Fundada en 1973 ISSN 0716-0135 REVISTA CHILENA DE TECNOLOGIA MEDICA VOLUMEN 21 – Nº 1 – JULIO 2001 Revista Indizada en: Index Medicus Latinoamericano (IMLA) de la Biblioteca Regional de Medicina y Ciencias de la Salud (BIREME) - LILACS Rev. Chil. Tecnol. Méd. 21 (1), 906–910, 2001. ARTICULO ORIGINAL EFECTOS DE PARATION SOBRE LA SINTESIS PROTEICA TESTICULAR PARATHION EFFECTS IN TESTICULAR PROTEIC SYNTHESIS M.V. Héctor Rodríguez, T.M. Fémina Guzmán, T.M. Juan Carlos Araya, Sr. Mauricio Guzmán Dr. Eduardo Bustos-Obregón. Programa Morfología. ICBM. Facultad de Medicina. Universidad de Chile RESUMEN El Paratión como insecticida de uso masivo en la agricultura, puede afectar el potencial reproductivo de la población humana y animal expuesta. Sus propiedades bioquímicas potencialmente alteran los mecanismos de síntesis proteica testicular, afectando la morfofuncionalidad del aparato reproductor. El objetivo del presente trabajo, es cuantificar la síntesis de proteínas testicular, bajo la presencia de paratión, en ratón CF1, in vitro. Se cultivaron túbulos seminífero de ratones CF-1 e incubaron con concentraciones decrecientes (0,4; 0,04 y 0,004 mM) de Paratión (PT) por 4 horas. Leucina tritiada (2 µCi) fue agregada después de una hora. Posteriormente se evaluó la síntesis proteica como Actividad Específica (cpm/µgr proteínas). Los resultados mostraron que el Paratión induce inhibición significativa de la síntesis proteica en la concentración 0,4 mM, mientras que a dosis menores de Paratión disminuye el efecto sobre la inhibición de la síntesis de proteínas. Palabras claves: espermatogénesis, testicular, paratión, organofosforados, pesticidas ABSTRACT Massive use of agropesticides has elicited interest on potential adverse effects on human and animal reproductive health. Exposure for long periods even at low doses could induce subclinical, epigenetic or genetic effects. This work deals with the evaluation of the in vitro effect of Parathion on protein synthesis by mice testicular tissue. The pesticide was used at concentrations similar to those found in agroproducts. Seminferous tubule incubation was done for 4 hours at decreasing concentration of Parathion (0.4; 0.04; 0.004 mM, and control). Tritiated Leucine (2µCi) was added for one hour. Thereafter, total proteins and Leucine uptake were measured to determine an inhibited fraction (IF: cpm/µgr). The results shows that Parathion at a concentration of 0.4 mM decreased protein synthesis. And the effect is dose dependent. Therefore, organophosphoric agropesticides at low concentration affect spermatogenesis by interfering with protein synthesis. Key words: Spermatogenesis, testicular, parathion, organophosphoric, pesticides. 906 INTRODUCCIÓN MATERIALES Y MÉTODO El Paratión es un pesticida organofosforado (1) de uso frecuente en la agricultura . Su acción inhibitoria sobre la acetilcolinesterasa en la unión neuromuscular provoca (2) sobreexcitación colinérgica , con efectos (1,3) clínicos característicos . Material biológico El Paratión es metabolizado por el complejo enzimático P-450 por desulfuración oxidativa y resultando la producción de paraoxón su principio activo, altamente tóxico. Posteriormente, el paraoxón es (4) degradado por la paraoxonasa . Los potenciales mecanismos de daño que ejerce el Paratión se explicarían por sus propiedades bioquímicas. Como éster de ácido fosfórico puede interactuar con macromoléculas orgánicas como agente nucleofílico, alquilante y fosforilante, con potenciales efectos sobre la replicación, (2) transcripción y traducción de proteínas , reduciendo la potencialidad fecundante y alterando el desarrollo embriofetal. El objetivo del presente trabajo es cuantificar la síntesis de proteínas en el epitelio germinal expuesto a concentraciones decrecientes de Paratión, bajo condiciones in vitro. Se utilizaron ratones cepa CF1, alimentados “ad libitum” y con período luz-oscuridad de 12/12 horas a 18º-22ºC. Los animales fueron sometidos a sobredosis de anestesia y se procedió a la extracción de los testículos. Material Reactivo Paratión 99,2% de pureza (Lab. Chemical Co.). Medio Ham F-10 Leucina Tritiada Buffer TRIS, pH 7,2 Acido Tricloroacético al 10% Método Los testículos fueron descapsulados y los túbulos seminíferos se incubaron en medio Ham F-10 (1 ml) con concentraciones decrecientes de Paratión (0,4; 0,04 y 0,004 mM) frente a un grupo control, en baño termorregulado a 35ºC, 60 ciclos/min de agitación, durante 4 horas. Luego se añadió 2 µl de Leucina tritiada (LH³), y se continuó la incubación por 1 hora adicional. Se extrajo el tejido testicular y se congeló a –20ºC. Los túbulos seminíferos fueron macerados a 4 ºC (5) en 2 ml de buffer Tris, pH 7,2. 907 El tejido testicular se homogenizó con 2 ml de Acido Tricloroacético (TCA) al 10% y se centrifugó a 2000 rpm por 10 minutos a 4º C. El sobrenadante fue eliminado y el pellet se (6) lavó 2 veces con 2 ml de TCA . Posteriormente el sobrenadante se desechó y al pellet se le adicionó 1 ml de buffer Tris pH 7,2 para la evaluación de incorporación (7,8) de leucina tritiada y concentración de (9) proteínas totales . Se calculó la razón entre cuentas por minuto (Centelleo Liquido), y concentración de proteínas (Bradford Reaction)), obteniéndose la actividad específica (cpm/µgr. de proteínas). La fracción de inhibición se obtiene mediante la razón entre la diferencia de promedios entre el control y el grupo experimental (se utilizó la prueba de - student para 0,05). diferencia de promedios, p < RESULTADOS Los resultados se expresan en actividad específica, que representa la síntesis proteica total del tejido testicular. Ellos demuestran que la presencia de Paratión afecta significativamente la síntesis de proteínas en el epitelio seminífero de ratón. En el Gráfico, se muestra que la actividad específica de la síntesis proteica tiende a disminuir con la concentración de 0,4 mM de Paratión. mientras que en la Tabla, se distingue que a concentraciones mayores de pesticida la inhibición es mayor, en cambio, a concentraciones menores del pesticida no se demuestra inhibición. TABLA CONCENTRACIONES / FRACCION INHIBICIÓN Concentración de Paratión Fracción de inhibición 0,4 -0,44 0,04 -0,45 0,004 0,35 La tabla muestra la fracción de inhibición de la síntesis de proteínas en presencia de concentraciones decrecientes de Paratión. La fracción de inhibición aumenta en presencia de concentraciones mayores de pesticida (fracción de inhibición negativa indica inhibición de la síntesis proteica). DISCUSIÓN La actividad nucleofílica del Paratión permite sugerir que los resultados observados pueden ser producto de la interacción con ácidos nucleicos. Estos pesticidas pueden, además, alquilar DNA y fosforilar proteínas. (2,10) Por otra parte, existen investigaciones que señalan la capacidad del Paratión para (11) producir daño en el citoesqueleto y como responsable de la inhibición de la síntesis proteica testicular. El diseño experimental, sin embargo, no permite extraer una explicación mecanicística, aunque tales mecanismos podrían explicar la inhibición observada a la concentración 0,4 mM de Paratión. 908 GRAFICO ACTIVIDAD ESPECÍFICA / CONCENTRACIÓN PARATION 9 8 Actividad específica 7 6 5 4 3 2 1 0 Control 0,4 0,04 0,004 Concentración de paratión Actividad Específica de la síntesis de proteínas testicular, a concentraciones decrecientes de Paratión (0,4; 0,04 y 0,004 mM), y 5 horas de incubación con el pesticida. Se observa que la actividad específica aumenta a medida que disminuye la concentración del pesticida. A concentraciones bajas de Paratión se observa un aumento no significativo de la síntesis proteica testicular, que podría indicar un mecanismo compensatorio del testículo (12, 13) ante el efecto del pesticida . Es probable que la existencia de mecanismos detoxificantes presentes en el testículo permitan explicar los hallazgos. De este modo, se conoce la existencia del complejo proteico P-450 en testículo de rata, (12, 14) sin embargo éste también puede ser (15) inhibido por el pesticida. También existe documentación acerca de la presencia de paraoxonasa en plasma, enzima que (4, 16, 17) degrada al paraoxon. Ésta enzima está presente en el testículo y es responsable de los mecanismos detoxificadores en este tejido, sin embargo, sus mecanismos no están bien estudiados y podría ser objeto de futuras investigaciones. 909 REFERENCIAS 1. Araya J.C., Arenas G., González C., Troncoso J. Ecología e insecticidas en Arica. Tecnología Médica, Universidad de Chile. Arica, 1977. 2. Schram E. Organic scintillation detectors. Ed Elsevier Publishing Company. New York. 1963. 3. Tapia R. Toxicología General. Facultad de Ciencia Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile. Santiago. 1994. 4. Li W, Costa L, Furlong C. Serum paraoxonase status: a major factor in determining resistance to organophosphates. J. Toxicol. Environ. Health. 40:337-46. 1993 5. Lopez M, Leyton C, Graf M. Técnicas de Histología y Citología. Departamento de Biología Celular y Genética, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. Santiago. 1982 6. O´Brien R. Insecticide: Action and metabolism. Ed Academic Press. New York. 1967. 7. Burton K. A study of condition and mechanism of the diphenilamine reaction for the colorimetric estimation of DNA. Biochem 62:135. 1956. 8. Schneider W. Determination for nucleic acid in tissue by pentose analysis. Method in Enzimology 3: 680-684. 1957. 9. Kruger N. Methods in molecular biology. Ed Humana Press. 32:9-15. New Jersey. 1994. 10. Valenzuela A. Activación metabólica: un mecanismo biológico que 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. aumenta la toxicidad de los xenobióticos, Rev. Med. Chile 118:1028-1034. 1990 Deli E, Kiss Z. Effect of parathion and methyl parathion on protein content of chicken embryo muscle in vivo. Biochem. Pharmacol 37:3251-3256. 1988. Martín-Partido G, Alvarez I, Rodriguez L, Nanascués J. Differential staining of dead and dying embryonic cells with a simple new tecnique. Journal of Microscopy 142:101-106. 1985. Morgan E, Yan B, Greenway D, Petersen D, Parkinson A. Purification and characterization of two rats liver Microsomal carboxylesterases. Arch. Biochem. Biophys 315:495-512. 1994. Healy L, Pluta L, Recio L. Expression and distribution of cytochrome P-450 2E1 in B6C3F1 mouse liver and testes. Chem. Biol. Interact. 12:199207.1999. Butler A, Murray M. Inhibition and inactivation of constitutive cytochromes P-450 in rat liver by parathion. Mol. Pharmacology 43:902-8. 1993. Costa L, McDonald B, Murphy S, Omenn G, Richter R, Motulsky A, Furlong C. Serum paraoxonase and its influence on paraoxon and chlorpyrifos-oxon toxicity in rats. Toxicol. Appl. Pharmacol. 103:66-76. 1990. Wallace A.Principles and Methods of Toxicology. Ed Raven Press. New York. 1994. 910