EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA DEL VENENO DE LA

ACTIVIDAD BIOLOGICA DEL VENENO DE LA ARAÑA DE LOS
RINCONES (Loxosceles laeta)
Biological activities of brown spider venom (Loxosceles laeta)
López, Claudia1; Martínez, Jocelinne2; Vásquez, Abel1; González, Patricia1 y
González, Pamela1.
1Instituto
de Salud Publica de Chile, Avenida Marathon 1000, Ñuñoa. E-mail: [email protected],
[email protected], [email protected], [email protected].
2Universidad Santo Tomás, Escuela de Medicina Veterinaria.
INTRODUCCION
En Chile, sólo dos especies de arañas poseen veneno con significativa capacidad patógena
para el hombre: la araña del trigo (Latrodectus mactans) y la araña de los rincones (Loxosceles laeta).
Los accidentes producidos por arañas venenosas constituyen una problemática de salud pública, la
cual debe ser enfrentada con educación de la comunidad y capacitación de los profesionales de la
salud, con el objeto de brindar un adecuado diagnóstico, tratamiento y acciones de prevención. En
nuestro país, hay abundante conocimiento de la biología de L. laeta, existiendo varios estudios de su
veneno, enfocados a estudiar los daños que provoca, sin embargo, no están completamente
dilucidadas sus propiedades químicas, enzimáticas ni mecanismo de acción, como tampoco hay
antídotos específicos inmediatamente disponibles. En el presente estudio, se caracterizó biológica e
inmunológicamente el veneno de L. laeta, a través de electroforesis, western blott, actividad
dermonecrótica en conejos, y dosis letal en ratones, con el objeto de recopilar antecedentes para la
elaboración de un antídoto chileno.
MATERIAL Y METODOS
Se recolectaron 243 ejemplares adultos de L. laeta, los cuales se mantuvieron en ayuno por
35 a 42 días. Las glándulas de veneno (GV) de las arañas se obtuvieron previo sacrificio de los
ejemplares mediante congelación, observando bajo lupa y extrayéndolas con pinzas especiales. Las
GV se suspendieron en solución salina al 0,85%, manteniendo el vaso sobre hielo. Las GV se
maceraron en mortero estéril y se centrifugó a 15000 g por 15 minutos. El sobrenadante se almacenó
en alícuotas de 0,5 ml a -20°C hasta su posterior uso. La concentración de proteínas de los extractos
de GV se determinó por el método de Bradford.
Las fracciones proteicas de los extractos se separaron por medio de electroforesis en
presencia de dodecil sulfato de sodio para determinar el número y peso molecular de las bandas
proteicas. Los extractos ya separados fueron transferidos a una membrana de nitrocelulosa. Para el
western blott, la membrana fue enfrentada al primer anticuerpo (suero de paciente humano mordido
por L. laeta) en una proporción de 1:100. Después de sucesivos lavados, la membrana se incubó con
el segundo anticuerpo, diluído 1:1000. La unión de ambos anticuerpos se reveló con una solución de
fosfatasa alcalina hasta la aparición de bandas de color celeste.
La actividad dermonecrótica se evaluó en conejos neozelandeses blancos de 3 kilos de peso,
divididos en tres grupos de dos animales cada uno. Previa depilación en el dorso, se inoculó
intradérmicamente 0,2 ml de extracto diluído conteniendo 1,5; 3 y 4 microgramos (ug) de proteína. Las
lesiones cutáneas se evaluaron a las 3, 6, 12, 24, 48 y 72 horas post-inoculación (p.i.). La superficie
de éstas se midió en centímetros cuadrados (cm 2). Se calculó promedio, desviación estándar y
coeficiente de variación porcentual, con un intervalo de confianza del 95%. El análisis comparativo de
las lesiones se realizó mediante prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis (p0,05). La dosis mínima
necrotizante (DMN) se definió como la dosis mínima de extracto capaz de producir necrosis en piel de
conejo adulto.
Para determinar la dosis letal cincuenta (DL50), se empleó ratones CF-1 de 20 gramos de
peso, los que se dividieron en 9 grupos de 5 animales cada uno. Cada grupo se inyectó
intraperitonealmente con 0,2 ml de solución de extracto en concentraciones crecientes (1; 1,25; 1,5;
1,75; 2; 2,25; 2,5; 2,75; 3 mg/kg). Se evaluó el número de animales muertos a las 3, 6, 12, 24, 48 y 72
horas p.i. Se realizó la necropsia de los animales muertos para la observación macroscópica de los
órganos. La DL50 se determinó por análisis estadístico de Probit. Al final de la experiencia los conejos
y ratones vivos, fueron sacrificados por inyección de solución de eutanasia (T61 ®) e inhalación de
dióxido de carbono, respectivamente.
RESULTADOS Y DISCUSION
De las 243 arañas capturadas, se obtuvo y procesaron un total de 427 GV. La concentración
de proteínas de los extractos fue de 2 a 2,5 ug/ul. A la electroforesis, los extractos evidenciaron once
bandas proteicas, distribuídas entre los 15 a 70 kilodaltons (kDa). Se observó dos bandas
prominentes, ubicadas alrededor de los 70 kDa y la otra entre los 30 a 32 kDa. Esta última se ha
detectado en otros estudios y se le ha atribuído el rol necrótico y letal del veneno (Schenone y col.,
1988; Barbaro y col., 1996; Bravo y col., 1994; Mota y Barbaro, 1995; Guilherme y col., 2001).
Al realizar el western blott, no se observó bandas de reconocimiento inmunológico, resultado
similar al obtenido por Schenone y col.(1988) y Bravo y col. (1994), esto indicaría que en el
loxoscelismo no se instalaría una respuesta inmune efectiva, probablemente debido a la acción
citotóxica directa del veneno sobre los tejidos del huésped. Sin embargo, si se inocula dosis crecientes
de veneno, aparece resistencia al forzar al sistema inmune a responder (Schenone y col., 1988).
La actividad dermonecrótica reveló que 1,5, ug de proteínas, equivalente a 0,04 GV, fue
capaz de producir una lesión necrótica local cuya dimensión fue de 0,77 a 1,31 cm2 a las 72 hrs p.i.
Sin embargo, 4 ug de proteína (0,1 GV), produjeron lesión significativa (p0,05) a las 24 horas p.i.
(0,52 cm2). La dinámica de las lesiones consistió en la aparición de eritema y edema a las 3 horas p.i.
en 11 de 18 animales. Pasadas las 6 horas p.i., se observó una placa violácea en 3 de 18 conejos, la
cual se fue oscureciendo y dio lugar a la necrosis. A las 72 horas p.i., 10 de 18 animales presentaron
lesión necrótica. El edema, eritema y congestión mostraron mayor dimensión a mayor concentración
de proteína inoculada (p0,05), no así la necrosis, ya que a mayor dosis no se presentó la mayor
lesión. En humanos, Schenone y col. (1988) observaron evolución similar de las lesiones.
La DL50, fue de 1,86 a 3,01 mg/kg de peso. La mortalidad de los ratones comenzó a
producirse a las 3 hrs pi.. A la necropsia se observó hemorragia, inflamación peritoneal y congestión
renal. Barbaro y col. (1996) obtuvieron DL menores debido a que emplearon veneno puro y no un
extracto.
CONCLUSIONES
1. El extracto de GV presentó componentes homogéneos y estables en el tiempo, al ser mantenido a
-20°C, con lo cual se cuenta con una materia prima consistente para el desarrollo de un antídoto u
otros estudios relacionados con el área.
2. La mantención en cautiverio de las arañas, extracción y procesamiento de las GV son métodos
sencillos de implementar y requieren de bajo nivel de inversión. Con ello, se asegura una alta
cantidad de materia prima para la producción de antídotos, lo cual podría proyectar a Chile como
un proveedor de antídotos a otros países de la región.
3. Dosis pequeñas de veneno pueden producir importantes lesiones cutáneas (1,5 ug) y sistémicas
(1,86 mg/kg) en animales de laboratorio.
4. La lesiones cutáneas fueron proporcionales a la dosis de proteínas inoculadas excepto la
necrosis. La necrosis estaría relacionada a cierta susceptibilidad individual.
5. Otras líneas de desarrollo son la purificación de la fracción de 30 kDa o su producción por
tecnología recombinante con el objeto de obtener un antidoto más específico idealmente
monoclonal. Además puede dilucidarse posibles usos de componentes del veneno en el
tratamiento del cáncer u otras enfermedades al aprovechar el efecto angiostático y necrótico.
6. El antídoto es una herramienta que puede ser valiosa y es un complemento al tratamiento de
soporte del paciente con loxoscelismo.
REFERENCIAS
- Barbaro, K; Ferreira, M; Cardoso, D; Eickstedt, V, Mota, I. 1996. Identification and neutralization of
biological activities in the venoms of Loxosceles spiders. Braz. J. Med. Biol. Res 29 (11): 14911497.
- Bravo, M; Oviedo, I; Farías, P; Schenone, H. 1994. Estudio de la acción del suero antiloxoscélico
sobre los efectos hemolíticos y ulceronecróticos cutáneos producidos por el veneno de Loxosceles
laeta. Rev. Med Chile 122: 625-629.
- Guilherme, P; Fernandez, I; Barbaro, K. 2001. Neutralization of dermonecrotic and lethal activities
and differences among 32-35 kDa toxins of medically important Loxosceles spiders venoms in
Brazil revealed by monoclonal antibodies. Toxicon 39: 1333-1342.
- Mota I; Barbaro, K. 1995. Biological and biochemical properties of venoms from medically
important Loxosceles (Aranae) species in Brazil. Lab. of inmunopathology, Inst. Butantan, Brasil. J.
Toxicol. Toxin Reviews 14(3). 401-421.
- Schenone, H; Catalan, J; Araneda, T; Nuñez, F; Cortes, M; Correa, L; Muñoz, R; Contreras, M;
Saavedra, T; Rojas, A. 1988. Resistencia inducida en voluntarios humanos a dosis crecientes de
veneno de la araña de los rincones Loxosceles laeta. Bol. Chil. Parasit. 43: 47-53.