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Rev Cubana Plant Med 2006;11(3-4))
Hospital Militar Central “Dr. Luis Díaz Soto”
Influencia del Aloe vera L. sobre la respuesta inmune
humoral de ratones Balb/C inmunizados contra el
virus de la hepatitis B
Dra. Edelis Catellanos Puerto,1 Dra. Leysis Mc Cook Noa,2 Lic. Adriana Sin Mayor,3
Lic. Tatiana Vázquez González,4 Lic. María Celia Maceira y 5 Téc. Odalis Matos6
RESUMEN
Se realizó un estudio utilizando el extracto acuoso de Aloe vera L. para determinar su
actividad inmunogénica en ratones Bal/C inmunizados con la vacuna recombinante
contra hepatitis B (Herbiovac HB) de producción nacional. Específicamente se evaluó la
latencia, la intensidad, la durabilidad y la memoria inmunológica a través de
extracciones que se les hicieron en varios tiempos (3, 5, 27 semanas, 1 año y 15 días
después de los 2 últimos tiempos); la muestra obtenida fue procesada mediante micro
ELISA tipo sandwich para cuantificar anticuerpos contra el virus de la hepatitis B (anti
HB). Se trabajó con 2 grupos de trabajo (control y tratamiento con Aloe) a los que se les
inoculó por vía subcutánea solución salina y extracto acuoso inyectable de Aloe B M
respectivamente durante 21 días. Los resultados obtenidos mostraron que todos los
animales sero-convirtieron y tuvieron hiper-respuesta; además se encontró elevación de
la respuesta humoral con presencia de los títulos de anticuerpos protectores después del
año. Los estudios de anatomía patológica a los órganos primarios y secundarios de la
respuesta inmune denotaron proliferación celular en timo y aumento del área de células
B en el bazo.
Palabras clave: adyuvante, hepatitis B, HBs Ag, Aloe vera
Desde el inicio de la existencia misma del hombre, hubo una estrecha relación entre
magia, religión y medicina.1 En estos años el estudio de las plantas medicinales ha
ganado una creciente importancia pues las investigaciones se dirigen a las plantas
medicinales más usadas popularmente, entre las que se destaca Aloe vera L. o Aloe
barbadensis Miller, nombre científico de la conocida popularmente como sábila.
En Cuba, el uso de la sábila siempre ha sido diverso, es de gran aceptación por el pueblo
que la emplea de forma empírica en el tratamiento del asma, las afecciones
gastrointestinales, la hepatitis crónica, quemaduras y las hemorroides entre otras.2-4
En la actualidad, debido a que el arsenal terapéutico con que se cuenta en el mundo para
la inmunopotenciación no es muy amplio, nos hemos visto en la necesidad de ampliar
las investigaciones de los productos naturales para demostrar sus propiedades
terapéuticas y para obtener principios activos con vistas a sustituir importaciones y
elaborar medicamentos nacionales efectivos o tan efectivos como los existentes en el
mercado mundial.
Las principales investigaciones con la variedad cubana de Aloe B M se han realizado
evaluando la actividad de lectina, la actividad linfoblasto génica, la hemoaglutinación y
la inmunodifusión radial simple (IDR); se estudió además el mecanismo de la
fagocitosis, se exploró la morfología y viabilidad de los linfocitos usando esferas de
látex, así como la actividad antiviral mediante pruebas de reducción de placas de
neutralización y la evaluación de la actividad in vitro e in vivo.5
De todas esas investigaciones se han obtenido los siguientes resultados: efectos
estimulantes del Aloe B sobre la cicatrización, acción inhibitoria sobre la liberación de
prostaglandinas, tromboxanos e histamina, básicamente se vio que la viabilidad de los
linfocitos se elevó con el número de repeticiones de la dosis del producto por día, la
morfología de la célula cultivada no sufrió modificación. El timo de los ratones
inoculados con Aloe experimentó inhibición de la involución pero no hubo inducción a
la transformación blastogénica; la hemaglutinación resultó negativa en todas las
diluciones y la IDR exhibió líneas de precipitación específicas así como la identidad con
el título. También se encontró actividad antiviral.5
Teniendo en cuenta estos resultados nos propusimos explorar la posible acción del Aloe
B sobre la respuesta inmune humoral, específicamente evaluando la latencia, la
intensidad, la durabilidad y la memoria inmunológica del sistema inmune de ratones
inmunizados contra el virus de la hepatitis B.
MÉTODOS
Se utilizaron 30 ratones isogénicos de la línea Balb/C suministrados por CENPALAB,
todos hembras destetadas de 3 semanas de nacidas, con un peso promedio de 20g.
Fueron sacrificados por dislocación cervical y se les extrajo el timo, los ganglios
linfáticos y el bazo para que fueran procesados por anatomía patológica. La atención,
alimentación y manipulación de estos animales se hizo de acuerdo a las normas éticas
establecidas.6,7
Inmunógeno
Se empleó la vacuna antihepatitis B recombinante Herbiovac HB, lote # 50150,
fabricada en el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB). (Casanueva O.
L. El Control estatal de las vacunas en Cuba. Experimental con la vacuna antihepatitis B
recombinantes. Biotecnología Habana ¨94. Reportes cortos del Congreso1994; Vol 2).
(Izquierdo M. Validación de una prueba de potencia para la vacuna cubana antihepatitis
B recombinante (Herbiovac HB). Biotecnología Habana ´94. Reportes cortos del
Congreso, 1994.Vol 2, p.42).
La vacuna recombinante cubana expresa el fenotipo adw2 de la HBs Ag y utiliza como
célula hospedera la levadura Pichia pastoris y ha sido aplicada en el programa nacional
de inmunización. (Salgado Abel. Comunicación Personal, Girón, 1997).
Esquema de tratamiento
Para llevar a cabo el experimento, se utilizaron 2 grupos de trabajo: un grupo control
(n=16), que no recibió tratamiento con el extracto acuoso de Aloe B y un grupo
problema (n=16), que recibió tratamiento con el extracto acuoso de Aloe, a dosis de 0,1
ml (0.2 mg/Kg de peso) por vía subcutánea diariamente durante 6 meses. Este
tratamiento comenzó una semana antes del inicio del esquema de inmunización que se
aplicó a todos los animales de ambos grupos con la vacuna antigénica contra la hepatitis
B en las 1ra, 2da, 3ra, 24ta semanas y al año a dosis de 0.1 ml (2 µg) por vía
intraperitoneal.
La evaluación para la determinación de anticuerpos contra el antígeno de superficie de
la hepatitis B se realizó en las semanas 3ra, 5ta y 27ma y 15 días más tarde se midió la
memoria inmunológica, la que se evaluó también 15 días después de la dosis del año.
Método analítico
La variabilidad de las concentraciones de anticuerpos se mostró por medio de un
método inmunoenzimático (ELISA) cuantitativo, heterogéneo, tipo sandwich antígenoantígeno conjugado con peroxidasa desarrollado en el Departamento de Inmunología del
ICBP “Victoria de Girón”.8,9
Las mediciones se realizaron empleando una curva con estándares secundarios. Como
control positivo se utilizó un estándar secundario de 135000 UI/L a las diluciones de
1:500 y 1:1000, calibrado contra uno primario cedido por la OMS realizando una curva
con cinco puntos de dilución doble seriada a partir de 1:20 (120, 60, 30, 15 y 7.5).
Como control negativo se empleó suero de ratones Balb/C no inoculados.
Las muestras se corrieron 1:20 diluidas en PBS. La pendiente para la cuantificación se
obtuvo en el rango de densidades ópticas entre 0.2-0.8, que es donde se cumple el
principio de linealidad tal y como se determinó en la estandarización del método.(
Izquierdo M. Validación de un Sistema ELISA para la cuantificación del Ag de
superficie del virus de la hepatitis B. Biotecnología Hab.´94, vol 2, p. 42).10
La sensibilidad del método oscila entre 5-7 UI con coeficiente de variación de un 10 %.9
Se utilizó como fase sólida placas de cloruro de polivinilo (PVC) de micro titulación y
con fondo plano.
Para la realización de la técnica se extrajo sangre a los ratones del plexo retro-orbital, la
cual se centrifugó durante 10 min a 500 g y el suero obtenido se almacenó a -20 oC
hasta su análisis.
Análisis estadístico
La concentración de la muestra se calculó mediante la siguiente ecuación:
[Muestra] = DO muestra – x ctrl. Neg. x ftor, siendo:
DO: Densidad óptica.
X: media de los controles negativos.
dil: Dilución (1:20)
Factor; para hallarlo se toma [estándar] / dilución / ctrl. + que oscile entre 0,2- 0,8.
Se calculó el porcentaje de animales que fueron seropositivos así como la media
aritmética de ellos, calculándose la diferencia entre los mismos por t de Student y el
coeficiente de variación (DS/media aritmética x 100) en los tiempos en que logra la
sero-conversión en todos los animales.
Variables medias
1. Seroprotección: considerando 10 ó más UI/ L de anticuerpos anti HBs Ag. Esta
variable se refiere al límite inferior de protección.
2. Hiper-respuesta: considerando 100 ó más UI/L de anticuerpos anti HB AG.
(Dienstang, L. Prevention of hepatitis B. In American Ass for study of liner
diseases. Postgraduate: viral hepatitis A to F on update. Chicago, Illinois, USA,
1994).
RESULTADOS
Al intentar crear un modelo experimental para estudiar la respuesta inmune humoral de
los grupos estudiados, se obtuvieron los resultados que muestra la figura 1, donde se
aprecia una elevación consecutiva de los niveles de anticuerpos específicos en los
diferentes tiempos del estudio.
Fig. 1. Diferencias de los niveles de Ac entre los grupos de estudio en los tiempo
analizados.
Los animales del grupo tratado tuvieron títulos elevados desde la tercera semana de
iniciado el tratamiento con extracto acuoso de Aloe B Miller hasta el año.
Específicamente, al evaluar la memoria se encontró gran significación estadística entre
los grupos de trabajo para una p < 0,05, lo que no fue así para el resto de los tiempos
estudiados (Fig.2).
Fig. 2. Variación en el tiempo de los niveles Ac entre los grupos de estudio.
Desde el punto de vista anatomopatológico en cuanto al bazo, se encontró una
histología normal con buena distribución de los folículos y buena proporción cortezamédula pero en el grupo tratado apareció un aumento de las células madres
pluripotenciales (Figs. 3, 4 y 5).
Fig. 3. Bazo. Grupo Control.
Fig.4. Bazo. Grupo Tratado.
Fig. 5. Bazo. Grupo Tratado.
Específicamente, en el timo macroscópicamente, sus restos se encontraron conservados
en el grupo tratado a pesar de ser animales viejos, y microscópicamente revelaron una
abundante proliferación linfocitaria, lo que no fue observado en el grupo control donde
los fragmentos no se visualizaron bien (Figs. 6 y 7).
Fig. 6. Timo. Grupo Control.
Fig. 7. Timo. Grupo Tratado.
En los ganglios linfáticos, sin deterioro a simple vista en ambos grupos, se pudo
apreciar que el tejido linfoide de los animales tratados presentaba una hiperplasia de los
folículos linfoides con aumento de los linfocitos, predominando los de la estirpe B
(Figs. 8 y 9).11
Fig. 8. Ganglio L. Grupo Control.
Fig. 9. Ganglio. Grupo Tratado.
DISCUSIÓN
Mientras que algunos antígenos extraños tienden a provocar indiferencia inmunológica,
otros provocan reacciones de variable duración e intensidad y mayor o menor grado de
memoria inmunológica.
Si tenemos en cuenta el creciente aumento de los títulos de anticuerpos contra el virus
HB encontrados en el grupo tratado y la permanencia de ellos en el grupo tratado al año
respecto al grupo control, podemos afirmar una vez más que el extracto acuoso de Aloe
B potencia la respuesta inmune, no sólo desde el punto de vista celular sino también
humoral y que conjuntamente con ello tiene una importante actividad antiviral y es muy
probable que tales efectos sobre el sistema inmunológico estén en concordancia con el
efecto adyuvante aquí encontrado. (Aguilar J C, Veliz G, Penton E, Leal M, Echevarría
M, Izquierdo E, y otros. Evaluación del efecto inmunopotenciador de un extracto
acuoso de Aloe vera L como modelo de Ag de superficie de la Hepatitis B. Libro de
reportes cortos Biotecnología Habana 97, Dic. 1-6, Ciudad de la Habana. Centro de
Ingeniería Genética y Biotecnología, 1998). (Rodríguez Acosta M. Acción
inmunomoduladora del extracto acuoso inyectable de Aloe B M en el paciente
quemado). [Tesis de Doctorado].12
En este trabajo se demuestra que la respuesta inmunológica específica, como era de
esperar en este caso, es elaborada en el tiempo y no inmediata y que para lograrla son
necesarios un conjunto de adecuados estímulos como son la activación de células
presentadoras de antígeno como el macrófago, la liberación de mediadores de activación
y proliferación linfocitaria como la IL-1, IL-2, la liberación de otras citocinas como el
IFN gamma, todo lo cual hace el Aloe B. (Aguilar J C, Veliz G, Penton E, Leal M,
Echevarría M, Izquierdo E y otros. Evaluación del efecto inmunopotenciador de un
extracto acuoso de Aloe vera L como modelo de Ag de superficie de la Hepatitis B.
Libro de reportes cortos Biotecnología Habana 97, Dic.1-6, Ciudad de la Habana.
Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología, 1998), hasta la cooperación, activación
y diferenciación de la célula B, que redunda en la producción de anticuerpos específicos
contra el virus de hepatitis B. (Rodríguez Acosta M. Acción inmunomoduladora del
extracto acuoso inyectable de Aloe B M en el paciente quemado. [Tesis de Doctorado].
De hecho estos estudios realizados plantean que el éxito de la vacunación en la
protección radica en que la respuesta sea intensa y duradera como lo es en este caso.
(González Ramírez, Victoria. E. Comunicación Personal 2001).
Los efectos del Aloe sobre los órganos primarios y secundarios del sistema inmune,
como se ha planteado, han sido ampliamente estudiados, específicamente el bazo,
órgano hematopoyético importante y productor de linfocitos y monolitos, con el
estímulo del Aloe realiza una hematopoyesis extramedular;11 muchos estudios de
mielosupresión inducida por determinadas sustancias hablan de ello después de haber
sido estimulados los animales con otras sustancias inmunomoduladoras,13-15 por lo que
el aumento de las células madres encontrado en nuestro estudio no es casual, así como
tampoco lo es el aumento de los linfocitos B productores de anticuerpos en el ganglio
linfático de los ratones tratados.
Los adyuvantes inmunológicos se describen como sustancias que permiten al antígeno
provocar la formación de anticuerpos, independientemente de que existen antígenos
muy inmunogénicos, como el de hepatitis B, pero por otra parte el polisacárido del Aloe
B M puede tener epítopes diferentes que se distribuyan de forma tal que permita su
fijación en varios puntos de los receptores linfocitarios, lo que aumentaría la capacidad
para estimular no sólo a los linfocitos T sino también a los linfocitos B y a los
macrófagos (trío fundamental en la respuesta inmunitaria).
También intervendría el estímulo que provoca la aloesina en el proceso de
diferenciación celular16 y en la activación de células de memorias, importantes después
que se inoculan los llamados búster en el proceso de la vacunación para la obtención de
una respuesta de anticuerpos específica y protectora.
Este producto utilizado como adyuvante tendría la ventaja de potenciar la inmunidad sin
que su uso en exceso cause graves efectos, porque no tiene reacciones adversas descritas
como hipersensibilidad, irritación del sitio de inoculación, etc.; pero además, no tiene
las desventajas de otros adyuvantes, de manera tal que al Aloe se le pudieran adjudicar
varios de los atributos que debería tener un adyuvante según la serie # 595 de la OMS.
Summary
Influence of Aloe vera L. on the immune humoral response of Balb/C mice immunized against the hepatitis B virus
A study was conducted by using the aqueous extract of Aloe vera L. to determine its
immunogenic activity on Balb/C mice immunized with the recombinant vaccine against
hepatitis B (Herbiovac HB) of national production. The latency, intensity, durability and
the immunological memory were evaluated through extractions made at different times
(3, 5, 27 weeks, 1 year and 15 days after the last 2 times). The sample obtained was
processed by sandwich micro ELISA to quantify antibodies against the hepatitis B virus
(anti HB). The control group and the group treated with Aloe were inoculated saline
solution and injectable aqueous extract of Aloe B M by subcutaneous route,
respectively, during 21 days. The results attained showed that all the seroconverted
animals and had a hyperresponse. Elevation of the humoral response with presence of
titers of protective antibodies was found after a year. The studies of pathological
anatomy undertaken in the primary and secondary organisms of the immune response
showed cellular proliferation in the thymus and increase of the area of B cells in the
spleen.
Key words: Adjuvant, hepatitis B, HBs Ag, Aloe vera.
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Recibido: 10 de septiembre de 2006 Aprobado: 28 octubre de 2006.
Dra. Edelis Catellanos Puerto. Hospital Militar Central “Dr. Luis Díaz Soto” E- mail:
[email protected]
1Especialista II grado en Inmunología Básica y Clínica
2Especialista I grado en Anatomía Patológica
3Licenciada en Biología
4 Licenciada en Bioquímica
5 Licenciada en Veterinaria
6Téc. en Anatomía patológica
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