en la fase gaseosa, la temperatura puede oscilar entre –100ºC y –140ºC.
OBSERVACIONES
El Dimetilsulfóxido es potencialmente tóxico para las células en temperaturas por arriba
de 0ºC, por ello su adición y los pasos subsecuentes deben de realizarse lo más rápido
posible en todo el procedimiento, tanto en la preparación de los reactivos, como en la
preparación de las muestras biológicas se deben de mantener a una temperatura de 4ºC y
con asepsia en la campana de flujo laminar.
En el laboratorio se han realizado experimentos de criopreservación usando la prensa
para la bolsa criogénica, incluida en el equipo CryoMed Freezeer, el casete de aluminio
(Canister), y los sensores de temperatura, superficial, o dentro de la muestra, con lo cual
hemos observado que el proceso se ve afectado por estas configuraciones y por tal
motivo es necesario elegir el programa adecuado al momento de criopreservar las CPH
según la manera que se elija al congelar las muestra.
9.4 MATERIAL Y EQUIPO REQUERIDO PARA CRIOPRESERVAR CPH
1. Bata quirúrgica
2. Cubre bocas
3. Gorro quirúrgico
4. Guantes estériles
5. Campos estériles
6. Tijeras inoxidables estériles
7. Pinzas inoxidables estériles (Rocher)
8. Gasas estériles
9. Torundas de algodón (jabón, alcohol, isodine)
10. Alcohol isopropílico al 70%
11. Desinfectante (glutaraldehído, fenol al 5%, o formaldehído)
12. Isodine
13. Frascos estériles (100 mL) o matraz Elermeyer de 250 mL
14. Probeta graduada estéril (100 mL)
15. Acopladores para toma de muestras (Sampling Site Couplers, Fenwal 4C-2405)
16. DMSO estéril (Sigma, Cat D-2650) o USP (Sigma, Cat. D-1435)
17. Jeringas desechables estériles de 5, 10, y 20 mL
18. Agujas estériles del No. 18G
19. Bolsa criogénica de 250 mL (OriGen, Cryostore, Cat. CS 250n)
20. Casete de aluminio (Canister) para bolsa criogénica a 4ºC
21. Equipo para congelamiento controlado CrioMed Freezer
22. N2 (l) a baja presión
23. Guantes criogénicos
24. Frascos para hemocultivo y de hongos/micoplasma (pediátricos, 1-3 mL)
25. Tubos para Biometría Hemática (BH)
26. Hielo fräppe
27 Refrigerantes envueltos en papel
28. Azul Tripano al 0.4%
29. Cubre y porta objetos
30. Microscopio óptico
32. Sellador dieléctrico
33. Bolsas para desechos
34. Etiquetas de identificación
35. Crioviales estériles
36. Campana de Flujo Laminar
37. Depósito para almacenamiento con N2 (l)
38. Formato del material necesario para criopreservar CPH (Formato I)
39. Formato de registro del procedimiento para criopreservar CPH (Formato II)
40. Marcos metálicos (Racks) numerados N2 (l)
41. Diagrama del sitio de almacenamiento en el depósito de N2 (l)
42. Pipetas automáticas de 200 y 1000 μL
43. Puntas para pipetas automáticas de 200 y 1000 μL
44 Solución Salina Fisiológica 0.9%
9.5 ESPÉCIMEN A CRIOPRESERVAR
 Células progenitoras hematopoyéticas (alogénicas o autólogas) movilizadas de
sangre periférica y obtenidas mediante aféresis.
 Médula ósea autóloga obtenida en quirófano.
Si es necesario, la suspensión celular es primero concentrada en forma manual o por una
técnica automatizada (seguir el procedimiento apropiado).
9.6 PROCEDIMIENTOS PREVIOS A LA CRIOPRESERVACIÓN DE CPH

Realizar la limpieza y desinfección de la campana de flujo laminar, la
esterilización con luz ultravioleta (U.V.) del material que no se puede esterilizar
con vapor (por ejemplo, bolsas criogénicas, DMSO, tubos de BH, etc.), dejar 15
minutos y encender la lámpara de luz U.V. Colocar un letrero que indique que
está encendida.

Solicitar el plasma del paciente (aprox. 100 ml) obtenido durante la aféresis al
equipo de enfermería y mantenerlo a 4ºC.

Rotular las bolsas criogénicas y el casete de aluminio (canister).

Colocar una etiqueta de identificación en la porta-etiqueta de la bolsa criogénica.
Sellar con el sellador dieléctrico en varios puntos la porta- etiqueta.
.
La información de la etiqueta debe contener la siguiente información:
Nombre del donador
No. de unidad o identificación (por ejemplo, expediente)
Fecha
Producto celular (por ejemplo, CPHSP alogénica, MO o CPHSP autóloga
reducida), si es autóloga: SOLO PARA USO AUTOLOGO
No. de secuencia de la bolsa criogénica, (por ejemplo, 1 de 3).

Apartar las bolsas criogénicas hasta que se necesiten.

Rotular una bolsa criogénica como bolsa control y apartarla hasta su uso.

Rotular los frascos de cultivo, BH y crioviales con la información del paciente.

Rotular el casete de aluminio (canister) con una etiqueta con la
información
de paciente.

Verificar el nivel de N2 (l). Abrir la válvula del N2 (l), y encender el equipo de
congelamiento y elegir el programa que va ser utilizado.

Colocar canister en el congelador hasta su uso.

Anotar el número de lote, la fecha de caducidad y la casa comercial del DMSO
y de las bolsas criogénicas en el Formato del registro del procedimiento
criopreservación de CPH (Formato II).
de
9.7 PROCEDIMIENTO PARA CRIOPRESERVAR
Pesar la bolsa que contienen las CPHSP al terminar su recolección. Restar el peso de la
bolsa vacía (bolsa transfer de 600 mL de equipo CobeSpectra = 32g; bolsa de
recolección de equipo CS-3000 = 25g) y dividir el resultado entre la densidad específica
de las CPH (d= 1.066) para obtener el volumen aproximado. Con este valor se puede
calcular la cantidad de bolsas criogénicas que serán necesarias para la criopreservación
de las células.
Ejemplo,
Peso de la bolsa con CPHSP =
133 g
Peso de la bolsa transfer de 600 mL =
-
32 g
__________
101 g CPHSP
÷
Densidad específica de las CPHSP =
1.066 g/mL
__________
94.74 mL de CPHSP
En la siguiente tabla se muestran el volumen mínimo y máximo permitido al
criopreservar CPH en las bolsas criogénicas de diferentes capacidades (Nota. Los datos
fueron tomados de las bolsas Cryostore de Origen Biomedical, pero se puede aplicar a
cualquier bolsa con las mismas dimensiones y capacidades).
TABLA 15. VOLUMEN MÍNIMO Y MÁXIMO PERMITIDO AL
CRIOPRESERVAR CPH
Código del
Producto
CS 50
CS 250
CS 500
Volumen, a
congelar
Min – Max
10 a 20
30 a 70
55 a 100
Volumen
Nominal
Largo,
cm
Ancho, cm
50
250
500
11.4
15.2
19.0
7.6
12.7
12.7
Tomando en cuenta la capacidad de las bolsas criogénicas, el volumen de CPH se
dividiría en 3 bolsas criogénicas con un volumen de 31.58 mL (más un volumen igual
de solución crioprotectora con DMSO al 20%).
Si el volumen de la cosecha es mayor a 140 mL, el volumen deberá ser reducido,
según el protocolo establecido en el Servicio de Medicina Transfusional.
Si el volumen de la cosecha es igual o menor a 140 mL, colocar la bolsa dentro de la
campana de flujo laminar. Realizar la asepsia de uno de los puertos de entrada y colocar
un acoplador de toma de muestra en el puerto y realizar su asepsia correspondiente.
Si no se cuenta con dicho acoplador, realizar la asepsia del tubo de recolección de la
bolsa de CPH para puncionarlo con una jeringa con aguja del calibre 18G. En este
momento se puede realizar la asepsia de los puertos de entrada de las bolsas criogénicas
y de los frascos de hemocultivo. De igual forma, realizar la asepsia de un extremo de
tubo de la bolsa del plasma para poder tomar el volumen indicado para preparar la
solución crioprotectora.

Usando una jeringa de 5 mL con aguja del calibre 18G retirar 2 mL de la
suspensión celular y depositar 1 mL en un tubo de BH (Tubo morado con
EDTA), rotulado previamente. Realizar el recuento celular en el equipo CellDyn
3500 y determinar el número de células Mononucleares en la muestra.

Inocular 1 mL de la suspensión celular en un frasco de hemocultivo, rotulado
previamente como pre-congelamiento o pre-DMSO. Tomar las jeringas de
20 mL con aguja del calibre 18G y llenar completamente a un volumen de 20 ml
cada una. Usar las jeringas necesarias para recolectar el volumen total de
CPHSP. La última jeringa contendrá menos de 20 ml.

Tapar la aguja con su capuchón cuidadosamente y retirar la aguja de la jeringa
(desechar la aguja en un contenedor de punzo cortantes). Unir cada jeringa a una
bolsa criogénica. Dispensar la suspensión celular hacia la bolsa, dejando la
jeringa unida. Comenzar con la bolsa criogénica # 1.

Repetir el procedimiento con las otras bolsas criogénicas.

Anotar el volumen de cada bolsa criogénica en el formato del registro de
procedimiento.

Dispensar a la bolsa control un volumen igual al de la bolsa de CPH con mayor
cantidad de la solución control (se puede utilizar plasma).

Colocar las bolsas criogénicas entre los refrigerantes e incubar durante 30
minutos.

Calcular la cantidad de la mezcla crioprotectora (plasma autólogo con DMSO al
20%) para que al ser mezclada 1:1 con las células.
Volumen de cosecha de CPH + volumen bolsa control = volumen de
solución crioprotectora + 10 mL de excedente.
Ejemplo:
70 mL para CPH + 20 mL para la bolsa control = 100 mL de solución crioprotectora
(90 mL para bolsas + 10 mL excedente).
Por lo tanto se
DMSO.
prepara el volumen de solución = 80 mL de plasma + 20 mL
En la siguiente tabla se muestran los cálculos de diferentes volúmenes de solución
crioprotectora:
TABLA 16. VALORES DE DMSO-PLASMA PARA LA MEDICIÓN EXACTA
DEL DMSO AL 20%.
Volumen Total (mL)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
115
120
125
130
135
140
145
150
160
170
180
190
200
250
300
=
DMSO
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
32
34
36
38
40
50
60
+
Plasma
4
8
12
16
20
24
28
32
36
40
44
48
52
56
60
64
68
72
76
80
84
88
92
96
100
104
108
112
116
120
128
136
144
152
160
200
240

Anotar el volumen de la solución crioprotectora de cada bolsa criogénica en el
Formato del registro del procedimiento de criopreservación.

Anotar el volumen total de cada bolsa en el Formato del registro.

Colocar un reloj con alarma a los 30 minutos y otro a los 20 minutos.

A la alarma de los 20 minutos preparar la solución. Con la probeta estéril medir
la cantidad del plasma autólogo frío (a 4ºC) y depositarlo en un frasco estéril en
hielo. Con una jeringa de 20 mL tomar la cantidad necesaria de DMSO y
adicionar al plasma mezclando perfectamente para evitar desnaturalizar las
proteínas del plasma debido a la reacción exotérmica.

Iniciar el programa correspondiente del congelador programable y permitir que
se enfríe a 4ºC.

A la alarma de los 30 minutos tomar con una jeringa de 20 mL la cantidad
necesaria de la solución crioprotectora. Retirar la jeringa vacía de la suspensión
de CPH, con prontitud adicionarla en cada bolsa criogénica, empezando con la
bolsa control y posteriormente a las bolsas con las células, mezclar
perfectamente. Usar el émbolo de la jeringa para retirar la mayor cantidad
posible de aire y tomar aproximadamente 2.5 mL de la mezcla.

Colocar 0.5 mL en un criovial rotulado, 1 mL en el tubo de BH, rotulado
previamente como post-DMSO, para corroborar su viabilidad. Mantener el tubo
a 4ºC. Inocular 1 mL de la mezcla en el frasco de hemocultivo, rotular como
post-DMSO.

Sellar la línea de la bolsa criogénica que contiene la jeringa tres veces con un
sellador dieléctrico. Cortar con tijeras en medio de la línea sellada y desechar la
línea unida y la jeringa.

Secar rápidamente cada bolsa criogénica y colocarla dentro del canister
previamente enfriado a -20ºC; por ejemplo, colocar la bolsa #1 canister #1.
Cuando corte la línea sea cuidadoso en no dejar cualquier gota de CPH en el
área de sellado. La presencia de células en un extremo abierto de la línea
después del sellado debe de ser evitada ya que puede contaminar el N2 (l) en el
tanque de depósito. Ver observaciones para otras opciones para congelar las
bolsas criogénicas usando una prensa para congelamiento del equipo CryoMed
Freezer.

Colocar los canister y el criovial en la cámara de enfriamiento. Distribuir
individualmente los canister en una gradilla metálica para que se lleve a cabo el
proceso en las mismas condiciones del congelamiento.

Coloque la bolsa control dentro de un canister e inserte el sensor de la
temperatura en uno de los puertos de muestreo. Tener cuidado de no dejar aire
para evitar un registro inadecuado del proceso de congelamiento. Cerrar con
cuidado el canister para evitar maltratar el sensor de la temperatura, y colocarlo
en la gradilla metálica. Ver observaciones para otras opciones para congelar las
bolsas criogénicas usando una prensa para congelamiento del equipo CryoMed
Freezer.

Cerrar la puerta de la cámara de enfriamiento y oprimir el botón de RUN del
equipo. Registrar el programa utilizado para el congelamiento controlado y el
tiempo de inicio en el Formato del registro de procedimiento (formato II).

Al final del proceso de congelamiento presionar el botón stop para silenciar la
alarma del equipo. Registrar el tiempo final. (formato I).

Abrir la puerta de la cámara de enfriamiento, remover los canister y el criovial
de las CPH y colocarlos en el depósito de almacenamiento con N2 (l) en la fase
de líquida o de vapor. Anotar el No. del marco metálico (rack), la fase de
almacenamiento de N2 (l) y el sitio dentro del depósito de N2 (l) en el Formato
del registro del procedimiento de criopreservación , según el siguiente diagrama:
FIGURA 10. ESQUEMA DE LA LOCALIZACIÓN DENTRO DEL
CONTENEDOR DE N2 (l).
FIGURA 11.ESQUEMA DE LA LOCALIZACIÓN DENTRO DEL MARCO
METÁLICO (RACK)
Imprimir la gráfica del registro de temperatura y rotular con la identificación del
paciente.
La carta de congelamiento será parte del registro permanente del proceso.
La gráfica del congelamiento no deberá mostrar un cambio inusual o inesperado en la
temperatura.
La curva apropiada del calor latente de fusión deberá de estar por debajo de 0ºC.
Cerrar la puerta de la cámara de enfriamiento y accionar el botón de calentamiento
(warm) para descongelar la cámara. Al terminar, retirar la bolsa control y almacenarla a
-20ºC y apagar el equipo de congelamiento.
Limpiar la campana de flujo laminar y tirar todo el material desechable en las bolsas
correspondientes.
9.8 PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR EL NO. DE CMN DE LAS CPH

Encender el equipo para Biometría Hemática, Cell-Dyn 3500.

Evaluar los controles alto, normal y bajo, y establecer si el equipo no muestra
valores fuera del rango para dichos controles. Si algún valor está por afuera de
estos rangos será necesario calibrar el equipo según el manual del usuario.

Procesar por duplicado la muestra rotulada como pre-DMSO que se obtuvo de la
cosecha de CPH. Si los valores están por encima del rango de detección del
equipo diluir la muestra de CPH 1:10 con solución salina fisiológica. Obtener el
promedio de los valores y reportarlos en el formato del registro del
procedimiento de criopreservación.

Calcular el No. De CMN presentes en la muestra y la dosis / Kg de peso, como
sigue:
Leucocitos Totales = valor de leucocitos obtenido del Cell-Dyn (K/μL) x 1000000 x
Dilución (si se realiza) x Volumen de la cosecha.
CMN Totales = % de Linfocitos Cell-Dyn + % de Monocitos Cell-Dyn ÷ 100 x
Leucocitos Totales.
Dosis de CMN/Kg = CMN totales ÷ peso del donador.
Anotar los resultados en el formato del registro del procedimiento de criopreservación.
9.9 PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR LA VIABILIDAD CELULAR DE
LAS CPH
 MATERIAL REQUERIDO:

Portaobjetos

Microscopio óptico

Pipeta automática de 50 μL

Puntas para pipeta automática

Tubos de ensayo de 12 x 75 mm

Cámara de Neubauer

Cubreobjetos para cámara de Neubauer
 REACTIVOS:

Azul de Tripano al 0.4 %
 PROCEDIMIENTO:

Verificar que el material este completamente limpio.

Rotular un tubo de ensaye de 12 x 75 mm con el nombre donador y
CPHR y otro con el nombre del donador y CPH post-DMSO.

Adicionar a cada tubo 50 μL de la CPH de la cosecha y de la muestra
post-DMSO, respectivamente.

Adicionar en cada tubo 50 μL de la solución de Azul Tripano al 0.4% y
mezclar perfectamente.

Adicionar la muestra en la cámara de Neubauer y contar el número de
células vivas y muertas con el microscopio óptico (40X).

Reportar el porcentaje de viabilidad de las muestras en el formato del
registro del procedimiento de criopreservación.
9.10 LIMPIEZA Y ASEPSIA DE LA CAMPANA DE FLUJO LAMINAR
Debido a que las CPH son recolectadas en un ambiente “abierto” y porque muchos de
los pasos de su procesamiento no pueden ser realizados en un sistema completamente
cerrado, hay numerosas oportunidades para la contaminación con microorganismos. Por
esto, se debe asumir un método estricto de asepsia que deberá de ser realizado en el área
de trabajo dentro de la campana de flujo laminar. Cultivos bacterianos y de hongos
deberán ser realizados en las diferentes etapas del procesamiento para determinar si
cualquiera de las técnicas y/o materiales en uso están comprometiendo la pureza de
estas.
 MATERIAL Y EQUIPO REQUERIDO:

Solución desinfectante PRESEPT (Code Nr. SPW50, Johnson & Johnson)

Alcohol al 70%

Fenol al 5 %

Guantes desechables

Cubre bocas

Lentes de Protección

Gasas estériles
 PROCEDIMINETO:

Realizar la limpieza de la superficie del piso, techo y paredes con la solución de
Dextrán-Hipoclorito de Sodio.

Encender la luz de la campana de flujo laminar, realizar la desinfección de las
cuatro paredes de ésta con la solución PRESEPT humedecer las gasas estériles
con etanol al 70 % y pasar por toda el área, desinfectar con la solución de Fenol
al 5 %. Dejar actuar por 15 minutos.

Encender el motor y dejar durante 30 minutos como mínimo. Posteriormente
encender la luz U.V. y dejar actuar durante 15 minutos. Colocar un letrero
indicando que la luz está encendida.
9. 11 VERIFICACION DE LA ESTERILIDAD DEL PROCESO
Mantener la esterilidad es una consideración importante en el procesamiento y
criopreservación de las CPH. Se ha reportado contaminación en pacientes que han
recibido transplantes alogénicos y autológos. Los microorganismos identificados fueron
flora normal encontrada en la piel.
La contaminación puede ocurrir durante la colección de las mismas y en varias etapas
durante el procedimiento. La disponibilidad de sistemas semicerrados de recolección
reduce oportunamente la contaminación, sin embargo la esterilidad debe ser
monitoreada con cultivos bacterianos y de hongos. La identificación del organismo y su
sensibilidad debería de ser realizada en los cultivos que resultaran positivos. Aunque el
mayor propósito de esta prueba es la protección del paciente, también suministra
información epidemiología útil acerca de las actividades de laboratorio y del transplante
en general.
9.12 PROCEDIMIENTO PARA DESCONGELAR CPH CRIOPRESERVADAS
Las células criopreservadas son descongeladas en un baño maría entre 37ºC y – 40ºC
inmediatamente antes de infundirlas y administrarlas a través de un catéter central.
Aunque la infusión de DMSO ha sido asociada con cierta toxicidad incluyendo nauseas,
vómitos, rubor, incremento en la frecuencia cardiaca y presión sanguínea, y elevación
de las transaminasas en suero, muchos investigadores creen que la manipulación de las
células descongeladas pueden provocar pérdida celular inaceptable.
MATERIAL NECESARIO:

Baño María

Cronómetro

Agua estéril

Solución desinfectante PRESEPT (Code Nr. SPW50, Johnson & Johnson)
Disolver una tableta de 5 g en 3 litros de agua

Alcohol al 70%

Fenol al 5 %

Refrigerantes

Tubos de vidrio de 12 x 75 mm

Frascos para Hemocultivo y Hongos

Microscopio Óptico

Porta y cubre objetos

Azul de tripano al 0.4%

Campos quirúrgicos

Contenedor de N2 (l) portátil

Ropa quirúrgica

Gasas estériles

Tijeras estériles

Acoplador para toma de muestra

Jeringas desechables estériles de 10 mL y 20 mL

Agujas estériles del calibre 18G

Torundas de alcohol e isodine

Guantes estériles

Cubre bocas
PROCEDIMIENTOS PREVIOS PARA DESCONGELAR LAS CPH
Localizar en el depósito de almacenamiento de N2 (l) las bolsas criogénicas con las
CPH correspondientes al paciente que va a ser reinfundido. Verificar perfectamente que
los datos de las bolsas concuerden con los datos del paciente que se va a transfundir,
Determinar la cantidad de CMN y/o células CD34 de cada bolsa criogénica.
Transferir los canister de la fase líquida a la fase gaseosa del depósito de N2 (l), por lo
menos 12 horas antes de la reinfusión.
 PROCEDIMIENTO:

Realizar la desinfección del baño maría con la solución desinfectante PRESEPT
con la ayuda de gasas estériles y la asepsia con una solución de Fenol al 3 %.
Dejar actuar por espacio de 30 minutos cubrir con un campo quirúrgico y
trasladar el baño al pie de la cama del paciente al que se van a reinfundir las
CPH.

Localizar las células criopreservadas y acomodar las bolsas de mayor a menor
concentración en el depósito de N2 (l) portátil, trasladar el contenedor al área
donde se llevará a cabo la reinfusión y conectar el baño maría a una toma de
corriente eléctrica. Adicionar agua estéril y dejar que alcance la temperatura de
40ºC. Adicionar el antiséptico.

A la indicación del médico responsable, seleccionar la primera bolsa con mayor
concentración de CPH del contenedor portátil de N2 (l) y verificar una vez más
los datos de identificación de la bolsa y del paciente. Introducir la bolsa al Baño
María y con una leve agitación dejar que se descongele, aproximadamente 1
minuto y 50 segundos. Este tiempo puede variar según el volumen de las células
y de las características de la bolsa criogénica.
NOTA: No descongelarlas completamente, sino hasta el punto en que se
note la apariencia de una moneda de 10 pesos en el centro de la bolsa.

Retirar la bolsa criogénica del Baño María y colocarla entre dos refrigerantes.
Realizar la asepsia de uno de los puertos de entrada con las TORUNDAS de
alcohol e isodine e insertar el equipo de transfusión para su reinfusión en el
paciente. Otra opción sería, colocar un acoplador de toma en el puerto de entrada
y con la ayuda de una jeringa de 20 mL con aguja del calibre 18G, tomar las
CPH e iniciar la reinfusión en alguna de las líneas de soluciones que tenga el
paciente.

Vigilar los signos vitales y reacciones que pudiera presentar el paciente.

En cada una de las bolsas realizar la asepsia de una esquina y cortar con las
tijeras estériles un extremo de las bolsas. Tomar el sobrenadante remanente para
realizar los cultivos bacterianos (hemocultivo y hongos) y la viabilidad de éstas
después de descongelarlas. El DMSO es toxico para las células a temperaturas
mayores de 4ºC, por tal motivo, conservar todas las muestras en los
refrigerantes.
9.13 ABREVIATURAS
EDTA
Anticoagulante, Etilendiaminotetraacético disódico
BH
Biometría Hemática
CMN
Células Mononucleares
CPH
Células Progenitoras Hematopoyéticas
CPHSP
Células Progenitoras Hematopoyéticas de Sangre Periférica
NaCl
Cloruro de Sodio
Dx
Diagnostico clínico
DMSO
Dimetilsulfóxido
ºC
Grados Centígrados Celsius
Hto
Hematocrito
HB
Hemoglobina
Kg
Kilogramo
MO
Médula Ósea
µL
Microlitro
N2 (l)
Nitrógeno Líquido
SP
Sangre periférica
SSF
Solución Salina Fisiológica al 0.9%
Tx
Tratamiento
U. V.
Ultra violeta
MATERIAL NECESARIO PARA LA CRIOPRESERVAR CPH
FORMATO I
PREPARADO
1. Bata quirúrgica
2. Cubre bocas
3. Gorro quirúrgico
4. Guantes estériles
5. Campos estériles
6. Tijeras inoxidables estériles
7. Pinzas inoxidables estériles (Rocher)
8. Gasas chicas estériles
9. Torundas de algodón (jabón, alcohol, isodine)
10. Alcohol isopropílico al 70%
11. Desinfectante (glutaraldehído, fenol al 5%, o formaldehído)
12. Isodine
13. Frascos estériles (100 mL) o matraz Elermeyer de 250 mL
14. Probeta graduada estéril (100 mL)
15. Acopladores para toma de muestras (Sampling Site Couplers, Fenwal 4C-2405)
16. DMSO (Dimetilsulfóxido) USP (Sigma, Cat. D-1435) o estéril (Sigma, Cat
17. Jeringas desechables estériles de 5, 10, y 20 mL
18. Agujas estériles del No, 18G
19. Criobolsa de poliolefina o teflón de 250 mL o 500 mL
20. Canister para criobolsas de poliolefina a 4ºC
21. Equipo para congelamiento controlado Criomet
22. Nitrógeno líquido N2 (l) a baja presión (22 PSI dewars) criogénicos
24. Frascos para hemocultivo (pediátricos, 1-3 mL)
25. Tubos para Biometría Hemática
26. Hielo fräppe
27 Refrigerantes envueltos en papel
28. Azul Tripano al 0.4%
29. Cubre y porta objetos
30. Microscopio óptico
32. Grapas metálicas y rodillo
33. Sellador dieléctrico
34. Bolsas para desechos
35. Etiquetas de identificación
36. Crioviales estériles
37. Campana de Bioseguridad
38. Depósito para almacenamiento con Nitrógeno líquido
39. Formato del material necesario para criopreservar CPH (Formato I)
40. Formato de registro del procedimiento para criopreservar CPH (Formato II)
41. Racks numerados
42. Diagrama del sitio de almacenamiento en el depósito de N2 (l)
43. Pipetas automáticas de 200 μL y 1000 μL
44. Puntas desechables para pipetas automáticas de 200 y 1000 μL
45, Solución Salina Fisiológica
46. Conocer la ubicación del material y reactivos
47. Leer el manual de procedimientos
48. Leer las instrucciones sobre el uso de la bolsa criogénica
49. Contenedor para desechos punzo cortantes potencialmente infecciosos
50. Recipiente y bolsas para los desechos
51. Masking tape.
RESPONSABLE DEL PROCESO: ________________________________________________
FECHA: _____________________________________________________________________
REGISTRO DEL PROCEDIMIENTO DE CRIOPRESERVACION DE CPH
FORMATO II
IDENTIDAD DE LA MUESTRA
Nombre: OSEGUERA MARTINEZ JOSE ANGEL
Edad: 37
Dx: TUMOR GERMINAL MEDIASTINO
Registro: S/R
Tx. para Movilizar SP: NEUPOGEN 300 g/12 HRS X 5 DÍAS
Equipo de Aféresis: CS-3000, VACIADO DE CAMARAS
No. Procedimiento
realizado: 1
Serologia:
VIH
HVC
NEG
Peso: 68 Kg
Cama: Externo
Gpo Sanguíneo/Rh: 0 positivo
Vol. Sanguíneo Procesado:
14.161 L
NEG
HVB
NEG
VDRL
NEG
CITOMETRÍA HEMÁTICA DEL PACIENTE
Leucocito K/μL
Neutrófilos %:
Linfocitos%
Monocitos%:
Eosinófilos%
Basófilos%
Eritrocitos M//μL
Hb g/dl
Hto %
Plaquetas K/μL
CMN K/μL
Células CD34 células/μL
CLASE DE RECOLECCIÓN
Aféresis: X
Médula Ósea:
Otros:
Autóloga: X
Autóloga:
Alogénica:
Alogénica:
Proceso adicional:
Proceso adicional:
CRIOPRESERVACIÓN
No. Unidad: 14507 (pre-donante)
Bolsa criogénica: Cryostore CS 250 n
DMSO: (DMSO) HYBRI-MAX
Volumen CPH: 95 ml (BOLSA 1)
Volumen Sol. Criogénica (DMSO
20%)
Volumen Total
Sitio en Reservorio: II
Fase en N2 (l): Líquida
Programa Cryomed:
Caducidad: 8 – 2009
Caducidad: 03/07
Bolsa 2: 35 ml
Bolsa 2: 35 ml
9v.19
Lote: C 14098
Lote:35K23334
Bolsa 1: 35 ml
Bolsa 1: 35 ml
Bolsa 1: 70 ml
Bolsa 1 Rack:
Bolsa 2: 70 ml
Bolsa 2 Rack No: 2A
Bolsa 3: 50 ml
Bolsa 3 Rack:
Marca: OriGen
Marca:
Bolsa 3: 25 ml
Bolsa 3: 25 ml
No: 1A
No: 3A
Hora de inicio del proceso: 11:10 Hr
Hora final: 14:00
Hr
RESULTADOS DE LA COSECHA DE CPH
Leucocitos:
Neutrófilos
Linfocitos:
Monocitos
Eosinófilos:
Basófilos:
Fecha de Recolección:
Volumen de Recolección:
Leucocitos Totales:
CMN Totales: :
Células CD34 Totales: :
CMN/Kg: :
Células CD34/Kg: :
166.0
23.0
13.1
38.6
0.151
25.2
K/μL
%:
%
%
%
%
Eritrocitos:
Hb:
Hto:
Plaquetas:
CMN:
Células CD34:
M//μL
2.26
g/dl
9.86
%
232.0
K/μL
85.82
K/μL
3810
células/μL
mL
(x 106)
(x 106)
(x 106)
(x 106/Kg)
(x 106/Kg)
Viabilidad precongelamiento:
95
Viabilidad post-DMSO:
65
Viabilidad post-descongelamiento:
Hemocultivo cosecha:
Hemocultivo post-DMSO:
Hemocultivo post-descongelamiento:
1.43
04/04/2006
95
15770
8152.9
361.95
119.89
5.32
Observaciones:
_____________________________________________________________________________
Nombre del Receptor:
_____________________________________________________________________________
Médico Solicitante:
_____________________________________________________________________________
Realizó procedimiento:
_____________________________________________________________________________
Vo.Bo. Dr.
_____________________________________________________________________________
Fecha
_____________________________________________________________________________
%
%
%
REGISTRO DE LA TEMPERATURA Y NIVEL DE N2 (l) DEL CONTENDOR
FORMATO III
FECHA HORA
TEMPERATURA
(ºC)
NIVEL DE
N2 (l)
OBSERVACIONES
Nivel mínimo para cubrir los diferentes espacios de marco de aluminio (Rack) para bolsas de
500 mL:
Nivel A = 9 pulgadas; Nivel B = 16 pulgadas; Nivel C = 22 pulgadas; Nivel D = 28
pulgadas.
REGISTRO DEL NIVEL DE N2 (l) DE LOS CILINDROS INFRA
FORMATO IV
CILINDRO INFRA 1
Fecha
Hora
Nivel
Cambio
CILINDRO INFRA 2
Observaciones
Fecha
Hora
Nivel
Cambio
Observaciones
9.14 FORMATOS, REFERENCIAS Y BIBLIOGRAFÍAS

Boletín ISO 9001; 2000. I: Núm. 1, 2002. Hospital Universitario Dr. José
Eleuterio González, mayo.

Clark DA, et al. Medical schools and hospitals. Interdependence for service. J
Med Educ 1985; 60:22-38.

Clark DA y Sheps CG. Administración de hospitales universitarios. OPS.
Boletín núm. 58.

Conde E, Sierra J, Iriondo A et al. 1994. Prognostic factors in patients who
received autologous bone marrow transplantation for non-Hodgkin's lymphoma.
Report of 104 patients from the Spanish Cooperative Group GEL/TAMO.Bone
Marrow trasnspl; 14:279-286.

Freedman A., Gribben J., Neuberg D., et al 1996. High dose therapy and
autologous bone marrow transplantation in patients with follicular lymphoma
during firt remission. Blood 88: 278.

He Y, Wheatley K, Clark O, et al. 2003 Early versus deferred treatment for early
stage multiple myeloma. Cochrane Database Sits Rev (1): CD004023.

Hot M, Hellquist L, Holmberg E, et al. 2003. Initial versus deferred melphalanprednisone therapy for asymptomatic Rajkumar SV, Gertz MA, Lacy MQ, et al.
Thalidomide as initial therapy for early-stage myeloma. Leukemia 17 (4): 775-9.

Juliusson G, Celsing F, Turesson I, et al.200. Frequent good partial remissions
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refractory and relapsed myeloma. Br J Haematol 109 (1): 89-96.

L, Cabanillas F, Rodríguez J, et al. 1998. Gallium scan after 2nd. and 4th.
chemotherapy cycle is predictive in poor prognosis aggressive non-Hodgkin's
lymphomas: Study of 113 cases. Blood :(Abstr).

Philip T, Guglielmi C,Hagenbee et al . 1995. Autologous
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transplantation as compared wiyh salvage chemotherapy in relapses of
chemotherapy.sensitive non Ho JanIFEk M, Kaplan M, Neuberg D, et al: Early
restaging gallium scans predict outcome dgkin lymphoma. New England Journal
of Medicine, 333; 1540-45.

Rajkumar SV, Hayman S, Gertz MA, et al. 2002. Combination therapy with
thalidomide plus dexamethasone for newly diagnosed myeloma. J Clin Oncol 20
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
Richardson P, Schlossman R, Jagannath S, et al. 2004. Thalidomide for patients
with relapsed multiple myeloma after high-dose chemotherapy and stem cell
transplantation: results of an open-label multicenter phase 2 study of efficacy,
toxicity, and biological activity. Mayo Clin Proc 79 (7): 875-882.

Schlegelberger B, Zwingers T, Harder L et al. 1999. Clinicopathogenetc
significance of chromosomal abnormalities in patients with blastic peripheral Bcell lymphoma. Blood, 94:3114-3120.
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Sierra J, Conde E, Montserrat E. 1993. Autologous bone marrow transplantatio
for non-Hodgkin's lymphoma in first remission. Blood 81:1968-1969.

Ship An, Abellof KH, Antman G et al.1999. International Consensus conference
on high-dose therapy with hematopoietic stem cont/cell transplantation in
aggressive non Hodgkin’s lymphomas report of the jury. Journal of Clinical
Oncology, 17: 423-29.
COMENTARIOS FINALES
El objetivo primordial de los Bancos de Sangre y Servicios de Medicina Transfusional
es la calidad en todos sus aspectos. Los procedimientos habituales incluyen el control
de los reactivos, la eficiencia del laboratorio, el mantenimiento de los equipos y la
documentación de los errores y accidentes.
Para describir los componentes de un sistema de calidad, se utilizan los criterios de la
Organización Internacional de Estandarización (ISO).
En el presente trabajo se aplican los principios básicos inmunológicos para el estudio
de los antígenos presentes en los elementos formes de la sangre y su comportamiento
serológico. Se presentan las técnicas importantes del estudio de los grupos sanguíneos y
sus anticuerpos, que ayudan a que la transfusión sanguínea se convierta en un
procedimiento seguro y confiable.
El Manual de Procedimientos para Inmunohematología Banco de Sangre. Fue realizado
después de sintetizar la información necesaria para obtener un trabajo escrito que, de
forma sencilla incluí los conceptos y procedimientos que se realizan de manera rutinaria
en el departamento donde laboro. Esta herramienta se presenta actualizada
bibliográficamente y sobre todo haciendo hincapié en los métodos y equipos modernos
utilizados.
Gracias a la experiencia que se me ha permitido obtener durante más de cinco años en el
Servicio de Medicina Transfusional puedo decir que los Bancos de Sangre tienen como
principal preocupación el uso correcto de los componentes de la sangre, la cual tiene
un amplio uso en hemoterapia así como en la industria médico-farmacéutica, por lo que
debe estar libre de agentes infecciosos. Aunque el uso de este componente contribuye a
salvar numerosas vidas, también puede convertirse en un riesgo potencial para la salud
cuando no está sometida a un estricto control de calidad.
Con mucho entusiasmo puedo comentar que el laboratorio de inmunohematología es
sobradamente variado e interesante, en donde los estudiantes de la carreta de Químico
Farmacéutico Biólogo nos podemos desenvolver ampliamente gracias a la seguridad
obtenida durante formación universitaria. Mi trabajo me ha permito un crecimiento
significativo, ya que cada día la aplicación de la ética y responsabilidad dejan un buen
sabor de boca, considero que al ser parte del área laboral del sector salud ponemos un
granito de arena para contribuir a salvar una vida.