Biología Celular Cell Biology - Severo Ochoa

Memoria 1997/98
CBMSO
1997/98 Report
Biología Celular
Cell Biology
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Memoria 1997/98
CBMSO
1997/98 Report
BIOGÉNESIS MITOCONDRIAL EN MAMÍFEROS
MAMMALIAN MITOCHONDRIAL BIOGENESIS
Jefe de Línea / Group Leader:
Personal Científico
Scientific Personnel:
Becarios Postdoctorales
Postdoctoral Fellows:
Becarios Predoctorales
Graduate Students:
Técnico de Investigación
Technical Assistance:
José M. Cuezva
Carlo M. Di Liegro, José M. Izquierdo
Luciana K. Ostronoff, Cristina Ugalde
Miguel López de Heredia, Javier Ricart, Gema
Santamaría
Margarita Chamorro
Resumen de Investigación
Nuestro grupo estudia los mecanismos celulares y moleculares que controlan la
biogénesis mitocondrial en células de mamíferos. Se entiende por biogénesis de la mitocondria el conjunto de procesos que conducen a un aumento del número y de la actividad mitocondrial en la célula. Estos procesos vienen mediados por la expresión coordinada de los genes mitocondriales y nucleares implicados en la función del orgánulo.
Poco se conoce sobre los mecanismos moleculares que regulan la expresión coordinada
de estos dos sistemas genéticos en células de organismos superiores. Menos aún, de su
operatividad durante el desarrollo, la morfogénesis y la diferenciación de los distintos
tejidos y tipos celulares de mamíferos. La relevancia de estos estudios estriba, como se
ha puesto de manifiesto durante los últimos años, en la implicación evidente de la mitocondria en múltiples manifestaciones de la patología humana. Por citar algunas: envejecimiento, diabetes, enfermedades neurodegenerativas y cáncer. Más recientemente, se
ha demostrado que las mitocondrias son los orgánulos celulares responsables de integrar y ejecutar el proceso de muerte celular programada o apoptosis.
Trabajos anteriores de nuestro laboratorio han permitido definir la existencia de
dos programas biológicos distintos que dan cuenta de la función mitocondrial en el
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hígado de rata en desarrollo. Estos dos programas, que son los responsables de la proliferación y diferenciación funcional de la mitocondria, se encuentran regulados por
mecanismos moleculares distintos. En concreto, el programa de diferenciación mitocondrial se encuentra regulado a dos niveles de control post-transcripcional de la expresión génica. En efecto, tanto la estabilidad como la eficiencia traduccional de los tránscritos, codificados en ambas unidades génicas, están sometidas a una regulación concertada durante el desarrollo.
El descubrimiento de la existencia de mecanismos post-transcripcionales de regulación de la expresión génica para la biogénesis mitocondrial ha supuesto el inicio de
estudios encaminados a caracterizar las moléculas responsables de ejercer este tipo de
control. En este sentido, hemos descrito que el mensajero nuclear que codifica para la
subunidad catalítica β del complejo mitocondrial ATP sintasa (β-mRNA), es un mRNA
localizado en unas estructuras discretas del citoplasma celular, frecuentemente asociadas a la membrana del orgánulo. Hemos postulado que estas estructuras desempeñan
un papel importante en el control de la expresión citoplasmática de este gen, así como
en el “targeting” e importación del precursor citosólico de esta proteína a la mitocondria. Hemos caracterizado parcialmente estas estructuras, que por distintos criterios de
co-localización, son consideradas traduccionalmente activas.
Por otro lado, hemos descrito que el control de la traducción de β-mRNA durante
el desarrollo del hígado, así como la distinta expresión tisular de este mRNA, se ejerce
por regulación de la expresión de una proteína inhibidora (3’βFBP) que, por unirse a
una secuencia intensificadora de la traducción del mRNA localizada en la región 3’-no
traducible del mismo, inhibe estéricamente la comunicación 3’-5’ necesaria para la reiniciación eficiente de la traducción del mRNA. Hemos propuesto que la alteración de la
función mitocondrial que se observa en algunos tipos de células cancerosas es el resultado de la expresión de esta proteína inhibidora (3’βFBP). En la actualidad, nuestros
esfuerzos se concentran en la caracterización molecular de dichas estructuras, así como
en la caracterización del papel funcional que las distintas proteínas que las componen
desempeñan en la localización, control traduccional y estabilidad del mensajero objeto
de nuestros estudios. Finalmente, en un trabajo en colaboración con el grupo de VPPA,
hemos descrito que en células infectadas por este virus se produce una migración masiva de las mitocondrias por elementos del citoesqueleto hasta las factorías virales.
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Research Summary
Our group investigates the cellular and molecular mechanisms that control the
biogenesis of mitochondria in mammalian cells. Mitochondrial biogenesis is a complex
cellular response that involves the concerted expression of the nuclear and mitochondrial genomes in which molecular components of the organelle are encoded. Little is
known about the basic mechanisms that regulate the coordinated expression of these
two genetic systems in cells of higher eukaryotic organisms. Even less is known about
their operation during development, morphogenesis and differentiation of the different
tissues and cellular types of mammals. The relevance of these studies steams from the
fact that mitochondria have been implicated in many manifestations of human pathology, such as aging, diabetes, neurodegenerative diseases and cancer. More recently, it
has been demonstrated that mitochondria are the cell organelles responsible for integrating and executing the process of programmed cell death or apoptosis.
Previous work from our laboratory has allowed us to define the existence of two
different biological programs responsible for the biogenesis of mitochondria in rat liver
during development. These two programs, that are responsible for the proliferation and
differentiation of the organelle, are regulated by different molecular mechanisms of
gene expression. The program of mitochondrial differentiation is controlled at two
post-transcriptional levels of the regulation of gene expression, involving profound
changes in both the stability and translational efficiency of the transcripts encoded in
both genomes.
The existence of post-transcriptional mechanisms for the regulation of the expression of the genes involved in the biogenesis of mitochondria has prompted us to initiate studies aimed at characterizing the molecules responsible for exerting this type of
control. In this regard, we have described that the nuclear-encoded mRNA of the β-catalytic subunit of the mitochondrial ATP synthase (β-mRNA) is localized in clusters in
the cytoplasm of the hepatocyte, an electron-dense structure that is frequently observed
associated with the mitochondria. We have suggested that these structures have an
important role in controlling the cytoplasmic expression of this gene, as well as in the
targeting and import of the cytosolic precursor protein into the mitochondria. We have
partially characterized the clusters and found, by different co-localization criteria, that
they are translationally active structures.
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At the molecular level, we have described that the control of the translation of βmRNA during development of the liver, as well as the tissue-specific expression level
of this mRNA, is exerted by the controlled expression of an inhibitory protein (3’βFBP)
that binds a translational enhancer sequence found in the 3’-untranslated region of the
mRNA. We have suggested that the binding of 3’βFBP to the cis-acting translational
enhancer sterically hinders the 3’ to 5’ communication that is required for an efficient
re-initiation of the translation of the mRNA. Furthermore, we have proposed that the
alteration in mitochondrial function observed in certain tumor cells results from the
aberrant expression of this inhibitory protein (3’βFBP). At present time, our efforts are
focused on the molecular and functional characterization of the cellular proteins
involved in the localization of β-mRNA, as well as of those controlling the translation
and the stability of the transcript. Finally, in a collaboration with the ASFV group, we
have described a massive migration of mitochondria towards viral factories through
cytoskeletal elements in the cells infected with the ASFV.
Publicaciones / Publications
—
Egea, G., Izquierdo, J.M., Ricart, J., San Martín, C. and Cuezva, J.M. mRNA encoding the β-subunit of the mitochondrial F1-ATPase complex is a localized mRNA
in rat hepatocytes. Biochem. J. 322, 557-565 (1997).
—
Flores, A.I. and Cuezva, J.M. Identification of sequence similarity between 60- and
70-kDa molecular chaperones: evidence for a common evolutionary background?
Biochem. J. 322, 641-647 (1997).
—
Ricart, J., Egea, G., Izquierdo, J.M., San Martín, C. and Cuezva, J.M. Subcellular
structure containing mRNA for β-subunit of mitochondrial H+-ATP synthase in
rat hepatocytes is translationally active. Biochem. J. 324, 635-643 (1997).
—
Lithgow, T., Cuezva, J.M. and Silver, P.A. Highways for protein delivery to the
mitochondria”. Trends Biochem. Sci. (TIBS) 22, 110-113 (1997).
—
Cuezva, J.M., Ostronoff, L.K., Ricart, J., López de Heredia, M., Di Liegro, C.M.,
and Izquierdo, J.M. Mitochondrial biogenesis in the liver during development
and oncogenesis. J.Bioenerg. Biomemb. 29, 365-377 (1997).
74
—
Izquierdo, J.M. and Cuezva, J.M. Control of the translational efficiency of β-F1ATPase mRNA depends on the regulation of a protein that binds the 3’-untranslated region of the mRNA. Mol. Cell. Biol. 17, 5255-5268 (1997).
—
Rojo, G., Chamorro, M., Salas, M.L., Viñuela, E., Cuezva, J.M. and Salas, J.
Migration of mitochondria to viral assembly sites in African swine fever virusinfected cells. J. Virology 72, 7583-7588 (1998).
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Memoria 1997/98
CBMSO
1997/98 Report
ESTUDIOS SOBRE FACTORES QUE REGULAN LA DINÁMICA
DE MICROTUBULOS: EFECTO DE LA FOSFORILACIÓN
STUDIES ON FACTORS THAT REGULATE MICROTUBULE
DYNAMICS: EFFECT OF PHOSPHORYLATION
Jefe de Línea / Group Leader:
Personal Científico
Scientific Personnel:
Becario Postdoctoral
Postdoctoral Fellow:
Becarios Predoctorales
Graduate Students:
Francisco J. Moreno
María José Benitez, Juan S. Jiménez, Francisco
Wandosell
María Teresa Moreno
Ruth Gutiérrez, M Jesús Martín, Juan R. Muñoz,
Silvia Sánchez, Laura Sayas
Resumen de Investigación
La función de los microtúbulos en la segregación de los cromosomas, motilidad
celular, transporte intracelular y la regulación de las formas de las células se basa en su
capacidad para ensamblarse y desensamblarse. El ensamblamiento de los microtúbulos
puede además ser regulado por otras proteínas distintas a la tubulina tales como la proteína tau (que es una proteína asociada a microtúbulo) que estabiliza a los microtúbulos o la estathmina que es otro regulador de microtúbulos y se sabe que interacciona
preferentemente con la tubulina despolimerizada y es un firme candidato que hace crecer la velocidad de catástrofe de los microtúbulos. Los efectos fisiológicos tanto de la
proteína tau como de la estathmina cambian cuando ambas proteínas se encuentran fosforiladas. De aquí se puede deducir que los procesos de fosforilación/desfosforilación
de ambas proteínas pueden controlar la dinámica de los microtúbulos. Ambas proteínas pueden ser fosforiladas en respuesta a múltiples señales extracelulares. Hemos confirmado la localización de los restos de amino ácidos que son modficados por la acción
de distintas proteínas quinasas como la MAP quinasa, cdc 2 quinasa, la proteína quina-
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sa A y la caseína quinasa 2 que modifican a la estathmina. Además hemos encontrado
que la glucógeno sintasa quinasa 3β (GSK 3β) fosforila a la ser 31. A través de los resultados obtenidos se ha encontrado que la estathmina modificada por la PKA pierde su
capacidad despolimerizante de los microtúbulos, como anteriormente se había descrito
por otros grupos, mientras que la modificación por la caseína quinasa 2 o GSK 3β hace
crecer su función desestabilizadora de microtúbulos.
Además se ha estudiado si la estathmina interacciona con el extremo C terminal
de la tubulina. Nuestros resultados indican que la estathmina se une a una región de la
subunidad α de la tubulina que se extiende desde el resto 307 al 417. Por otro lado se
ha encontrado que al interaccionar la estathmina con la tubulina es capaz de modular
la interacción de la tubulina con el GTP.
La morfogénesis neuronal depende de la organización de los diferentes elementos
del citoesqueleto, en donde los microtúbulos desempeñan un papel preponderante. Otra
MAP que controla la dinámica microtubular es la MAP 1B se encuentra a una elevada
concentración en los axones que están creciendo durante el desarrollo neuronal y se ha
encontrado que es substrato de diferentes proteínas quinasas entre ellas la CK 2. La
expresión de la MAP 1B disminuye notablemente después de la maduración neuronal
en paralelo con un cambio de su localización ya que se concentra fundamentalmente en
el cuerpo neuronal y en las dendritas. Interesantemente MAP 1B permanece altamente
fosforilada en los sitios consenso de fosforilación de la CK 2 en neuronas maduras.
Nosotros hemos examinado la expresión y la localización de las subunidades
catalíticas de la CK 2 durante el desarrollo neuronal. La subunidad catalítica α de la CK
2 aparece rápidamente durante el desarrollo neuronal mientras que la α’ solo aparece
cuando maduran las neuronas justo en el momento en que se produce la maduración
neuronal y la sinaptogénesis y en paralelo con el cambio en la localización de la MAP
1B. La subunidad α se encuentra asociada con la preparación de microtúbulos obtenidos
tanto de la materia blanca o gris del cerebro bobino adulto mientras que la subunidad α’
se encuentra enriquecida en microtúbulos procedentes de la materia gris. Estos datos
permiten soportar la hipótesis que la subunidad α’ se encuentra concentrada en el cuerpo neuronal y dendritas y allí se encuentra asociada con los microtúbulos contribuyendo en un aumento en la fosforilación de la MAP 1B en estos sitios en neuronas maduras.
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Igualmente se ha estudiado diversas interacciones entre la proteína quinasa CK 2, substratos y activadores como la polilisina, con la técnica de Resonancia superficial de plasmón.
La glucógeno sintasa quinasa 3β (GSK 3β) es una proteína multifuncional que fosforila una gran variedad de substratos incluyendo a la proteína asociada a microtúbulos, la proteína tau. Datos recientes han resaltado el papel de la GSK-3β como una de las
quinasas más importante en la fosforilación de tau durante el desarrollo neuronal tanto
in vivo como in vitro. Existe por tanto un gran interés en establecer como se regula la
GSK-3β en neuronas de mamífero. Los datos obtenidos nos permiten deducir que se
produce una importante caída en la cantidad de proteína de la GSK-3β como uno de los
primeros acontecimientos que se producen en el proceso de diferenciación de las células de neuroblastoma humana de la línea IMR-32. La disminución de la GSK 3β se
acompaña de un más bajo estado de fosforilación de tau. También es de un gran interés
el señalar que también se incrementa la expresión de tau al final del proceso de diferenciación en de las células IMR-32. Ambos datos, el aumento en la expresión de tau así
como la caída en la desfosforilación de tau durante la diferenciación de las células de
neuroblastoma pueden correlacionarse con el incremento en el ensamblaje de los
microtúbulos y la asociación de tau a los microtúbulos.
Estos resultados sugieren un importante papel a la GSK-3β en los acontecimientos moleculares que se suceden en la diferenciación de las células de neuroblastoma.
Entre todos estos hay que destacar que una menor fosforilación de tau contribuye a la
estabilización de los microtúbulos en la formación de neuritas.
Mecanismos moleculares implicados en la reparación del SNC
En el Sistema Nervioso Central (SNC) la mayor parte de la extensión de axones
cesa al final del periodo del desarrollo. Sin embargo el CNS sigue manteniendo la capacidad de activar la neuritogénesis. Después de una lesión y en muchas situaciones neuropatológicas, el SNC responde con una respuesta de activación glial, que en su conjunto es conocida como “gliosis reactiva”. Además de toda una serie de cambios morfológicos la glia expresa toda una serie de moléculas que, o son especificas de esta situación de lesión o tenían un bajo nivel de expresión en situaciones fisiológicas normales.
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Para nuestro trabajo hemos desarrollado un modelo animal de lesión del CNS con el
análogo de glutamato denominado ácido kaínico. Este compuesto produce una muerte
específica de algunas neuronas de hipocampo. A partir de este modelo pudimos comprobar que este tejido gliótico contenía moléculas con capacidad inhibitoria de la iniciación y de la extensión axonal. Además de la presencia de este tipo de proteínas
hemos podido comprobar la presencia de moléculas que previamente se han usado
durante el desarrollo, como la molécula precursora del Amiloide /APP). Esta proteína
y su péptido derivado el ßA han sido implicados en la etiología de la enfermedad de
Alzheimer, como elementos responsables de la formación de las placas Seniles. Por
tanto nos ha interesado analizar el papel del péptido Amiloide y del APP en la respuesta glial ante una lesión.
Usando cultivos primarios de células gliales hemos demostrado la respuesta de
los astrocitos ante la presencia del péptido Amiloide. El cambio morfológico observado
en el tratamiento está acompañado de una sobre-expresión de algunas proteínas de los
astrocitos como el APP o la Fibronectina.
En paralelo a estos experimentos hemos analizado más en detalle la activación
glial en nuestro modelo de lesión. En este sentido hemos elegido los receptores con actividad kinasa de tirosina (Trks) y sus ligandos como uno de elementos más generales
implicados en activación celular.
Nuestros datos sugieren un papel importante en lesión de la familias Trks denominados EPH. Muchos de los miembros de esta familia son usados durante el Desarrollo
del CNS, presentan un patrón restringido; y ellos y sus ligandos han sido implicados en
guia axonal, mediando repulsión axonal. Varios de estos elementos responden diferencialmente tras una lesión llegándose a un nivel alto de sobre-expresión en algunas de las
regiones del hipocampo afectado. En estos momentos estamos estudiando las bases de
los mecanismos de señalización mediado por estas Trks y sus ligandos.
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Research Summary
Microtubule functions in chromosome segregation, cell motility, intracellular
transport, and regulation of cell shape are based on the ability of microtubules to assemble and disassemble. Microtubule assembly could also be modulated by other proteins
apart from tubulin such as tau (one microtubule-associated proteins) which stabilize
and stathmin that is another microtubule regulator that preferentially interacts with
unpolymerized tubulin and it is a candidate for increasing the microtubule catastrophe
rate. These effects are significantly changed when tau or stathmin are phosphorylated,
suggesting that phosphorylation and dephosphorylation of both proteins could be used
to regulate microtubule dynamics in vivo. Both proteins are phosphorylated in response to numerous extracellular signals. We have confirmed the localization of the residues modified by MAP kinase, cdc 2 kinase, protein kinase A and casein kinase 2 on
brain stathmin. Additionally, we have localized the region for Glycogen synthase kinase 3β (GSK 3β) modification and we postulate that modification by GSK 3β could occur
at serine 31. Our results have indicated that modification of stathmin by, mainly, protein kinase A results in a decrease of its depolymerizing activity, as previously indicated by others, whereas modification by casein kinase 2 or GSK 3β results in a slight
increase of stathmin activity.
Furthermore, we have studied if Op18/stathmin binds to the C-terminus of α-tubulin
subunits or to other tubulin regions. Our results indicate that stathmin binds to the α-tubulin region comprising residues 307 to 417. Additionally, we observed that the interaction of
stathmin with tubulin is capable of modulating the binding (or exchange) of GTP to tubulin.
Neuronal morphogenesis depends on the organization of cytoskeletal elements
among which microtubules play a very important role. Another MAPs that control the
microtubule dynamic is MAP1B, which is very abundant within growing axons of
developing neurons where it is found phosphorylated by several protein kinases including CK 2. The expression of MAP1B is notably decreased after neuronal maturation in
parallel with a change in the localization of the protein, which becomes largely concentrated in neuronal cell bodies and dendrites. We have analyzed the expression and localization of CK 2 catalytic subunits along neuronal development. CK 2α subunit appears early during development whereas CK 2α’ subunit appears within mature neurons
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at the time of dendrite maturation and synaptogenesis, in parallel with the change in
the localization of MAP1B. CK 2α subunit is found associated with microtubule preparations obtained from either grey matter or white matter from adult bovine brain, whereas CK 2α’ subunit is highly enriched in microtubules obtained from grey matter.
These results lend support to the hypothesis that CK 2α’ subunit is concentrated in neuronal cell bodies and dendrites, where it associates with microtubules, thus contributing to the increased phosphorylation of MAP1B in this localization in mature neurons.
The interaction between protein kinase CK 2, substrates and enzyme activators
such as polylysine has been studied by Surface Plasmon Resonance.
Glycogen synthase kinase 3β is a multifunctional protein kinase that phosphorylates a variety of substrates including the neuronal-specific microtubule-associated protein
tau. Recent evidence has emphasized the role of GSK 3β as a major kinase involved in
the phosphorylation of Tau protein in developing neurons both in culture and in vivo.
Thus, there is considerable interest in the regulation of GSK 3β in mammalian neurons.
We have reported that the down-regulation of the GSK 3β protein is an early event in the
course of the differentiation of human neuroblastoma IMR-32 cells. This decline in GSK
3β is accompained by a significant decrease in the phosphorylation state of tau protein.
A noteworthy increase in tau protein expression also takes place later during the differentiation of IMR-32 cells. The augmented expression and diminished phosphorylation
of Tau protein in differentiated IMR-32 cells can be correlated with increments in the
assembly of microtubules and in the association of tau with microtubules.
These results suggest a contribution of a decrease in GSK 3β to molecular events
leading to neuroblastoma cell differentiation. Among these, tau dephosphorylation
might favor microtubule stabilization within neurites.
Molecular mechanisms implicated in CNS repair
Most neuritic outgrowth in the mammalian central nervous system ceases at the
end of the developmental period. However CNS neuron maintain their ability to rearrange their axons. After any type of brain insult and in many neurophatological disorders, the CNS respond with a “glial cell activation”. The overall glial response is refe81
rred as ”reactive gliosis”. In addition to the morphological changes they express a number of molecules absent or reduced in “resting” CNS.
We performed a CNS lesion model, using an analog of glutamate, kainic acid.
This produces neuronal death and glial activation in the hippocampus. From this tissue,
we demonstrated that they contained “new” molecules that inhibited the neurite initiation and the axonal elongation. In addition of this new types of molecules expressed
after brain insult, other molecules, previously used during brain development, appeared to be over-expressed, such as Amyloid precursor protein (APP). This protein and its
derived peptide βA have been implicated in the ethiology of Alzheimer’s disease, as
responsible elements of Senile plaques. Therefore, we analysed the role of Amyloid
peptide (βA) and APP in the glial response after brain damage.
Using primary cultures of glial cells we demonstrated the response of astrocytes
to the presence of βA peptide. The morphological change observed after βA addition is
accomplished by the over-expression of some molecules such as the APP and
Fibronectin.
In parallel, we have analysed more in detail the glial activation. In this sense, protein tyrosine kinases (PTK) receptors (TKR) and their ligands are the most common elements implicated in cell activation. The purpose of our work was to analyse the role of
TKRs in our CNS lesion model. Our results suggest a role for the Eph family of TKRs in
injury. Its members, named according to the first described member, are developmentally
regulated, with restricted expression patterns. They and their ligands have been implicated in processes of neural pathfinding, mediating axonal repulsion. However their role in
the adult brain, particularly after neuronal injury, remains unexplored. We are currently
analysing the signalling pathway/s linked to this group of molecules EPH/EPHRINS.
82
Publicaciones / Publications
—
Muñoz-Montaño, J.R., Moreno, F.J., Avila, J. and Díaz-Nido, J. Lithium inhibits
Alzheimer’s disease-like tau protein phosphorylation in neurons FEBS Lett. 411,
183-188 (1997).
—
Benítez, M.J., Mier, G., Briones, F., Moreno, F.J. and Jiménez, J.S. A surface-plasmon-resonance analysis of polylysine interactions with a peptide substrate of protein kinase CK2 and with enzyme Biochem J. 324, 987-994 (1997).
—
Salinero, O., Moreno, M.T., Ceballos, M.L. and Wandosell, F. βAmyloid peptide
induce cystoskeletal reorganization in cultured astrocytes. J. Neurosc. Res 47, 216223 (1997).
—
Salinero, O., Moreno-Flores, M.T. and Wandosell, F. Okadaic acid modulates the
cytoskeletal changes induced by ßAmyloid peptide (25-35) in cultured astrocytes
Neuroreport 8-15, 3333-3338 (1997).
—
Moreno, F.J. and Avila, J. Phosphorylation of stathmin modulates its function as
a microtubule depolymerization factor. Mol. Cell. Biochem. 183, 201-209 (1998).
—
Moreno-Flores, M.T., Salinero, O. and Wandosell, F. β-Amyloid peptide induced
APP expression in cultured astrocytes. J. Neurosc. Res. 52, 661-671 (1998).
—
Salinero, O., Garrido, J.J. and Wandosell, F. Amyloid precursor protein proteoglycan is increased after brain damage. Biochim. Biophys. Acta. 1406, 237-250
(1998).
—
Pérez, M., Wandosell, F., Colaço, C. and Avila, J. Sulfated glycosaminoglycans
prevent neurotoxicity of a human prion protein fragment. Biochem J. 335, 369-374
(1998).
—
Moreno, F.J., Diaz-Nido, J., Jímenez, J.S. and Avila, J. Distrihbution of CK 2, its
substrate MAP 1B and phosphatases in neuronal cells. Mol. Cell. Biochem. 191, 201205 (1999).
83
—
Benítez, M.J., Mier, G., Briones, F., Moreno, F.J. and Jiménez, J.S. Binding of
polylysine to protein kinase CK 2, measured by surface plasmon resonance. Mol.
Cell. Biochem. 191, 29-33 (1999).
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Juan R. Muñoz: “La fosforilación de la proteína tau por la glucógeno sintasa quinasa
3”. Universidad Autónoma de Madrid. 1998. Calificación: Apto cum laude.
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Memoria 1997/98
CBMSO
1997/98 Report
BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA ACTIVACIÓN
CELULAR Y SUS IMPLICACIONES TERAPÉUTICAS
MOLECULAR BIOLOGY OF CELL ACTIVATION AND ITS
THERAPEUTIC IMPLICATIONS
Jefe de Línea / Group Leader:
Personal Científico
Scientific Personnel:
Becarios Postdoctorales
Postdoctoral Fellows:
Becarios Predoctorales
Graduate Students:
Técnicos de Investigación
Technical Assistance:
Científicos Visitantes
Visiting Scientists:
Jorge Moscat
Edurne Berra, Mª Teresa Díaz-Meco, Laura Sanz
Guillermo de Cárcer, Trudy A. Kohout, Mª José
Lallena
Sonia Frutos, Jose Lozano, Alicia Monjas, Mª Mar
Municio, Javier Pastor, Pilar Sánchez, Patricia
Hernanz
Esther Garcia, Carmen Ibañez, Beatriz Ranera
Geir Bjorkoy (University of Tromso. Norway)
Esta línea de investigación se desarrolla en el seno del Laboratorio GlaxoWellcomeCSIC de Biología Molecular y Celular/ This research project is developed in the
GlaxoWellcome-CSIC Laboratory of Molecular and Cellular Biology.
El Laboratorio está dirigido por su Comité Ejecutivo, compuesto por los siguientes miembros/The Laboratory is directed by its Executive Committee:
María Teresa Díaz-Meco
Federico Gómez de las Heras
Jorge Moscat
Gonzalo Paris
Isabel Pérez
Director del CBMSO
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Resumen de Investigación
El objetivo del Laboratorio es el estudio de las bases moleculares de los mecanismos de activación celular, con el fin de contribuir a la identificación de nuevas dianas
terapéuticas para el tratamiento de procesos patológicos, en los que las alteraciones de
la transducción de señales desempeñan un papel destacado tales como en el cáncer, la
inflamación, o los procesos neurodegenerativos.
En la actualidad, el Laboratorio centra su atención sobre la regulación y función
de los isotipos λ/ι y ζ de la proteína quinasa C (PKC). Estos, son los únicos dos miembros conocidos pertenecientes a la subfamilia atípica de PKC y desempeñan un papel
crucial en el control de la proliferación y la supervivencia celular, a través de la activación del factor de transcripción NF-κB. Resultados recientes de nuestro laboratorio
han permitido desvelar el mecanismo por el que estas PKCs regulan NF-κB. Así, hemos
identificado a la IκB quinasa-β (IKKβ) como la diana de la acción de las PKCs atípicas
(aPKCs). Las aPKCs interaccionan con IKKβ activándola por fosforilación, iniciando la
cascada que culmina en la translocación al núcleo de NF-κB. El siguiente reto que se nos
plantea es, por tanto, el estudio de los eslabones moleculares que conectan a estas
aPKCs con los complejos de los receptores de TNFα e IL-1 que son potentes activadores
de NF-κB y de estas quinasas. En este sentido, se debe tener en cuenta que la regulación
de las aPKCs es en estos momentos objeto de una intensa investigación. A diferencia de
otros isotipos, las atípicas no son activables por calcio, ésteres de forbol o diacilglicerol,
pero se regulan por importantes segundos mensajeros lipídicos como el fosfatidilinositol 3,4,5-P3. Por otra parte, nuestro laboratorio ha contribuido de manera decisiva a la
caracterización de un nuevo mecanismo de regulación de estas quinasas que implica la
interacción con proteínas que modulan su actividad, o su localización subcelular, funcionando como adaptadores. Así, hemos identificado tres nuevos moduladores proteicos de la actividad y/o función de estas quinasas: LIP, Par-4, y p62/ZIP. LIP es un
activador selectivo de λ/ιPKC, mientras que Par-4, que se induce durante la parada del
crecimiento celular y la apoptosis, es un inhibidor de ζPKC y λ/ιPKC. La interacción
de las aPKCs con LIP y Par-4, ha permitido desvelar el papel fundamental de estas
quinasas en la supervivencia celular. Por otra parte, p62 localiza a ambas aPKCs en los
endosomas, permitiendo que estas quinasas puedan recibir las señales generadas por
86
los receptores de citoquinas y factores de crecimiento, que se internalizan tras la interacción con sus respectivos ligandos. Cómo p62 acopla las aPKCs a las señales activadas
por los receptores de membrana, será uno de los objetivos de nuestra investigación en
los próximos meses.
El estudio de los mecanismos por los que las aPKC regulan la supervivencia y
el crecimiento celular ha sido objeto de nuestro trabajo reciente. Es de destacar el papel
clave que tanto la cascada de MAPK como de PI-3K tienen en estos fenómenos. Las
aPKCs constituyen una ruta paralela a Raf para activar MAPK sin afectar la cascada de
SAPK. Esto puede ser de especial relevancia ya que el balance de la actividad de MAPK
frente a SAPK y p38 puede ser crítico en la inducción de apoptosis. De hecho, el bloqueo de las aPKCs por Par-4 conlleva la inhibición de MAPK y una activación concomitante de p38. Resultados recientes demuestran, además, que la simple inhibición
de la actividad basal de MAPK es suficiente para inducir apoptosis y desencadenar la
activación de p38 de manera dependiente de caspasas. Este efecto se bloquea en presencia de suero a través de la cascada de PI 3-quinasa-Akt, lo que desvela un “crosstalk”
entre señales de supervivencia celular, susceptibles de intervención con nuevos
inhibidores farmacológicos con potencial terapéutico. En este sentido, nuestro
Laboratorio, como parte de un esfuerzo común de GlaxoWellcome para la obtención de
nuevos fármacos, ha iniciado la búsqueda de inhibidores de las aPKCs utilizando el sistema de HTS (“High Throughput Screening”). La obtención de estos inhibidores permitirá reevaluar el papel de las aPKCs en modelos animales de enfermedades humanas,
así como el diseño de posibles nuevos fármacos.
Research Summary
The main objective of the Laboratory is the study of the molecular basis of cell
activation, toward the identification of novel therapeutic targets for human diseases
such as cancer, inflammation or neurodegenerative processes.
In this moment, the work of the Laboratory is focused on the regulation and function of the atypical PKC isotypes λ/ιPKC and ζPKC. These PKCs have been shown to
play critical roles in the control of cell growth and survival through the activation of the
87
NF-κB transcription factor. Recent results from our group have identified the IκB
kinase-β (IKKβ) as the target of the aPKCs in the activation of NF-κB. Thus, we show
that the aPKCs bind to, and activate IKKβ triggering the whole cascade that culminates
in the nuclear translocation of the NF-κB complex. The next challenge for our
Laboratory is to identify the links that connect the aPKCs to the signaling complex of
the receptors for TNFα and IL1, two reported potent activators of NF-κB and the
aPKCs. In this regard, the mechanism that regulate these PKCs is a matter of intense
research. In contrast to other isotypes, the atypicals are not activated by Ca2+, phorbol
esters or diacylglycerol, but can be activated by other important lipid second messengers such as the 3’-phosphoinositides. Our laboratory has contributed significantly to
the characterization of a novel mechanism for the regulation of the aPKCs. This mechanism involves the interaction with proteins that act as regulators of their enzymatic
activity or adapters that serve to localize the aPKCs to intracellular regions critical for
their signaling function. Thus, we have recently described three novel protein modulators of the aPKCs: LIP, Par-4, and p62/ZIP. LIP is a selective activator of λ/ιPKC,
whereas Par-4, whose expression is induced in cells undergoing growth arrest and
apoptosis, is an inhibitor of both λ/ιPKC and ζPKC. The interaction of the atypicals
with Par-4 and LIP unveils their role in cell survival. The third protein, p62, serves to
localize both aPKCs in the endosomes, where these kinases receive signals from
cytokine and growth factor receptors internalizing once they are bound to their respective ligands. The mechanisms whereby p62 couples the aPKCs to the membrane signaling events will be addressed in the forthcoming months.
How the aPKCs regulate cell survival and growth has also attracted the interest
of our group during this past year. It should be stressed the role played by other kinases such as MAPK and PI 3-kinase in these processes. The aPKCs constitute a parallel
pathway to that of Raf for the activation of MAPK. This is particularly relevant because
the balance of MAPK to SAPK and p38 appears critical for apoptosis in response to different cellular insults. In fact, the blockade of the aPKCs by Par-4 triggers the inhibition
of MAPK and the subsequent activation of p38. Recent data from this Laboratory
demonstrates that the simple inhibition of the MAPK basal activity is sufficient to trigger apoptosis and p38 activation through a caspase-dependent mechanism. This effect
88
is blocked by serum survival factors acting through the PI 3-kinase/Akt cascade. These
findings unveil an interesting cross-talk between different signaling mechanisms,
involving potential new targets for novel therapeutic intervention. In this regard, our
laboratory, as part of the effort of GlaxoWellcome to develop new medicines has undertaken the search of aPKC inhibitors using the HTS (High Throughput Screening)
methodology. The finding of these potential new inhibitors will permit the re-evaluation of the role of the aPKCs in animal models of human diseases as well as the design
of new therapeutic agents.
Publicaciones/Publications
—
Bandyopadhyay, G., Standaert, M.L., Zhao, L., Yu, B., Avignon, A., Galloway, L.,
Karnam, P., Moscat, J. and Farese, R.V. Activation of Protein Kinase C (α,β,ζ) by
Insulin in 3T3/L1 Cells. Transfection Studies Suggest a Role for PKC-ζ in Glucose
Transport. J. Biol. Chem. 272, 2551-2558 (1997).
—
Cai, H., Smola, U., Wixler, V., Eisenmann-Tappe, I., Diaz-Meco, M.T., Moscat, J.,
Rapp, U. and Cooper, G. Role of Diacylglycerol-Regulated Protein Kinase C
Isotypes in Growth Factor Activation of the Raf-1 Protein Kinase. Mol. Cell. Biol.
17, 732-741 (1997).
—
Berra, E., Municio, M.M., Sanz, L., Frutos, S., Diaz-Meco, M.T. and Moscat, J.
Positioning Atypical Protein Kinase C Isoforms in the UV-Induced Apoptotic
Signaling Cascade. Mol. Cell. Biol. 17, 4346-4354 (1997).
—
Bandyopadhyay, G., Standaert, M.L., Galloway, L., Moscat, J. and Farese, R.V.
Evidence for Involvement of Protein Kinase C (PKC) ζ and Non-Involvement of
Diacylglycerol-sensitive PKCs in Insulin-Stimulated Glucose Transport in L6
Myotubes. Endocrinology 138, 4721-4731 (1997).
—
Standaert, M.L., Galloway, L., Karnam, P., Bandyopadhyay, G., Moscat, J. and
Farese, R.V. Protein Kinase C-ζ as a Downstream Effector of Phosphatidylinositol
3-Kinase During Insulin Stimulation in Rat Adipocytes. Potential Role in Glucose
Transport. J. Biol. Chem. 272, 30075-30082 (1997).
89
—
Berra, E., Diaz-Meco, M.T. and Moscat, J. The Activation of p38 and Apoptosis by
the Inhibition of Erk is Antagonized by the Phosphoinositide 3-Kinase/Akt
Pathway. J. Biol. Chem. 273, 10792-10797 (1998).
—
Sanchez, P., De Carcer, G., Sandoval, I.V., Moscat, J. and Diaz-Meco, M.T.
Localization of Atypical Protein Kinase C Isoforms into the Lysosome-targeted
Endosomes Through the Interaction with p62. Mol. Cell. Biol. 18, 3069-3080 (1998).
—
Lallena, M.J., Diaz-Meco, M.T., Bren, G., Payá, C.V., Moscat, J. Activation of IκB
Kinase β by Protein Kinase C Isoforms. Mol. Cell. Biol. 19, 2180-2188 (1999).
—
Frutos, S., Moscat J., Diaz-Meco, M.T. Cleavage of ζPKC but not of λ/ιPKC by
Caspase-3 During UV-Induced Apoptosis. J. Biol. Chem. 274, 10765-10770 (1999).
Tesis Doctorales/Doctoral Theses
José Lozano Castro: “Identificación de la ribonucleoproteína heterogénea nuclear A1
como un nuevo substrato de la proteína quinasa C ζ”. Universidad Autónoma de
Madrid. 1997. Calificación: Apto cum laude.
María del Mar Municio Escurín: “Identificación y caracterización molecular de reguladores específicos de proteínas quinasa C atípicas”. Universidad Autónoma de
Madrid. 1997. Calificación: Apto cum laude.
Colaboraciones con la industria / Collaborations with Industry
Acuerdo de colaboración entre el CSIC y GlaxoWellcome para la creación del
“Laboratorio GlaxoWellcome-CSIC de Biología Molecular y Celular” en el Centro de
Biología Molecular-Severo Ochoa.
Collaboration agreement between the CSIC and GlaxoWellcome for the creation of the
“GlaxoWellcome-CSIC Laboratory of Molecular and Cellular Biology”, in the CBMSO.
Premios y Distinciones / Prizes and Distinctions
Jorge Moscat:
—
90
Homenaje a la Biomedicina Española, 1998. Fundación Ciencias de la Salud.
Memoria 1997/98
CBMSO
1997/98 Report
TRANSPORTE DE PROTEÍNAS: MECANISMOS
MOLECULARES INVOLUCRADOS EN EL TRANSPORTE DE
PROTEÍNAS LISOSOMALES Y VACUOLARES
TRANSPORT OF PROTEINS: MOLECULAR MECHANISMS
IMPLICATED IN THE TRANSPORT OF LYSOSOMAL AND
VACUOLAR PROTEINS
Jefe de Línea / Group Leader:
Personal Científico
Scientific Personnel:
Becarios Postdoctorales
Postdoctoral Fellows:
Becarios Predoctorales
Graduate Students:
Ignacio V. Sandoval
Diego Pulido Vega, Vassiliki Lalioti
Sonia Martínez Arca, Yolanda Robledo Ozaya,
Mercedes del Valle Sanz
Silvia Palacios Lidón, Eduardo Silles Mc Caney,
Julio Valdueza Beneitez, Silvia Vergara-Jaúregui
Publicaciones / Publications
—
Sandoval, I.V. and Carrasco, L. Poliovirus infection and expression of the poliovirus protein 2B provoke the disassembly og the Golgi complex, the organelle target for the antipoliovirus drug Ro-090179. J. Virol. 71, 4679-4693 (1997).
—
Sánchez, P., De Carcer, G., Sandoval, I.V., Moscat, J. and Díaz-Meco, M.T.
Localization of Atypical Protein Kinase C Isoforms into the Lysosome-targeted
Endosomes Through the Interaction with p62. Mol. Cell. Biol. 18, 3069-3080 (1998).
—
Di Jeso, B., Pereira, R., Consiglio, E., Formisano, S., Satrústegui, J. and Sandoval,
I.V. Demonstration of a Ca2+ requirement for thyroglobulin dimerization and
export to the Golgi complex. Eur. J. Biochemistry 252, 583-590 (1998).
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Sonia Martínez Arca: “Mecanismos moleculares involucrados en la segregación y el transporte de dos proteínas de membrana, LIMPII y GLUT4, en la red trans del aparato de
Golgi. Universidad Autónoma de Madrid. 1998. Calificación: Sobresaliente cum laude.
91
Memoria 1997/98
CBMSO
1997/98 Report
CITOESQUELETO Y NUCLEOESQUELETO
CYTOSKELETON AND NUCLEOSKELETON
Jefe de Línea / Group Leader:
Becarios Predoctorales
Graduate Students:
Isabel Correas
Carlos Manuel Luque, Carmen María PérezFerreiro, Mª José Lallena Jimeno
Resumen de Investigación
Algunos componentes del citoesqueleto están presentes también en otros compartimentos celulares. La proteína 4.1 fue originalmente descrita como un componente de 80 kDa del citoesqueleto del eritrocito humano. Estudios posteriores
pusieron de manifiesto que es una proteína común a todas las células y tejidos, si bien
presenta una gran variabilidad de tamaños moleculares y de distribución subcelular.
Durante el periodo 97-98, el interés de nuestro grupo de trabajo se ha centrado en la
caracterización de las señales responsables de la distribución diferencial de las isoformas de 4.1, así como en el estudio de la función que estas proteínas desempeñan en
los distintos compartimentos celulares en los que han sido detectadas, especialmente
en el núcleo.
Mediante análisis de deleción y/o mutación de cDNAs específicos de 4.1 clonados en nuestro laboratorio, hemos podido establecer un orden jerárquico en las
secuencias de la proteína 4.1. Así, las secuencias responsables de la entrada al núcleo
de la molécula se localizan en la zona carboxilo-terminal (común para las isoformas
traducidas tanto desde el ATG1 como desde el ATG2). La zona amino-terminal específica de las isoformas traducidas desde el ATG1 bloquea estas señales nucleares de
manera que las proteínas que contienen dicha región permanecen en el citoplasma/membrana plasmática. Estos resultados indican que las señales nucleares son
inactivadas en presencia de la región dominante amino-terminal específica de las isoformas traducidas desde el ATG1. Este hallazgo concuerda con el hecho de que solo
92
se hayan aislado isoformas nucleares dentro del grupo de proteínas 4.1 que se traducen desde el ATG2.
Respecto al posible papel funcional de 4.1 en el núcleo, hemos continuado colaborando con el grupo del Dr. Juan Valcárcel (EMBL, Heidelberg) sobre la caracterización de la asociación de la proteína 4.1 con factores de splicing. Hemos determinado que una de las isoformas de 4.1 clonadas, al igual que el factor de splicing SC35,
interacciona con el factor U2AF35 y no con el U2AF65. Estos datos junto con resultados
previos obtenidos por nuestro grupo, sugieren un papel estructural para la proteína
4.1 nuclear como componente del nucleoesqueleto celular al que se anclan componentes de la maquinaria de splicing.
Research Summary
Many cytoskeletal proteins have also been detected in other cellular compartments. Protein 4.1 was originally identified as an 80 kDa component of the membrane
skeleton of human red blood cells. Posterior studies showed that multiple immunoreactive proteins 4.1, varying widely in size, were also detected in nucleated cells not
strictly confined to the plasma membrane. Thus, stress fibers, perinuclear regions, centrosomes and the nucleus are different intracellular sites where 4.1 epitopes have been
detected. Studies carried out by our group have confirmed the nuclear localization of
4.1 by transfection experiments of different 4.1 cDNAs isolated from human T lymphocytes. During 1997-1998, we have approached to identify the sequence motifs involved in differential targeting of proteins 4.1 and to investigate the roles that 4.1 plays in
the nucleus. Two main groups of proteins 4.1 can be generated by differential use of
two translation initiation sites, ATG1 and ATG2. The use of ATG1 as translation start
site generates isoforms containing N-terminal extensions of up to 209 amino acids as
compared to those translated from ATG2.
We have identified the nuclear localization signals at the central part of the 4.1
molecule, therefore, they are present in both groups of 4.1 isoforms. Interestingly, the
209 amino acids block nuclear entry of protein 4.1. Thus, appendage of this sequence to
nuclear 4.1 isoforms encoded from ATG2 abrogate their nuclear targeting.
93
Concomitantly with this, 4.1 isoforms encoded from ATG1 are predominantly localized
to the plasme membrane, endoplasmic reticulum and cytoplasm but not to the nucleus.
These results indicate that the amino-terminal region of proteins 4.1 encoded from
ATG1 plays a pivotal role in the differential targeting of proteins 4.1.
Regarding to the studies on the nuclear role of proteins 4.1, we have continued
our collaboration with Dr. Juan Valcarcel’s group (EMBL, Heidelberg). We have determined that a specific nuclear 4.1 isoform associates with the splicing factor U2AF35 but
not with U2AF65, in a similar way as SC35 does. These data together with previous
results obtained by our group indicate that protein 4.1 is a component of the nucleoskeleton to which proteins of the splicing machinery attach.
Publicaciones / Publications
—
Lallena, M.-J. and Correas, I. Transcription-dependent redistribution of nuclear
protein 4.1 to SC35-enriched nuclear domains. J. Cell Sci. 110, 239-247 (1997).
—
Lallena, M.-J., Martínez, C., Valcárcel, J. and Correas, I. Functional association of
nuclear protein 4.1 with pre-mRNA splicing factors. J. Cell Sci. 111, 1963-1971 (1998).
—
Franco, P., Massa, O., García-Rocha, M., Chiaradonna, F., Iaccarino, C., Correas,
I., Méndez, E., Ávila, J., Blasi, F. and Stopelli, P. Protein kinase C-dependent in
vivo phosphorylation of prourokinase leads to the formation of a receptor competitive antagonist. J. Biol. Chem. 273, 27734-27740 (1998).
—
Luque, C.M., Lallena, M.-J., Alonso, M.A. and Correas, I. An alternative domain
determines nuclear localization in multifunctional protein 4.1. J. Biol. Chem. 273,
11643-11649 (1998).
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
María José Lallena Jimeno: “Identificación de isoformas nucleares de la proteína 4.1:
Asociación con factores implicados en el procesamiento del RNA precursor”
Universidad Autónoma de Madrid. 1997. Calificación: Apto cum laude.
94
Memoria 1997/98
CBMSO
1997/98 Report
GRUPO DE TERAPIA GÉNICA EXPERIMENTAL
EXPERIMENTAL GENE THERAPY GROUP
Investigadores Principales /
Principal Investigators:
Personal Científico
Scientific Personnel:
Becarios Predoctorales
Graduate Students:
Técnicos de Investigación
Technical Assistance:
Científicos Visitantes
Visiting Scientists:
Marta Izquierdo y Antonio Talavera
Antonio Liras Martín
Marisa Cortés, Pablo de Felipe, Laura Fuentes
Sánchez, Isabel Jimenez, Luisa Fernanda Mariscal,
Verónica Martín, Fernando Martín Gordillo, Raquel
Martín Palomeque, Humberto Sánchez González
Marta Vaz, Belén Viña
Nora Calcaterra (Universidad de Rosario.
Argentina), Marcelo López-Lastra (INSERM U412,
Francia)
Resumen de Investigación (M. Izquierdo)
Terapia génica de tumores cerebrales malignos
Los glioblastomas representan casi el 40% de los tumores primarios cerebrales,
poseen una mortandad superior al 90 % considerándose prácticamente incurables. Los
tratamientos empleados hasta el momento (radioterapia, quimioterapia y cirugía) no
han sido capaces de mejorar estos drásticos resultados. Los avances recientes en ingeniería genética permiten la utilización de nuevas estrategias. Una de estas estrategias es
la utilización de vectores retrovíricos que depositen en cada célula tumoral un gen
capaz de inducir su destrucción. Los retrovirus solamente infectan células en división y
la gran mayoría de las células del cerebro adulto no se dividen; prácticamente las únicas células proliferativas en un cerebro que alberga un tumor son las neoplásicas. Se
pueden elaborar “retrovirus terapeúticos” en los que algunos genes esenciales del virus
están sustituidos por genes asesino-suicidas entre los que se encuentra el gen de la
95
quinasa de timidinas del virus Herpes simplex (tk ); esta quinasa no es tan estricta como
su homóloga celular y fosforila análogos de nucleósidos, como el “ganciclovir”, convirtiéndolo en un competidor de la guanosina trifosfato. La incorporación en el DNA del
ganciclovir fosforilado interfiere con la replicación y produce la muerte celular.
También se estan utilizando vectores que llevan otros genes asesino-suicida como por
ejemplo el gen de la linamarasa (lin ). El gen lin codifica la enzima β-glucosidasa (linamarasa) que hidroliza la linamarina (2-0H-isobutironitrilo-β-D-glucopiranósido) a glucosa y cianuro. El cDNA ha sido clonado y caracterizado, se han construído vectores
retrovirales portadores del gen y se ha determinando su efectividad como gen suicida
in vitro e in vivo. Es la primera vez que se utiliza un gen de origen vegetal para el
tratamiento del cáncer. Hemos encontrado que el efecto colateral del cianuro producido en el sistema linamarasa/linamarina permite eliminar tumores de gran tamaño. No
hemos encontrado efectos secundarios aparentes en los animales de experimentación,
cuya evolución patológica se ha seguido por imágenes de resonancia magnética.
Resumen de Investigación (A. Talavera)
Nuestro interés se centra en la adaptación de vectores retrovirales a terapia génica de sustitución y de células en reposo. El uso de la primera es apropiado en el tratamiento de enfermedades monogénicas debidas a mutaciones puntuales, (como la anemia falciforme), y/o pequeñas alteraciones (hemofilias), ya que soslayaría los inconvenientes encontrados en la terapia génica de adición en que, debido a efectos de posición
y al uso de promotores y otras secuencias ajenas al gen, éste es comúnmente silenciado
o exhibe expresión inadecuada para los fines terapéuticos perseguidos. A fin de favorecer la interacción homóloga entre la secuencia génica correctora incluída en el vector
y el gen residente, hemos estudiado dos modos de inhibir la integración propia de los
retrovirus: 1) en cis, (deleción de secuencias de DNA reconocidas por la integrasa); 2) en
trans, (uso de un gen de integrasa con terminación prematura). Células murinas conteniendo el gen de la timidina kinasa inactivado por una mutación quasi-puntual, fueron
transfectadas con vectores retrovirales deficientes en integración y portadores de una
secuencia parcial del gen no mutado. La obtención de clones con actividad timidina
kinasa (seleccionables en medio HAT), cuyo gen curado está siendo actualmente carac96
terizado, nos permite concluir que los vectores retrovirales son aplicables a la terapia
génica sustitutiva. La evaluación de la frecuencia de curación respecto a la de inserciones no homólogas permitirá abordar la optimización de este tipo de vectores
Los vectores retrovirales basados en el virus de la leucemia murina de Moloney
(MoMLV) son incapaces de transfectar células que no pasen por mitosis en un corto
periodo tras la infección, lo que impide su uso en numerosos casos en que el objeto de
la terapia génica lo constituyen las células madres hematopoyéticas. Actualmente se
están desarrollando vectores basados en lentivirus (incluyendo el VIH), ya que éstos, a
diferencia del MoMLV, presentan señales de localización nuclear (SNL) en proteínas
que acompañan al DNA recién retrotranscrito. Este tipo de vectores de genoma complejo es dificil de manejar y, cuando se basan en el VIH, su uso comporta evidente riesgo. Nuestro grupo ha diseñado un enfoque alternativo en el que la preparación de vectores basados en el MoMLV, incluye una integrasa a la que se ha añadido la SLN del
antígeno T de SV40. Experimentos preliminares sugieren que estos vectores, a diferencia de sus homólogos sin la NLS, son capaces de transfectar células arrestadas en la fase
S del ciclo celular.
Research Summary (M. Izquierdo)
Gene therapy in malignant brain tumors
The glioblatoma represents almost 40% of all primary brain tumors, have over
90% mortality and are considered virtually incurable. The current cancer therapies
such as surgery, radiation and/or chemotherapy, have had little success to improve the
median survival, of less than a year, in patients with malignant gliomas. The new
advances in genetic engineering allows the use of new strategies. One of these new
strategies is based upon retroviral vectors carrying potentially killer-suicide genes, able
to kill each cell of the tumor cells. Retrovirus infect and integrate only into dividing cells
offering a very selective possibility of targeting neoplastic cells within an adult brain,
this mainly constituted by nondividing cells. Retroviral vectors have been created from
the Moloney murine leukemia virus; one of these vectors carried the potential suicide
gene thymidine kinase (tk) from the herpes simplex virus. The thymidine kinase (TK)
97
produced by the herpes simplex virus (HSV) is not as strict as its mammalian cellular
counterpart and can phosphorilate nucleoside analogs such as ganciclovir or aciclovir
into nucleotide-like precursors that will block replication of the DNA which results into
killing the dividing cell. We have also made vectors carrying other killer-suicide gene
called linamarasa (lin ). The gene codes for the enzyme β-glucoxidase (linamarasa) that
hydrolizes linamarine (2-0H-isobutyronitrilo-β-D-glucopyranoxide) to cyanide and
glucose. The efficiency of this and other new constructs is being tested both in vitro and
in vivo. It is the first time that a plant gene is used in cancer therapy. We have shown
that the system can eradicate very large intracerebral gliomas in vivo helped by a
cyanide bystander effect. Animals showing a total regression of the tumor by magnetic
resonance imaging (MRI), do not show other appreciable toxic effects.
Research Summary (A. Talavera)
Our aim is the adaptation of retroviral vectors to substitutive- or resting-cell gene
therapy, the former being the best option for the correction of monogenic diseases due
to point mutations (e.g. sickle-cell anemia) or small alterations (e.g. hemophilias). This
type of gene therapy is expected to circunvent the difficulties inherent to the use of
additive gene therapy, in which the therapeutic gene is frequently silenced or its expression imbalanced, due to position effects as well as to the use of promoters and other
expression signals that are not the ones that control the gene in a natural context. With
the purpose of favouring the homologous interaction between the correcting gene
sequence included in the vector and the resident cellular gene we have studied different ways to inhibit the random integration characteristic of retroviruses: 1) in cis, by
deleting the DNA sequence recognized by the viral integrase; 2) in trans, by using a packaging system that includes a prematurely truncated integrase gene. Cells containing a
point mutation-inactivated thymidine kinase were transfected with integration-deficient retroviral vectors carrying a partial sequence of the native gene. The isolation of
HAT-resistant cells that produce active thymidine kinase, whose corrected gene is
currently being characterized allowed us to conclude that retrovirus-based vectors can
be used in substitutive gene therapy. The evaluation of the relative frequencies of
homologous correction and random, non-homologous insertion is expected to be of
help in the optimization of this type of vectors.
98
Retroviral vectors based on Moloney murine leukemia virus (MoMLV) are unable to transfect cells unless these undergo mitosis shortly after infection. This fact prevents the use of these vectors in gene therapy aimed to hematopoietic stem cells.
Currently, vectors are being developed that are based on lentivirus (including HIV), as
these carry nuclear localization sites (NLS) in proteins that bind to the newly retrotranscribed DNA. The manipulation of these vectors is difficult, given their complex
genome and, in the case of HIV-based vectors, dangerous, due to the patogenicity of the
corresponding wild-type virus. We have devised an alternative approach in which the
preparation of MoMLV-based vectors includes the use of an engineered integrase to
which the SV40 T-antigen NLS sequence has been added. Preliminary experiments suggest that these vectors, unlike their NLS-less counterparts, are able to transduce cells
that are arrested in the S phase of the cell cycle.
Publicaciones / Publications
—
Izquierdo, M., Cortés, M.L., Martín, V., de Felipe, P., Izquierdo, J.M., PérezHigueras, A., Paz, J.F., Isla, A. and Blázquez, M.G. Gene therapy in brain tumors:
implications of the size of glioblastoma on its curability. Advances in Stereotactic
and functional neurosurgery (12), and Acta Neurochirurgica 68, 111-117 (1997).
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Izquierdo, M. Situación actual de la terapia génica en enfermedades hereditarias
y cáncer. Capítulo del libro titulado Biotecnología y enseñanza . Ed. Colegio Oficial
de Biólogos, Madrid. pp. 149-161 (1997).
—
Begreve, B., Andrei, G., Izquierdo, M., Piette, J., Morin, K., Knaus, E.E., Wiebe,
L.I., Basrah, I. Walker, R.T., De Clercq and Balzarini, J. Varicella zoster virus thymidine kinase gene and antiherpetic pyrimidine nucleoside analogues in a combined gene/chemotherapy treatment for cancer. Gene Therapy 4, 1107-1114 (1997).
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Izquierdo, M. Papel de la terapia génica en oncología: el tratamiento de los tumores cerebrales malignos como modelo. 27, Cáncer 96. Actualizaciones en oncología.
Ed. Fundación BBV. Bilbao pp. 392-408 (1997).
99
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Izquierdo, M. Gene therapy. Methods and findings in experimental and clinical pharmacology 19, (suppl. A) 7-8 (1997).
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Izquierdo, M. An overview of gene therapy approaches to neurological malignancies. BioDrugs 4, 337-349 (1998).
—
Cortés, M.L., de Felipe, P., Martín, V., Hughes, M.A. and Izquierdo, M. Successful
use of a plant gene in the treatment of cancer in vivo. Gene Therapy 5, 1499-1507
(1998).
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Fernando Martín Gordillo: "Nuevos sistemas de empaquetamiento de vectores retrovirales para terapia génica". Universidad Autónoma de Madrid. 1998. Calificación:
Apto cum laude.
Colaboraciones con la Industria / Collaborations with Industry
Colaboración con la empresa Boehringer Ingelheim International/ IMP Viena en el
proyecto: Gene therapy of rat glioblastoma using the AVET technique (1997).
Colaboración con la empresa Boehringer Ingelheim International/ IMP Viena en el
proyecto: Glioblastoma total regression in vivo by linamarase/linamarin killer-suicide
gene therapy system (1998).
100