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AIDA (2009), XIII Jornadas sobre Producción Animal, Tomo I, 6-8
ESTUDIO DE LOS GENES IMPLICADOS EN LA CANTIDAD Y COMPOSICIÓN DE LA
GRASA INTRAMUSCULAR DE LOS MÚSCULOS LONGISSIMUS DORSI Y GLUTEUS
MEDIUS EN UNA POBLACIÓN DUROC
Solé, M.1, Pena, R. 1, Amills, M. 2, Cánovas, A. 1, Gallardo, D. 2, Reixach, J. 4, Díaz, I. 3,
Noguera, J.L. 1 y Quintanilla, R.1
1
IRTA Genètica i Millora Animal (Lleida) [email protected]; 2Departament de Ciència
Animal i dels Aliments, Universitat Autònoma de Barcelona; 3IRTA Tecnologia dels Aliments;
4
Selección Batallé SA
INTRODUCCIÓN
La cantidad y composición de la grasa intramuscular (GIM) son caracteres determinantes de
las características organolépticas y tecnológicas de la carne (Regueiro y Díaz, 1994). Este
hecho, unido a la relación existente entre la composición grasa de la carne y la salud
humana, ha despertado un creciente interés por estos caracteres. En este sentido el
músculo Longissimus dorsi, caracterizado por un alto contenido en fibras de tipo IIB
glucolíticas, ha sido el más ampliamente estudiado y utilizado como indicador en estudios de
calidad de la carne en porcino. El músculo Gluteus medius presenta una composición fibrilar
similar a la del músculo Longissimus dorsi, si bien algunos estudios en diversas razas de
porcino han mostrado perfiles metabólicos diferentes entre ambos músculos (EssenGustavson y Fjelkner-Modig, 1985).
En el presente trabajo se aborda el estudio de los genes relacionados con el contenido y la
composición de la grasa intramuscular de los músculos Longissimus dorsi (LD) y Gluteus
medius (GM) en una población Duroc caracterizada por un alto contenido de grasa
intramuscular mediante un análisis conjunto de QTL y de expresión génica diferencial.
MATERIAL Y MÉTODOS
Material animal, registros fenotípicos y genotipado de los individuos. El material animal
procede de una población de 350 individuos castrados pertenecientes a una línea comercial
Duroc y distribuidos en cinco familias de medio-hermanos paternos. Todos los individuos
fueron genotipados para 110 microsatélites distribuidos por todo el genoma (Gallardo et al.,
2008). Se tomaron muestras de los músculos LD y GM al sacrificio (190 d de edad, 122 kg
de peso vivo). En ambos músculos se midió el porcentaje de GIM, el contenido en colesterol
y la composición de ácidos grasos (C:12-C:22).
Análisis de QTL. El barrido genómico para la detección de QTL se realizó mediante la
aproximación descrita por Knott et al. (1996) para el análisis de familias de medio hermanos.
El modelo de análisis incluía los efectos lote o día de sacrificio y las covariadas espesor de
grasa dorsal (para GIM) o GIM (para el porcentaje de ácidos grasos). Los niveles de
significación a nivel genómico se establecieron mediante corrección de Bonferroni.
Experimento de microarrays. El diseño del experimento de microarrays se realizó
seleccionando a los animales extremos (grupo Alto y grupo Bajo) para un índice derivado del
primer componente principal que incluye diversos parámetros relacionados con el
metabolismo lipídico (lípidos plasmáticos, nivel de engrasamiento y grasa intramuscular y
perfil de ácidos grasos). De estos animales, se procesaron 70 muestras del músculo GM (35
por grupo) y 20 del músculo LD (10 por grupo). El RNA de las muestras se extrajo y purificó
con el kit RiboPureTM (Ambion), realizando posteriormente una hibridación no competitiva
con el chip GeneChip Porcine Genome Array (Affymetrix). La corrección del background y la
normalización de los datos se realizaron mediante el algoritmo gcRMA.
Análisis de los datos de expresión génica. El análisis de los datos de expresión se realizó
mediante las herramientas BRB-Array Tools (Xu et al, 2008) y GEAMM (Casellas et al.
2007). En ambos casos se analizó la expresión diferencial entre músculos y entre grupos
con alto y bajo nivel de metabolismo lipídico mediante un único análisis con toda la
información disponible. Posteriormente se realizó un análisis ontológico para clasificar desde
una perspectiva funcional los genes diferencialmente expresados, utilizando el paquete de
herramientas bioinformáticas DAVID (Huang et al., 2009; en http://david.abcc.ncifcrf.gov/).
Finalmente se realizó una búsqueda de genes diferencialmente expresados en los intervalos
—6—
de confianza de los QTL detectados, utilizando la aplicación para el alineamiento de los
elementos
Affymetrix
incluída
en
Pig
QTL
DataBase
(http://www.animalgenome.org/QTLdb/pig.html).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La Tabla 1 muestra los QTL significativos a nivel genómico detectados para la cantidad y el
perfil de ácidos grasos de la GIM de los músculos GM y LD. En general existe cierta
consistencia con QTL detectados en otros estudios (e.g. Sánchez et al. 2007). No obstante
cabe destacar la escasa correspondencia entre las asociaciones observadas en ambos
músculos, resultado que sugiere diferencias en cuanto a la determinación genética de estos
caracteres en LD y GM. Para el músculo GM se observan QTL relevantes para el %GIM en
los cromosomas 3 y 7. El cromosoma 7 en particular parece desempeñar un papel
importante en la variabilidad genética de la GIM del músculo GM mostrando, además de las
asociaciones descritas, varios QTL significativos a nivel cromosómico (no descritos en el
presente trabajo) para el perfil de ácidos grasos. Para el músculo LD por su parte, el
cromosoma 6 y el cromosoma 12, este último con un importante efecto sobre la cantidad
total de ácidos grasos saturados, son los que parecen tener mayor relevancia.
Los resultados obtenidos en el estudio de expresión diferencial de mRNA (Tabla 2)
muestran un total de 292 genes (correspondientes a 350 sondas) diferencialmente
expresados entre músculos, resultado que estaría en consonancia con la posición diferencial
de los QTL descritos en los músculos analizados. Para todos estos genes el cociente entre
las expresiones medias mostraba una tasa superior al 20% de sobre/infraexpresión en uno
de los músculos, si bien el rango llega hasta el 800% (caso del gen HOXA10). En un 66%
(196 genes) de los casos se trata de sondas sobreexpresadas en LD, si bien tan solo 23 de
estas sondas (17 genes) superaron el 50% de sobreexpresión, mientras que 55 sondas (43
genes) superaron dicha tasa para la sobreexpresión en GM.
Entre los grupos de individuos con niveles extremos para diversos caracteres del
metabolismo lipídico (Tabla 2) se obtuvo un número muy superior de genes diferencialmente
expresados (579 sondas correspondientes a 459 genes), pero el rango para las tasas de
sobre/infraexpresión fue considerablemente menor. De acuerdo con lo observado
previamente por Cánovas et al. (2008) al analizar los niveles de expresión mRNA en GM,
hubo un claro predominio de los genes sobreexpresados en el grupo de animales con
valores elevados de parámetros relacionados con el metabolismo lipídico. Cabe destacar
que tan solo 35 genes demostraron expresión diferencial simultáneamente para ambos
efectos, músculo y grupo. Asimismo el estudio ontológico mostró diferencias funcionales
entre ambos grupos de genes.
Por último el estudio de concordancia posicional entre las sondas diferencialmente
expresadas entre grupos / músculos y los QTL detectados nos permitió elaborar una lista de
genes candidatos (Tabla 3) que podrían presentar una asociación estructural y funcional con
la cantidad y composición de la grasa intramuscular de los músculos LD y GM en porcino.
De entre ellos cabe destacar el gen GPD1, relacionado con el incremento en la producción
de triacilglicerol en el tejido adiposo de los humanos obesos, o los genes NPC1 y NPC2, que
codifican para una proteína relacionada con la captación de colesterol.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
• Cánovas et al. 2008. 3rd Internat. Symposium on Animal Functional Genomics (Edimburgo)
• Casellas et al. 2008. Anim Genet 39:89 • Essen-Gustavson & Fjelkner-Modig 1985. Meat
Sci 13:33 • Gallardo et al. 2008. Physiol Genom 35:199 • Huang et al. 2009. Nat Protoc.
4:44 • Knott et al. 1996. Theor Appl Genet 93:7180 • Regueiro & Díaz 1994. Irtacam •
Sanchez et al. 2007. BMC Genetics 8:55 • Xu et al. 2008. Bioinformatics 24:137.
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Tabla 1. Principales QTL relacionados con la cantidad y composición de la grasa
intramuscular (GIM) de los músculos gluteus medius y longissimus dorsi.
SSC
3
3
5
7
7
18
18
gluteus medius
Carácter
F-value
%GIM
12.64*
%Vaccénico
12.95*
%Mirístico
13.98*
%GIM
16.48**
%Vaccénico
17.60**
%Palmítico
15.67**
a
14.46*
%SAT
Posición
15cM
15cM
94cM
133cM
81cM
39cM
40cM
a
SSC
3
6
6
12
14
longissimus dorsi
Carácter
F-value
%GIM
10.24+
%Vaccénico
14.56*
Colesterol(mg/g) 16.57**
%SAT
13.31*
%Esteárico
12.28*
Porcentaje de ácidos grasos saturados
* p<0.05; **p<0.01 a nivel genómico
Posición
53cM
95cM
35cM
74cM
85cM
Tabla 2. Genes con expresión diferencial entre los dos músculos y los dos grupos con alto y
bajo nivel de metabolismo lipídico
A
MÚSCULO
GRUPO
Nº Sondas
A
(Genes)
350 (292)
579 (459)
Sobreexpresados
grupo 1
GM 119 (96)
Alto 459 (376)
Sobreexpresados
grupo 2
LD 231 (196)
Bajo 120 (83)
Rango Cociente
Expresiones
0.32-8.84
0.43-2.76
Nº de Sondas (Genes) que cumplieron los requisitos p<0.001, FDR < 0.01 y FoldChange >1.2 o <0.8. (Resultados con BRB-array Tools)
Tabla 3. Genes con expresión diferencial entre grupos con alto y bajo metabolismo lipídico y
concordancia posicional con los QTL detectados.
(posición
QTL)
3 (15cM)
3 (53cM)
SSC
Banda citogenética
porcina
chr.3 (0-33 cM)
chr.3 (33-76 cM)
Banda citogenética
Humana
chr.7 (63-102 cM)
chr.16 (0-31 cM); chr.2 (50-114 cM)
Genes candidatos
GNAI2
RRN3; IK
a
a
a
MRLC2 GPD1 MKRN1 SP1
5 (94cM)
chr.5 (88-118 cM)
chr.12 (0-105 cM)
TAF9
OXCT1; NPC1 AQP4
6 (95cM)
chr.6 (84-107 cM)
chr.1 (11-40 cM); chr.18 (0-40 cM)
6 (35cM)
chr.6 (0-53 cM)
chr.16 (56-89 cM)
SERF1A
NPC2
7 (133cM)
chr.7 (100-137 cM)
chr.14 (72-92 cM)
7 (81cM)
chr.7 (74-100 cM)
chr.15 (31-95 cM); chr.14 (18-73 cM) TCF12a IDH1; MYH10a PRPF39
12 (74cM)
chr.12 (56-89 cM)
chr.17 (31-65 cM)
GALNT1a COASY PKCNT1
a
14 (85cM)
chr.14 (80-101 cM)
chr.10 (118-130 cM)
TIAL1 BAG3 LYRM2 ALDOC
18 (40cM)
chr.18 (27-50 cM)
chr.7 (25-120 cM)
GNAI2 COASY
a
El subíndice denota los genes diferencialmente expresados entre Músculos.
Agradecimientos: Este proyecto ha sido financiado por el MICINN (AGL2007-66707-C0201 y GEN2003-20658-C05-05). Agradecemos a Selección Batallé su cooperación en la
obtención del material animal y a D. Almuzara su apoyo técnico. M. Solé es beneficiaria de
una beca FPI del MICINN.
STUDY OF GENES INVOLVED IN THE INTRAMUSCULAR FAT CONTENT AND
COMPOSITION OF MUSCLES LONGISSIMUS DORSI AND GLUTEUS MEDIUS IN A
DUROC POPULATION
ABSTRACT: The intramuscular fat (IMF) content and composition are key traits in
organoleptic, technological and nutritional quality of meat. We have conducted a study of
genes influencing these traits in pigs by two approaches: QTL and expression analyses. The
animal material consisted on 350 barrows of a commercial Duroc line, distributed in 5 half-sib
families. The percentage of IMF, cholesterol content and fatty acid composition were
determined in Longissimus dorsi and Gluteus medius muscles. A gene expression analysis
of individuals with extreme values for several parameters related with lipid metabolism and
fat meat characteristics was carried out in these two muscles by RNA hybridization in the
GeneChip Porcine Genome Array (Affymetrix). All individuals were genotyped for 110
microsatellites distributed across the 18 autosomes. Several genome-wide significant QTL
with effects on %IMF and several fatty acid profile have been detected at SSC 3, 6, 7, 12, 14
and 18. Moreover, we have detected 350 genes differentially expressed between the two
analysed muscles, along with 579 genes differentially expressed in the two groups of animals
with high and low levels of lipid metabolism. A list of potential candidate genes has been
elaborated from genes differentially expressed and located in the confidence intervals of
detected QTL.
Keywords: intramuscular fat, QTL, gene expression, candidate gene
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