TECANA AMERICAN UNIVERSITY Accelerated Degree Program Doctorate of Science in Biology- Parasitology & Medical Entomology INFORME Nº 3 “CONTROL BIOLÓGICO DE VECTORES” “El uso de hongos entomopatógenos para el control biorracional de TRIATOMINAE, vectores de la enfermedad de Chagas” M. Sc. Dalmiro José Cazorla Perfetti. “Por la presente juro y doy fe que soy el único autor del presente informe y que su contenido es fruto de mi trabajo, experiencia e investigación académica”. Coro, 16 de Febrero de 2.008 1 INDICE GENERAL Página LISTA DE FIGURAS Y CUADROS…………………………………….. 4 RESUMEN………………………………………………………………... 5 INTRODUCCIÒN…………………………………………………………. 6 CAPÌTULOS I IMPORTANCIA DE LOS TRIATOMINOS EN LA SALUD PÚBLICA……………………………………………. 8 Problemática actual de la enfermedad de Chagas en Venezuela…………………………………………. II CONTROL DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS…….. 12 Generalidades………………………………………. 12 Control químico de las poblaciones triatominos…. III 10 14 CONTROL BIOLÓGICO DE LAS POBLACIONES TRIATOMINAS……………………………………… Generalidades……………………………………… 18 18 Uso de hongos entomopatógenos como bioplaguicidas contra TRIATOMINAE…………………………… Mecanismo de acción de los hongos entomopatógenos… IV 20 22 ESTUDIOS SOBRE EL USO DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS NATIVOS COMO BIOPESTICIDAS CONTRA TRIATOMINAE EN VENEZUELA………………… 2 28 Generalidades……………………………………… 28 Germinación in Vitro ……………………………………… 28 Esporulación in Vitro e In Vivo ……………………………… 31 Ensayos de patogenicidad y virulencia de B. bassiana contra vectores de la enfermedad de Chagas en Venezuela………. 35 Aspectos histopatológicos y ultraestructurales sobre la relación B. bassiana-R.prolixus……………………………. 38 CONCLUSIONES…………………………………………………………….. 44 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………………………… 46 ANEXOS………………………………………………………………………. 67 A B Cadáveres esporulados de R. prolixus por efecto de B. bassiana…. 68 Acción ultraestructural de hifas de B. bassiana sobre tejidos de R. prolixus……………………………………………………….. 3 69 LISTA DE FIGURAS Y CUADROS FIGURAS Página 1 Ciclo vital de Trypanosoma cruzi……………………………… 9 2 Esporas de 3 especies de hongos entomopatógenos…………… 21 3 Ciclo de infección generalizado de un hongo entomopatógeno.. 23 4 Conidias, tubo germinativo y apresorio de un hongo entomopatógeno……………………………………………………………… 5 25 Adhesión, germinación e invasión de conidias de B. bassiana sobre tegumento de R. prolixus y T. maculata…………………………. 6 39 Invasión micelial de B. bassiana en hemocele y tegumento de R. prolixus……………………………………………………….... 7 40 Acción ultraestructural de hifas de B. bassiana sobre tejidos de R. prolixus…………………………………………………… 8 41 Fagocitosis, encapsulación y melanización de esporas de B. bassiana por hemocitos de R. prolixus…………………… 9 41 Fagocitosis, encapsulación y melanización de esporas de B. bassiana por hemocitos de R. prolixus………………………… 42 CUADROS 1 Comparación de la capacidad de esporulación de ninfas V de R. prolixus y T. maculata. …………………………………. 33 4 RESUMEN Se hace un revisión sobre el uso e implementación de los hongos entomopatógenos, con especial énfasis en el control de poblaciones triatominas, vectores del Trypanosoma cruzi. Los estudios muestran que el rociamiento intradomiciliar con insecticidas de origen químico representa una medida de control profiláctica práctica y efectiva contra los vectores-triatominos, no obstante, potencialmente representa un peligro para la salud del hombre y los animales, además de la biósfera en general. El uso constante de insecticidas químicos induce a mecanismos de resistencia en los insectos vectores. Como alternativa a los insecticidas químicos, se ha venido implementando tanto a nivel experimental como de campo, con resultados esperanzadores, la aplicación de formulaciones de hongos entomopatógenos como bio-controladores de las poblaciones triatominas, los cuales son más inocuos para los vertebrados. Las esporas de los hifomicetos penetran por el tegumento sobre los insectos hematófagos, tal como ocurre in extenso con las de B. bassiana sobre los triatominos. En relación con los mecanismos de acción de los hifomicetos, y particularmente en los aislados venezolanos, requieren de mayores estudios para dilucidar las clases de metabolitos secundarios presentes y en qué cantidades, de manera tal de poder utilizarlos en programas de control de vectores. En general, es poco lo que se ha hecho sobre el empleo de especies de hifomicetos nativos en TRIATOMINAE de Venezuela. Uno de los más estudiados es el aislado LF14, el cual ha mostrado ser altamente patógeno para Rhodnius prolixus y Triatoma maculata, siendo un patotipo que muestra una excelente adaptabilidad en su capacidad de germinación y esporulación y patogenicidad a las condiciones extremas del trópico venezolano. Además, los estudios histopatológicos y ultraestructurales confirmaron que sus conidias penetran vía tegumento a sus triatominos-hospedadores. Palabras clave: Control biológico, hongos entomopatógenos, Triatominos, enfermedad de Chagas. 5 INTRODUCCIÓN El reciente hallazgo epidémico en la víspera de la Navidad de 2007, de más de 80 casos de la enfermedad de Chagas en el municipio Chacao de la Gran Caracas, el más rico de Venezuela, confirma que esta enfermedad metaxénica está lejos de ser eliminada y, dada su condición de enzootia, mucho menos erradicada. En virtud de la elevada toxicidad de las drogas en uso (i.e, nifurtimox y benznidazole), y de que aún no se ha desarrollado una vacuna efectiva, la única medida profiláctica actual de control que evita la adquisición del Trypanosoma cruzi, es mediante la aplicación de insecticidas de origen químico contra las poblaciones triatominas involucradas en el ciclo doméstico de transmisión del hemoflagelado, siendo impráctica e inviables esta medida contra las poblaciones de vectores de hábitos peridomésticos y selváticos. No obstante, el uso de insecticidas de origen químico posee los incovenientes de que muchas veces los insectos adquieren resistencia hacia ellos, además de que generan problemas de toxicidad para el hombre, sus animales y el ecosistema en general. Por lo tanto, urge la necesidad de implementar programas de control de los vectores de la enfermedad de Chagas, enmarcados dentro de un diseño de Manejo Integral de Plagas (MIP) con una visión más ecológica o biorracional. En virtud de lo planteado, en el presente trabajo se realiza una investigación de los estudios hechos hasta la fecha sobre aspectos de la implementación de agentes biológicos, tanto macrobianos y microbianos, para el control biorracional de los vectores de la enfermedad de Chagas, con especial énfasis acerca del uso de hongos entomopatógenos, incluyéndose los estudios hechos en Venezuela con aislados nativos. La presente Monografía de Investigación fue organizada en cuatro Capítulos. En el Capítulo I, se comenta la relevancia en la salud pública de los triatominos en el contexto de la enfermedad de Chagas, abarcándose la realidad venezolana. En el Capítulo II, se discutió acerca de las medidas que se implementan para el control de la enfermedad de Chagas, particularmente sobre el manejo de las poblaciones triatominas con los insecticidas de origen químico, haciendo hincapié sobre sus inconvenientes. En relación con el Capítulo III, se diserta todo lo 6 relacionado con el empleo de agentes macrobianos y microbianos para el control de las poblaciones triatominas, discutiéndose especialmente acerca del uso de hongos hifomicetos, así como también de sus mecanismos de acción. Finalmente, en el Capítulo IV se comenta acerca de los estudios hechos en Venezuela con aislados y/o cepas nativas de hongos hifomicetos que han mostrado ser patógenos, o han sido usados, para las especies triatominas. Estos estudios incluyen los de tipo “In vitro” e “In vivo” de germinación, esporulación, patogenicidad y virulencia, y de la relación íntima hifomiceto-TRIATOMINAE, Con toda esta disertación, se propuso cumplir con los siguientes objetivos: OBJETIVOS Objetivo General Discutir los aspectos más relevantes acerca del uso de hongos entomopatógenos como elementos para el control biológico de poblaciones triatominas vectoras del T. cruzi. Objetivos Específicos - Analizar críticamente las medidas empleadas para el control de la enfermedad de Chagas. - Discutir las ventajas y desventajas del empleo de insecticidas de origen químico para el manejo de las poblaciones triatominas. - Describir los elementos macrobianos y microbianos empleados para el control biológico de los vectores de la enfermedad de Chagas. - Discutir la relevancia de los hongos entomopatógenos hifomicetos como elementos para el control biorracional de poblaciones triatominas. - Discernir el mecanismo de acción de los hongos entomopatógenos sobre sus hospedadores invertebrados. - Destacar los trabajos de investigación hechos en Venezuela sobre el uso de especies nativas de hongos entomopatógenos sobre TRIATOMINAE. 7 CAPITULO I IMPORTANCIA DE LOS TRIATOMINOS EN LA SALUD PÚBLICA Los triatominos, o “vinchucas”, “chipos”, “barbeiros”, “kissing bugs” como comúnmente se les denomina, entre otros nombres, en los idiomas español, portugués e inglés en las diferentes regiones de América, son artrópodos de la clase de los insectos. Dentro de INSECTA, se ubican en el orden HEMÍPTERA, familia REDUVIIDAE, subfamilia TRIATOMINAE, cuyos integrantes resaltan, dentro de sus características biológicas, por poseer hábitos estrictamente hematofágicos (Lent & Wygodzinsky, 1979; Carcavallo et al., 1998). La hematofagia de los triatominos los hace particularmente importantes dentro del grupo de las enfermedades metaxénicas que afectan a los humanos, ya que son los transmisores de la enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana (Lent & Wygodzinsky, 1979; Mujica & Mesa, 2007). En la actualidad, la subfamilia TRIATOMINAE se encuentra compuesta por cerca de 140 especies, agrupadas en 6 tribus y 18 géneros, incluyendo ALBERPROSENIINI (Alberprosenia), BOLBODERINI (Bolbodera, LINSHCOSTEUSINII Belminus, (Linshcosteus), Microtriatoma, Parabelminus), CAVERNICOLINI (Cavernicola), RHODNIINI (Rhodnius, Psammolestes) y TRIATOMINI (Triatoma, Meccus, Hermanlentia, Eratyrus, Mepraia, Dipetalogaster, Panstrongylus, Nesotriatoma, Paratriatoma) (Galvão et al. 2003; Forero et al., 2004; Poinar, 2005; Galvao & Angulo, 2006; Berenguer & Blanchet, 2007; Sandoval, Pabón, Jurberg & Galvao, 2007). De éstos, las principales especies de importancia epidemiológica se encuentran en los géneros Rhodnius (e.g., R. prolixus, R. pallescens), Triatoma (e.g., T. infestans, T. dimidiata) y Panstrongylus (e.g., P. megistus) (Lent & Wygodzinsky, 1979; Carcavallo et al., 1998). La enfermedad de Chagas es una parasitosis ocasionada por el hemoprotozoario flagelado, del orden Kinetoplastida, familia Trypanosomatidae, Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi (Becerril & Romero, 2004; Carlier, Luquetti, Días, Truyens & Kirchhoff, 2007). La manera natural más frecuente de su transmisión es a través de las heces de los triatominos vectores (Fig. 1), mientras que en las zonas urbanas la transmisión sanguínea, a través de las transfusiones, es la otra de las vías más importantes; también cabe mencionar las vías de transmisión 8 congénita, y la oral, ya sea cuando las heces de los triatominos y/o la orina de marsupiales (Didelphis sp.), donde se reproducen en sus glándulas anales, contaminan alimentos, así como también por la ingestión de carnes crudas de reservorios animales o por la lactancia materna (Becerril & Romero, 2004; PintoDías, 2005; Moreno et al., 2006; Carlier et al., 2007). Desde el punto de vista clínico, en la enfermedad de Chagas se reconocen tres etapas, a saber, una aguda de duración más corta y otra crónica más prolongada, separadas por un período clínico asintomático o fase indeterminada; las dos primeras fases usualmente se encuentran asociadas a lesiones cardíacas o del tracto digestivo, y las cardiomiopatías particularmente asociadas a la fase crónica hace de la tripanosomiasis americana la más letal de las enfermedades infeciosas del hemisferio occidental (Cubillos-Garzón, Casas, Morillo & Bautista 2004; Teixeira, Nitz, Guimaro, Gomes & Santos-Buch, 2006). Figura 1. Ciclo vital de Trypanosoma cruzi. Fuente: Tomado de [http://www.vetmed.ucdavis.edu/mpvm/MPVM_students_0607/H4_Williams/lifecycle.gif] 9 La enfermedad de Chagas se encuentra distribuida exclusivamente en el continente americano, entre el sur de los Estados Unidos de Norte América hasta Argentina y el sur de Chile en la América del Sur. Esta dolencia es un serio problema de salud pública, presentando el T. cruzi una gran variedad de cepas einfecta a 150 especies de animales domésticos y silvestres. Desde comienzos de los años 90, se crearon las denominadas Iniciativas oficiales para el control de la transmisión vectorial y transfusional, incluyendo las del Cono Sur (1991), Andina (1997), América Central y México (1998) y la del Amazonas (2004) (Gulh, 2007). Estas “Iniciativas” han sido exitosas; así en Chile y Uruguay se ha logrado la interrupción de la transmisión, lográndose por lo tanto la disminución de la incidencia de la enfermedad de Chagas en América Latina (W.H.O., 2002; Gulh, 2007). Sin embargo, estos éxitos no han sido del todo homogéneos, existiendo países del Cono Sur (Argentina, Bolivia, Paraguay), andinos (Colombia, Perú, Ecuador, Venezuela) y todos los de Meso-América y México donde los controles vectoriales han tenido diferentes grados de intensidad en las campañas con áreas geográficas no abarcadas, debido a la falta de conocimientos bio-ecológicos sobre las especies de triatominos-vectores (Gulh, 2007). En virtud de esto, se estima que de las 360-400 millones de personas que viven en las áreas endémicas, por lo menos 90 millones se encuentran expuestos de contraer la protozoosis, y entre 16 y 18 millones de personas están infectadas, con una incidencia anual entre 500 mil a 1 millón de nuevos casos, falleciendo un tercio de los individuos crónicamente afectados (Teixeira, Nascimento & Sturm, 2006; Teixeira et al., 2006). Problemática actual de la enfermedad de Chagas en Venezuela Después de que el médico brasileño C. Chagas hiciera el descubrimiento en 1909 de la dolencia, Tejera en 1919 hizo el primer reporte de la presencia de la enfermedad de Chagas en Venezuela (Puigbó, 2001; Añez et al., 2003; Añez, Crisante & Rojas, 2004). Para los años 30, 40 y 50 del siglo pasado, el médico venezolano J.F.Torrealba mediante la implementación del xenodiagnóstico, indicó que existían prevalencias entre 30-40% de la protozoosis en el país (Añez et al., 2003; Añez, Crisante & Rojas, 2004; Feliciangeli et al., 2007). Con la puesta en marcha de los programas de rociamiento de insecticidas de origen químico en los años 60, se comenzó de una manera sistemática con el control de la dolencia. Sin 10 embargo, entre 1962 y 1971 se detectaron seroprevalencias en el territorio nacional en algunos casos de más del 50%, incluyendo un 20,4% en el grupo etareo entre 0-10, lo que evidenciaba una transmisión activa (Pifano, 1974; Aché & Matos, 2001; Añez et al., 2003; Añez et al., 2004). En los años 80 del siglo XX, los esfuerzos gubernamentales por reducir la prevalencia e incidencia se hicieron más intensos, siendo considerado el país de la región andina con mayor experiencia y tradición en el control de la parasitosis (Gulh, 2007); de acuerdo con los datos suministrados por Aché & Matos (2001), entre 1958 y 1998 las tasas de seroprevalencia cayeron de 44,5 hasta 9,2%, lo que redujo el área chagásica nacional de 750.000 km2 a 365.000 km2. A pesar de esto, algunos autores consideran que en el país existe una re-emergencia de la enfermedad de Chagas, al detectarse casos agudos con 12,5% de mortalidad (Parada et al., 1996; Añez et al., 1999b). En este mismo sentido, Añez et al. (2004) revelan mediante serodespistaje en varios estados, incluyendo, entre otros, Anzoátegui, Monagas y Falcón, la presencia de una proporción importante de individuos seropositivos; lo que contrasta con lo que se afirma que la enfermedad de Chagas en Venezuela se encuentra restringida a los estados Portuguesa, Lara y Barinas o a regiones montañosas donde hay plantaciones cafeteras (Aché & Matos, 2001; Moncayo, 2003). Por lo tanto, el control y vigilancia epidemiológica de una enfermedad metaxénica como lo es la enfermedad de Chagas no debe ser sometida a la propaganda proselitista, toda vez que los triatominos son seres vivos con un genoma que les permite la plasticidad de adaptarse a las circunstancias ecológicas más diversas; lo dicho se hizo patente con la detección en la víspera de la Navidad de 2007 de un brote epidémico de tripanosomiasis americana en pleno centro de la capital de Venezuela (Barreto, 2007; Escalante & Bracci, 2007); sin embargo, en el mundo académico-científico esta noticia no debió ser tan extraña, toda vez que Feliciangeli (2005) llamó la atención, y alertó, acerca de la posible transmisión de la enfermedad de Chagas en las zonas urbanas, especialmente en la región capital, ya que constantemente se detectaba a ejemplares de P. geniculatus infectados con T. cruzi, frecuentemente en el domicilio por los habitantes del D.F. y de los estados Vargas y Miranda. 11 CAPITULO II CONTROL DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS Generalidades Existen enfermedades, como por ejemplo la poliomelitis, en la que se puede esperar una completa erradicación, i.e., una interrupción total de la transmisión. En cambio existen aquellas en las que sólo es posible esperar su eliminación en una escala de tiempo, y otras en las que sólo se puede esperar una reducción en su transmisión (Silveira & Vinhaes, 1999). No obstante de los resultados exitosos alcanzados hasta ahora, de acuerdo a las autoridades sanitarias de Latinoamérica y Venezuela, en las campañas anti- chagásicas, desafortunadamente dada su condición de enzootia, es poco probable que la tripanosomiasis americana sea una “enfermedad erradicable”: con toda seguridad el parásito se transmitirá entre los reservorios y triatominos en los ecotopos naturales, pudiéndose, inclusive, darse la reinfestación de las viviendas a partir de los ciclos silvestres, además, la enorme variedad de especies de resorvorios hace que sea imposible su erradicación; por otra parte, aún no se cuenta con una medida inmunoprofiláctica efectiva, ya que los antígenos de T. cruzi parecen estimular reacciones autoinmunes que hacen remota la posibilidad de una vacuna (Kierszebaun, 1985, Dumonteil, 2007), y de que las drogas (e.g., Nifurtimox y Benznidazole) en uso no logran eliminar los parásitos remanentes de tejidos (e.g., miocardio), además de su elevada toxicidad y problemas de resistencia (Brener et al., 1993; W.H.O., 1997; Añez et al., 1999a; Castro, de Mecca, & Bartel, 2006; Bartel et al., 2007; Rego et al., 2008), aunque se debe indicar que una nueva droga triazólica denominada TAK-187 muestra resultados esperanzadores contra el T. cruzi (Corrales et al., 2004); por lo tanto, a la luz de lo discutido y de las evidencias actuales, esta dolencia es realmente poco susceptible de ser “eliminada” (Morel, 1998; Schofield, Diotaiuti & Dujardin, 1999; Silveira & Vinhaes, 1999) Un programa de control de la enfermedad de Chagas debe tener presente que la transmisión del T. cruzi se encuentra estrechamente relacionada con las condiciones de pobreza de las poblaciones humanas endémicamente expuestas. En 12 este sentido, los triatominos domiciliados encuentran un ambiente favorable para esconderse en las rendijas de las paredes de bahareques y techos de palma de las viviendas pobres de las zonas rurales y de los barrios periféricos urbanos (Días, 1987a, b; 1992; Moncayo, 1999). Por otra parte, las amplias migraciones humanas que ocurrieron en Latinoamérica en las décadas de los 70 y 80 del siglo pasado, del campo hacia las ciudades incrementó la transmisión de la protozoosis por la vía de las transfusiones sanguíneas, cambiando definitivamente los patrones epidemiológicos (Días, 1987a, b; 1992; Guhl & Vallejo, 1999; Moncayo, 1999). Asimismo, la necesidad de establecer nuevos acentamientos humanos en áreas silvestres donde circula activamente el parásito aumenta el riesgo de colonización y/o invasión intradomiciliar de los triatominos y, por lo tanto, de transmisión activa, por la destrucción de los ecotopos naturales. Obviamente, ésto puede causar la disminución, e inclusive la desaparición, de las fuentes alimentarias naturales de los triatominos, conllevando a la invasión de las viviendas por estos vectores para alimentarse sobre humanos (Días-Lima & Sherlock, 2000). En este sentido, es oportuno señalar los hallazgos de Sampson-Ward & Urdaneta (1988), y Herrera & Urdaneta (1992; 1997), quienes detectaron focos naturales de tripanosomiasis americana en pleno valle de Caracas, DF, asociados a triatominos, marsupiales y roedores sinantrópicos, lo que hace que potencialmente pueda existir transmisión activa de la dolencia, especialmente en zonas de la capital venezolana que exhiben un deficitario control sanitario (Herrera & Urdaneta, 1997), y más recientemente Reyes-Lugo & Rodríguez-Acosta (2000) encuentran poblaciones intradomiciliarias de P. geniculatus, una especie considerada habitualmente como de hábitos silvestres, en el municipio Hatillo aldedaño a Caracas. Esto discutido se hizo patente recientemente en pleno Municipio Chacao de Caracas, paradójicamente el municipio más rico de Venezuela, con el hallazgo de un brote epidémico con más de 80 casos, al contaminarse mediante las heces de triatominos infectados con el protozoo el jugo del almuerzo escolar (Barreto, 2007; Escalante & Bracci, 2007), tal como ocurrió durante los carnavales del 2005 en Florianópolis, estado de Santa Catarina, Brasil, por la ingestión de jugo de caña, muriendo inclusive 5 de los 30 turistas argentinos infectados (Medina, Savio & Hernández, 2005; Nolte, 2005) . Aunado a esta problemática, como ya fue 13 reseñado, existe la posibilidad de reinfestación y/o invasión de parte de las especies triatominas de hábitos peridomésticos y selváticos, en áreas donde la eliminación de los triatominos domésticos ha sido exitosa, lo cual se hace epidemiológicamente más alarmante cuando el hecho ocurre por parte de las especies con hábitos selváticos, e.g., T. tibiamaculata (Pinto, 1926) y P. geniculatus (Latreille, 1811) en la ciudad de Bahía y la isla de Marajó, en el noreste y en el delta del río Amazonas de Brasil, respectivamente (Valente, 1999; Días-Lima & Sherlock, 2000). De lo discutido se deriva la premisa de que la interrupción de la transmisión de la enfermedad de Chagas se encuentra dirigida a la prevención de nuevos casos en niños y jóvenes, ya sea mediante los controles vectorial en las viviendas humanas y transfusional en los bancos de sangre; esto último se hace mediante screening serológico de la sangre donada, descartándose las positivas a la presencia de T. cruzi (Días, 1987a, b; 1992; Schumis, 1999; Moncayo, 1999). En cambio, las poblaciones triatominas se controlan ya sea mediante mejoramiento físico de la vivienda, o por el rociado de insecticidas de origen químico de las casas infestadas, la cual es la medida mayormente implementada (Moncayo, 1999). Control químico de las poblaciones triatominas El uso de insecticidas residuales de origen químico es la medida más práctica y rápida para interrumpir la transmisión vectorial de la enfermedad de Chagas, siendo la aplicación de los plaguicidas dentro de las viviendas el método más tradicional (Pinchin, Oliveira Filho, Fanara & Gilbert, 1980; W.H.O., 1999). El combate químico de los triatominos comenzó con el uso de los organoclorados (Diedlrín, HCH) en las décadas 50-60 del siglo XX, y continuó con la aplicación de organofosforados (fenitrotión, malatión) en la década de 1970. Desde 1980-90, se sustituyeron éstos casi exclusivamente por piretroides, lo que permitió bajar las dosis de uso entre 10 y 20 veces, en la actualidad, preferentemente se utilizan piretroides sintéticos de tercera generación (cianopiretroides) con base acuosa y de aplicación foable, incluyendo deltametrina, beta-cipermetrina, beta-ciflutrina y lamda-cihalotrina, los cuales poseen menor riesgo para el ser humano y el medio 14 ambiente (Pinchin et al., 1980; Zaim, Aitio & Nakashima, 2000; W.H.O., 1999; Zerba, 2004). Siendo la aplicación de insecticidas de origen químico la medida antivectorial más implementada actualmente y práctica hasta el presente para el control y prevencion de la enfermedad de Chagas, no obstante, también posee sus inconvenientes, ya que éstos tienen una alta estabilidad química y física, característica ésta que los hace persistentes en el ambiente (Murphy, 1980; Mazzarri & Mazzarri, 1987). Uno de los inconvenientes más resaltantes es en relación con los efectos tóxicos potenciales de éstos sobre la salud humana y de los animales, tanto los de hábitos silvestres como aquellos domesticados por el hombre y los organismos benéficos (e.g., polinizadores y enemigos naturales de otros artrópodos dañinos), así como también a toda la biósfera en general, lo que evidentemente alteraría el equilibrio natural de los ecosistemas con la subsecuente contaminación de las aguas y los suelos (Murphy, 1980; Sosa-Gómez & Moscardi, 1991; Cook et al., 1996). En este sentido, se tiene que anualmente ocurren entre 10.000 a 20.000 decesos humanos en el globo terráqueo como consecuencia de su aplicación, guarismos que se pueden incrementar hasta diez veces más, particularmente en los denominados países en desarrollo (Andrade Carvalho, 1991; McConnell & Hruska, 1993; Klein-Schwartz & Smith, 1997). Dentro de los efectos más severos de los insecticidas que se emplean para controlar a las poblaciones triatominas, incluyendo a los organoclorados, organofosforados, carbamatos y los piretroides, son los que afectan al sistema nervioso al inhibir los canales iónicos y los químicos neurotransmisores, pudiendo producir desde efectos clínicos tóxicos, especialmente los de tipo agudo, leves, moderados y de gravedad, incluyendo, entre otros, desde debilidad, náuseas, alteraciones de la marcha, convulsiones generalizadas, trastornos psíquicos hasta la muerte por insuficiencia respiratoria y cardíaca (Organización Mundial de la Salud, 1995; Pose, De Ben, Delfino & Burguer, 2000; Costa , Giordano , Guizzetti & Vitalone, 2007 ). Actualmente, existen numerosos estudios en los que se viene demostrando la asociación entre el Mal de Parkinson, una dolencia degenerativa del sistema nervioso central, y la exposición a pesticidas químicos (Brown, Rumsby , Capleton , Rushton & Levy , 2006). En este mismo sentido, y 15 lo cual es alarmante, existen fuertes evidencias entre la aparición de varios tipos de cánceres, especialmente leucemia en niños, ante la exposición a insecticidas químicos, así como también con abortos, mortinatos y defectos congénitos (García, 2003; Bassil et al., 2007). Otro de los inconvenientes que ocasiona el uso de los insecticidas de origen químico, es en lo referente a la aparición de poblaciones de insectos resistentes, producto de su aplicación inadecuada o indiscriminada (extensiva e intensivamente), o por la biología intrínseca del vector (e.g., fenómeno preadaptaivo de pocos individuos) (Zerba, 2004). Particularmente en TRIATOMINAE, se ha detectado dicha resistencia en R. prolixus en Venezuela hacia carbamatos, piretroides, organofosforados y organoclorados, y T. maculata hacia estos últimos compuestos (González-Valdivieso, Sánchez & Nocerino, 1971; Cockbum, 1972; Nocerino, 1976; Nelson & Colmenares, 1979; Vassena, Picollo & Zerba, 2000; Soto Vivas & Molina de Fernández, 2001; Molina de Fernández, Soto Vivas & Barazarte, 2004), y hacia los piretroides en T. infestans en Argentina, Brasil y Perú, y P. herreri en este último país mecionado (Nelson & Colmenares, 1979; Vasena et al., 2000; Yon et al., 2004; Zerba, 1999; 2004). Este fenómeno trae como consecuencia que se tengan poblaciones triatominas fuera de control, que exista un aumento en el uso y frecuencia del químico, con el subsecuente mayor impacto sobre el ambiente y la biósfera (Zerba, 2004). Dentro de los retos que se deben afrontar desde un punto de vista de la Salud Pública en Venezuela, es en relación, antes que nada, en la evaluación de la toxicidad crónica de los insecticidas de origen químico para la población humana endémicamente expuesta. Esto se indica, ya que generalmente la preocupación principal, probablemente porque posee mayor impacto, es con lo referente a la toxicidad aguda. Por lo que hay que abocarse a la síntesis o extracción de sustancias químicas que sean cada vez más inócuas, tanto para el hombre como para toda la biósfera. Otro punto importante que pareciera estarse descuidando, es en lo referente a la monitorización de la resistencia de las poblaciones triatominas hacia los insecticidas químicos en uso; una problemática que se puede prevenir con la vigilancia epidemiológica constante. Así mismo, debe exigirse la 16 investigación de la dinámica poblacional de los triatominos vectores, especialmente los de hábitos peridomésticos y selváticos, los cuales tienden invadir y adaptarse a la domiciliación donde se han diezmado los vectores de hábitos tácitamente domésticos con rociamiento de insecticidas químicos. 17 CAPITULO III CONTROL BIOLÓGICO DE LAS POBLACIONES TRIATOMINAS Generalidades Por todo lo anteriormente, parece pertinente proponer que un programa de control y vigilancia epidemiológica de la enfermedad de Chagas debe involucrar un Manejo Integral de Plagas (MIP), más aún cuando se sabe que los principales vectores de Chagas en el país no son estrictamente domiciliarios. En efecto, a pesar de que R. prolixus, principal vector de la tripanosomiasis americana en Venezuela (Lent & Wygodzynsky, 1979; Días, 1992; W.H.O., 1997), puede alcanzar altas densidades poblacionales dentro de la habitación humana, existen, asimismo, poblaciones silvestres de esta especie que habitan en palmeras llaneras indistinguibles morfométricamente de aquellas capturadas dentro del domicilio (Schofield & Dujardin, 1999), por lo tanto, es muy probable que R. prolixus sea un triatomino con un hábitat natural y silvestre con adaptación secundaria al domicilio humano (Gamboa, 1963; Guerrero & Scorza, 1981). Por otra parte, T. maculata, considerado como un vector alterno de la tripanosomiasis americana en Venezuela (Días, 1992), es una especie distribuida en todo el territorio nacional (Ramírez-Pérez, 1985; 1987; Galvao, Carcavallo, Rocha & Jurberg, 2003). Se le captura en todos los hábitats, incluyendo el silvestre, el peridoméstico y dentro de la habitación humana (Tonn, Otero, Mora, Espínola & Carcavallo, 1978; Ramírez- Pérez, 1985; Carcavallo et al., 1997). Se le tiene como una especie que reemplaza a R. prolixus en el domicilio en aquellas zonas donde esta última es eliminada por la acción humana (Zeledón, 1974). En este sentido, es oportuno implementar como una medida alternativa a los insecticidas de origen químico, aquellos que utilizan organismos vivos para reducir la transmisión del T. cruzi por parte de los triatominos a la población endémicamente expuesta: es el denominado control biológico. Este último puede definirse tal como lo propone López –LLorca (1992): “la acción de parásitos, predadores o patógenos (diferentes del hombre), que mantienen la densidad de población de otro organismo más baja de la que existiría en su ausencia”, i.e, sus enemigos naturales, los cuales pueden ser manipulados por el hombre o no. El control 18 biológico de plagas posee la desventaja de que se requiere paciencia, entrenamiento y un mayor estudio biológico, ya que los enemigos naturales atacan a un insecto-plaga específico, a diferencia de los agentes químicos que destruyen a un amplia variedad de insectos; además, estos enemigos naturales muchas veces son susceptibles a la acción de los pesticidas, lo que requiere mucho cuidado en su manejo; así mismo, el control biológico también muchas veces es de acción lenta, y en algunos organismos su producción masificada no siempre es rentable desde el punto de vista económico (López –LLorca, 1992). Para el control biológico de los triatominos, en varios países de Centro y Sur América, e inclusive de Asia, se han estudiado y utilizado numerosos insectos entomófagos (bioplaguicida macrobiano), incluyendo predadores de los órdenes Orthóptera, Hemíptera, Coleóptera, Díptera e Hymenóptera, estando en este último orden las especies parasitoides de las familias Aphelinidae, Eupelmidae, Encyrtidae y Scelionidae (De Santis, Loiacono & Coscaron, 1987). En nuestro país, desde los trabajos pioneros de Ortiz & Alvarez (1959), se han estudiado y ensayado las avispas de las especies Telenomus costalimai, T. capito (Scelionidae) y Ooencyrtus venatorius (Encyrtidae) contra los huevos de R. prolixus (Feliciangeli, 1973; 1976; De Santis, Sarmiento, Rabinovich & Feliciangeli, 1975-1976; De Santis et al., 1987), desafortunadamente, sin embargo, hasta los momentos su implementación rutinaria y comercial no es un hecho tangible para el control de la protozoosis. Más recientemente, se ha reportado la potencialidad de ácaros (Pimeliaphilus plumifer) de la familia Pterygosomatidae como posible biocontroladores de las poblaciones triatominas, al observarse que éstos causan en Meccus pallidipennis mortalidad, la reducción de la muda, y de la fertilidad de las hembras debido a la desnutrición por la infestación de estos ácaros (MartínezSánchez, Camacho, Quintero-Martínez & Alejandre-Aguilar, 2007). Para Schofield (1990) este tipo de herramienta biológica posee la desventaja de no ser efectivo en pruebas de campo y por ser muy costoso, siendo “irrelevante ya que la mortalidad inducida por una liberación inundativa puede ser fácilmente compensada, los depredadores o los parasitoides rápidamente alcanzarían niveles de equilibrio que no afectaría al nivel de población de chipos (porque esta no es la forma en que las poblaciones de chipos son reguladas”, no obstante, este 19 autor no menciona la desventaja de la toxicidad que eventualmente puedan ocasionar los insecticidas de origen químico a los vertebrados, incluyendo al hombre. El control microbiano se puede referir como la rama del control biológico que emplea microorganismos (bacterias, viurus, hongos, nemátodos, protozoarios) para disminuir y controlar las poblaciones de artrópodos- plagas (López –LLorca, 1992; Lecuona, 1996). En relación con el uso de las bacterias en TRIATOMINAE, Lima , dos Santos , da Silva , Rabinovitch (1994) han obtenido resultados exitosos con la aplicación de Bacillus thuringiensis, bacteria Gram-positiva que es uno de los agentes microbianos más extensamente utilizado en los programas de MIP (Lacey & Siegel 2000), sobre T. vitticeps, bajo condiciones de laboratorio. De interés ha resultado el aislamiento en T. infestans del virus Triatoma-virus (TrV), el cual es un picorna-like virus; su aplicación en estos insectos les paraliza las piernas y les impide la ecdisis. Su transmisión vertical (transovárica) y horizontal (vía oral-fecal) hace que se tengan expectativas acerca de su utilización como herramienta en futuros programas de control biológico de triatominos (Muscio,Torre & Scodeller, 1987; Muscio, La Torre, Bonder & Scodeller, 1997; Rozas-Dennis, Cazzaniga & Guérin, 2002). Uso de hongos entomopatógenoas como bioplaguicidas contra TRIATOMINAE. Otro de los microorganismos que se han implementado contra TRIATOMINAE son los hongos (División Eumycota) filamentosos mitospóricos del orden Hypocreales (Fig. 2) [(Ascomycota, que fueron clasificados anteriormente en la clase Hiphomicetos, Fungi Imperfectis: Deuteromicotina) (Dolinshy & Lacey, 2007)], particularmente las especies Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae (Fig. 2), aunque también se han ensayado en menor grado los entomopatógenos B. brongniartii, Nomuarea rileyi, Paecilomyces fumosoroseus, Evlachovaea sp., Penicillium corylophilum y Aspergillus giganteus (Mora Costa, 1978; Sherlock & Guitton, 1982; Silva & Messias, 1986; Messias, Daoust & Roberts, 1986; Romaña, Fargues & Pays, 1987; Luz & Fargues, 1997; 1998; Luz, Silva, Cordeiro & Tigano, 1998a; 1999; Fargues & Luz, 2000; Lara da Costa , Lage de Moraes & Galvão, 2003; Luz, Rocha & Silva, 2004). 20 Beauveria bassiana Metarhizium anisopliae Verticillium lecanii Figura 2. Esporas de 3 especies de hongos entomopatógenos Fuente: Tomado de [www.invasive.org/hwa/pathogens.cfm] Los hongos superan a los insectos y/o artrópodos en general debido a su ciclo de vida corto (alto potencial reproductivo), producen esporas de resistencia o tienen fases saprofíticas en la ausencia de sus hospedadores. Además, los hongos pueden ser modificados con las nuevas herramientas biotecnológicas, y son generalmente inocuos para los organismos que no son sus hospedadores. Por lo general, los hongos se pueden producir masivamente y a bajos costos (LópezLLorca, 1992; Zambrano, García, Zambrano, Linares & Molina, 1992; Dolinshy & Lacey, 2007). Los hongos mitospóricos B. bassiana y M. anisopliae infectan especies diferentes de insectos de varios órdenes, aunque se tienen aislados altamente específicos, siendo las especies entomopatógenas más empleadas a nivel mundial (Ferrón, Hurpin & Robert, 1972; Fargues, 1976); particularmente B. bassiana es capaz de infectar a más de 700 especies insectos (Barbercheck & Kaya, 1990; Goettel & Inglis, 1997). Los mismos son unos excelentes candidatos para ser utilizados como bioinsecticidas contra los vectores del Mal de Chagas, debido a que establecen la infección por contacto, no debiendo ser ingeridos por estos hemípteros de hábitos hematofágicos estrictos (Luz, Tigano, Silva, Cordeiro & Aljanabi, 1998b). Varios investigadores han probado cepas de estos hongos con una alta virulencia contra varias especies triatominas de importancia epidemiológica, incluyendo, entre otras, R. prolixus, T. infestans, T. brasiliensis y P. megistus, con resultados alentadores (Romaña, Fargues & Pays, 1987; Luz & Fargues, 1997; 1998; Luz, Silva, Cordeiro & Tigano, 1998a; Luz, Tigano, Aljanabi, 1998b; Luz et la., 1999; Fargues & Luz, 2000), inclusive a nivel de campo con resultados promisorios (Luz, Nery, Magalhaes & Tigano, 2004; Luz & 21 Batagin, 2005). No obstante, como bien lo señalan Goettel & Inglis (1997), los hongos son organismos que dependen de numerosos factores, tanto bióticos como abióticos, que pueden determinar o influenciar su acción patógena sobre los insectos. Estos incluyen la cepa (aislado) o especie de hongo, el estado fisiológico del hospedador, la nutrición, los mecanismos de defensa, los microorganismos cuticulares y epicuticulares, y otros diversos factores como los de tipo ambiental (temperatura, humedad relativa, luz, etc.). Los ensayos a nivel de laboratorio deben tratar de imitar, lo mayor posible, las condiciones ecológicas que predominan en la naturaleza, ya que los insectos son más susceptibles en las condiciones controladas de laboratorio que en las del medio ambiente donde ellos habitan (Goettel & Inglis,1997). Mecanismo de acción de los hongos entomopatógenos Antes de entrar a estudiar directamente el mecanismo de acción de los hongos entompatógenos, se debe describir, aunque no tan extensamente, la estructura de la pared celular de los hongos. Esta se encuentra constituida por polisacáridos, principalmente quitina, que también se encuentra en los artrópodos, y es de tipo estructural; además posee proteínas, que son glicoproteínas, con galactosa y manosa; lípidos (ácidos grasos); pigmentos, básicamente compuestos de melanina, y sales inorgánicas (Ruiz, 1991; Wessels, 1999; Pucheta, Flores, Rodríguez & De la Torres, 2006). A diferencia de otros organismos patogénicos de artrópodos (e.g., virus, bacterias), los hongos entomopatógenos pueden invadir a sus hospeadores a través del exoesqueleto, ya sea por adherencia de sus esporas en las partes bucales, tegumento y/o los espiráculos (Carruthers & Hural, 1990; Khachatourians & Valencia, 1999;; Holder & Keyhani, 2005; Pucheta et al., 2006; Holder, Kirkland, Lewis & Keyhani, 2007). De una manera general (Fig. 3), se puede dividir los eventos que desarrollan los hongos para parasitar a sus hospedadores artrópodos-plagas en las siguientes fases: i) germinación; ii) formación de apresorios; iii) formación de estructuras de penetración; iv) colonización, y v) reproducción (Pucheta et al., 2006). 22 Figura 3. Ciclo de infección generalizado de un hongo entomopatógeno. Fuente: Tomado de [www.invasive.org/hwa/pathogens.cfm] El proceso se inicia cuando la espora o conidio viable (Fig. 4), encuentra un lugar propicio sobre la cutícula o tegumento de sus hospedadores artrópodos, para establecer la relación patógeno-hospedador; para ello, la superficie de la pared celular del hongo debe adherirse a la cutícula; mediante herramientas de la Biofísica, varios estudios han indicado que existen asociaciones inespecíficas y específicas, detacándose que iones Ca++ y Mg++ logran disminuir las fuerzas de repulsión electrostáticas entre ambas superficies al modificar la hidrofobicidad, que es determinada en parte a proteínas denominadas hidrofobinas que disminuyen la tensión superficial del agua y carbohidratos, facilitándose la unión pared celular fúngica-cutícula del invertebrado. Luego, un proceso de enlace aún más específico se da a través de la partcipación de estructuras con actividad parecida a lectinas (Fargues, 1984; Boucias, Pendland, & Latge, 1988; Doss, Potter., Soeldner, Christian & Fukunaga, 1995; Wosten, De Vries. & Wessels, 1993; Soeldner, Christian & Fukunaga, 1995; Holder & Keyhani, 2005; Kwan et al., 2006; Pucheta et al., 2006; Holder et al., 2007). Es importante resaltar que, como bien lo indican Fargues (1984), Khachatourians & Valencia (1999) y Holder et al. (2007), la conformación lipídica de la superficie de la epicutícula determinará el éxito o el fracaso de la eficacia entomopatogénica de las esporas 23 fúngicas, ya que este paso es primordial para que se instaure la micosis; en este sentido, existen grupos de insectos, como los Homópteros, que al poseer un epicutícula demasiado grasosa impide la efectividad de las esporas muy hidrofílicas. Después que ocurre la adhesión de la espora, esta necesita germinar, proceso que es disparado por carbohidratos que actúan como mensajeros y que están presentes en el exoesqueleto de los artrópodos (Hegedus & Khachatourians, 1995; Khachatourians, 1996; Pucheta et al., 2006). Al entrar en contacto con el tegumento, las esporas deben encontrar el sustrato nutricional (Carbono, Nitrógeno y otros elementos) y las condiciones ambientales de alta humedad, temperatura y luz necesarias para su germinación; la cubierta mucigilanosa de las esporas posee propiedades antidesecantes que las ayudan a conservar su hidratación; con esto, las esporas lograrán hincharse (Hegedus & Khachatourians, 1995; Khachatourians, 1996; Pucheta et al., 2006). Una vez que ocurre el hinchamiento, se forma un tubo germinativo o haustorio (Fig. 4) y un apresorio (Fig.4), mediante el crecimiento apical de la pared celular, el cual es estimulado por un flujo iónico (Ca++ y H+) (Riquelme, Reynaga, Gires & Bartnicki, 1998; Harold, 1999; Wessels, 1999; Pucheta et al., 2006). El tubo germinativo permite reconocer los receptores a nivel del tegumento donde se fijará la hifa, y con el apresorio (hifa de penetración) el hongo logra anclarse a la cutícula del hospedador, y posteriormente penetrar hacia el celoma del artrópodo (Wessels, 1999; Hajek & Eastburn, 2003; Pucheta et al., 2006). Ahora, el hongo logra penetrar mediante mecanismos físicos producto de la presión mecánica del apresorio, y químicos, mediante la excresión de enzimas hidrolíticas, incluyendo, entre otras, proteasas, lipasas, quitinasas, quitobiasas, lipooxigenasas, las cuales logran degradar la cutícula del hospedador, apreciándose síntomas de histólisis, y adicionalmente le ayudan a la penetración mecánica y proporciona nutrientes al hongo (St Leger, 1995; St. Leger, Joshi, Bidochka, Rizzo & Roberts, 1996; Monzón, 2001; Pucheta et al., 2006). Al estar la cutícula compuesta en hasta un 70% de proteínas, las proteasas juegan un papel fundamental en el proceso de hidrólisis cuticular (St Leger, 1995; St. Leger et al., 1996). 24 Figura 4. Conidias, tubo germinativo y apresorio de un hongo entomopatógeno. Fuente: [http://www2.scielo.org.ve/img/fbpe/inci/v31n12/art06img02.gif] Una vez que el hongo logra penetrar, la hifa se ensancha y se ramifica formando cuerpos hifales secundarios (blastosporos), invadiendo todas las capas cuticulares, y luego se expande hacia los órganos internos del insecto (e.g., túbulos de Malpighi, cuerpos grasos) y todo el hemocele, produciendo cambios patológicos como convulsiones, carencia de coordinación y comportamientos alterados, logrando su colonización total después de la muerte del artrópodo (Tanada & Kaya 1993; Pucheta et al., 2006); el deceso del insecto se produce por los cambios pato1ógicos en el hemocele, acción histolítica, el bloqueo mecánico del aparato digestivo, secundario al crecimiento de las hifas, y por la producción de metabolitos secundarios denominados micotoxinas, las cuales aunque son de baja toxicidad para los vertebrados, para los insectos son altamente tóxicas, teniendo por lo tanto una vital importancia en el ciclo de la relación hospedadorhifomiceto, al causarles desde la degeneración de tejidos producto de la pérdida de la integridad estructural de las membranas, seguido de la deshidratación de las células por pérdida de fluidos (Gillespie & Claydon, 1989; Tanada & Kaya 1993; Pucheta et al., 2006); existen, desde el punto de vista químico, varios tipos de metabolitos secundarios (microtoxinas) involucrados en la acción patogénica de los hongos; en este sentido, primeramente tenemos varias clases de ácidos 25 orgánicos (e.g., ácido oxálico, ácido dipicolínico) (Claydon & Grove, 1982; Hegedus & Khachatourians, 1995; Asaff, García-Rojas, Viniegra-González, de la Torre, 2006); otra familia de compuestos bioquímicos, es el grupo de las toxinas peptídicas cíclicas y lineales, siendo los disipéptidos una de las mejor estudiadas (Pucheta et al., 2006); el primer compuesto de disipéptidos aislado fue beauvericina, a partir de B. bassiana, la cual actúa sinergícamente con otros compuestos (Billich & Zocher, 1988; Pucheta et al., 2006). Los metabolitos secundarios de naturaleza peptídica mejor estudiados, son las destruxinas, que se han aislados a partir de M. anisopliae, y que actúan a nivel de la síntesis de ADN, ARN y de proteínas de los hospedadores- artrópodos (Quiot, Vey & Vago, 1985; Gillespie & Claydon, 1989; Monzón, 2001; Pucheta et al., 2006). Posteriormente de la invasión miceliar interna general, si la disponibilidad de agua es alta y la temperatura adecuada, la fase reproductiva del hongo se da en dos etapas: miceliación y esporulación, entonces emerge fuera del insecto atravesando la cutícula, especialmente por las áreas más débiles, espiráculos, regiones intersegmentales, esporulando sobre la superficie de la momia del hospedador, y logrando producir suficiente inóculo para infectar a otros insectos; por el contrario, si las condiciones son secas, el proceso reproductivo fúngico se detiene, y sólo se observan los insectos momificados y no cubierto por una capa algonodosa (miceliación) o por una especie de polvillo blanco, verde o lila (esporulación) (Gillespie & Claydon, 1989; Tanada & Kaya 1993; Goettel & Inglis, 1997; Pucheta et al., 2006). Es significativo señalar, como bien lo indican Pucheta et al. (2006), que durante la invasión miceliar dentro del hemocele, además de nutrientes, el hongo también se encuentra expuesto a la acción de la respuesta inmune celular de los hemocitos y/o de compuestos bioquímicos de la humoral del artrópodo-hospedador, tales como la fagocitosis, melanización y la encapsulación, para la cual el hongo también ha desarrollado mecanismos de defensa y evasión, pero si el artrópodo se encuentra en un estado de inmunodeficiencia, ya sea por efectos biótico y/o abióticos, entonces la acción de los hongos es más rápido (Tanada & Kaya 1993; Hayek & St Leger, 1994; Hegedus & Khachatourians, 1995; Rendón & Balcázar, 2003). 26 Siendo los mecanismos patogénicos de los hongos entomopatógenos un proceso complejo, que aún le falta mucho por dilucidarse, es necesario por lo tanto aumentar la investigación en estos aspectos. Con esto se puede indagar, en primer lugar, las cepas y aislados de los entomopatógenos que posean las características específicas para un artrópodo en particular o situaciones del trópico, especialmente del ambiente venezolano. Así mismo, comprender estos mecanismos, permitirá obtener y seleccionar los patotipos que produzcan mayor cantidad de esporas y metabolitos secundarios (micotoxinas) más virulentos, e inclusive manipularlos genéticamente, para ser empleados en futuros programas de MIP, especialmente en control de TRIATOMINAE. También, cabe la posibilidad de aislar los metabolitos secundarios o micotoxinas altamente entomotóxicas especie-específico, y sintetizarlas artificialmente, en un intento por lograr su comercialización. Uno de los grandes retos que debe proponerse la comunidad científica internacional y particularmente la nacional, especialmente en estos momentos en que la temática del calentamiento global se encuentra sobre el tapete y sus consecuencias catastróficas predicitivas son apocalípticas, es en lo relacionado de convencer, o de sensibilizarlas, a las autoridades sanitarias encargadas del Programa de Control de Vectores acerca de al menos disminuir el uso de las cantidades de insecticidas químicos, y que se implementen concomitantemente otras alternativas, todo dentro de un amplio programa de manejo integrado con visión ecologistas; esto por supuesto incluye el empleo de control macro y microbiano de vectores. 27 CAPITULO IV ESTUDIOS SOBRE EL USO DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS NATIVOS COMO BIOPESTICIDAS CONTRA TRIATOMINAE EN VENEZUELA. Generalidades En Venezuela, los bioinsecticidas autóctonos con hongos hifomicetos se han implementado con un rotundo éxito en el control biorracional como parte de un Manejo Integrado de Plagas (MIP) de interés agrícola, siendo su comercialización un hecho tangible con patentes de un aceptable nivel eficiencia/costo (Zambrano, García, Zambrano, Linares & Molina, 1992; Fernández & Colmenares, 1997; Alcalá de Marcano, Marcano & Morales, 1999; Pavone, 2003; Montilla, Camacho, Quintero & Cardozo, 2006; Linares & Salazar, 2008). Sin embargo, su utilización y aplicación para el manejo de poblaciones de insectos de interés médico-sanitario ha sido prácticamente de poca importancia o de limitada implementación (e.g., Scorza-Dágert & Cova, 2006; Cova & ScorzaDágert, 2006, para el caso de Musca domestica, y Agudelo-Silva & Wassink, 1984 para el de Aedes ageypti). Es un hecho bien documentado que los hongos hifomicetos exhiben un amplio rango de variabilidad genética (St Leger, Alee, May, Staples & Roberts, 1992; Luz et al., 1998b; Couteauddier, Viaud & Neuveglise, 1998), por lo que es importante identificar la variabilidad biológica, bioquímica, genética y fisiológica existente entre los distintos aislados y especies, de manera tal que permita seleccionar los mejores patotipos adaptados a las condiciones del trópico venezolano, para ser utilizados efectivamente como potenciales micoinsecticidas contra las especies triatominas selváticas, peridomésticas y/o domésticas de Venezuela. En esta sección se documentará los estudios, en el sentido más amplio posible, hechos hasta el presente con cepas y/o aislados autóctonos de hongos entomopatógenos empleados contra especies de TRIATOMINAE, especialmente contra los principales vectores (i.e, R. prolixus y/o T. maculata). Germinación in Vitro Al ser la germinación de los conidios uno de los primeros eventos para que ocurra la infección fúngica, y por lo tanto las epizootias, resulta importante y 28 relevante estudiar la influencia de los factores, especialmente a nivel estresante, incluyendo los ambientales (e.g., temperatura), sobre el proceso germinativo, en un intento por comprender y clarificar cómo se genera el proceso de infección de los hongos entompatógenos sobre sus hospedadores invertebrados. Sin embargo, se debe tener siempre presente que a pesar de que los medios artificiales “In Vitro” representan una herramienta útil para obtener información sobre la influencia de los factores ambientales en el proceso germinativo de los conidios, hay diferencias con las condiciones naturales existentes en la cutícula de los insectos, así como también la complejidad de la interacción de esta estructura con los conidios (Luz y Fargues, 1997; Lecuona et al., 2001). De acuerdo a la bibliografía consultada, el único trabajo hecho en Venezuela sobre el proceso germinativo en hifomicetos autóctonos ensayados o que hayan mostrado patogenicidad sobre especies de triatominos, especialmente los principales vectores, se debe a Cazorla, Morales & Acosta (2007). Estos investigadores realizaron ensayos “In Vitro” sobre medio sólido (agar-Lactrimel) acerca de la influencia de gradientes térmicos (6- 40ºC), salinos (4 – 70% concentración salina [NaCl]) y pH (1,32 - 12) sobre la capacidad de germinación de un aislado autóctono o nativo (LF 14) de B. bassiana, proveniente del Estado Trujillo, en la región andino-venezolana, el cual ha demostrado en ensayos previos ser altamente virulento contra R. prolixus y T. maculata (Cazorla et al., 2005a), principales vectores de la enfermedad de Chagas en Venezuela. Los bioensayos revelaron que las conidias del aislado LF14, con excepción de las temperaturas extremas de 6 y 40 ºC, son capaces del germinar en el rango térmico 12-35ºC, incrementándose significativamente los porcentajes de germinación desde los 12-15 ºC hasta 19-34ºC, y alcanzándose % >99 en el rango 21-34ºC. Hallazgos similares a los de este estudio observaron Luz & Fargues (1997) en Francia, con el aislado INRA 297 del hifomiceto, igualmente patogénico para R. prolixus, al obtener elevados porcentajes de germinación (>95%) “In Vitro en el rango térmico entre 20-35°C. Por contraste, Lecuona et al. (2001) reportaron tan sólo 3% de germinación para la cepa argentina Bb10 de B. bassiana, patógena para T. infestans, expuesta a 34°C. Estas diferencias de respuestas detectadas pudieran estar relacionadas con la variabilidad genética entre las cepas; por lo que 29 urge la necesidad de caracterizar las cepas molecularmente (e.g., patrones de ADN) y relacionarlos con los patrones de germinación. Cuando se hace el análisis de la influencia de los gradientes salinos (NaCl), Cazorla et al. (2007) observaron que las conidias disminuían significativamente los porcentajes de germinación con el incremento de la [NaCl], inhibiéndose totalmente el proceso germinativo a partir de la [NaCl] del 7%. Es bien conocido que la Humedad Relativa (HR) y la disponibilidad de agua son factores ambientales críticos para que ocurra la germinación en los hongos hifomicetos (Goettel & Inglis, 1997), por lo que un aumento en la concentración salina puede conllevar primeramente a una disminución de la actividad acuosa, probablemente por un efecto osmótico, o pudiera tener un efecto tóxico (Lerner, 1985; Vacher, Dizes, Espínola & Castillo, 1994). A pesar de esto, los conidios del aislado LF14 lograron germinar en % >95 en [NaCl] del 5%, la cual es si se quiere elevada. En virtud de la influencia de la temperatura y la HR sobre la germinación de los conidios, los futuros diseños de MIP en el caso particular para el control de las poblaciones de triatominos, deben tener presente las condiciones microclimáticas que prevalecen en los refugios (palmeras, grietas de paredes, etc.) de los triatominos-vectores. En este sentido, Heder, Guerin & Eugster (2006) refieren que, en una región endémica del estado Portuguesa, al occidente de los llanos de Venezuela, las poblaciones de R. prolixus en ayuno prolongado prefieren refugiarse en aquellos sitios de las palmeras, grietas de las paredes y techos de palma donde las temperaturas son más bajas y la HR más elevada, como un intento de los insectos por regular su balance hídrico y energético, cuya única fuente alimentaria y de agua proviene de la sangre de los vertebrados. Teng (1962) ha señalado que algunas cepas de B. bassiana no logran germinar a pH 10, sin embargo, Cazorla et al. (2007) encontraron que el aislado nativo LF14 de este hifomiceto alcanza un amplio rango de tolerancia (germinación >99%) hacia rangos de pH extremos (ácidos: 3-4 y básicos: 10), lo cual es significatvo, toda vez que los cambios de pH extremos pueden alterar significativamente las funciones biológicas, como por ejemplo, los enlaces de hidrógeno de las enzimas, bicapa lipídica y el ADN (Hallsworth & Magan, 1996). Es significativo comentar que el pH puede regular la expresión de los genes 30 involucrados en la secreción de las proteasas de M. anisopliae, que degradan la cutícula de los insectos, además de otros factores de virulencia, proceso de relevancia para el éxito de un hongo entomopatógeno durante la invasión y colonización de sus hospedadores artrópodos (St. Leger, Joshi & Roberts, 1998; St. Leger, Nelson & Screen, 1999). A pesar de esta tolerancia mostrada por los hongos entomopatógenos hacia factores estresantes medio ambientales, no obstante no se conoce bien el mecanismo de esta resistencia. Sin embargo, se sabe por ejemplo que la acumulación de solutos compatibles osmóticamente (e.g., manitol, trehalosa, glicerol) en las vacuolas de B. bassiana, y de otros dos hifomicetos entomopatógenos: M. anisopliae y P. farinosus, ayudan a las membranas y proteínas de éstos a protegerse de los factores ambientales estresantes (Hallsworth & Magan, 1996). En virtud de esto comentado, en futuros trabajos los ensayos se deben enfocar en tratar el incrementar aún más la resistencia y tolerancia, así como también acelerar la germinación, de los conidios del aislado LF14 de B. bassiana hacia los factores estresantes del medio ambiente mediante la adición al medio de cultivo de polioles y/o trehalosa, las cuales son sustancias de ajuste osmótico. En este sentido, Halworth y Magan (1996), al manipular las concentraciones de glicerol y eritritol en conidios.de B. bassiana y M. anisopliae, pudieron incrementar la capacidad de las mismas para germinar bajo condiciones de muy escasa actividad acuosa. Por su amplia tolerancia y resistencia hacia factores ambientales estresantes, el aislado nativo LF14 de B. bassiana aparece como un potencial patotipo para ser implementado en futuros programas de MIP contra TRIATOMINAE. No obstante, aún se deben realizar otra serie de estudios con otras variables físicas y/o biológicas. En este sentido, por sólo nombrar algunas relevantes, es necesario observar el efecto inhibitorio o sinérgico, entre los conidios y los diferentes insecticidas de origen químico empleados actualmente en Venezuela para el control de las poblaciones triatominas, así como el efecto de los rayos ultravioletas y la composición selectiva de los medios de cultivo. Esporulación “In Vitro” e “In Vivo”. 31 Además de la intensidad y capacidad de infectividad de un hifomiceto, la intensidad y cuantificación de la producción de conidias cadavéricas (i.e., esporulación o conidiación), y su subsiguiente capacidad para dispersarse dentro de la población de insectos sanos, son factores relevantes que deben tomarse en cuenta para la implementación de un programa biorracional-integral con hongos entomopatógenos, así como también debe estimarse cuál es la producción de la esporulación “in Vitro” en medios artificiales selectivos (Thomas et al., 1995; Luz & Fargues, 1998; Sun et al., 2002). Esto señalado es particularmente relevante en el caso de los vectores de la enfermedad de Chagas con hábitos peridomésticos y selváticos, tal como ocurre con T. maculata y P. geniculatus, ya que los insecticidas de origen químico son imprácticos para su control, pudiendo por lo tanto adquirir éstos potencialmente hábitos domésticos (Harry et al., 1992; Luz & Fargues, 1998; Luz et al., 1998b; 2004). De aquí que bajo condiciones ambientales favorables, el control microbiano de los hospedadores-artrópodos depende de la dispersión y abundancia de la esporulación fúngica de los cadáveres momificados para expandirse en el seno de la población sana de hospedadores (Luz & Fargues, 1998). Es bien conocido que las condiciones ambientales (e.g., HR) influyen notablemente sobre la esporulación de los cadáveres de los insectos, sin embargo son pocos los trabajos hechos en triatominos. Como bien lo señalan Luz & Fargues (1998), las condiciones microclimáticas, que muchas veces se rige por una curva bimodal pluviométrica, en los hábitats selvático, peridoméstico y doméstico de los triatominos en el medio latinoamericano y particularmente el venezolano, habla a favor de considerar la época de lluvia como la mejor para los hongos entomopatógenos, cuando la HR es elevada. Esto último expresado encuentra apoyo en los trabajos de Cazorla et al. (2005b), quienes determinaron la capacidad del aislado nativo LF14 de B. bassiana para producir conidias a partir de cadáveres de ninfas de V estadio de R. prolixus y T. maculata, previamente expuestos a un inóculo de 1x107 conidios/mL, y mantenidos a 26ºC y regímenes variables de alta (>90%) y baja (50-55%) HR. La obtención de conidias de B. bassiana/ml de agua destilada, a partir de cadáveres de R. prolixus y T. maculata fue significativamente mayor a 90% de HR, que los de T. maculata expuestos a baja HR de 50-55% (Cuadro 1). 32 Cuadro I Comparación de la capacidad de esporulación de ninfas V de Rhodnius prolixus y Triatoma maculata. ESPORULACIÓN (Conidias/cadáver) ++ GRUPO DE NINFAS V ± D.S. a Triatoma maculata/ HR: >90% 808.917 ± 649.841 Triatoma maculata/ HR: 55% 215.413 b ± 197.537 Rhodnius prolixus/ HR: >90% 1.752.305 c ± 2.119.406 ++ En el análisis de comparación múltiple cuando dos medias posean letras iguales sus diferencias resultaron estadísticamente no significativas (p>0,05) Fuente: [Cazorla et al. (2005b)] Los ensayos de otros investigadores de otros países coinciden con estos resultados, al requerir los cadáveres de los triatominos elevados niveles de HR para su elevada esporulación (Gerson et al., 1979; Ramoska, 1984; Luz & Fargues, 1998). Basados en estos resultados, aunque muy preliminares, desde un punto de vista pragmático, se sugiere que las aplicaciones fúngicas en los futuros Programas de Control de vectores de la enfermedad de Chagas, deben realizarse durante las épocas de invierno cuando la atmósfera de los sitios o hábitats de los triatominos se encuentre saturada, ya que la HR pareciera ser crucial para que el aislado LF 14 pueda reciclarse. En relación con los bioensayos de esporulación “In Vitro” con cepas nativas que han demostrado su infectividad hacia los vectores de T. cruzi en Venezuela, de acuerdo a lo que se ha indagado, sólo existe el realizado por Cazorla, Morales & Acosta (2006), quienes trabajaron similarmente con el aislado nativo LF14 sobre medio artificial sólido agar-Lactrimel, en un intento por determinar su capacidad de esporulación a estreses de pH (2-12) y salinos ([NaCl]: 1-50%). Los autores observaron que aunque este aislado obtuvo su mayor biomasa entre los pH 4 y 6,8 es capaz de esporular en todos los pH ácidos y básicos expuestos, lo que contrasta con los resultados de otros investigadores. En efecto, según Rojas (2004) a B. bassiana se le clasifica, de acuerdo a su tolerancia hacia gradientes de pH, como un hongo alcalófilo, i.e, que sólo se desarrolla a pH 9-10. Por su parte, Halworth y Magan (1996) indican que B. bassiana crece mejor en un rango de pH entre 5 y 8, mientras que Teng (1962) refiere que el pH 6 es más efectivo para la 33 esporulación de este hifoomiceto. Una característica relevante que poseen los hongos entomopatógenos es que, a diferencia de otras especies fúngicas, pueden regular su pH citosólico con mayor eficacia, lo cual es muy importante cuando se requiere la producción industrial de sus formulaciones, toda vez que se inhiben otros organismos contaminantes (e.g., bacterias) sin afectar su propio medio, además que les puede permitir soportar mejor los “shock osmóticos” en medios de baja disponibilidad de agua, al poder acumular polioles citosólicos en sus membranas (Halworth y Magan, 1996). Cuando se hace el análisis de la producción de conidias del aislado LF14 ante el estrés salino, se observó que decrece significativamente con el incremento de la [NaCl], inhibiéndose completamente la conidiación a 15% de [NaCl] del medio, donde el hifomiceto no soporta los estreses hídricos, osmóticos y los efectos tóxicos (Lerner, 1985; Halworth y Magan, 1996). Si se comparan estos resultados con los obtenidos por otros investigadores con otras especies de hifomicetos, pareciera haber un proceso especie-dependiente hacia la tolerancia del estrés salino-osmótico. En efecto, Mert & Dizbay (1977) reportaron que P. lilacinum no logró esporular “In Vitro” a una [NaCl] del 5%, mientras por el contrario Aspergillus níger desarrolló satisfactoriamente su conidiciación a esta concentración salina. Por su parte, Mert & Ekmekçi (1987) encontraron que la salinidad posee un efecto inhibitorio sobre la producción de conidias de A. flavus y estimulante para Penicilium chrysogenum. Sun, Fuxa & Herderson (2002) trabajando con aislados de M. anisopliae y B. bassiana patogénicos para termites (Orden Isóptera) del género Coptotermes, encontraron una correlación altamente positiva entre la producción de conidias “In Vivo” e “In Vitro”, concluyendo que esto permite realizar ensayos preliminares “In Vitro”, que son más rápidos, con una gran cantidad de aislados para proyectar cuáles serán aquellos con la más alta esporulación “In Vivo”. Por lo que a juzgar por la elevada biomasa obtenida “In Vitro” (hasta 89,7 x 106 conidias/mL) e “In Vivo” (Cuadro 1), y su alta resistencia hacia condiciones ambientales estresantes, se ratifica lo expresado con los bioensayos de germinación, de la buena potencialidad que posee el aislado LF14 como micropesticida en un programa de control vectorial contra TRIATOMINAE en 34 Venezuela. Sin embargo, su formulación definitiva hacia el medio ambiente, requerirá realizar otra serie de bioensayos, con otras variables bióticas y abióticas. Así mismo, lo cual es muy importante, se debe evaluar su inocuidad para el modelo vertebrado (e.g., animales de laboratorio), a pesar de que generalmente los hongos entomopatógenos son adecuadamente bioseguros. Sin embargo, en algunos casos, especialmente en individuos inmunosuprimidos, B. bassiana se ha encontrado involucrada en procesos patológicos, como por ejemplo en los de tipo alérgico (Westwood, Huang & Keyhani, 2006) u otros de tipo degenerativos del sistema nervioso central (Schmidt, Schubert, Huang, Stoyanova & Hamburger, 2003). Ensayos de patogenicidad y virulencia de B. bassiana contra vectores de la enfermedad de Chagas en Venezuela Hasta donde se ha podido indagar, los primeros trabajos documentados acerca de la implementación de hongos hifomicetos nativos contra TRIATOMINAE de Venezuela fueron hechos por Zambrano, Sepúlveda & De Sepúlveda (1991) y Guédez, Oviedo & Márquez (1995) al aplicar formulaciones de B. bassiana y B. brongniiartii sobre R. prolixus, respectivamente. Estos fueron resultados preliminares presentados a manera de Resúmenes en los Congresos Venezolanos de Entomología, por lo que la obtención de mayores detalles es limitado. Similarmente se da lo expresado en el más reciente trabajo sobre el tópico, el de Cazorla et al. (2005a), quienes estimaron la patogenicidad de B. bassiana (LF14) contra R. prolixus y T. maculata. Cazorla (2006) realiza una serie de ensayos, si se quiere más amplios y detallados, acerca de la evaluación de la patogenicidad y virulencia del aislado nativo (LF14) de B. bassiana hacia R. prolixus y T. maculata, incluyendo variables físicas (temperatura, HR) y biológicas (inóculo, estadio de desarrollo). A pesar de que todos los estadios de desarrollo de los artrópodos- plagas son susceptibles a la acción de los hongos entomopatógenos, existen reportes que indican una susceptibilidad diferencial entre los estadios imaginales y preimaginales para la infección fúngica (Romaña & Fargues, 1992); por lo que en el primero de estos ensayos, Cazorla (2006) evalúa el efecto diferencial de la virulencia de este aislado nativo sobre todos los estadios de desarrollo de R. prolixus y T. maculata, incluyendo ninfas y adultos, y variando la cantidad del 35 inóculo (1 x 105, 3 x 105, 1 x 106, 3 x 106, 1 x 107 y 3 x 107 conidias/ml) para observar la virulencia del hifomiceto, bajo condiciones de 26 °C y >90% HR. Los análisis de supervivencia mostraron, de una manera general, que los estadios ninfales I y II, tanto de R. prolixus como de T. maculata, son menos susceptibles que los estadios III, IV, V y los adultos a la acción del aislado LF14 de B. bassiana. Las ninfas I y las de II estadio jamás alcanzaron porcentajes de mortalidad del 100%, aún a la concentración de conidias de 3 x 107 en el caso de R. prolixus. Por lo tanto, la susceptibilidad de R. prolixus y T. maculata se incrementa con la edad. A pesar de esto, se puede afirmar que el aislado LF14 de B. bassiana causó una alta mortalidad, especialmente hacia los estadios de mayor edad y a mayores inóculos, presentando así mismo conidiación visible en la mayoría de los cadáveres. Los resultados de Cazorla (2006) son similares a los que encontraron Romaña & Fargues (1992), quienes al infectar con la cepa INRA 297 a varios estadios de desarrollo de R. prolixus detectaron que el estadio ninfal I es 700 veces menos susceptible que las ninfas V y los adultos. Contrastando con estos resultados, Zambrano et al. (1991) encuentran que los estadios II y III de R. prolixus son más susceptibles a la cepa 1389 de B. bassiana, cuando se inocularon todos los estadios ninfales con 3x106 conidias/ml. Por lo tanto, debe decirse, tal como lo sostienen Romaña & Fargues (1992), que la susceptibilidad de los estadios larvales depende de la especie del hospedador y del aislado fúngico. Esto expresado también se observa en otras especies de insectos. En este sentido, por ejemplo Fargues (1972) encontró que en el coleóptero Leptinotarsa decemlineata la susceptibilidad hacia B. bassiana decreció con la edad. Mientras que por el contrario, las larvas más viejas de Melolontha melolontha, otra especie de escarabajo, fueron más susceptibles hacia B. brongniartii (Ferrón, 1967). Como bien lo señalan Romaña & Fargues (1992), la susceptibilidad hacia el estadio de adulto se encuentra poco estudiado. Así, adultos del escarabajo L. decemlineata, no fueron susceptibles hacia los aislados de Beauveria patogénicos para sus larvas (Bajan & Kmitowa, 1969). Por contraste, los adultos de los coleópteros Acanthoscelides obtectus o Oryctes rhinoceros fueron altamente susceptibles a B. brongniartii y M. anisopliae (Ferrón & Robert, 1975; Ferrón, P., Robert, P. & Deotte, 1975). 36 A pesar de que es bien conocido que los hongos dependen de la HR para poder desarrollarse (Luz et al., 1998b), los ensayos del aislado LF14 sobre R. prolixus a baja HR del 55% demostró que éste puede causar altos porcentajes de mortalidad, de hasta el 100%. En lo que respecta a la influencia de la temperatura sobre la susceptibilidad de los estadios de R. prolixus, se encontró un rango óptimo de la acción del aislado LF14 entre 15 y 30 °C (% de mortalidad >90), lo cual coincide con los resultados de germinación óptimos encontrados para este aislado por Cazorla et al. (2007). Debido al hecho de que la infección de los insectos depende de la temperatura y la HR, estos ensayos fueron hechos bajo condiciones favorables de temperatura (26°C) y HR (>90%) y a rangos extremos de temperatura y baja HR (55%). Por lo tanto, podemos concluir que el aislado LF14 de B. bassiana es altamente patógeno para R. prolixus y T. maculata. Otro hecho a resaltar es que se observó, de una manera general en todos lo estadios de R. prolixus, un efecto Dosis-dependiente, al tenerse mayores porcentajes de mortalidad con el aumento de la concentración de conidias, o que la supervivencia disminuye con el aumento de este parámetro. Este efecto, de que la respuesta de mortalidad depende de la dosis del inóculo, es bien conocido en la literatura del área (Ferrón, 1978; Hall & Papierock, 1982), y particularmente en los triatominos (Luz et al., 1998b; Lecuona et al., 2001; Vásquez, Saldarriaga & Chaverra, 2005). Sin embargo, resulta interesante discutir el caso observado por Pineda, Saldarriaga & Gómez (2002) en ninfas de V estadio de R. ecuadoriensis expuestos a B. bassiana a similares condiciones de HR y temperatura, al detectar porcentajes de mortalidad del 100% en todos los inóculos ensayados. Como bien lo señalan Vázquez et al. (2005), esto demuestra que especies muy relacionadas de hospedadores pueden dar respuestas diferentes a la misma cepa del hongo. Las diferencias mostradas en la respuesta diferencial de patogenicidad hacia los diferentes estadios de R. prolixus y T. maculata, nos lleva a porponer al aislado LF14 como un buen candidato para el control microbiano de estos vectores en ambientes en los cuales se favorezca la infección micótica. Estos último expresado es particularmente importante para el caso de una especie peridoméstica como T. maculata, ya que el ambiente peridoméstico es uno de los 37 puntos críticos en el control de vectores de la enfermedad de Chagas (Romaña & Fargues, 1992; Luz et al., 2004). Este comentario se refuerza por el hallazgo de que se observó que una alta proporción de los insectos presentaron el hongo después de morir, demostrándose su deceso por la acción del hifomiceto, por lo que estos cadáveres constituyen una fuente potencial de infección para otros insectos que habitan tanto en el domicilio como el peridomicilio, factor relevante para el control natural a nivel de campo (Luz et al., 2004; Vásquez et al., 2005). Esto último discutido es importante recalcarlo, ya que la mayoría de los programas de control de triatominos se basan en el control químico de vectorestriatominos a nivel del domicilio. Sin embargo, los focos silvestres permiten las reinfestaciones domiciliares, lo cual podría contrarrestarse mediante el uso de hongos entomopatógenos, tales como Beauveria, aunque siempre enmarcado dentro de un programa de MIP. Aspectos histopatológicos y ultraestructurales sobre la relación B. bassianaR.prolixus/T. maculata. A pesar de que existen varios trabajos que demuestran la patogenicidad y virulencia de varios aislados y cepas de hongos hifomicetos (e.g., Metarhizium, Beauveria) sobre las especies triatominas (Mora Costa, 1978; Sherlock & Guitton, 1982; Silva & Messias, 1986; Messias, Daoust & Roberts, 1986; Romaña, Fargues & Pays, 1987; Luz & Fargues, 1997; 1998; Luz, Silva, Cordeiro & Tigano, 1998a; 1999; Fargues & Luz, 2000; Lara da Costa , Lage de Moraes & Galvão, 2003), es poco lo que se sabe acerca de los mecanismos de patogenicidad envueltos de los hongos hifomicetos sobre los triatominos; mecanismos que por lo demás, se han estudiado en otras especies de insectos (Maramorosch & Shope, 1975; Iwanaga & Lee, 2005). De acuerdo a la bibliografía consultada, los primeros, y aparentemente los únicos, trabajos sobre este tópico corresponden a Cazorla et al. (2005b, c) y Cazorla (2006), quienes implementaron mediante técnicas convencionales histológicas y de tinción (e.g., hematoxilina-eosina) y de Microscopía Electrónica de Transmisión (MET) los estudios histopatológicos y ultraestructurales de la acción del aislado LF14 de B. bassiana sobre R. prolixus y T. maculata; con esto, se pretendió en primera instancia verificar que la causa de la muerte de los insectos se debía al hifomiceto, tal como se hizo en ensayos previos (Cazorla et al., 2005a; Cazorla, 2006). Así mismo, en estos trabajos se 38 detalló los eventos (adhesión, germinación, penetración, colonización y conidiación) y daños que ocasiona el hongo a los triatominos. Con la comprensión de los mecanismos de patogenicidad, se podrá contribuir en futuros bioensayos para seleccionar los mejores patotipos de los hifomicetos adaptados a las condiciones de nuestro trópico. Haciéndose el análisis de las fotomicrografías por microscopía fotónica del trabajo de Cazorla et al. (2005b, c) y Cazorla (2006), se revela la adhesión de numerosas conidias al tegumento de los triatominos, tal como se evidencia en la Figura 5, aunque sin tener un sitio específico para este evento. Figura 5. Adhesión, germinación e invasión de conidias de B. bassiana sobre tegumento de R. prolixus y T. maculata. Fuente: [Cazorla et al., 2005b, c y Cazorla, 2006] Tal como lo mencionan Hegedus & Khachatourians (1995), la cutícula es una de las principales barreras de defensa que poseen los insectos contra agentes externos, sin embargo es poco lo que se sabe acerca de cómo los insectos reconocen al hongo como algo extraño (Hayek & St. Leger, 1994). Resultados similares a éstos han obtenido otros investigadores en otras especies de insectos (Vey & Fargues, 1977; Bittencourt, Masca-Renhas & Faccini, 1999; García, Monteiro & Szabó, 2004). En la misma Fig. 5, se evidencia la germinación de las conidias sobre la superficie de la cutícula del insecto, proceso que dura entre las 12 y 18 horas después de la infección. Por su parte, la penetración via tegumento ocurre entre las 18 y 48 horas después de la infección (Fig.5). La penetración del hongo por el tegumento es un hallazgo particularmente promisorio, ya que los insectos hematófagos como los triatominos, dejan su aparato bucal fijo a la 39 superficie de sus hospedadores vertebrados, por lo que la vía oral no es viable para la penetración. Por lo tanto, una germinación y penetración rápida por la cutícula de los insectos son dos características importantes para la virulencia de los aislados (García et al., 2004). A pesar de que la epicutícula tiene varias capas, las mismas son proclives a la acción de las enzimas de los hongos (Hayek & St. Leger, 1994). Además se debe acotar que existen otros factores, como la humedad, la inhabilidad para utilizar los nutrientes disponibles, o la ausencia de otro factor necesario para el reconocimiento en la superficie durante la adhesión, así como también la presencia de otros que son inhnibitorios del proceso (e.g., fenoles, quinonas, lípidos) (Hayek & St. Leger, 1994). La colonización del hemocele ocurrió de una manera masiva (Fig. 6), dándose Figura 6. Invasión micelial de B. bassiana en hemocele y tegumento de R. prolixus. Fuente: [Cazorla et al., 2005b, c y Cazorla, 2006] la esporulación por las aberturas empezando por las coxas y tórax, hasta finalmente invadir mediante el micelio externamente todo el cadáver, que se torna blaquecino (Anexo A). Nótese que las hifas invaden todos los tejidos (músculos, sistema digestivo), hasta colapsar y fenecer el insecto (Figs.6, 7 y Anexo B). En este sentido, se detalla la aparición de una región electrontransparente en el sitio donde penetran las hifas, lo que sugiere una acción exoenzimas degradando los tejidos (Fig. 7). 40 Figura 7. Acción ultraestructural de hifas de B. bassiana sobre tejidos de R. prolixus. Fuente: [Cazorla et al., 2005b, c y Cazorla, 2006] En el Anexo B es particularmente apreciable la acción patogénica de las hifas sobre los tejidos del insecto, donde se aprecia así mismo, una apertura traqueolar por donde logran penetrar generalmente las hifas del hifomiceto. Las barreras de tipo físico, e.g., el exoesqueleto y la membrana peritrófica, son las primeras líneas de defensa de los insectos, las cuales sin embargo no pueden evitar la invasión de los microorganismos patógenos (Maramorosch & Shope, 1975; Iwanaga & Lee, 2005), tal como ocurrió en el caso presentado por Cazorla et al. (2005a, b) del aislado LF14 de B. bassiana contra R. prolixus y T. maculata. Resulta interesante resaltar y analizar la respuesta inmune celular (RC) del hemocele de estas especies de TRIATOMINAE, ejercida por los hemocitos, sobre las esporas del aislado LF14 de este hifomiceto, tal como se observa en las Figuras 8 y 9. Se aprecia visiblemente cómo los hemocitos, en un intento por resistir la invasión, fagocitan, encapsulan y melanizan, hasta finalmente fenecer, las esporas del hongo hifomiceto. 41 Figura 8. Fagocitosis, encapsulación y melanización de esporas de B. bassiana por hemocitos de R. prolixus. Fuente: [Cazorla et al., 2005b, c y Cazorla, 2006] Figura 9. Fagocitosis, encapsulación y melanización de esporas de B. bassiana por hemocitos de R. prolixus. Fuente: [Cazorla et al., 2005b, c y Cazorla, 2006] Como bien lo señalan Leclerc and Reichhart (2004), Waterfield, Wren & Ffrench-Constant (2004) y Abraham & Jacobs-Lorena (2004), una vez que un patógeno penetra al hemocele, se encuentra expuesto a la respuesta humoral (RH) y celular (RC) de los insectos. La de tipo humoral comprende la producción de péptidos antimicrobianos, incluyendo proteínas antifúngicas (Natori, Shiraishi, Hori & Kobayashi, 1999), la inducción de la síntesis de lectinas y la activación del sistema pro- fenoloxidasa; sin embargo, se debe recalcar que la RH no es tan distinta de la RC, toda vez que la RH modula la RC (Iwanaga & Lee, 2005). La fagocitosis es una de las primeras líneas de defensa celular del hemocele de los artrópodos contra cuerpos extraños, la cual es ejercida por lo hemocitos, que los encapsulan y luego los melanizan formando capas concéntricas de nódulos (Nappi, 1975; Söderhäll & Cerenius, 1992; Hayek & St. Leger, 1994; Hegedus & Khachatourians, 1995; Rendón & Balcázar, 2003). Es bien sabido que la melanización es un mecanismo de defensa de los artrópodos, incluidos los insectos (Nappi, 1975; Rendon & Balcazar, 2003; Iwanaga & Lee, 2005).La fenoloxidasa es la enzima responsable de la melanización observada en crustáceos e insectos, actuando también en la reparación de las heridas y la esclerotización de la cutícula (Söderhäll & Cerenius, 1992; Iwanaga & Lee, 2005). Esta última es responsable de la oxidación de fenoles en quinonas, los cuales se polimerizan en melanina y son altamente tóxicas. La melanina es un pigmento pardo-negro, al 42 cual se le adjudican diversas propiedades biológicas tal como la inhibición de la actividad de enzimas bacterianas y fúngicas (Smith y Söderhäll, 1983; Iwanaga & Lee, 2005). Por su parte, la encapsulación es un mecanismo de defensa multicelular para eliminar sustancias externas que normalmente no pueden ser eliminadas exclusivamente por lo mecanismos humorales del insecto, aunque se han aislado proteínas de encapsulación que ayudan al proceso de defensa (Johanson, Lind, Holmblad, Thörnqist & Söderhäll, 1995; Vázquez et al., 1998; Iwanaga & Lee, 2005). Estas cápsulas se encuentran fuertemente melanizadas, y actúan cuando una partícula es demasiado grande para ser fagocitada, muchos hemocitos cubren a la partícula grande formando capas alrededor de ella (Söderhäll & Cerenius, 1992). Götz & Vey (1974) revelaron que larvas de Chironomus inyectadas con esporas de B. bassiana fueron encapsuladas, atribuyendo este fenómeno a la fenoloxidasa (Nappi, 1975). A pesar de todo lo comentado, en las cepas hipervirulentas de B. bassiana los hemocitos de los insectos son incapaces de frenar al crecimiento de los hongos, como pareciera ser el caso del aislado LF14, no formándose la encapsulación o las blastosporas germinan libremente fuera de los hemocitos (Hung, Bocias & Vey, 1993; Hayek & St. Leger, 1994). Evidentemente, aún faltan muchos estudios para la implementación definitiva de un programa de MIP para el control de los vectores de la enfermedad de Chagas en Venezuela. Para llegar a aplicar las esporas de hongos entomopatógenos a nivel de campo, es necesario conocer con mayores detalles los inconcevientes, desde el punto de vista biológico y de los factores físicoambientales, que deberá afrontar un programa de esta magnitud. Y lo que es similarmente importante, sensibilizar a la comunidad venezolana, incluyendo a las autoridades sanitarias y la científica y la comunidad en general, acerca de la necesidad de implementar el control de vectores desde un punto de vista ecológico-biorracional. 43 CONCLUSIONES - A pesar de que desde los años 60 del siglo XX se ha logrado disminuir las poblaciones triatominas intradomiciliares y por ende las tasas de infección, no obstante, éstos se adaptan a las nuevas circunstancias biológicas y ecológicas, por lo que la enfermedad de Chagas aún representa un problema de Salud Pública en Venezuela. - El rociamiento intradomiciliar con insecticidas de origen químico aún representa la medida profiláctica más práctica y efectiva para evitar la transmisión del Trypanosoma cruzi. - A pesar de su efectividad a nivel intradomiciliar, los insecticidas de origen químico son imprácticos, inviables ecológicamente e inefectivos contra las poblaciones de especies triatominas de hábitos peridomésticos y selváticos. - El uso indiscriminado de los insecticidas de origen químico, pueden potencialmente conducir a problemas de toxicidad aguda y crónica para la salud humana y sus animales, además de toda la vida del planeta tierra. - Así mismo, el uso indiscriminado y/o su inadecuada implementación de los insecticidas de origen químico podría generar problemas de resistencia en las poblaciones triatominas. - El control microbiano con hongos hifomicetos de las poblaciones de vectores del Mal de Chagas representa una alternativa ecológicamente viable. - Los estudios acerca del uso de hongos hifomicetos para el control de vectores de enfermedades metaxénicas, incluyendo a los triatominos, son escasos en Venezuela. - Se debe profundizar los estudios sobre el mecanismo de acción de los hongos entomopatógenos, especialmente en la búsqueda de metabolitos secundarios (micotoxinas) potencialmente utilizables en programas de control de plagas. - El aislado nativo LF14 de Beauveria bassiana ha demostrado ser patogénico y altamente virulento hacia poblaciones de Rhodnius prolixus y 44 Triatoma maculata, principales vectores de la enfermedad de Chagas en Venezuela. - Los estadios más longevos de R. prolixus y T. maculata son más susceptibles a la acción patogénica del aislado nativo LF14. - El aislado nativo LF14 de B. bassiana es capaz de germinar y esporular “In Vitro” e “In vivo”, bajo condiciones extremas de variables ambientales. - Los estudios histopatológicos y ultraestructurales de la relación íntima entre B. bassiana (LF14) y sus hospedadores triatominos confirman que las conidias del hifomiceto invanden a éstos por el tegumento. Además, se evidenció la importancia de los hemocitos en la inmunidad del hemocele de los triatominos frente a las esporas de B. bassiana, y se sugiere la acción exo-enzimática de sus hifas. 45 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abraham, E. G. and Jacobs-Lorena, M. (2004) Mosquito midgut barriers to malaria parasite development. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 34 (7): 667-671 Aché, A. & Matos, A. (2001). Interrupting Chagas disease transmission in Venezuela. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo, 43 (1): 37-43. Agudelo-Silva, F. & Wassink, H. (1984). Infectivity of a Venezuelan strain of Metarhizium anisopliae to Aedes aegypti larvae. Journal of Invertebrate Pathology, 43 (3): 435-436. Alcalá de Marcano, D., Marcano, A. & Morales, M. (1999). Patogenicidad de Beauveria bassiana y Paecilomyces fumosoroseus sobre adultos del picudo de la batata Cylas formicarius elegantulus Summers (Curculionidae). Revista de la Facultad de Agronomía-LUZ, 16 (1): 52-63. 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