TRABAJO PRÁCTICO PURIFICACIÓN DE FOSFATASA ÁCIDA

CÁTEDRA BIOQUÍMICA
Carreras: Farmacia
Profesorado en Química
Licenciatura en Química
Lic. en C. y T. de los Alimentos
TRABAJO PRÁCTICO
PURIFICACIÓN DE FOSFATASA ÁCIDA INESPECÍFICA DE TUBÉRCULO DE PAPA
(Solanum tuberosum) Y DETERMINACIÓN DE SUS PARÁMETROS CINÉTICOS.
INTRODUCCIÓN
Las enzimas fosfatasas hidrolizan monoésteres de fosfato en una reacción
termodinámicamente favorable. (ΔGo’ < -9 KJ*mol-1). Son monómeros o dímeros de masa
molecular aproximada a 50 o 60 kDa. Se diferencian entre sí por su pH óptimo de catálisis
(ácidas o alcalinas), PM, respuesta frente a distintos efectores, activadores e inhibidores. Se
encuentran en una gran variedad de especies y tejidos.
En los seres vivos el anión ortofosfato (Pi) juega un rol vital en la transferencia de energía
y en la regulación metabólica, siendo un importante constituyente estructural de muchas
biomoléculas. Su acumulación a partir del medio ambiente, depósito y metabolismo son
críticos para el desarrollo y crecimiento de todos los organismos, entre ellos los vegetales.
Durante este trabajo práctico se purificará la fosfatasa ácida de tubérculo de papa. Se
caracterizará a la enzima purificada mediante determinación de su masa molecular,
determinación de parámetros cinéticos (Km, Vmax) y se observará el efecto de su inhibidor
natural, el Pi.
Este trabajo práctico se desarrollará durante tres sesiones:
Sesión 1: Purificación de fosfatasa ácida.
Sesión 2: Determinación de concentración de proteínas
Obtención de los espectros del pnitrofenol y proteínas
Determinación de la actividad enzimática por método continuo y discontinuo
Construcción de la tabla de purificación
Sesión 3: Determinación de parámetros cinéticos.
Determinación de peso molecular.
MATERIALES
Buffer de extracción (BE):
acetato de sodio 50 mM pH 5,2
sal sódica de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 1 mM
fluoruro de fenil metilsulfonilo (PMSF) 1 mM
β-mercaptoetanol (ßME) 2 mM (agregar en el momento de usar)
Polietilenglicol (PEG) 50% (P/V)
Columna de intercambio aniónico Q-Sepharose®
Buffer de columna (BC):
Tris HCl 50 mM pH 7,5
EDTA1 mM.
β-mercaptoetanol 1 mM (agregar en el momento de usar)
Citrato de sodio 200 mM pH 6,5
p-nitrofenil-fosfato (pNPP) sólido.
a) 90 mM. Se prepara la solución con citrato de sodio 200 mM (pH= 6,5). Se utilizará
como sustrato en las medidas de actividad enzimática que se realizarán para
seguimiento de la purificación.
b) 50 mM. Se prepara la solución en medio acuoso. Se utilizará como sustrato en las
medidas de actividad enzimática que se realizarán para medir los parámetros
cinéticos de la enzima.
NaOH 500 mM
Fosfato de sodio 50 mM
Reactivo de Coomassie: Coomassie Blue 6250 0,06 % en 3% P/V de ácido perclórico
(concentración final 0,3 M) para medir concentración de proteínas. (Método de Bradford)
PRIMERA SESIÓN
Purificación de fosfatasa ácida de papa.
Se obtendrá un extracto crudo de las enzimas de tubérculo de papa mediante tratamiento
con un homogeneizador de mesa Polytron®, posterior precipitación con PEG y por último,
cromatografía de intercambio iónico en Q- Sepharose®. De cada una de las fracciones se
medirá el volumen y se reservará una fracción para la posterior determinación de
actividad enzimática por método continuo, concentración de proteínas (datos
necesarios para la realización de la tabla de purificación) y electroforesis en
condiciones desnaturalizantes.
Etapa I - Obtención de extracto crudo.
A 50 g de tubérculo de papa adicionar 10 mL de buffer de extracción y homogeneizar en
frío. Centrifugar a 12000 g (10000 rpm, rotor SS34) durante 10 min. (la centrifugación la
realizará el auxiliar). Medir el volumen del sobrenadante. (Etapa I en la tabla de purificación).
Separar 1 mL para posterior medición de actividad enzimática, concentración de proteínas y
electroforesis en gel de poliacrilamida. Rotular el tubo y entregárselo al auxiliar.
Etapa II - Precipitación con PEG (50 %).
Al volumen restante de extracto crudo, agregar un volumen de PEG (50%) de manera
que la concentración final del mismo sea del 20 % (ver cálculo en pág 8). Agitar 40 min en
baño de hielo. Centrifugar a 12000 g (10000 rpm, rotor SS34) por 10 min (la centrifugación
la realizará el auxiliar). Descartar el sobrenadante, resuspender el precipitado obtenido con
0,9 mL de BC y trasvasar a uno o dos tubos tipo Eppendorf. Centrifugar en centrífuga tipo
Eppendorf a 13000 rpm por 10 min. Reservar el sobrenadante (a).
Resuspender el precipitado con 0,5 mL del mismo buffer BC, trasvasar esta resuspensión
a tubos tipo Eppendorf, centrifugar en microcentrífuga a 15699 g (13000 rpm) durante 10
minutos. Reservar el sobrenadante (b).
Reunir los sobrenadantes (a) y (b).
Nota: Las etapas I y la precipitación con PEG se realizarán en forma conjunta para los
cuatro grupos de cada comisión por lo que se partirá de 200 g de papa y 40 ml de buffer de
extracción.
Resumen del paso:
Precipitación con PEG
+ Centrifugación
Sobrenadante DESCARTAR
Precipitado REDISOLVER con 0,9 mL de BC
Nueva Centrifugación
Sobrenadante GUARDAR (a)
Precipitado REDISOLVER con 0,5 mL de BC
Última Centrifugación
Sobrenadante GUARDAR (b)
Precipitado DESCARTAR
Reunir fracciones (a) y (b)
Luego de mezclar por inversión, medir el volumen (Etapa II). Separar 100 µL para
medición posterior de actividad enzimática, determinación concentración de proteínas y
electroforesis en gel de poliacrilamida. Rotular el tubo y entregárselo al auxiliar.
Etapa III- Separación cromatográfica en Q-Sepharosa.
Se utilizará una columna de 5 mL, con 3 mL de volumen de lecho, previamente
equilibrada con 2 volúmenes de etanol al 20 % más 2 volúmenes de buffer de columna BC.
Cerrar la salida de la columna. Sembrar el sobrenadante anterior (a+b) y agregar con pipeta
y en forma sucesiva a la columna, (destapando la salida de la misma, y comenzando a
recoger en el primer tubo):
6 mL de buffer BC,
6 mL de (buffer BC + NaCl 25 mM)
6 mL de (buffer BC + NaCl 200 mM)
6 mL de (buffer BC + NaCl 500 mM)
Se recogerán fracciones de 3 mL en cada tubo receptor (invertir cada tubo varias veces
para lograr una correcta homogeneización del eluído).
Estimación de actividad enzimática de las fracciones obtenidas en la Etapa III
Se seguirá la aparición de actividad fosfatasa ácida midiendo actividad enzimática por
método discontinuo semicuantitativo, en placa.
Se empleará el sustrato artificial p-nitrofenil-fosfato (pNPP) que es hidrolizado según la
siguiente reacción:
Este método permite comparar muestras con distintas actividades ya que el p-nitrofenol
absorbe a 405 nm y se visualiza de color amarillo. Se realizará en un volumen final de
reacción enzimática en cada pocillo de 200 µL. Se colocarán en 9 pocillos 100 µL de pNPP
(90 mM en citrato pH 6,5) + 70 µL de H2O. Se inicia la reacción con el agregado de 30 µL (el
primer pocillo con H2O; los restantes pocillos con cada uno de los distintos eluídos de la
columna a analizar en forma secuencial), agitando mediante pequeños golpes laterales en la
placa para la mezcla adecuada de los reactantes. Al término de 4 min se finaliza la reacción
con 50 µL, también en forma secuencial, de NaOH 500 mM y se visualiza en qué fracción
hay más actividad fosfatasa.
Se medirá el volumen de la misma (Etapa III de la tabla de purificación) y se separará 1
mL para medición posterior de actividad enzimática, determinación de concentración de
proteínas y electroforesis en gel de poliacrilamida.
Estimación dee la concentración de proteínas de las fracciones obtenidas en la Etapa
III:
Se determinará la concentración de proteínas mediante la medida de la absorbancia de
las muestras a 280 nm. Emplear una cubeta de cuarzo o de plástico transparente al UV.
SEGUNDA SESIÓN
Determinación de actividad enzimática de etapas I, II y III.
Se determinará la actividad enzimática por el método continuo empleando el mismo
sustrato (p-nitrofenil-fosfato, pNPP) que para el método discontinuo. Se realizará
espectrofotométricamente a 405 nm en cubeta con un volumen final de 1000 µL utilizando
como buffer citrato 100 mM pH=6,5 a 30 ºC. El coeficiente de extinción del p-nitrofenol a
pH=6,5 (pH de trabajo) es 4400 M-1cm-1. La concentración de sustrato es saturante (45 mM)
para asegurar la velocidad máxima en la determinación. La reacción se iniciará con el
agregado de la solución que contiene la enzima.
Las cubetas se preparan de la siguiente manera:
pNPP 90 mM (en citrato 200 mM pH 6,5)
H2O + muestra
500 µL
500 µL
El volumen sugerido para las muestras es de 60 µL
Se determinará la ΔA/min en condiciones de linealidad
Nota: por reacción no enzimática el sustrato pNPP (en citrato 200 mM pH 6,5) genera
p-nitrofenol al mezclarlo con agua. La absorción a 405 nm se estabiliza
aproximadamente a los 10 min. Por ello se recomienda preparar la mezcla de medida
con 10 min de antelación a la medición de actividad con el agregado de la muestra)
Cuantificación de proteínas de las muestras correspondientes a las Etapas I, II y III.
Se utilizará el método de Bradford (ver fundamento al final). Se emplearán 0,5 mL de
muestra más H2O y se agregarán 0,5 mL de reactivo de Coomassie. Se leerá absorbancia a
595 nm. (Se recomienda realizar la lectura de absorbancia dentro de los 30 minutos de
agregado el reactivo, ya que después de este período el complejo proteína-colorante
aumenta de tamaño y precipita.)
Se realizará una curva de calibración usando una solución testigo de albúmina 0,3 mg/ml.
La cantidad de proteína a emplear en este ensayo debe estar en el rango de sensibilidad del
método (3 a 12 μg). Se recomienda hacer el blanco por duplicado y emplear 5 volúmenes
distintos de testigo.
El protocolo se muestra en forma incompleta en el siguiente cuadro:
B
1
2
3
4
5
EC
a
EC
b
PEG PEG
a
b
Eluido Eluido
a
b
Testigo (µg)
0
--
--
--
--
--
--
Testigo (µL)
0
--
--
--
--
--
--
Muestra (µL)
--
500
500
500
500
500
500
H2O (µL)
500
Rvo color (µL)
500
--
--
500 500
--
--
--
500
500
500
Abs 595 nm
Abs - blanco
Se sugiere utilizar 20 y 50 µL de una dilución 1/30 de las etapas I y II y los mismos
volúmenes de una dilución 1/10 de la etapa III. Si las absorbancias así obtenidas no se
encuentran en el rango de linealidad de la curva de calibración de deberá repetir con la
determinación con otros volúmenes y/o diluciones.
Realización de espectros de absorción de pnitrofenol y proteínas.
Determinación de espectros
a) Espectro de absorción del pnitrofenol
Las enzimas fosfatasas ácidas tienen un pH óptimo de alrededor de 5,0. A ese pH no se
podría realizar una medida de actividad enzimática con aparición de pnitrofenol pues se
vería la interferencia del pnitrofenil fosfato (ver gráfico). Por esto es que se hacen las
medidas a pH 6,5. No se ve la actividad máxima de la enzima (no es su pH óptimo), pero
se puede detectar casi sin interferencias la aparición de pnitrofenol a 405 nm.
Se realizará el espectro de absorción del pnitrofenol a 3 pHs distintos: 2,3; 6,5 y 9,2,
utilizando distintos buffers: acetato, citrato y dietanolamina, respectivamente.
b) A continuación se realizarán espectros de absorción de distintas proteínas y se
discutirá la utilidad de las medidas de absorción a 220 nm y 280 nm como métodos
para la determinación de la concentración de las mismas. (ver fundamento al final del
cuadernillo)
Se hará entre las longitudes de onda 200 y 500 nm, con un máximo de absorción de 3,0 y
un intervalo de lecturas entre 2 y 5 nm.
TERCERA SESIÓN
Determinación de Km, V máx y Ki
Determinación de Km y V máx (Efecto de la concentración de sustrato sobre la
actividad enzimática)
Se utilizará la fracción eluída de la columna con mayor actividad fosfatasa ácida para las
medidas cinéticas.
El sustrato pNPP 50 mM se preparará en solución acuosa como se indicara
anteriormente. Previo al inicio de las medidas cinéticas se deberá observar linealidad con la
menor concentración de sustrato programado (en este caso 0,5 mM) durante 3 min de
reacción y con 250 μL de eluído. (Ver problema Nº 7 de la guía de problemas de
enzimología). Si no se observa linealidad disminuir el volumen de solución conteniendo la
enzima.
Se determinará el ΔA/min inicial de la reacción por el método continuo para distintas
concentraciones de sustrato. Las concentraciones de sustrato a emplear son 0,5; 1; 2; 4; 6 y
10 mM y el volumen final de reacción será de 1 mL. Se iniciará la reacción con el agregado
de eluído. El protocolo de trabajo se indica en forma incompleta en el siguiente cuadro:
[pNPP] cubeta
citrato 200 mM (μL)
pNPP 50 mM (μL)
H2O (μL)
Eluido (μL)
0,5 mM
500
1 mM
2 mM
4 mM
6 mM
10 mM
250
Determinación de Ki (Efecto del inhibidor sobre la actividad enzimática)
Se evaluará al fosfato (Pi) como inhibidor. Se trabajará con concentraciones de fosfato
0,5; 1,0 y 2,0 mM. Para ello, sobre las mismas cubetas con concentraciones de sustrato
4, 6 y 10 mM empleadas en el punto anterior se harán agregados sucesivos de fosfato 50
mM (10 µL, 10 µL y 20 µL). Se determinarán las pendientes luego de cada agregado. Se
determinarán los ΔA/min luego de cada agregado y se registrarán en la siguiente tabla:
0,5
1
[pNPP] mM
2
4
6
10
0
[Pi]
mM
0,5
(+10µL Pi 50 mM)
1,0
(+10µL Pi 50 mM)
2,0
(+20µL Pi 50 mM)
Determinar gráficamente Km y Vmáx, qué tipo de inhibidor es el fosfato y cuál es su Ki.
Electroforesis en geles de acrilamida: evaluación de los pasos de purificación y
determinación de la masa molecular.
Electroforesis en condiciones desnaturalizantes en geles de poliacrilamida
Se emplearán geles con una concentración de poliacrilamida del 10%. Se sembrarán
20µL de cada muestra junto con marcadores de peso molecular conocido.
Se mostrarán geles previamente preparados por los docentes. La muestra de proteínas a
sembrar previamente debe hervirse 3 min en presencia de “sample buffer” (5X). Se
siembran 20 µL de muestra y 20 µL de marcadores de masa molecular (MM). Se corre
durante una hora a 40 mA. Se extrae el gel de corrida y se tiñe con azul de Coomassie (1
hora) y se decolora.
Se observarán las distintas bandas de proteínas y se determinará la MM de la fosfatasa
ácida purificada.
PRESENTACIÓN DEL INFORME
En el informe se deberá presentar:
• Un perfil de la columna de Q-Sepharosa en el cual se graficará la actividad enzimática,
cualitativamente y la concentración de proteínas, versus el volumen de elución.
• Una tabla de purificación con los siguientes items: volumen, actividad (U/mL),
concentración de proteína (mg/mL), cantidad total de proteína (mg), U totales,
actividad específica (U/mg), rendimiento (parcial y total) y purificación (parcial y total).
• v =f(s) para comprobar cinética hiperbólica.
• 1/v= f(1/s) para cálculo de Km y Vmáx.
• 1/v= f(I) para determinación de Ki.
• Masa molecular aproximada de la enzima purificada utilizando un método gráfico
conocido.
INFORMACIÓN ADICIONAL
• EDTA: es un quelante que secuestra metales pesados que potencialmente podrían inhibir
la actividad enzimática.
• PMSF: es un inhibidor de proteasas. Se incluye en el medio de extracción porque durante
la homogeneización se liberan proteasas endógenas que pueden afectar la
estructura molecular de la enzima en estudio, y consecuentemente, la medida de su
actividad.
• β-mercaptoetanol: es un reductor de grupos disulfuro, necesario para preservar la
actividad de la enzima frente a oxidantes naturales que se liberan durante el proceso
de homogeneización.
• Polietilenglicoles: son polímeros no iónicos de óxido de etileno cuyo tamaño varía de
200 a 20000 Da. Son muy solubles en agua debido a la formación de múltiples
enlaces de hidrógeno.
La estructura química es la siguiente:
HO-CH 2 -(CH 2 -O-CH 2 -) n -CH 2 -OH
Estos polímeros en solución atraen moléculas de agua de la capa de solvatación
alrededor de la proteína. Esto aumenta las interacciones proteína-proteína y
favorece la precipitación de las mismas. El proceso es independiente del pH y de la
fuerza iónica. Sólo depende de la concentración del polímero y las dimensiones de la
macromolécula.
Son menos propensos a desnaturalizar los biomateriales de precipitación que los
iónicos.
Además, los PEG son los preferidos para la precipitación de proteínas, porque la
viscosidad de las soluciones concentradas es más baja que la hallada en otros
polímeros no iónicos (dextranos, polivinilpirrolidona y polipropilenglicoles) y la
formación de los precipitados toma mucho menos tiempo que con sulfato de amonio
o etanol.
Una desventaja de PEG es la dificultad de la eliminación cuando se usa a altas
concentraciones.
- Cálculo de volumen de PEG 50 % a utilizar.
Se tiene en cuenta la siguiente fórmula:
Ci . Vi = Cf . Vf, reemplazando
50% . Vx = 20 % (Vext crudo + Vx)
Se despeja de la ecuación Vx y es ése el volumen de PEG 50 % que se tiene que
agregar al Vext crudo para que la concentración final sea de PEG 20 %.
• Q-Sepharose®: es una matriz empleada para preparar columnas de intercambio
aniónico. Sepharose es un nombre comercial de un reticulado, material polímero
polisacárido extraído de algas marinas al que se incorpora químicamente una amina
cuaternaria. La estructura química de la amina cuaternaria es la siguiente:
Reticulado−Ο−CH2CHOHCH2OCH2CHOHCH2N+(CH3)3
Regeneración: el lavado de la columna con una solución salina de alta fuerza iónica
(por ejemplo NaCl 1 M) o con los pHs extremos tolerables es suficiente para remover
todo el material reversiblemente unido.
Los lípidos y proteínas precipitados pueden eliminarse lavando con NaCl 1-2 M (un
volumen de columna (VC)), seguido de 1 VC de NaOH 0,1 M en NaCl 0,5 M y
enjuague con varios VC de agua. Luego se reequilibra la columna con el buffer de
columna y el pH adecuados.
• Método de Bradford
Se basa en que el colorante azul brillante de Coomassie sufre un cambio en
absorbancia a 595 nm cuando se une a proteínas.
Las ventajas de esta técnica con respecto a otras que también dosan proteínas son:
rapidez y simplicidad, ya que requiere un solo reactivo y el desarrollo de color es
inmediato, estabilidad de la absorbancia del complejo proteína colorante y presencia
de pocas interferencias.
Sensibilidad del método 3 a 12 µg de proteína.
Entre las desventajas se encuentra que diferentes proteínas producen distintas
intensidades de color.
• Electroforesis en geles de acrilamida
La acrilamida en presencia de radicales libres, aportados por persulfato de amonio y
estabilizados por TEMED, inicia una reacción en cadena en la que monómeros de
acrilamida son polimerizados en largas cadenas. Cuando se incluye bisacrilamida las
cadenas se entrecruzan para formar un gel, cuya porosidad es determinada por el largo
de las cadenas y el grado de entrecruzamiento.
Esta mezcla se vuelca entre dos vidrios separados por espaciadores y sellados con
agar. Así se evita la exposición al aire, ya que el oxígeno inhibe la polimerización,
quedando sólo la capa superior, la cual se cubre con isobutanol o agua.
Estos geles se usan para separar proteínas y ácidos nucleicos que tengan entre 5 y 500
pares de bases.
En primer lugar se prepara la parte inferior del gel llamada gel de separación. Una vez
gelificado se prepara la parte superior, más laxa, en la que se coloca un peine que
determina las distintas calles, llamada gel de concentración, en el que se concentra la
muestra, lo que permite sembrar cantidades mayores de muestra que en agarosa. La
muestra se prepara en “sample buffer” que contiene azul de bromofenol para seguir la
corrida y SDS y betamercaptoetanol para desnaturalizar las proteínas.
• Espectros de absorción de proteínas
Ninguno de los 20 aminoácidos hallados en las proteínas absorbe luz en la zona del
espectro visible. Las proteínas simples tampoco absorben en el visible, pero hay
proteínas conjugadas (con grupos prostéticos) que absorben porque lo hace el grupo
prostético.
Todos los aminoácidos y proteínas absorben en la región del ultravioleta lejano (180-220
nm), debido a la absorción del enlace peptídico.
Los aminoácidos aromáticos – triptofano, tirosina y fenilalanina- absorben luz en el
ultravioleta cercano, con un máximo en las longitudes de onda 278-280 nm. Dado que
las proteínas contienen restos de estos aminoácidos, las medidas de absorbancia a 280
nm constituyen un método rápido para la determinación del contenido de proteínas de
una solución.