Identificación de un microorganismo

Microbiología
Práctica 3: Identificación de un microorganismo: Pruebas bioquímicas.
La práctica consiste en la identificación de un germen procedente de cultivo puro que a su vez procede de un
cultivo de los microorganismos presentes en una muestra de pimentón del que se aisló una de las colonias.
Lo primero que hacemos es una tinción de Gram para lo cual hacemos un frotis, con el asa de siembra, en un
porta del microorganismo en cuestión que queremos identificar. Ponemos primero una gotita de agua en la
que suspendemos la muestra, después fijamos con calor. Una vez fijada procedemos a añadir los distintos
componentes de la tinción de Gram: primero el colorante principal, después el lugol, el colorante de contraste
y el alcohol.
Nos interesa ver en el microscopio si es Gram positivo o negativo, esporulado o no, y si lo es, saber la forma
de la espora (elipsoidal o esférica), la posición (central, central terminal o terminal) y si deforma o no al
bacilo.
El resultado es que es un bacilo Gram positivo, esporulado, con la espora central, elipsoidal y que deforma
al esporangio.
Si es aerobio, esporulado y Gram positivo, es del género Bacillus, ahora, para afinar más e intentar dar con la
especie, hacemos cuatro pruebas bioquímicas.
La primera de ellas es la de Voges−Proskawer en la que se busca la presencia de acetoina o acetil−metil
carbonil. Sembramos en un tubo con un medio líquido especial para dicha prueba. Tras la incubación 24−48h
a 28ºC añadimos dos reactivos: −naftol en solución alcohólica (etanol) al 6% y una solución de KOH al
40%. Este último reactivo oxida a la acetoina formando diacetilo que se une a un residuo de guanidina del
medio en que se hace la prueba, en presencia del −naftol. Se forma en la parte superior del tubo un
compuesto rojo ladrillo que nos indica que es Voges−Proskawer positivo (V−P +).
Con la segunda de las pruebas se trata de saber si fermenta a la glucosa produciendo ácido, esto es, si es ácido
positivo o ácido negativo. Se hace en un medio líquido glucosado que tiene un indicador de pH: púrpura de
bromocresol. Este medio es de color violeta y si produce ácido va a virar a color amarillo, si no lo produce se
queda de color púrpura, incluso podría hacerlo de un púrpura más intenso. En los dos últimos casos sería
ácido negativo. En nuestro caso, nuestro Bacilo es ácido positivo.
En el mismo tubo de la prueba anterior se introduce una campana de Durham en posición invertida, que
dependiendo de que aparezca una burbuja o no, nos va a indicar si es gas positivo o gas negativo. Nuestro
microorganismo es gas negativo porque no aparece burbuja. Si hubiera sido ácido negativo solo podría ser
gas negativo, siendo ácido positivo se podrían haber dado los dos casos.
La última de las pruebas bioquímicas consiste en investigar la producción o no de −amilasa que es la enzima
que hidroliza el almidón. Para realizar esta prueba sembramos previamente, 48h a 28ºC y en posición
invertida como siempre, en superficie en una caja de Petri, una o dos pequeñas estrías. Echamos sobre toda la
superficie de la placa, incluidas las colonias, Lugol que va a teñir de negro−morado el almidón. Se va a teñir
toda la placa y en nuestro caso no se tiñen las colonias ni sus inmediaciones ya que es amilasa positivo, es
decir, nuestro bacilo produce −amilasa que ha hidrolizado el almidón. Si hubiese sido amilasa negativo, se
hubieran teñido también las colonias.
Con todos los datos de que disponemos nos vamos a una tabla en la que aparecen distintas especies del género
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Bacillus y si son positivas o negativas con respecto a las pruebas bioquímica que hemos realizado. Además
aparece si son esporulados o no y forma y posición de la espora así como si deforman o no al Bacilo.
!Nuestro Bacilo es Gram+, esporulado con espora central, elipsoidal que deforma al esporangio, V−P+,
amilasa+, ácido+, gas−.
Según la tabla podría ser: B. subtilis, B. cereus, B. mycoides,
B. licheniformis, B. thuringiensis o B. anthracis.
Anthracis es parásito de animales (causante del carbunco), thuringiensis es parásito de insectos, licheniformis
es anaerobio y patógeno al igual que cereus que suele formar cadenas (no es nuestro caso). Lo más probable
es que se trate de B. subtilis o de B. Mycoides (del que no he encontrado información).
Para dar más exactamente con la especie deberíamos hacer algunas otras pruebas.
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