Jasmonico 2016

UNIVERSIDAD NACIONAL DE RÍO CUARTO
Facultad de Ciencias Exactas, Físico-Químicas y Naturales
Guía de Trabajos Prácticos Nº 4- AÑO 2016
DETERMINACIÓN DE NIVELES ENDÓGENOS DE ÁCIDO JASMÓNICO EN
HOJAS DE TOMATE EN RESPUESTA A HERIDAS
Las plantas están sometidas a lo largo de su vida a diversos factores de estrés biótico y
abiótico. En este sentido, los tejidos que constituyen las plantas son altamente
vulnerables al daño ocasionado por artrópodos herbívoros y otros patógenos. Ante las
lesiones o heridas ocasionadas por estos organismos las plantas deben ser capaces de
percibir y responder al daño que éstos producen. La herida ocasionada por el herbívoro
puede activar un mecanismo de defensa en el tejido dañado directamente (respuesta
local), y en otros tejidos no dañados localizados a considerable distancia del sitio inicial
de ataque (respuesta sistémica).
Este proceso implica un complejo mecanismo de regulación capaz de generar,
transportar e interpretar la señal de alarma producida por el ataque del herbívoro. En
este sentido, las hormonas vegetales juegan un rol central en la regulación de las
respuestas de las plantas.
Los jasmonatos (JAs), como miembros de la familia de las oxilipinas, desempeñan una
importante función en la inducción de la defensa a insectos herbívoros y otros animales
que se alimentan de plantas. De hecho, se ha establecido que ácido jasmónico (JA)
juega un importante rol en la promoción de la resistencia a herbívoros y patógenos
mediante la activación de su síntesis. Luego de la herida, se observó acumulación de
ácido α–linoleico (α-Lea), sustrato para la biosíntesis de JA. Asimismo, en tomate
diferentes enzimas involucradas en la síntesis de JAs tales como lipoxigenasas (LOX),
óxido de aleno sintasa (AOS), óxido de aleno ciclasa (AOC), 12-OPDA-reductasa3
(OPR3) y acil-CoA oxidasa 1A (ACX1A) son inducidas y expresadas en respuesta a
insectos.
JA ejerce sus efectos mediante el control de una amplia gama de procesos relacionados
con la defensa tales como síntesis de metabolitos secundarios, cambios en la tasa de
crecimiento vegetativo, como así también en la expresión de diferentes genes tales
como los que codifican para inhibidores de proteinasas (PIN) y polifenol oxidasa.
Por otro lado, JA es capaz de mediar la respuesta sistémica ante la herida. Se han
establecido dos modelos a través de los cuales JA media dicha respuesta. Uno de estos
mecanismos establece que JA o alguno de sus derivados producido en el sitio de la
herida actúa como molécula señal móvil para activar la respuesta en los tejidos
sistémicos. El segundo mecanismo establece que en el sito de herida se producen
señales móviles distintas de JA las cuales activan la síntesis de la hormona en tejidos
sistémicos. En tal sentido, se ha observado que una herida ocasionada por insectos
induce la acumulación sistémica de JA/JA-Ile en Arabidopsis, principalmente por la
síntesis de novo de estos compuestos en hojas sistémicas más que por transporte desde
sitios cercanos a la herida.
Objetivos
 Cuantificar los niveles endógenos de JA en plántulas de tomate sometidas a
estrés por heridas (wounding).
Materiales
Plántulas de tomate Balones de 10 ml
Morteros
Metanol
Tubos Falcon
Centrífuga
Espátulas
Cinta de pH
Agua deionizada
Éter etílico
Micropipetas
Vortex
Pipetas Pasteur
Evaporador
Bisturí
Probetas
Ácido acético 30%
Equipo de Cromatografía Líquida- Espectrometria de Masas
Procedimiento
Las dos primeras hojas de plántulas de tomate de 20 días de edad serán heridas con un
bisturí (dos cortes completos perpendiculares a la vena central). Luego de 1 h., las hojas
serán cosechadas y pesadas (Peso fresco). Inmediatamente se colocarán en nitrógeno
líquido a fin de detener la actividad metabólica. Hojas sin herir se considerarán
controles.
La extracción y purificación de JA se realizará según el protocolo adaptado de
Durgbanshi et al. (2005).
1. Triturar las hojas con nitrógeno líquido en mortero pequeño. Dejar que el mortero
tome temperatura ambiente.
2. Homogenizar con 5 ml de agua deionizada.
3. Adicionar 50 ng de (2H6)-JA como estándar interno.
4. Homogeneizar brevemente en ultraturrax. (Enjuagar el recipiente con agua
deionizada entre cada muestra).
5. Centrifugar (15 min. a 5000 rpm).
6. Colectar el sobrenadante en tubos Falcon de 50 ml.
7. Ajustar a pH 2.8 con ácido acético 30 %.
8. Partición: agregar igual volumen de éter etílico al utilizado en el ítem 2, agitar en
vórtex 30 segundos y centrifugar (1 min. a 5000 RPM). Repetir el procedimiento
(doble partición).
9. Descartar las fases acuosas. Tomar las fases orgánicas (fase superior) con pipeta
Pasteur y recoger en balón de 10 ml. Secar a temperatura ambiente (25º C) en
evaporador rotativo.
10. Resuspender con 750 μl de metanol 100% (x 2 veces) → 1.500 μl volúmen final por
muestra.
11. Filtrar en columna. Recoger en Eppendorf de 2 ml.
12. Secar totalmente a temperatura ambiente (25º C) en concentrador centrífugo (SpeedVac).
13. Re-disolver en 50 μl de metanol 100 %.
14. Colocar en vial con inserto.
15. Inyectar 10 μl en LC-ESI-MS-MS.
Los datos obtenidos se calcularán usando una curva de calibración y se expresarán en
pmol.g-1PF.
Graficar los resultados obtenidos (control vs. tratamiento).