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Inmunofisiología
Tema 5: Organización y expresión de los genes de las
inmunoglobulinas y del TcR
Organización y expresión de los genes que codifican el BcR y las Igs.
Organización de los múltiples genes que codifican las cadenas livianas y
cadenas pesadas de las inmunoglobulinas
Secuencia y mecanismo de reordenamiento de los genes de las regiones
variables de las inmunoglobulinas.
Mecanismos responsables de la diversidad de las inmunoglobulinas.
Modificación de las regiones V: hipermutaciones somáticas
Cambio de clase (Class switching) de los genes de las regiones constantes.
Expresión del BcR y de las diferentes clases de Igs.
Organización y expresión de los genes que codifican el TcR
Organización de los múltiples genes que codifican el TcR
Secuencia y mecanismo de reordenamiento de los genes de las regiones
variables del TcR
Mecanismos responsables de la diversidad del TcR.
¿Cómo puede explicar genéticamente la naturaleza bifuncional
de la molécula de anticuerpo?
~1960
• Repertorio de Ac de un individuo ≈ 1x1011
• Análisis de secuenciación de Ig mostró:
– Cada molécula de Ac tiene una única
secuencia en la región variable y una
secuencia invariante de un número limitado
de regiones constantes
Teoría de línea germinal
“El repertorio de Ac es heredado”
En el genoma de la célula se encuentra
codificado todo el repertorio de genes
de las inmunoglobulinas
1 x 10 11 genes (especificidades de Ac)
Representa el 15% del genoma
Teoría de variación somática
“El repertorio de Ac es generado”
En el genoma de las células somáticas se
encuentra codificados unos pocos genes
de inmunoglobulinas, a partir de los cuales
se generan todas las especificidades de
anticuerpos mediante un mecanismo de
recombinación genética y mutaciones
¿Cómo puede explicar genéticamente la naturaleza bifuncional
de la molécula de anticuerpo?
Ninguno de los proponentes de estas teorías puede explicar ciertas
características de la estructura molecular de las inmunoglobulinas
1. ¿Cómo se mantiene la estabilidad en un extremo de la molécula del Ac,
mientras que algún tipo de mecanismo de diversificación genera la región
variable?
2. La existencia de isotipos de Ig asociados a la misma secuencias variable
¿Cómo explicar que una región variable con una especificidad particular
está asociada con diferentes isotipos?
3.
Un mecanismo genético que explique el aumento de la afinidad de los
anticuerpos hacia el antígeno durante la respuesta inmune
¿Cómo puede explicar genéticamente la naturaleza bifuncional
de la molécula de anticuerpo?
Modelo de Dreyer and Bennett (1965)
Postulan un modelo genético teórico consistente con los datos
conocidos de la estructura molecular de las inmunoglobulinas
•
Tanto la cadena pesada como la cadena ligera de las
inmunoglobulina están codificadas por al menos dos genes.
•
En el genoma hay miles de genes variables (V) y un solo tipo de
gen constante (C) para un isotipo dado.
•
Los dos genes se unen (en la fase de ADN o de ARN) para
formar un mensaje continuo que puede ser transcrito y
traducido en la cadena pesada o la cadena liviana
Esta propuesta violaba dos paradigmas aceptados en ese momento
– Un gen codifica una cadena de polipéptido
– Constancia del genoma durante la ontogenia y diferenciación celular
Verificación de la hipótesis de Dreyer y Bennet
Verificación de la hipótesis de Dreyer y Bennet
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V C
V
En la configuración germinal el
gen C se encuentra separado
de múltiples genes V
C
Reordenamiento de genes V y C
V
Objetivo: mostrar los múltiples genes V y cómo ocurre el
reordenamiento con el gen C
Tomado de “The Molecular Genetics of Immunoglobulins, ©Dr. Colin R.A. Hewitt”
Verificación de la hipótesis de Dreyer y Bennet
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V C
ADN germinal
V
C
ADN Reordenado
V
Herramientas:
• ADN en línea germinal (células embrionarias) y ADN reordenado (células B mieloma)
• Enzimas de restricción del ADN
• Dos sondas de 32P-mRNA cadena λ de mieloma : 1) mARN (V+C) y 2) mARN (C)
Tomado de “The Molecular Genetics of Immunoglobulins, ©Dr. Colin R.A. Hewitt”
Este ejemplo describe
los eventos en UNO
de los cromosomas
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
CC
V
V
Corte de ADN en
línea germinal con
enzimas de
restricción
V
V
V
V
V
V
Fraccionamiento
por
electroforesis en
gel
V
V
C
Se generan fragmentos
de diferentes tamaños
V
V
Blot con una
sonda de la
región V
Blot con una
sonda de la
región C
V
C
V
V
V
V
V
V
Tomado de “The Molecular Genetics of Immunoglobulins, ©Dr. Colin R.A. Hewitt”
Evidencias de la recombinación de genes
V
V CC
V
V
V
V
V
Fraccionamiento
por electroforesis
en gel
Blot con sonda
de región V
V
V
V
V
V
V
V
Corte del ADN de
células B de mieloma
con enzimas de
restricción
Blot con sonda
de región C
V C
V C
Fraccionamiento
por electroforesis
en gel
V
V
Blot con sonda
de región V
Blot sonda de
región C
V
C
V
V
V
V
V
V
V
Bandas de la hidrólisis del ADN de linfocitos B
• Las sondas de V y C detectan el mismo fragmento
• Algunas regiones de V están ausentes
• El fragmento C es mas grande en la cf germinal
V
V
V
Bandas de la hidrólisis del
ADN en línea germinal
Tomado de “The Molecular Genetics of Immunoglobulins, ©Dr. Colin R.A. Hewitt”
Generación de la diversidad de las inmunoglobulinas
Interpretación de los resultados de los experimentos de
Tonegawa S. y Hozumi N. (1976)
-En el embrión los segmentos génicos V y C se encuentran separados por un
segmento de ADN, el cual contiene un sitio de restricción para la enzima de
restricción utilizada en el experimento
-Los segmentos génicos V y C sufren un reordenamiento durante la
diferenciación de los linfocitos (del estado embrionario al estado
completamente diferenciado del plasmocito) por un mecanismo genético
denominado RECOMBINACIÓN SOMÁTICA
- Durante la diferenciación de los linfocitos B, los segmentos génicos V y C
quedan adyacentes y el segmento que se encontraba entre ellos es eliminado
Los resultados de la secuenciación de los genes de las
Ig complica el modelo
Las estructuras de los genes VL de la línea germinal eran similares
para Vκ, y Vλ,
Sin embargo, había una anomalía entre los genes de la línea
germinal y el ADN reorganizado en el mieloma:
VL
CL
~ 95aa
~ 100aa
L
L
V L CL
~ 208aa
¿Donde están codificados los 13
aminoácidos extras?
L
VL JL
~ 95aa
CL
~ 100aa
Los aminoácidos extras
están codificados por un
pequeño segmento
denominado J o región de
UNIÓN (JOINING
regions)
Tomado de “The Molecular Genetics of Immunoglobulins, ©Dr. Colin R.A. Hewitt”
Mayor diversidad en la cadena pesada de las Ig
L
VH JH DH
CH
Cadena pesada: entre 0 y 8 aminoácidos adicionales entre JH y CH
La región D o de DIVERSIDAD
Cada cadena pesada requiere tres eventos de recombinación:
VH con JH, VHJH con DH y VHJHDH con CH
L
VL JL
CL
Cada cadena liviana requiere dos eventos de recombinación:
VL con JL y VLJL con CL
Tomado de “The Molecular Genetics of Immunoglobulins, ©Dr. Colin R.A. Hewitt”
Los genes que codifican las inmunoglobulinas y los
receptores de Ag específicos (mIg y TcR) se
reordenan en las células productoras de anticuerpos
•
En todas las células del cuerpo a excepción de los linfocitos
maduros los genes que codifican las inmunoglobulinas y los
TcR están constituidos por varios tipos de segmentos
génicos, los cuales se encuentran en un orden denominado
configuración lineal
•
Durante el desarrollo y maduración de las células B y T, los
segmentos génicos que codifican la región variable del
receptor específico se reordenan al azar para producir un
gen funcional del BcR, TcR o Ig secretada
Diversidad: múltiple familia de genes codifican
las inmunoglobulinas
El dominio variable de las cadenas livianas está codificado por dos
segmentos génicos: segmentos génico V y segmento génico J
El dominio variable de las cadenas pesadas está codificado por tres
segmentos génicos: segmento génico V, segmento génico D y segmento
génico J
La región constante de la cadena pesada está codificado por un
segmento génico C que puede ser de varios tipos (9 genes C)
Organización de los genes de las inmunoglobulinas en el
genoma humano (ADN de línea germinal)
Las cadenas de inmunoglobulinas se codifican en tres loci separados
1. Locus de la Cadena ligera λ en el cromosoma 22
2. Locus de la Cadena ligera κ en el cromosoma 2
3. Locus de la Cadena pesada en el cromosoma 14
Organización de los genes de las inmunoglobulinas en el
genoma humano (ADN de línea germinal)
•
La organización germinal de los loci de las inmunoglobulinas está
presente en todas las células del cuerpo.
•
Los genes de la línea germinal no pueden transcribirse a un mRNA
capaz de generar proteínas.
•
Los genes de las inmunoglobulinas y TcR funcionales sólo se generan en
los linfocitos B y T en desarrollo, en los órganos linfoides primarios,
mediante reordenamiento del ADN que deja contiguos los segmentos V,
D y J – Mecanismo genético denominado Recombinación Somática -
Reordenamiento de genes de la cadena liviana
• El reordenamiento de los genes de la
cadena liviana requiere un evento de
recombinación dentro de la región
variable:
• La unión de VL y JL, mediante
recombinación somática, crea un exón
VJL continuo que codifica el dominio
variable (VL) de la cadena liviana.
• El segmento VJL está separado de CL
por un intrón.
• RNA polimerasa transcribe el transcripto
primario mARN desde el exon L hasta el
exon C
• En el procesamiento del transcripto
primario de RNA se elimina el intrón
entre VJ y C, quedando VJ contiguo a C
(VJC)
en el mRNA de genes de Ig de los linfocitos pre-B en médulaósea
Reordenamiento
Secuencia de reordenamiento genético de la región
variable de la cadena pesada de Igs
• El reordenamiento de la cadena pesada
requiere dos eventos de recombinación
separados dentro de la región variable:
• La unión de DH y JH crea el segmento DJH
• La unión de los segmentos DJH y VH crea
el segmento VDJH que codifica el dominio
variable (VH) de la cadena pesada.
ADN
Pre-mARN
• RNA polimerasa transcribe el transcripto
primario mARN desde el exon L hasta el exon
C
mARN
Splicing
• En el procesamiento del transcripto primario
de RNA se elimina el intrón entre VJ y C,
quedando VJ contiguo a C (VJC) en el mRNA
Cadena H
VDJ
Reordenamiento de genes de Ig de los linfocitos pre-B en médulaósea
Coexpresión de las IgM e IgD en la membrana
• En las células B maduras la transcripción iniciada en el promotor VH se
extiende a través de ambos exones Cμ y Cδ.
– Generación de un transcripto primario que contienelos exones Cμ y Cδ
• La poliadenilación diferencial y el procesamiento alternativo del ARN
transcripto primario (splicing) da lugar a la formación de mARN de IgM
y IgD.
Interrogantes
1. ¿Cómo los segmentos de genes V encuentran los segmentos de genes J
y porqué no se unen a los segmentos génicos C?
2. ¿Cómo ocurre el rompimiento y re-unión de los fragmentos de ADN?
3. ¿Cómo se genera la enorme diversidad de especificidades a partir de
una cantidad finita de ADN?
4. ¿Cómo puede un anticuerpo con la misma especificidad ser secretado
y ser también expresado sobre la superficie de la célula?
La recombinación somática del ADN depende de:
a) La presencia de regiones conservadas, contiguas a cada segmento
V, D y J, en el ADN germinal, las cuales guían el proceso de
recombinación
– Secuencia de señal de recombinación = RSS
L1 Vλ1
L2 Vλ2
L Vλ30
Jλ1 Cλ1
Jλ2 Cλ2
Jλ3 Cλ3
Jλ4 Cλ4
5’
3’
b) La existencia de enzimas recombinasas específicas (RAG1, RAG2)
que reconocen las secuencias RSS y clivan el ADN entre los RSS y
los segmentos génicos de las Ig. Estas enzimas sólo se expresan en
los linfocitos B y T en las etapas de desarrollo
- RAG1 y RAG2: recombination activating genes
Mecanismo de reordenamiento del ADN de la región
variable de las Igs
Las Secuencias de Señales de Recombinación (RSSs) específicas
del ADN están localizadas contiguas a los segmentos génicos V, D y
J de las Igs y del TcR
RSS
en el extremo 3’ de cada exón V
el extremo 5’ de cada segmento J y
a ambos lados de cada segmento D
Secuencias de señales de recombinación (RSSs)
• Secuencia de 7 nucleótidos – HEPTÁMEROS 9 nucleótidos – NONÁMEROS
muy conservados y
separados por 12 o 23 nucleótidos,
HEPTÁMERO
NONÁMERO
Vl
7
Vk
7
23
12
7
23
9
9
9
9
VH
9
12
9
7
D
12
23
7
12
9
7
Jl
7
Jk
9
23
7
JH
Secuencias de señales de recombinación (RSSs)
HEPTAMERO – Siempre contiguo
con la secuencia codificante
9
VH 7
23
√
VH
9
7
12
23
7
D 7
9
12
9
9
12
NONAMERO – Separado del
heptámero por espaciador de
9
12 o 23 nucleótidos
7
D
7 JH
23
7
12
9
√
9
23
7
JH
REGLA 12-23 – Un segmento génico flanqueado por un RSS de 23 pares
de bases sólo se une a un segmento génico flanqueado por RSS de 12 pb
Explicación molecular de la regla 12-23
12-pb = un giro
23-pb = dos giros
23
V7
ADN intermedio de
cualquier longitud
9
9
12
7D J
Explicación molecular de la regla de 12-23
V4
V1
V8
V9
V3
V2
V7
V6
V3
V4
V2
V5
9
V7
V8
9
V9
23-pb
V1
7
12-pb
7
• La forma generada por los
RSS actúa como blanco de
las recombinasas
V6
El asa de
ADN
intermedio
se elimina
DJ
• Los heptámeros y
nanómeros se alinean
V5
DJ
• Una forma apropiada no se genera si dos segmentos génicos con RSS de 23
nucleótidos intentan unirse (viola la regla 12-23)
Enzimas que participan en la recombinación de los
segmentos de genes V(D)J
• Proteínas RAG1-RAG2 : recombinasa VDJ
– Reconocen y alinean las secuencias RSSs adyacentes a los
segmentos de genes V, D y J. RAG1 reconoce el nanómero
– Forman un complejo dimérico con actividad de endonucleasa que
corta el ADN
– Sólo se expresan en los linfocitos B y T durante el proceso de
reordenamiento de sus genes (pre-B-linfocito, B inmaduro)
• Enzimas que reparan el ADN
–
–
–
–
–
–
ADN ligasa IV
proteínas quinasas (DNA-PK: DNA dependent protein kinase)
Ku 70
Artemisa
endonucleasas
deoxinucleotil Transferasa terminal (Tdt)
Mecanismo de reordenamiento del ADN de la
región variable
Los complejos RAG1 y RAG2 se asocia a los RSSs
Los complejos RAG1 y RAG2 se unen entre sí,
colocando juntos los segmentos que se unirán
El ADN es clivado y se crea una estructura de
horquilla en los extremos de los segmentos de genes
de Ig
Otras enzimas se unen a la horquilla y corta los
extremos RSSs al azar
La enzima deoxinucleotil Transferasa terminal (Tdt)
adiciona nucleótidos y una exonucleasa elimina
nucleótidos generando unión imprecisa
ADN ligasa une los segmentos de los genes (unión
codificadora) y los RSSs ( señal de unión)
Mecanismo de reordenamiento del ADN de la
región variable de las Igs
• La recombinación puede ocurrir por un
proceso de deleción o de inversión de los
fragmentos de ADN
Recombinación de los genes V y J
de la cadena ligera
• Las enzimas RAG1 y RAG se asocian al azar
sobre los RSSs de los segmentos de genes
que se recombinarán.
• Yuxtaposición de los RSSs de un segmento
de gen variable V y de un segmento de gen
de unión J estableciendo “la regla 12-23
• Deleción: la recombinación de los exones V y
J ocurre por deleción de un bucle de ADN
intercalado y ligazón de los segmentos V y J.
•
Inserción: la recombinación ocurre por
reinserción del ADN intercalado en
orientación invertida, seguida de ligazón de
los segmentos V y J
Deleción
Inserción
Imprecisión de unión genera diversidad de ligación
Durante la unión de los segmentos (V, D, J) se producen cambios o
intercalación de codones debido a:
a) La flexibilidad en el corte de la horquilla terminal, el cual genera
nucleótidos denominados Palindrómicos (P).
b) La acción de la enzima TdT (deoxinucleotidil transferasa terminal) que
incorpora nucleotidos (N) en el extremo 3’.
Imprecisión de unión genera diversidad de ligación
V
TCGACGTTATAT
AGCTGCAATATA D
J
TTTTT Nucleótidos codificados en la línea germinal
TTTTT Nucleótidos palindrómicos (P) – no en línea germinal
TTTTT Nucleótidos incorporados (N) - no en línea germinal
Se crea una secuencia al azar entre los sitios de unión de los
segmentos V y J de la cadena liviana y entre los segmentos V, D y
J de las cadenas pesadas.
La diversidad combinatoria y de unión concentran la
diversificación en el CDR3
CDR1
N
CDR2
CDR3
Dominio variable
N
CDR1
CDR2
CDR3
Dominio constante
Ig, cadena liviana
V
mRNA
J
El dominio variable de las cadenas L está
codificado por dos tipos de segmentos de genes:
-Segmento del gen variable (Vκ o Vλ): codifica los
CDR1, CDR2, tres regiones FR y parte del CDR3 del
dominio variable L (κ o λ)
- Segmento de gen de la unión (Jκ o Jλ): codifica
unos residuos del CDR3 y el cuarto FR del dominio
variable
La diversidad combinatoria y de ligación concentran
la diversificación en el CDR3
El dominio variable de las cadenas H está codificado por tres tipos
de segmentos de genes:
- Segmento de gen variable (VH): codifica los CDR1, CDR2 y tres
regiones FR y unos residuos del CDR3 del dominio variable
- Segmento de gen de diversidad (D): codifica la mayor parte de los
residuos del CDR3 y unos residuos del cuatro FR del dominio
variable
- Segmento de gen de la unión (JH): codifica el cuarto FR del dominio
variable
V3
D9 J4
Exclusión alélica
• El reordenamiento de los genes
de la cadena pesada y de la
cadena liviana ocurre sólo en un
cromosoma
• Cada célula B (T) produce un solo
tipo de cadena pesada y de
cadena liviana. Sólo se reordenan
los genes de un solo cromosoma
El proceso asegura que solo se
exprese un alelo de la cadena
pesada y un alelo de la cadena
liviana
Una vez que el reordenamiento
productivo ha ocurrido la
maquinaria de recombinación deja
de operar (los genes RAG1 y RAG2
no son transcriptos)
Secuencia del reordenamiento y expresión de los
genes de las inmunoglobulinas
• La unión imprecisa de los segmentos génicos V.D-J ayuda a la generación
de la diversidad en el sitio de enlace de la Ig, pero impone una limitación
• La unión imprecisa (flexibilidad de unión) puede generar:
• Un gen funcional que se transcribe → Reordenamiento productivo
• No genera un gen funcional
→ Reordenamiento no productivo
• La mayoría de los reordenamientos de los genes en los linfocitos pre
B y pre T son no productivos
Reordenamiento productivo y no productivo
En el sitio de unión de un
segmento génico Vκ con uno Jκ se
introducen nuevos nucleótidos
por la enzima dTt, de tal forma
que el marco de lectura del
triplete en el RNA puede estar
en fase y hay traducción del RNA
a proteína (reordenamiento
productivo) o puede perderse el
marco de lectura (codón stop) y
por lo tanto no hay traducción del
RNA a proteína (reordenamiento
no productivo)
El orden de reordenamiento de los genes de las Ig
Genes de Ig de cadena
H de la línea germinal
Rearreglo de un
alelo
Productivo
No
productivo
Rearreglo del segundo alelo
Productivo
•Inhibición del rearreglo
del segundo alelo
•Estímulo para el
rearreglo de la cadena
kapa
Estímulo para el
rearreglo de la
cadena kapa
No
productivo
Muerte
celular
Secuencia del reordenamiento y expresión de los genes de
las Ig
El proceso de recombinación somática es central
al funcionamiento del sistema inmune adaptativo
La transcripción de genes de Ig sólo ocurre en células B
GENERACIÓN DE DIVERSIDAD : Repertorio básico de
inmunoglobulinas y receptores T.
SELECCIÓN CLONAL : Producción de linfocitos monoespecíficos.
REGULACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN : Aproxima secuencias
reguladoras (promotor/enhancer) promoviendo la transcripción.
DNA germinal 5’
DNA
rearreglado.
mRNA
P
5’
P
V1
P
V1
P
Vn
P
E
Vn
Vn
E
V40
C
C
E
C
E
Factores de
transcripción
Mecanismos responsables de la generación de la
diversidad del repertorio de anticuerpos
Gran parte de la diversidad de las Igs
proviene de la recombinación de distintas
copias de los segmentos génicos V, D, y J
1. Múltiples segmentos de genes
J
V3
2. Posibles uniones combinatorias
D9 J4
3. Posibles asociaciones combinatorias
λ : 30V x 4J = 120
Combinación λ o κ con H:
κ : 40V x 5J = 200
(120 + 200) x 6000 ≈ 1.9 x 106
H : 40V x 25D x 6 J= 6000
162 segm. ⇒ 1.9 x 106 paratopes
Mecanismos responsables de la generación del
repertorio de anticuerpos
4. Unión de los segmentos de genes es imprecisa (flexibilidad en unión)
En el sitio de unión de V-J y V-D, la enzima Tdt adiciona hasta 15
nucleótidos, de manera aleatoria, generando pequeñas secuencias
llamadas regiones – N y P
Secuencias adicionadas generan diferentes secuencias de amino
ácidos en el sitio que codifica las uniones
- codifica CDR3 de las inmunoglobulinas
Se estima que la flexibilidad en la unión puede alcanzar ~3x107
11
Se estima que la diversidad total ~ 1 x 10
Ac diferentes
Mecanismos responsables de la generación del
repertorio de anticuerpos
5.
Hipermutaciones somáticas en los exones V
En las células B activadas, que han respondido ante un antígeno con la
colaboración de linfocitos T, ocurre un proceso denominado
HIPERMUTACIONES SOMÁTICAS
Las hipermutaciones somáticas son mutaciones puntuales en el ADN
de los genes reordenados de las regiones V de las cadenas pesadas y
ligeras de los linfocitos B activados.
La tasa de hipermutación somática en los loci de inmunoglobulinas es
muy alta : 1 x 103 mutaciones / par de bases
Las hipermutaciones somáticas son responsables de la maduración de
la afinidad de los anticuerpos
Concentración de Ig
En el curso de la respuesta inmune aumenta la afinidad de los
anticuerpos hacia el antígeno y ocurre el cambio de isotipo de
inmunoglobulinas
Predomina IgG>IgA
Alta afinidad
Señales de linfocitos T activado
Predomina IgM
(interacción CD40~CD40L y secreción
de citocinas)
Baja afinidad
1er dosis
2nda dosis
Curso de la respuesta
La hipermutación somática es un elemento adicional
de generación diversidad
Recombinación
somática
(médula ósea)
Hipermutación
somática (opera en
órganos linfoides
secundarios)
En el humano y ratón las hipermutaciones somáticas ocurren sólo cuando los
linfocitos B responden a un antígeno y reciben otras señales procedentes
de los linfocitos T (interacción CD40~CD40L y secreción de citocinas)
Los genes de las regiones constantes y otros genes expresados en las
células B no son afectados, mientras que los genes reordenados de las
regiones variables (VL y VH) si son mutados.
Las hipermutación somática introducen variaciones en la
región variable reordenada de las inmunoglobulinas
Seguimiento del proceso de hipermutaciones somáticas secuenciando las
regiones variables de las inmunoglobulinas producidas por los linfocitos B, en
diferentes momentos luego de la inmunización.
Mutaciones en un clon de linfocitos B: mutación neutra (rosada); mutación
silente (amarilla); mutación deleteria (roja); mutación positivas (azul)
Las hipermutaciones somáticas
generan diversidad en los genes
DESPUÉS de la maduración y encuentro
con el antígeno.
Las mutaciones ocurren en las regiones
variables y la mayoría se encuentran
localizadas en los CDRs
Las mutaciones que resultan en la mayor
afinidad del anticuerpo por el antígeno
son preferentemente seleccionadas
= maduración de la afinidad.
Hapteno: 2-fenil-5 oxazolone
RESUMEN: Formas en que se genera la diversidad en
el dominio variable de las Inmunoglobulinas.
-Diversidad de la línea germinal
-Recombinación somática
Diversidad combinatoria (rearreglo V,D,J)
Diversidad de ligación
Combinación de cadenas livianas y pesadas
Diversidad potencial = 109-1011
-Hipermutación somática
Receptor T: Mecanismos similares operan en el caso del
TCR, con excepción de la hipermutación somática que no
existe.
Genes de la región constante de la cadena pesada de
las Igs
Los genes constantes CH (200Kb) de las Ig se encuentran aguas abajo del
segmento de genes JH , ordenados linealmente:
Humano: Cμ, Cδ, Cγ3, Cγ1, y Cε (pseudo-gen), Cα1, Cγ2, Cγ4, Cε y Cα2
L1 VH1 L2 VH2
J H 1-6
L VH40
5’
3’
Cμ Cδ
Cγ3
Cγ1
ψCε
Cα1
Cγ2
5’
Cγ4
Cε
Cα2
3’
Ratón: Cμ, Cδ, Cγ3, Cγ1, Cγ2b, Cγ2a, Cε y Cα
IgM e IgD son las primeras inmunoglobulinas
expresadas sobre los linfocitos
• Las células maduras vírgenes B reordenan sus genes de la región
variable (especificidad única) y co-expresan en su superficie IgM e
IgD, ambos con la misma especificidad (el gen reordenado VDJ)
• Después de la estimulación antigénica, las células B secretan IgM en
una respuesta primaria
L1 VH1 L2 VH2
J H 1-6
L VH40
5’
3’
Cμ Cδ
5’
Cγ3
Cγ1
ψCε
Cα1
Cγ2
Cγ4
Cε
Cα2
3’
Coexpresión de las IgM de membrana y secretada
• El procesamiento alternativo del ARN transcripto primario (splicing) da
lugar a la formación de IgM membranal o secretada
Cambio de clase de inmunoglobulinas = Cambio de isotipo
DESPUÉS de la estimulación antigénica, las células B pueden sufrir un
proceso de cambio de clase o de cambio de isotipo (cadena pesada)
dando lugar a la producción de otros isotipos IgG, IgA o IgE, con la
misma especificidad antigénica.
El cambio de isotipo permite la secreción de distintos isotipos de
Ig a medida que transcurre la respuesta inmune.
Luego del cambio de isotipo, la célula B expresa la misma cadena
liviana y una cadena pesada modificada la cual contiene la misma
región variable pero una nueva región constante.
¿ Como producen los linfocitos B distintas clases de
inmunoglobulinas ?
VDJ
Cμ
Cδ
Cγ3
Cγ1
Cα1
Cγ2
Cγ4
Cε
Cα2
Cambio de clase (isotipo) de cadena pesada
• Genes de la región constante de la cadena pesada (H) del ratón:
Cμ, Cδ, Cγ3, Cγ1, Cγ2b, Cγ2a, Cε y Cα
• Cada exon constante (excepto Cδ) está precedido por un intrón, el cual
contiene una secuencia que señaliza los sitios de recombinación
– Secuencia Switch /Cambio de Isotipo: Sμ, Sγ3, Sγ1, Sγ2, Sε, Sα1, Sα2
• Secuencia Switch: 150 repeticiones de la secuencia (GACT)n(GGGGGT)
• El segmento VDL reordenado se recombina con uno de los genes C,
eliminándose (deleción) el ADN intercalado mediante la acción de
enzimas recombinasas (diferentes a RAG1/2).
• Recombinación del ADN es irreversible
Cambio de clase (isotipo) de cadena pesada
Mecanismo de cambio de isotipo.
El cambio de isotipo ocurre cuando la célula B recibe la señal
apropiada del antígeno y de las citocinas
Cambio de clase (isotipo) de cadena pesada
El cambio de clase de isotipo está inducido por LPS y por
citocinas
Citocina
Cambio de isotipo
IL-4
Cμ ⇒ Cγ1 o Cε
IFNγ
Cμ ⇒ Cγ2 o Cγ3
TGF-β
Cμ ⇒ Cα
Receptor de Células T (TcR)
• Tipos de TcR: TcR αβ y TcR γδ
• El TcR α β (cadenas alfa y beta)
– es el receptor de antígeno de la mayoría
(95%) de las células T (TH , TC)
– TcR ab con CDRs muy diversas
• El TcR γ δ (cadenas ganma y delta)
– es el receptor de antígeno de un grupo
pequeño (5%) de células T denominadas
células T γδ (R I Innata)
– TcR con CDRs poco diversas
• Múltiple familia de genes: Cuatro familia de
genes (alfa, beta, gamma y delta)
Organización genética de las cadenas a y b del TcR
genes de linea germinal
La organización génica de la cadena α: (semejante a la cadena L de Ig)
• Segmentos de genes V-α , J y una región constante (C-α)
Organización génica de la cadena β: (semejante a la cadena H de Ig)
• Segmentos de genes V, D y J. Y dos tipos de C-β1 y C-β2
Cromosoma humano 14
Cromosoma humano 7
Organización genética de las cadenas γ y δ del TcR
genes de linea germinal
Entre los segmentos génicos V-alfa y J-alfa se
encuentran los genes V(D)J del TCR-delta
Los segmentos Vδ se encuentran intercalados con
los segmentos Vα, mientras que los segmentos D, J
y C se encuentran entre el Vα y Jα
El locus TcR γ es semejante
al locus TcR β
Cromosoma humano 14
Cromosoma humano 7
Reordenamiento y expresión de los genes de la cadena
α y de la cadena β del TcR
• Reordenamiento de los genes del TcR de los linfocitos pre-T toma lugar en el timo
• Secuencias RSS contiguas a los segmentos V, D, J / Recombinasas RAG1 y RAG2
• Adición de nucleótidos P y N entre los segmentos génicos V y J
Mecanismos que generan diversidad en los TcR
Combinaciones aleatorias entre los segmentos V, D y J de la región V,TcRαβ
• Cadena α: 70 Vα x 61 Jα = 4.27 x103
• Cadena β: 50 Vβ x 5 Jβ x 2 Dβ = 5 x 102
• Total de combinaciones TcR αβ : 2,13 x106
CDR3 se encuentra en el centro
del sitio de enlace del TcR
TcR
Cadena α
TcR
Cadena β
70 Vα
50 Vβ
0 Dα
2 Dβ
61 Jα
5 Jβ
CDR2
Gran número de segmentos J
aumenta diversidad del CDR3
CDR 3
CDR1
CDR 1
CDR3
CDR3 de la cadena α del TcR está
codificado entre los loci V y J
CDR 2
Mecanismos que generan diversidad en los TcR
•
Unión de los segmentos es imprecisa: El mismo grupo de segmentos
génicos V, D y J de la línea germinal puede generar diferentes
secuencias de amino ácidos en las uniones
•
Adición de nucleótidos N
En el sitio de unión de V-J y V-D, la enzima Tdt adiciona hasta 6
nucleótidos, de manera aleatoria, generando pequeñas secuencias
llamadas regiones – N.
En cada punto de unión se pueden añadir hasta seis nucleótidos al azar
Unión alternativa de segmentos D
Los segmentos D de las cadenas β del TcR están limitados por RSS
de una vuelta, en lugar de RSS de una vuelta y de dos vueltas como se
encuentran en los segmentos génicos D de las Ig.
Inmunoglobulinas
Regla de unión: 12x23
En los genes D del TcR puede ocurrir las uniones siguiente:
– Unión Vβ y Jβ
– Unión Vβ +Dβ+Jβ
– Unión Vδ +Dδ+Dδ+Jδ
– Unión Vδ+Dδ+Dδ+Dδ+Jδ
Aumenta la diversidad
del TcR
Mecanismos que generan diversidad en los TcR/ Ig
TcR
Cadena α
TcR
Cadena β
Ig Cadena
pesada
H
70 Va
50 Vb
40 Vκ
30 Vλ
0 Da
2 Db
40 VH
25 D
0
0
61 Ja
5 Jb
6 JH
5 Jκ
4 Jλ
4270 VαJα x 500 VβDJβ =
2,13 x 106
combinaciones posibles de
cadenas de TcR diferentes
Ig Cadena ligeras
κ
λ
6000 VHDHJH x (200 VκJκ + 120 VλJλ)
= 1,8 x 106 combinaciones posibles
de cadenas de Acs diferentes
Diversidad generada por la
flexibilidad de la unión
~ 1,6 x 1011 TcRs αβ
Diversidad generada por la
flexibilidad de la unión
~ 3x107 Acs
Diversidad total
~ 1017 TcRs αβ diferentes
Diversidad total
~ 1011 Acs diferentes
RESUMEN: Formas en que se genera la diversidad en el
dominio variable de las Inmunoglobulinas.
-Diversidad de la línea germinal
-Recombinación somática
Diversidad combinatoria (rearreglo V,D,J)
Diversidad de ligación
Combinación de cadenas livianas y pesadas
Diversidad potencial = 109-1011
-Hipermutación somática
Receptor T: Mecanismos similares operan en el caso del
TCR, con excepción de la hipermutación somática que no
existe.