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MOLECULAR PHYSIOLOGY OF MARINE MACROALGAE: DIVING INTO THE GENOME OF RED ALGAE RNA Concentration
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RAFAEL ROBAINA ROMERO PILAR GARCÍA JIMÉNEZ CULTIVO IN VITRO GENÓMICA DE MACROALGAS 1985 PAPEL DE FUENTES DE CARBONO Y DE LA LUZ ACTUALIDAD PGR´S: POLIAMINAS ETILENO COMPUESTOS VOLÁTILES JASMONATOS OXILIPINAS García-­‐Jiménez P., Rodrigo M., Robaina R.R. 1998. Marián FD, García-­‐Jiménez P., Robaina R.R. 2000 a,b Guzmán Urióstegui A, García-­‐Jiménez P, Marián F.D, Robledo D, Robaina R.R. 2002 Poliaminas Reproducción Maduración Cistocarpo Estrés Liberación esporas García-­‐Jiménez P., Just PM., Delgado AM., Robaina RR 2007. REPRODUCCIÓN • LAS POLIAMINAS ESTÁN IMPLICADAS EN EVENTOS REPRODUCTIVOS Y DE ESTRÉS. • 2 ENZIMAS RELACIONADAS CON SU SÍNTESIS: ODC RELACIONADA CON LA REPRODUCCIÓN ADC ACTIVA EN SITUACIONES DE ESTRÉS GAMETOFITOMASCULINO (n)
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Las cancdades de PAs son inferiores en talos fércles Las accvidades de las enzimas de síntesis se correlacionan con los niveles de PAs Sacramento AT., García_Jiménez P., Alcázar R., Tiburcio AF., Robaina RR. 2004. J. Phycol. 40: 887-­‐894 ¿QUÉ OCURRÍA DURANTE EL DESARROLLO DEL CISTOCARPO? Máximos en PAs hasta el día 5, a parcr de ahí los cistocarpos comienzan a ser evidentes y los niveles de PAs caen. Sacramento AT., García-­‐Jiménez P., Robaina RR. 2007. Máxima accvidad en la enzima biosintécca previo a la formación cistocarpos Accvidad catalícca máxima posterior al desarrollo de los cistocarpos Sacramento AT., García-­‐Jiménez P., Robaina RR. 2007. Infércl Fércl 0,02-­‐16,6 0,10-­‐2,63 nmol14CO2mg-­‐1 proteina h-­‐1 2 ± 0,01 0,9 ± 0,01 µgPUT g fw ¿HAY MENOS TRANSCRITOS DE ODC A MEDIDA QUE SE DESARROLLA EL CISTOCARPO? MEDIDA DE LA EXPRESIÓN GÉNICA CUÁNTO SE EXPRESA (qPCR) RNA Secuencias consenso: NCBI, CLUSTALW DISEÑO DE SONDA a parcr del gen ODC RT-­‐PCR cDNA DISEÑO DE PRIMERS Forward y Reverse Sonda de hidrólisis Sybr-­‐Green Fragmento de
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Extracción banda Purificación Secuenciación BLAST: Comprobación fragmento de ODC OK?…conGnuamos Aislamiento
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García-­‐Jiménez P., García-­‐Maroto F., Garrido-­‐Cádenas J., Ferrándiz C., Robaina RR (2009). J Plant Physiol 166: 1745—1754 IN VITRO ETILENO FOTOPERIODO Robaina RR, García-­‐Jiménez P. (2013). EN REVISIÓN MEDIDA DE LA EXPRESIÓN GÉNICA DÓNDE SE EXPRESA (ISH) CONSTRUCCIÓN DE LA SONDA PARA HIBRIDACIÓN INMOBILIZACIÓN DEL TEJIDO Control del fijador empleado y sus cempos. Vector + inserto ODC. Almacenado -­‐20 ºC Inclusión en parafina Cortes seriados montados en portas Linearización con enzimas de restricción Transcripción in vitro ADN ARN T7 Sal I SP6 T7 Pre-­‐ e hibridación ,
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Garda-Jiménez P., et al., (2009).
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A B pp • La expresión es dependiente de la formación del cistocarpo. • Existe una expresión diferencial del gen de la ODC. • Nº transcritos disminuye hacia la zona apical del talo. DIFERENCIACIÓN DEL CISTOCARPO
HACIA DÓNDE VAMOS? 5’ UTR-­‐ODC: REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA. FACTORES REGULADORES VOLÁTILES Compuestos Orgánicos Volácles Existen evidencias de señales gaseosas que afectarían también a la reproducción Pérdida repencna de los tapetes algales Alternancia de fases reproduccvas Olor caracteríscco de los lechos algales ¿Compuestos orgánicos volácles? HACIA DÓNDE VAMOS? VOLÁTILES T ahl. Z. Clusification of ",laik: Dfpnic compoundI ~Ieaocd by G. lU"bouatla .a:ordinll lO Iheir principol t"un.ctionaI8JOUIIIi and tho mzymo:
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García-­‐Jiménez P., Brito-­‐Romano O., Robaina RR. 2013. J Phycol 49: 661-­‐669 •  Nivel molecular •  Síntesis de ecleno GENES •  Nivel fisiológico SÍNTESIS PERCEPCIÓN ETILENO •  Receptores •  Otros •  Rutas enzimáccas García-­‐Jiménez P, Robaina RR. 2012. J Phycol. 48:710-­‐715. García-­‐Jiménez P., Brito-­‐Romano O., Robaina RR. 2013. J Phycol 49: 661-­‐669 EFECTO DEL ETILENO EN LA TETRAESPOROGÉNESIS 1. Incremento en el nº de ramas tetraesporangiales maduras Percepción del ecleno 2. Ablandamiento de los talos expuestos a 3h ecleno ETILENO SÍNTESIS: ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS DE ACS SINTASA, ACO , OXIDASA, DMSPlyase DMSP DMSPliasa 3.8 ± 0.3 nmol DMS h-­‐1 mg-­‐1 proteína Methionine SAM d-­‐SAM ACC sintasa 11.21± 1.19 nmol ecleno h-­‐1 mg-­‐1 proteína DMS 1-­‐aminocyclopropane-­‐1carboxylic acid, ACC Acrilato ACC oxidasa 7.13 ± 0.11 nmol ecleno h-­‐1 mg-­‐1 proteína Ecleno 1.12 ± 0.02 nmol ecleno h-­‐1 g-­‐1 fw PAs ETILENO Transcritos (mg RNA mL-­‐1) de talos en los diferentes tratamientos de ecleno. Transcritos son la media de 5 medidas ± SE. GENES: El ecleno incrementa los niveles de RNA, bien de genes inespecíficos como de otros relacionados con la percepción y síntesis del ecleno. RECEPTORES DE ETILENO ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS Receptores Ecleno IDENTIFICACIÓN DOMINIO GAF, HIS-­‐KIN, REC SECUENCIAS CONSENSO DISEÑO PRIMERS SENSOR QUINASAS (His-­‐Kin) PROTEÍNAS DE MEMBRANA. PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS AAA-­‐ATPase •  NO SECUENCIAS DE RECEPTORES DE ALGAS DEPOSITADAS EN NCBI •  POSIBLE NO HOMOLOGÍAS CON PLANTAS SUPERIORES OXILIPINAS, TRANSFERASAS, ESPECIES REACTIVAS PRODUCTOS DERIVADOS OXIDACION LIPÍDOS DE PARED ESPECIES REACTIVAS MECANISMOS DE SECUESTRO MECANISMOS DE MODULACIÓN QUINASAS OXILIPINAS H2O2 AMINOOXIDASA APX CAT SOD ACIDO JASMÓNICO METIL JASMONATO DÓNDE ESTAMOS AHORA? SECUENCIACIÓN MASIVA: TRANSCRIPTOMA • RNA de excelente calidad Carga homogénea de RNAm Distribución homogénea de las lecturas: con3gs Lecturas de las secuencias (READS) Alineación de las secuencias y mediante su solapamiento, la secuencia final va creciendo (CONTIGS) Ensamblaje de las secuencias Permicrá ir rellenado con secuencias intermedias hasta obtener el transcriptoma El transcriptoma nos va a permiGr • Ir ensamblando nuevas secuencias bajo diversas condiciones experimentales hasta obtener un transcriptoma completo o “casi completo”: transcriptoma de referencia. •  Análisis funcional basado en anotación de términos gene ontology a tres niveles (función molecular, componente celular y proceso biológico) . •  Determinación de función molecular para cada secuencia mediante blast search contra las bases de referencias NR y NT del NCBI. • Conocer qué genes se expresan bajo determinadas condiciones. • Cuancficar esos genes. • Ver cómo se modifican las secuencias. Estudiar SNPs. • …. RAFAEL ROBAINA ROMERO PILAR GARCIA JIMENEZ