Montado de Cristales

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - UBA
Cristalización y cristalografía de
proteínas
Guía de TPs 11-12
Química Biológica II-B:
Estructura y Función de Biomoléculas
2004
TP 11: Cristalización de Proteínas
Práctico de “hanging drop”
En este práctico intentaremos reproducir condiciones de cristalización
previamente establecidas de la proteína lisozima de huevo de gallina (HEL). Para
ello utilizaremos la técnica de difusión de vapor en “hanging drop”. Haremos un
estudio breve de la influencia de la concentración de la proteína y del precipitante
en la aparición y tamaño de cristales. Para ello, variaremos en forma de damero
ambos parámetros.
Las condiciones de cristalización son las siguientes: 1.1 M NaCl, 0,1 M AcNa
pH 4,6. Se probarán condiciones de acuerdo al siguiente esquema:
Lisozima
NaCl 1.0 M
0,1 M AcNa pH 4,6
NaCl 1.1 M
0,1 M AcNa pH 4,6
NaCl 1.2 M
0,1 M AcNa pH 4,6
50mg/ml
40 mg/ml
30 mg/ml
Se largaran gotas mezclando 3 ul de solución proteica con 3 ul de licor
madre. En el reservorio se pondrán 500 ul de licor madre.
Práctico de “sitting drop”
En este práctico utilizaremos la técnica de difusión de vapor en “sitting drop”.
Haremos un estudio breve de la influencia de la concentración de la proteína y del
precipitante en la aparición y tamaño de cristales. Para ello, variaremos en forma
de damero ambos parámetros.
Las condiciones de cristalización son las siguientes:
1 M NaCl, 0,1 M AcNa pH 4,6.
Se probarán condiciones de acuerdo al siguiente esquema:
Lisozima
NaCl 1.0 M
NaCl 1.1 M
NaCl 1.2 M
0,1 M AcNa pH 4,6 0,1 M AcNa pH 4,6 0,1 M AcNa pH 4,6
50mg/ml
40 mg/ml
30 mg/ml
Se largaran gotas mezclando 5 ul de solución proteica con 5 ul de licor
madre. En el reservorio se pondrán 500 ul de licor madre.
Montado de Cristales
Una vez obtenido el cristal de la proteína en estudio, el paso siguiente consiste en
ubicarlo de forma adecuada en el equipo de difracción para ser incidido por los
rayos X. Para ello existen dos métodos, según la colección de datos se haga a
temperatura ambiente o en condiciones criogénicas. En el primer caso, los cristales
son colocados en capilares de vidrio o cuarzo de 0,01 mm de espesor con la ayuda
de pipetas y jeringas especiales, teniendo en cuenta que quede a ambos lados del
cristal (pero sin tocarlo) una pequeña cantidad de aguas madres para evitar su
desecación.
Por otro lado, la toma de datos a bajas temperaturas requiere que los cristales sean
atrapados por tensión superficial en pequeños lazos o “loops”, en donde el flujo de
nitrógeno en ebullición utilizado impacta directamente sobre el cristal. Para este
método es necesaria una inmersión previa o “soaking” del cristal en una solución
crioprotectora (en general aguas madres con glicerol o etilenglicol) que evita que se
forme hielo cristalino en el cristal, con la consecuente aparición de anillos de
difracción de hielo en las imágenes
TP 12: Resolución de la estructura de una
macromolécula por cristalografía de rayos X
El objetivo de un experimento de difracción de rayos X es reconstruir una imagen
en tres dimensiones de la macromolécula cristalizada, a partir de la información
dada por la difracción (por parte de los electrones de la molécula) de los rayos X
que inciden sobre el cristal. Esta reconstrucción es posible si contamos con la
descripción completa de la onda (i.e., amplitud, frecuencia y fase) de cada rayo
difractado (reflexión). Con esta información se obtiene un mapa de densidad
electrónica, que permite construir un modelo de la molécula acorde a dicha
densidad electrónica. El modelo final constituye un archivo de coordenadas x, y, z
que describe la posición espacial de cada átomo de la macromolécula en estudio.
El diagrama del proceso de resolución de una estructura es el siguiente:
Colección y procesamiento de datos de proteína nativa
(obtención amplitudes)
Obtención de fases
Existe un modelo
Reemplazo molecular
(usar las fases del modelo)
No existe un modelo
Selenoderivado
(Sincrotron)
Átomos pesados
(Ánodo rotatorio)
Posición de
selenio
Posición de
átomos pesados
Construir un modelo inicial
Determinación de fases
Sustituir la secuencia
Calcular mapa de densidad
electrónica
Calcular mapa de densidad
electrónica
Construir modelo
Modelo y mapa con fases a afinar
Afinamiento automático y reconstrucción manual del modelo
Estimación de la calidad de la estructura
Primeros Resultados – Obtención de la celda unidad y grupo espacial
La primera información que se debe obtener con las primeras imágenes son el
grupo espacial y los parámetros de celda correspondiente. Conocer la simetría del
cristal es importante para diseñar la estrategia de colección de datos y esencial
para la integración de datos. Sólo son necesarias unas pocas imágenes para su
determinación.

Programas utilizados en esta etapa:
Mosflm, Denzo (ánodo rotatorio, sincrotrón)
Frambo, Astro (ánodo rotatorio del instituto)
Si en las primeras imágenes se observan spots a buena resolución y la celda unidad
se puede hallar sin problemas, se continuan tomando imágenes hasta conseguir un
set completo de datos. El número total de imágenes y la porción a cubrir para
logran un set completo de observaciones dependen fuertemente del grupo espacial.
Integración y escalamiento
Una vez tomado un juego completo de datos, debe integrarse la información de
todas las imágenes y ponerla en la misma escala. Esto es necesario debido a que
existen variaciones entre las imágenes debidas a la intensidad de los rayos X y el
decaimiento del cristal; además, la simetría del cristal determina que muchas de las
reflexiones medidas sean redundantes. El resultado de ello es una lista de
intensidades de las reflexiones únicas (con su error experimental) y de sus
posiciones en el espacio recíproco (h, k, l). Finalmente se transforman las
intensidades en factores de estructura, los cuales se guardan en un archivo que con
frecuencia lleva la extensión .mtz.

Programas utilizados en esta etapa:
Mosflm, Scalepack, Sort/Scala, Truncate (ánodo rotatorio, sincrotrón)
Saint, XDS (ánodo rotatorio del instituto)
Estos factores de estructura contienen la amplitud de las ondas difractadas, pero
carecen de información acerca de la fase de la onda. Sin conocer fases, no
podemos interpretar la información experimental de modo tal de reconstruir la
estructura de la macromolécula.
Obtención de fases
La obtención de fases es el punto de mayor dificultad en la resolución de una
estructura. Si se cuenta con las coordenadas espaciales de una macromolécula de
estructura homóloga previamente resuelta, se puede usar ésta como modelo y
tomar las fases a partir de ella. Para ellos debemos hacer uso de programas de
REEMPLAZO MOLECULAR (molecular replacement). Computacionalmente se realiza
una orientación del modelo en la celda unidad de forma tal que los factores de
estructura del modelo se parezcan lo más posible a los factores de estructura
observados experimentalmente. En general, el modelo utilizado es el de una
proteína de estructura secundaria y terciaria similar a la investigada, a la cual se le
reemplazan todas sus cadenas laterales por alaninas.

Programas utilizados en esta etapa:
Suite CCP4: AMoRe, MolRep
Suite CNS: Molecular Replacement
Si no se cuenta con una estructura con suficiente homología, se deben estimar las
fases a partir de otros métodos. Uno de los mas utilizados es el llamado MIR
(multiple isomorphous replacement), en donde las fases se determinan a partir de
la difracción de cristales de la misma proteína derivatizada con átomos pesados
(e.g. Hg, Pt). Los metales se une en forma no covalente a ciertos residuos de la
molécula cristalizada. Las fases de las difracciones correspondientes a los átomos
pesados se pueden obtener por el cálculo de las posiciones de dichos átomos,
mediante las llamadas funciones de Patterson. A partir de las fases de los átomos
pesados se pueden estimar las fases del resto de los átomos en la estructura.

Programas utilizados en esta etapa:
Suite CCP4 (varios programas)
Suite CNS (varios programas)
La información de fases se incorpora en el cálculo de los factores de estructura, que
ahora sí se acercarán a la representación matemática de las ondas difractadas.
Afinamiento y reconstrucción iterativa del modelo
El paso siguiente consiste en el afinamiento de las fases estimadas, el cálculo de un
mapa de densidad electrónica con dichas fases, y la reconstrucción del modelo
molecular de acuerdo a dicho mapa. Para ello se suele trabajar en forma iterativa,
alternadamente en el espacio recíproco y en el espacio directo.
Afinamiento en el espacio recíproco:
En este proceso se modifican progresivamente las posiciones atómicas del modelo
(coordenadas espaciales guardadas en un archivo con extensión .pdb), buscando la
mayor similitud posible entre los factores de estructura experimentales (Fo) y los
calculados con el modelo (Fc). Esto redunda en una mejora en las fases estimadas.
Los cambios en las posiciones atómicas son condicionados por penalidades de
distancias y ángulos de enlace, conformación absoluta de aminoácidos (rotámeros)
y ángulos diedros permitidos. Se usan diversos programas de la suite CCP4 (e.g.
Refmac) o CNS (e.g. Refine).
Una vez halladas las coordenadas más favorables para un ciclo de afinamiento, se
combina su información de fases con las observaciones experimentales y se
calculan mediante transformaciones de Fourier, mapas de densidad electrónica
(x,y,z).
Afinamiento en el espacio directo:
Una vez obtenido el mapa de densidad electrónica, se lleva a cabo lo que se conoce
como reconstrucción del modelo (model building). En un programa de graficación
(e.g. O, CrystalView) se carga el mapa de densidad electrónica y se le superpone el
esqueleto del modelo. Se busca entonces que el modelo ajuste a la densidad
experimental. Para ello se modifican las partes del modelo que no se ajustan a la
densidad electrónica observada. Lo más común es agregar cadenas laterales de
aminoácidos que no se encuentran asignados en el modelo inicial, o mover la
posición de la cadena principal o las cadenas laterales asignadas. Para ello es
crucial el conocimiento de la secuencia de la proteína investigada.
Es muy inusual que con el primer mapa se puedan reconstruir todas las cadenas
laterales, lo que se recomienda es colocar solamente aquellas que se vean
nítidamente en el mapa y dejar las otras para los siguientes ciclos de afinamiento.
Una vez modificadas adecuadamente las posiciones de los átomos del modelo, se
vuelve a comenzar con el afinamiento en el espacio recíproco y así sucesivamente.
La pregunta es entonces, ¿cuándo finaliza el afinamiento? A medida que se afina
tanto en el espacio recíproco como en el directo, el modelo se va ajustando cada
vez más a la densidad electrónica. El grado de precisión y detalle estructural que se
va logrando depende de la resolución obtenida originariamente en las imágenes.
Como guía para el ajuste del modelo a la densidad electrónica existe un factor
estadístico de correlación R, que marca la diferencia relativa entre los factores de
estructura Fo y Fc. Cuando sucesivos pasos de afinamiento no modifican
apreciablemente el valor de este parámetro, y el mismo oscila en valores cercanos
a 0,25, se puede considerar concluído el afinamiento de la estructura. Sin embargo,
aún pueden quedar zonas de densidad electrónica sin asignar, las cuales
probablemente correspondan a moléculas de agua estructurales, de iones
constitutivos o cofactores de la molécula, o bien de aditivos de la solución de
cristalización. La asignación racional de estas densidades hará bajar aún mas el
factor R. En este momento se da por terminado el afinamiento.
Seguidamente se analizan distintos parámetros de la estructura que permiten
evaluar la calidad del modelo. Junto con el factor R, se calcula un factor Rfree
(similar al R pero calculado con observaciones que no participaron en el proceso de
afinamiento). También se calculan desviaciones de la idealidad en longitudes y
ángulos de unión, y se analizan la presencia o no de ángulos conformacionales
irregulares correspondientes a la cadena principal, mediante el gráfico de
Ramachandran.
El resultado de todo el proceso de resolución de estructuras es un archivo de texto
con extensión .pdb, que contiene las coordenadas espaciales del modelo, ajustadas
a la densidad electrónica experimental. También nos quedará un archivo con los
factores estructura experimentales y un mapa de densidad electrónica. El último
paso es el depósito de las coordenadas obtenidas para el modelo (.pdb) en la base
de datos del Protein Data Bank (www.rcsb.org), donde a cada proteína publicada se
le asigna un códico alfanumérico de 4 caracteres (e.g. 1HEL corresponde a la
lisozima de clara de huevo de gallina). Esta base de datos es gratuita y de acceso
público.
Bibliografía
1) “Crystallization of Biological Macromolecules”. Edited by Alexander McPherson.
CSHL Press, New York, 1999.
2) “Second virial coefficient as predictor in protein crystal growth” George, A.,
chiang, Y., Guo, B., Arabshashi, A., Cai, Z. and Wilson W.W. Methods in
Enzymology, 276:100-110, 1997.
3) “Crystallography Made Crystal Clear”, 2nd edition. Gale Rhodes. Academic Press,
San Diego, 2000.
4) “Principles of protein X-ray crystallography” 2nd edition. Jan Drenth. SpringerVerlag, New York, 1999.