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Memoria de Investigación
Estudio del Estado Fisiológico sobre la Cinética
de Inactivación de Salmonella Enterica en
Matrices Líquidas
Study of the Physiological State on Inactivation
Kinetics of Salmonella Enterica in Liquid Matrices
Realizado por:
Eva María Padilla Navidad
Línea de Investigación Grupo Hibro
2012-2013
Tutor de Investigación: Antonio Valero Díaz
Palabras claves: Salmonella, leche, zumo, pasteurización, inactivación
Máster en Agroalimentación
La memoria de investigación titulada: "Estudio del Estado Fisiológico sobre la Cinética
de Inactivación de Salmonella Enterica en Matrices Líquidas" (Study of the
Physiological State on Inactivation Kinetics of Salmonella Enterica in Liquid Matrices)
ha sido realizada por Eva María Padilla Navidad dentro del Departamento de
Bromatología y Tecnología de los Alimentos, Grupo HIBRO AGR170 de la Universidad
de Córdoba bajo la dirección del Doctor Antonio Valero Díaz.
En Córdoba, a 14 de noviembre de 2015
El/a alumno/a
Tutor de Investigación
Fdo.:
Fdo.:
ÍNDICE
Resumen ...................................................................................................................... 1
Abstract ........................................................................................................................ 1
Introducción ................................................................................................................. 2
Objetivos ...................................................................................................................... 5
Material y métodos...................................................................................................... 5
Resultados y Discusión................................................................................................. 7
Conclusiones .............................................................................................................. 11
Propuestas ................................................................................................................. 11
Bibliografía ................................................................................................................. 12
Tabla 1: Promedio de Modelos Ajustados. ................................................................ 15
Figura 1: Inactivación de Salmonella Enterica (Réplica 1 y 2: Rep 1 y 2) sometida a
tratamientos térmicos de 50ºC (a), 55ºC (b), 60ºC (c) en caldo TSB y modelo loglineal + cola ajustado. ................................................................................................ 16
Figura 2: Inactivación de Salmonella Enterica (Réplica 1 y 2: Rep 1 y 2) sometida a
tratamientos térmicos de 50ºC (a), 55ºC (b), 60ºC (c) en Leche desnatada y modelo
log-lineal + cola ajustado. .......................................................................................... 17
Figura 3: Inactivación de Salmonella Enterica (Réplica 1 y 2: Rep 1 y 2) sometida a
tratamientos térmicos de 50ºC (a), 55ºC (b), 60ºC (c) en concentrado de zumo de
naranja y modelo log-lineal + cola ajustado. ............................................................. 18
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Memoria de prácticas. Departamento de Bromatología y Tecnología de los Alimentos. Grupo HIBRO AGR170
Universidad de Córdoba.
Estudio del Estado Fisiológico sobre la Cinética de Inactivación de
Salmonella Enterica en Matrices Líquidas.
Eva María Padilla Navidad
Resumen
La salmonelosis es una toxiinfección alimentaria muy importante, no sólo porque es la mayor
causa de brotes gastrointestinales en España, la Unión Europea y EE.UU.; sino por las pérdidas
económicas asociadas a ella entre otros factores. Una de las medidas más eficaces de
prevención de esta enfermedad es la aplicación de tratamientos térmicos a nivel industrial
tales como la pasteurización. El objeto de este estudio es conocer las curvas de inactivación de
Salmonella Enterica en diversas matrices liquidas, a fin de optimizar los tratamientos térmicos
industriales aplicados en estos productos y a la vez conseguir unos criterios microbiológicos en
concordancia a la normativa vigente. Para ello el microorganismo en estudio fue sometido a
temperaturas de 50ºC, 55ºC y 60ºC en diferentes matrices liquidas, como son medio de cultivo
TSB, leche desnatada y zumo de naranja. Los datos observados fueron ajustados a modelos de
inactivación de microorganismos gracias al programa DMfit y fueron obtenidos diversos
parámetros de interés como son los valores de kmax y el valor D. entre los principales hallazgos
encontrados caben destacar los siguientes. A medida que se aumenta la temperatura del
tratamiento térmico la inactivación de Salmonella Enterica es más acusada y rápida, lo que se
traduce en valores de kmax cada vez mayores y valores de D. menores. En TSB y leche a
temperaturas de 50ºC se obtienen modelos de inactivación lineales, en cambio a 55ºC-60ºC se
obtienen modelos de inactivación bifásicos. En zumo se consigue una inactivación bifásica en
cualquiera de los tratamientos aplicados en este estudio. Las diferencias encontradas entre
matrices distintas son las siguientes. En zumo se consigue una inactivación más acusada y
rápida que en TSB y leche, esto pudiera ser debido a que el pH acido del zumo ejerce un efecto
negativo en la supervivencia de Salmonella Enterica. En posteriores estudios cabria tratar con
otras matrices liquidas; usar otros microorganismos presentes en los alimentos o realizar
combinaciones de diferentes técnicas de inactivación para optimizar los tratamientos.
Abstract
Salmonelosis constitutes overall a highly important foodborne disease, being a major cause of
gastrointestinal outbreaks in Spain, European Union and U.S.A. Besides, it is associated to
economic losses and food waste among other factors. One of the most effective measures for
prevention of this disease is the implementation of thermal treatments in food industries such
as pasteurization. The purpose of this study was to determine the inactivation curves of
Salmonella Enterica in various liquid matrices, in order to optimize industrial heat treatments
applied to these products while achieving microbiological criteria in accordance with current
regulations. For this study, the microorganism was subjected to 50ºC, 55ºC and 60ºC in
different liquid matrices, such as Triptone Soja Broth (TSB), skimmed milk and orange juice.
The observed data were fitted to primary inactivation models by means of the DMfit software,
obtaining the correspondent kinetic parameters such as maximum inactivation rate (kmax), D
values, and residual populations after the thermal treatments. Among the main findings
obtained, as inactivation temperature increased, decrease in the population of Salmonella
Enterica was more pronounced, thus resulting in higher values of kmax values and reduced D
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Máster en Agroalimentación. Eva María Padilla Navidad.
values. In TSB and skimmed milk, at 50ºC treatments, linear inactivation models were
obtained, however at 55ºC-60ºC treatments, a biphasic behavior was observed in inactivation
patterns due to the existence of a residual population. In juice, a biphasic inactivation was
achieved in any of the temperature treatments used in this study. Significant differences were
found between matrices (p<0.05). In juice a faster and more pronounced inactivation was
achieved in comparison to TSB and skimmed milk. This fact could be due the acid pH of the
juice which had a negative effect on the survival of Salmonella Enterica. Further studies may
evaluate the influence of microbial inactivation in different liquid matrices, to use other
pathogenic microorganisms normally present in these types of food or to develop alternative
combinations of inactivation techniques in order to optimize food quality and safety.
Introducción
Importancia de Salmonella en los Alimentos.
El género Salmonella es un grupo de bacterias patógenas causantes de la salmonelosis, una
toxiinfección alimentaria de gran importancia. Esto se debe a que la salmonelosis es la mayor
causa de brotes de toxiinfecciones y de cuadros gastrointestinales en España, en otros países
de la Unión Europea y Estados Unidos. La frecuencia de los casos se ha visto incrementada
debido a que la industrialización de los procesos alimentarios favorece la diseminación de
estos microorganismos. Normalmente el número de casos registrados no superan el 25% de
los casos totales ya que la mayoría no se declaran, con lo que la incidencia real de casos es
mucho mayor de lo que se refleja en las estadísticas. En EE.UU., Salmonella ha sido causante
de un millón y medio de infecciones, miles de hospitalizaciones y cientos de muertes (1) (2).
Otro factor añadido que hace que sea muy importante son las pérdidas económicas que se
producen, tanto en sanidad pública, como en costes a nivel de explotación debido a varios
factores como son el porcentaje de bajas, costes de medicación y retraso del crecimiento en
animales que sobreviven. En EE.UU., los costes acarreados por las toxiinfecciones alimentarias
ascienden a siete millones de dólares (3).
El número de productos que son susceptibles de ser contaminados por Salmonella spp. es muy
elevado, pudiéndose encontrar en carne de res, carne de pollo, cerdo, pescado, huevos,
productos lácteos frescos, cereales, aperitivos, chocolate o golosinas para mascotas (1) (2) (4)
(5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). Esta amplia variedad de productos nos muestra que Salmonella
puede sobrevivir en condiciones adversas, como una actividad de agua baja y tratamiento
térmicos severos.
El número de casos de salmonelosis en humanos se redujo un 5,4% en comparación con el año
2010 y un 37,9% en comparación con 2007. Se observa una disminución significativa en la UE
en el periodo 2008-2011. En total se registraron 95.548 casos en 2011. La reducción observada
se debe al éxito de los programas de control de Salmonella en aves de corral. La mayoría de los
estados miembro cumplía los objetivos de reducción de Salmonella en aves de corral. La
mayoría de productos que no cumplían los criterios fueron carne picada, preparados de carne
y moluscos bivalvos vivos (12).
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Memoria de prácticas. Departamento de Bromatología y Tecnología de los Alimentos. Grupo HIBRO AGR170
Universidad de Córdoba.
Medidas de Prevención de Salmonella en Alimentos
Para la prevención de la salmonelosis existen tres líneas de actuación principales:
 Medidas de prevención en producción primaria:
El consumo de alimentos, contaminados por Salmonella, por parte de los animales
provoca la enfermedad en muchos de ellos y en la mayoría de las ocasiones aparecen
casos de animales portadores asintomáticos.
Es por esto que una de las líneas de prevención de la enfermedad sea el tratamiento
de los alimentos que servirán para consumo animal. Se usan diversos métodos para la
descontaminación de los alimentos como son: la granulación en caliente con inyección
de vapor, la irradiación a 7,5kGy o a 3kGy, combinándose con otros tratamientos
como la granulación o adición de un 3-3,5% de ácido propiónico. Estos tratamientos
tuvieron muy buenos resultados, disminuyendo e incluso eliminando Salmonella de
estos productos.
No obstante, el uso de alimentos en ganado exentos de Salmonella no resuelve
totalmente el problema ya que la enfermedad se propaga desde el medio. Podría
reducirse la contaminación depurando aguas residuales y lodos de forma más
eficiente, como con la pasteurización, desinfección química o irradiación. Aun así, la
disminución de la incidencia de la enfermedad por el uso de estas medidas es muy
baja.
Con normas sencillas de higiene se puede disminuir mucho la prevalencia, como
ejemplo tenemos la vacunación contra la salmonelosis, que servirá para evitar la
contaminación de los animales por serotipos específicos.
 Tratamientos de inhibición a nivel industrial:
El consumo de productos pasteurizados puede hacer que se reduzca en gran medida
los problemas de salmonelosis. Un ejemplo de ello es la leche pasteurizada ya que se
ha demostrado en numerosos estudios que la aplicación de temperaturas superiores a
65ºC elimina de forma significativa la presencia de Salmonella. Desafortunadamente,
en carnes rojas y de aves, no se puede aplicar el tratamiento térmico a gran escala y ni
fácilmente. El empleo de radiaciones ionizantes es una alternativa muy eficaz y
carente de riesgo para la salud, en cambio no es una alternativa muy aceptada para
los consumidores.
 Cumplimiento de principios de higiene en la fase final de preparación de alimentos:
Para lograr esta meta es muy importante la información y educación de cuantos
manejan alimentos, ya sea a nivel industrial, familiar o el propio consumidor. Las
actuaciones principales a tener en cuenta son la adecuada refrigeración (refrigerar
alimentos elaborados con huevo crudo y consumir antes de 24 horas, descongelar en
refrigerador, mantener la cadena de frio, etc.), suficiente cocinado de los productos
(huevos y carnes por encima de 70ºC), y las buenas practicas higiénicas en la
elaboración de alimentos (limpieza de manos, desinfección de utensilios y superficies,
etc.).
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Máster en Agroalimentación. Eva María Padilla Navidad.
Las pautas para la prevención de Salmonella en alimentos vienen referidas en la
legislación en lo que se conoce como “Paquete de Higiene”. Esta legislación la
componen los siguientes reglamentos fundamentalmente: Reglamento (CE) 178/2002
(13), Reglamento (CE) 852/2004 (14), Reglamento (CE) 853/2004 (15), Reglamento
(CE) 854/2004 (16), Reglamento (CE) 183/2005 (17), Reglamento (CE) 2073/2005 (18).
Efecto de los Tratamientos Térmicos sobre Salmonella
La temperatura es probablemente el factor más importante que afecta a la viabilidad y el
desarrollo microbiano. Aunque el crecimiento de microorganismos se puede dar en un amplio
rango de temperaturas (desde los -8ºC a +90ºC), normalmente la temperatura óptima a la cual
crecen los microorganismos está situada dentro del rango 30-37ºC, no siendo superior a 40ºC
para la mayoría de las formas vegetativas.
La pérdida de viabilidad de los microorganismos aumenta cuando la temperatura supera la
máxima de crecimiento. Este hecho viene determinado por la termorresistencia, que a su vez
viene dada por el tipo de microorganismo, número de células existentes, fase de crecimiento
en que se encuentran, y las condiciones del medio en que se efectúa el calentamiento. La
mayoría de las formas vegetativas de los microorganismos se destruyen en unos minutos a 7080ºC. Cuanto más elevada sea la carga microbiana inicial más tardará en alcanzarse un
determinado valor, por tanto, a la hora de aplicar un tratamiento térmico en un producto,
tendremos que tener en cuenta la carga microbiana inicial del producto.
Una temperatura superior a la que el microorganismo crece provoca su muerte o bien lesiones
subletales. Si hay lesiones subletales las células pueden permanecer viables pero sin capacidad
de multiplicarse hasta que no se subsane la lesión. Cuanto mayor sea el tiempo de exposición
al tratamiento mayor será la pérdida de viabilidad celular.
La pasteurización es un tratamiento térmico usado en la industria agroalimentaria, con la
finalidad de reducir microorganismos presentes en los alimentos, para así alargar su vida útil.
Es un tratamiento térmico en el cual se aplican temperaturas y tiempos de tratamiento
moderados, con lo que se consigue un aumento de la vida útil del producto conservando a su
vez las propiedades nutritivas y organolépticas del alimento. Con este tratamiento se consigue
la total eliminación de microorganismos patógenos y la reducción de los microorganismos
alterantes.
Según las características físico-químicas del alimento (valor de pH, actividad del agua,
conservantes añadidos etc.) al que apliquemos un tratamiento térmico obtendremos un
resultado u otro. En alimentos ácidos (zumo) se consigue una adecuada estabilización del
producto ya que el ácido junto con la aplicación de un tratamiento térmico consigue destruir la
mayoría de los microorganismos patógenos presentes en la materia prima. En aquellos
alimentos con un pH más cercano a la neutralidad (leche), con el tratamiento se consigue
destruir los microorganismos patógenos (Salmonella entre otros) y una reducción significativa
de la flora alterante (lactobacilos). Sin embargo, la efectividad del tratamiento térmico vendrá
determinada por el nivel de contaminación inicial y por el estado fisiológico en el que se
encuentran las células antes del tratamiento. Los tratamientos de pasteurización a
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Memoria de prácticas. Departamento de Bromatología y Tecnología de los Alimentos. Grupo HIBRO AGR170
Universidad de Córdoba.
temperaturas moderadas tienen como principal objetivo conseguir un producto con unas
características organolépticas que se asemejan más al producto en estado fresco. No obstante,
la posibilidad de supervivencia de patógenos como Salmonella, hace que sea necesario
verificar la eficiencia de dichos tratamientos para garantizar la seguridad alimentaria.
Durante más de cien años, la industria alimentaria supone que la penetración del calor en los
productos durante su tratamiento térmico se realiza de forma uniforme (19) y que en la
estimación de la inactivación térmica de un determinado microorganismo, durante el
tratamiento térmico, sigue una cinética lineal. Estudios recientes sugieren que en la
inactivación de microorganismos, entre ellos Salmonella spp., no se sigue una cinética lineal
tradicional (20) (21). Según algunos estudios, el hecho de que la inhibición no sea lineal se
puede deber a factores intrínsecos del propio procedimiento experimental, tales como
tratamientos no uniformes, poblaciones mixtas de células, efectos protectores de las células
muertas o de algunos componentes del alimento (grasas, proteínas), métodos de recuento,
entre otros (22). Sin embargo, recientes estudios de inactivación en células individuales
confirma que los patrones de inactivación no lineales pueden deberse a determinadas
resistencias (al calor u otros factores no térmicos) dentro de una población de células
microbianas (23) (24).
Objetivos
Objetivo General
 Estudio del impacto del estado fisiológico celular sobre la cinética de inactivación del
patógeno Salmonella Enterica, en caldo de cultivo, leche y concentrado de zumo.
Objetivos Específicos
 Evaluación de la resistencia a tratamientos térmicos de Salmonella.
 Comparación del efecto matriz sobre dicha cinética de inactivación.
 Cuantificación de la variabilidad de la población residual como consecuencia de la
aplicación de diferentes tratamientos térmicos
 Desarrollo de modelos de predicción del comportamiento microbiano: cálculo de los
valores D.
Material y métodos
Selección (screening) de cepas
En primer lugar, se realizó un screening, o selección de cepas, en el cual se comparó el
crecimiento de dos cepas diferentes pertenecientes al género Salmonella spp. Dichas cepas
fueron obtenidas de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT 4300 y CECT 4396). A la vista
de los resultados se seleccionó la cepa que presentó un crecimiento mayor, Salmonella
Enterica subespecie Enterica (CECT 4300).
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Máster en Agroalimentación. Eva María Padilla Navidad.
Reconstitución de la cepa
Se procedió a la reconstitución de la cepa a partir de crioviales (Microbank TM). Para dicha
reconstitución se realizaron tres pases sucesivos en caldo Triptona Soja (TSB) (Oxoid, UK). Los
tubos de ensayo y frascos de cada pase se incubaron a 37ºC/24h con la finalidad de conseguir
un crecimiento óptimo de la cepa durante el experimento. Una vez reconstituida la cepa se
almacenó en tubos con Agar de Recuento en placa (PCA, Oxoid) los cuales se mantuvieron en
refrigeración a 2-4ºC para su posterior utilización.
A fin de conseguir un inoculo adecuado para cada experimento se realizaron 2 pases a tubos
de TSB, en días consecutivos, partiendo de los tubos de PCA. Las condiciones de incubación
para cada pase fueron de 37ºC/24h. Con objeto de obtener un cultivo inicial en fase
exponencial, el último pase se incubó en frascos de 50ml a 37ºC/16h.
Todas estas operaciones fueron realizadas por duplicado y usando controles para verificar el
crecimiento.
Cálculo del tamaño del inóculo
Se procedió a calcular el tamaño del inóculo para cada experimento, a partir de los frascos de
TSB (50ml) procedentes del tercer pase. Para ello se realizaron diluciones decimales (1:10) en
tubos de solución salina (9ml) sembrándose las placas por duplicado. Posteriormente fueron
incubadas a 37ºC/24horas.
Diseño experimental
Se aplicaron tratamientos térmicos a Salmonella en diferentes matrices líquidas, con la
finalidad de observar los posibles cambios en la curva de inhibición de Salmonella según el tipo
de matriz usada.
Los tratamientos aplicados a Salmonella fueron de 50ºC-60min, 55ºC-20min y 60ºC-15min.
Todos ellos se aplicaron en tres matrices liquidas: TSB, leche desnatada y zumo de naranja. La
composición nutricional de la leche que se usó por cada 100ml fue la siguiente: grasas 0,3g de
las cuales 0,2g son saturadas; hidratos de carbono 4,9g, proteínas 3,2g, sal 0,1g. La
composición nutricional del zumo usado, por cada 100ml, fue la siguiente: 0g de grasas,
hidratos de carbono 10g, proteínas 0,6g.
Cada uno de los experimentos se realizó por duplicado con objeto de estudiar la variabilidad
microbiológica existente.
Tratamientos de inactivación
Se programó un baño termostático a las temperaturas seleccionadas. En dicho baño se
introdujeron 8 tubos de 9,9ml de la matriz liquida a estudiar (TSB, leche o zumo). Estos tubos
se inocularon, de manera simultánea, con 0,1ml de cultivo de Salmonella (2,68x109).
Posteriormente fueron agitados e introducidos de nuevo en el baño. Una vez inoculados los
tubos, se procedió a la monitorización de la inactivación microbiana a intervalos regulares de
tiempo, según cada tratamiento.
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Memoria de prácticas. Departamento de Bromatología y Tecnología de los Alimentos. Grupo HIBRO AGR170
Universidad de Córdoba.
Para llevar a cabo la monitorización de la inactivación, en cada tiempo de análisis, el primer
tubo (T0) se inoculó e inmediatamente se le aplicó un choque térmico. El choque térmico
consistió en trasferir 1ml desde el tubo T0 a un tubo de solución salina (9ml) previamente
enfriado con agua y hielo. Posteriormente se realizaron sucesivas diluciones desde este último
tubo a otros de solución salina (9ml). Esta operación se repitió hasta obtener la dilución
deseada en cada caso. Posteriormente, se sembró en superficie las diluciones de interés, por
duplicado.
Al resto de tubos se les aplicó un choque térmico, del mismo modo que se ha explicado
anteriormente, con la salvedad de que los choques térmicos se realizaron en un tiempo
determinado para cada tubo. Con todos ellos también se realizaron sucesivas diluciones.
Finalmente se sembraron en superficie las diluciones deseadas en Agar de Recuento en Placa
(PCA, Oxoid). Todas las placas sembradas se incubaron a 37ºC/24h antes de proceder a su
recuento.
Procesamiento de Datos
Los datos de tiempo y concentración para cada una de las condiciones estudiadas se
exportaron a MS Excel v2010. Se calculó el logaritmo de la concentración microbiana (log
ufc/ml). Con objeto de cuantificar la cinética de inactivación, se ajustó un modelo predictivo a
los datos observados. Para ello se utilizó el software DMFit (Institute of Food Research,
Norwich, UK).
Se determinaron una serie de parámetros cinéticos, tales como nivel de inoculo inicial (N0, log
ufc/ml); tasa máxima de inactivación (kmax, log ufc/h), valor D (min) y concentración final (Nf,
log ufc/ml).
Se realizó la prueba estadística T de Student con la finalidad de ver si hay o no diferencias
entre dos medias poblacionales. Este parámetro se determinó para comparar si hay diferencias
entre las matrices estudiadas y entre las temperaturas estudiadas dentro de cada matriz.
Resultados y Discusión
Los parámetros cinéticos obtenidos con el ajuste del modelo log-lineal, así como el número de
reducciones y el coeficiente de determinación (R2) se muestran en la Tabla 1. Dado el
comportamiento de Salmonella a las diferentes temperaturas en las matrices seleccionadas, se
concluyó que un modelo log-lineal bifásico con cola era el más adecuado para describir los
datos observados. Esto es debido a la existencia de una población residual al finalizar el
tratamiento térmico. La bondad de ajuste del modelo a las condiciones observadas fue
aceptable ya que los valores de R2 fueron superiores a 0,83 en todos los casos.
La utilización del baño termostático como método para monitorizar la inactivación térmica ha
sido considerada en otros estudios. No obstante, estudios realizados por Moody, Vertigo, 2003
(25), indican que existen otros métodos alternativos para el estudio de la inactivación térmica
de determinados microorganismos. El estudio fue realizado mediante ensayos con Escherichia
coli en zumo de naranja y se comparó el método térmico usado en estos ensayos con un nuevo
método emergente denominado “Paired Equivalent Isothermal Exposures” (PEIE). Otros
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Máster en Agroalimentación. Eva María Padilla Navidad.
métodos novedosos de inactivación en alimentos líquidos lo constituyen los pulsos de luz o el
uso de técnicas de campos magnéticos oscilantes (26) (27) (28).
A continuación se procede a la descripción de los resultados obtenidos en cada una de las
matrices estudiadas.
Inactivación de Salmonella Enterica en TSB
Se obtuvo, para el tratamiento a 50ºC durante 60 minutos; una media de 1,39 reducciones
logarítmicas al final del tratamiento; el valor promedio de kmax de las réplicas estudiadas fue de
0,033 log ufc/min y el valor de D fue de 36,24 minutos, lo que nos indica que se produce la
reducción de al menos una unidad logarítmica de la población inicial, a los 36 minutos.
Como cabía esperar, a medida que aumentó la temperatura de tratamiento, la inactivación de
Salmonella Enterica fue más pronunciada. Así, para el tratamiento a 55ºC durante 20 minutos,
se obtuvo una media de 2,43 reducciones logarítmicas al final del tratamiento; el valor
promedio de kmax fue de 0,28 log ufc/min; el valor de D fue de 3,6 minutos.
Con respecto al tratamiento a 60ºC durante 15 minutos, el valor promedio obtenido fue de
2,36 reducciones logarítmicas al final del tratamiento; el valor kmax fue de 0,6 log ufc/min; el
valor de D fue de 2,3 minutos.
Tal y como se muestra en la Figura 1, mediante la aplicación de un tratamiento de 50ºC en TSB,
(Fig. 1.a) se obtiene un modelo lineal. La reducción experimentada es similar entre ambas
réplicas, a pesar de que en una de ellas se alcance este grado de reducción más rápidamente
que en la otra, de ahí que haya una gran diferencia en los valores de D entre réplicas. En
cambio a 55ºC, (Fig. 1.b) se obtiene una cinética de inactivación bifásica en la cual en primer
término se produce una reducción brusca de la población y posteriormente hay una
resistencia, de los microorganismos que sobreviven a la destrucción. A 60ºC, (Fig. 1.c) se
consigue también una inactivación bifásica, aunque más acelerada que a menores
temperaturas. Se puede observar la variabilidad existente entre ambas réplicas, de modo que
en una se consigue más rápidamente la inactivación que en la otra. Estos resultados se
asemejan a los obtenidos en los trabajos realizados por Humpheson et al. (1998) (29), en los
cuales se estudió la cinética de inactivación térmica de Salmonella Enteritidis a temperaturas
comprendidas entre 40-60ºC. Se corroboró que la cinética de inactivación de Salmonella no
sigue el modelo comúnmente aceptado de inactivación de primer orden, sino que esta
inactivación se corresponde con una curva bifásica. Se comprobó experimentalmente que a
una temperatura de 50ºC las curvas de supervivencia eran lineales y conforme iba
aumentando la temperatura hasta 60ºC se producían reducciones decimales bifásicas en la
población.
Inactivación de Salmonella Enterica en leche desnatada
El tratamiento de 50ºC/60min en leche no produjo una reducción muy acusada de Salmonella
Enterica, de hecho en una de las réplicas los datos observados no pudieron ajustarse a ningún
modelo de inactivación microbiana. En la segunda réplica se obtuvo una media de 0,9
reducciones logarítmicas al final del tratamiento; kmax = 0,027 log ufc/min; valor D = 37,6 min.
En los estudios llevados a cabo por Migeemanathan et al. (2011) (30), en los cuales se
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Memoria de prácticas. Departamento de Bromatología y Tecnología de los Alimentos. Grupo HIBRO AGR170
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realizaron ensayos de inactivación de Salmonella Typhimurium en leche de cabra a diferentes
temperaturas, se demostró que este patógeno a una temperatura de 50ºC es termotolerante,
pudiendo crecer perfectamente en dichas condiciones en leche de cabra. En nuestro estudio se
han obtenido resultados similares a 50ºC en leche, en este caso de vaca y para la inactivación
del microorganismo Salmonella Enterica.
Al igual que se obtuvo en TSB, al aumentar la temperatura de tratamiento, la inactivación de
Salmonella Enterica fue más pronunciada. Así para el tratamiento a 55ºC durante 20 minutos,
se obtuvo una media de 2,15 reducciones logarítmicas; el valor de kmax promedio fue de 0,28
log ufc/min; el valor de D fue de 3,6 min.
Por último, para el tratamiento a 60ºC durante 15 minutos, se obtuvo una media de 2,47
reducciones logarítmicas al final del tratamiento; kmax = 1,15 log ufc/min; valor D = 0,9 min.
A temperaturas de 55-60ºC los estudios llevados a cabo por Migeemanathan et al. (2011) (30)
muestran que la población de Salmonella Typhimurium en leche de cabra podría llegar a
eliminarse completamente. Esto último discrepa con los resultados obtenidos en nuestros
ensayos, en los cuales, a dichas temperaturas, solo se obtiene una reducción de entre 2 a 2,5
reducciones decimales.
Otros estudios similares se han realizado en leche de camella, por Sela et al. (2003) (31). En
dichos estudios se comparó la inactivación de E. coli tanto en leche de camella como en leche
de vaca, no obteniéndose diferencias significativas.
Al observar la Figura 2 podemos concluir que, con un tratamiento térmico de 50ºC en leche,
(Fig. 2.a) se produce una reducción de la población inicial mínima. Una de las réplicas no se
ajustó a ningún modelo de inactivación debido a la poca reducción existente. Con un
tratamiento de 55ºC, (Fig. 2.b) se obtiene nuevamente un modelo de inhibición bifásico, con
una reducción rápida al inicio del tratamiento y una cola compuesta caracterizada por la
existencia de una población residual, resistente al tratamiento. Por ultimo a 60ºC, (Fig. 2.c) se
obtiene un modelo bifásico con una mayor inhibición de la población en menos tiempo. En
leche se obtuvieron menores diferencias o variación entre las réplicas, no obstante la mayor
variabilidad entre réplicas se obtiene a mayores temperaturas, es decir, a temperaturas de
60ºC.
Inactivación de Salmonella Enterica en zumo
Para el tratamiento a 50ºC durante 60 minutos, hubo una mayor variabilidad entre las réplicas
estudiadas. Se obtuvo, una media de 2 reducciones logarítmicas al final del tratamiento; el
valor de kmax promedio fue de 0,066 log ufc/min; el valor de D fue de 18 minutos.
Para el tratamiento a 55ºC durante 20 minutos, se consiguió una media de 2,55 reducciones
logarítmicas al final del tratamiento; el valor de kmax promedio fue de 0,42; el valor de D fue de
2,75 minutos. Las diferencias entre las réplicas se dan a nivel de kmax y valor D ya que en una
réplica se produce antes la reducción de la población que en la otra, el número de reducciones
es similar en ambas réplicas.
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Máster en Agroalimentación. Eva María Padilla Navidad.
Finalmente, para el tratamiento a 60ºC durante 15 minutos, una media de 2,7 reducciones
logarítmicas al final del tratamiento; el valor de kmax promedio fue de 0,97; el valor de D fue de
1,05 minutos.
Se realizaron estudios similares de inactivación microbiana en zumo de naranja por
Timmermans et al. (2011) (32), en los cuales se comparó la técnica térmica aquí descrita con
otras técnicas de inactivación, como son las altas presiones y los campos eléctricos pulsátiles.
Se obtuvieron unos resultados semejantes en cuanto a la inactivación microbiana conseguida
por cada uno de los tratamientos, en cambio para otros parámetros como son los que tienen
que ver con la calidad relacionada con la inactivación de la enzima pectinmetilesterasa se
obtienen resultados más positivos para los tratamientos térmicos tradicionales.
Según los resultados recogidos en la Figura 3, podemos concluir que, hay más variabilidad
entre las réplicas de los experimentos realizados en zumo si las comparamos con el resto de
matrices estudiadas. A 50ºC, (Fig. 3.a) podemos observar que el modelo de inactivación es
bifásico, a diferencia de lo que ocurre a esta misma temperatura en otras matrices. Esto podría
deberse al efecto ácido del zumo, de modo que a pH más bajos pudiera ser que Salmonella se
viera más vulnerable a tratamientos térmicos. Tanto a temperaturas de 50ºC, (Fig. 3.b) como a
55ºC, (Fig. 3.c) se obtiene una cinética bifásica, resultando como es de esperar, en una mayor
inactivación a mayor temperatura.
En vista de los resultados se puede concluir que, dentro de una misma matriz, cuando se
aplican sucesivos tratamientos térmicos con aumento de temperatura progresiva y con
tiempos cada vez más reducidos, se obtiene que a mayor temperatura de tratamiento se
consigue un mayor número de reducciones logarítmicas en la población inicial; valores
ascendentes de kmax y valores descendentes del valor D. No obstante, en el caso del
tratamiento en TSB a una temperatura de 60ºC se redujo en igual grado la población que a
55ºC, aun así a 60ºC esta reducción fue más rápida.
Cuando comparamos los resultados obtenidos entre matrices distintas, se obtiene que para los
tratamientos a 50ºC y 55ºC, la población de Salmonella resultó más inhibida en zumo,
posteriormente en TSB y por último en leche. En cuanto a los valores de kmax y D, encontramos
valores similares en leche y TSB, en cambio, en zumo, el kmax es mayor y el valor D menor, lo
que significa que en zumo hay una reducción no solo mayor, sino también más rápida. En
cambio, al hacer una comparación similar a una temperatura de 60ºC se obtienen resultados
diferentes. Así, obtenemos que a 60ºC, la inactivación de Salmonella fue mayor en zumo,
posteriormente en leche y por último en TSB. Los valores de kmax y D, en este caso, son
similares en leche y zumo. Estos valores en TSB son en el caso de la kmax menor y el valor D
mayor, lo que significa que en TSB, a 60ºC, encontramos una reducción menor y una mayor
lentitud de esta reducción.
Tras realizar el tratamiento estadístico de los datos (T-student; p<0.05) pudimos observar
algunas diferencias significativas. Se encontró una diferencia significativa entre las medias de
la población de Salmonella tratada en TSB con respecto a la población tratada en zumo. Esto es
así porque la inactivación de Salmonella en zumo es mayor que en TSB. Estos resultados
podrían explicarse atendiendo a la gran diferencia existente en el pH de estas dos matrices, de
modo que Salmonella se verá más afectada en aquella matriz más ácida, como en este caso es
10
Memoria de prácticas. Departamento de Bromatología y Tecnología de los Alimentos. Grupo HIBRO AGR170
Universidad de Córdoba.
el zumo. Otra de las diferencias encontrada al aplicar este tratamiento estadístico se encontró
en la media de las poblaciones entre la leche tratada a una temperatura de 50ºC con respecto
a la que se trató a una temperatura de 60ºC. Como cabe esperar la inactivación será mayor a
una temperatura más elevada. El hecho de que se considere significativa esta diferencia puede
deberse a que en leche a 50ºC no se produce apenas inactivación, en cambio a 60ºC en la
misma matriz se pueden tener reducciones de hasta 2,5 unidades logarítmicas.
Conclusiones





A medida que se aumenta la temperatura del tratamiento térmico la inactivación de
Salmonella Enterica es más acusada y rápida, lo que se traduce en valores de kmax cada
vez mayores y valores de D menores.
A temperaturas de 50ºC obtenemos modelos de inactivación lineales generalmente; a
temperaturas de 55-60ºC se obtienen modelos de inactivación bifásicos, en los cuales,
en primera instancia hay una reducción brusca del microorganismo y posteriormente
hay una parte de la población que es resistente al tratamiento térmico y sobrevive. No
obstante, a 50ºC en zumo no se obtuvo una cinética de inactivación lineal, sino que fue
bifásica. Esto podría deberse a que el pH del zumo hace que Salmonella sea más
vulnerable a su inactivación que a valores de pH más básicos.
La variabilidad de resultados es más acusada cuanto más alta es la temperatura y más
ácido el pH de la matriz en estudio.
Por norma general, cuando comparamos los resultados entre matrices obtenemos que
la reducción de la población inicial más acusada se da en zumo, obteniéndose en esta
matriz también valores mayores de kmax y menores del valor D, lo que nos indica que la
reducción microbiana en zumo se realiza de modo más eficaz y rápidamente.
Al aplicar la prueba estadística T de Student se obtuvieron resultados de diferencias
significativas entre las medias de las poblaciones reducidas en zumo y TSB, de modo
que en zumo la reducción es mucho mayor que en TSB, pudiéndose atribuir este hecho
al pH más acido del zumo respecto al TSB. Se obtuvieron también diferencias
significativas entre la población sometida a tratamiento de 50ºC en leche con respecto
a la temperatura de 60ºC.
Propuestas
Se podrían realizar otros estudios complementarios a éste, con la finalidad de conseguir una
optimización de los tratamientos térmicos aplicados a alimentos, garantizando así la inocuidad
de los productos y la eficiencia productiva. Una posibilidad para futuros estudios sería la
inclusión de trabajos de inactivación térmica de otros microorganismos patógenos susceptibles
de estar presentes en este tipo de productos, usando rangos de temperaturas mayores, junto
con la acción de otros factores a fin de adaptar estos estudios a los criterios microbiológicos de
la normativa vigente. Finalmente, otra alternativa sería realizar trabajos en los cuales se
utilicen varias técnicas de inactivación para así optimizar el rendimiento y conseguir mejores
resultados.
11
Máster en Agroalimentación. Eva María Padilla Navidad.
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Memoria de prácticas en el laboratorio de microbiología del departamento de tecnología de los alimentos.
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Tabla 1: Promedio de Modelos Ajustados.
N0: Inoculo Inicial; kmax: Tasa Máxima de Inactivación; Valor D: Tiempo de Reducción Decimal; N f:
Población Residual; Nº Red: Número de Reducciones (log ufc/ml); R2: coeficiente de determinación. El
error estándar obtenido para N0, kmax y Nf, se muestra entre paréntesis.
Matriz Tratamiento
Térmico
TSB
50ºC/60min
N0 (log
ufc/ml)
7,11(0,087)
TSB
50ºC/60min
6,50 (0,183)
TSB
55ºC/20min
7,25 (0,116)
TSB
55ºC/20min
7,25 (0,163)
TSB
60ºC/15min
7,30 (0,273)
TSB
60ºC/15min
7,32 (0,159)
Leche
Leche
50ºC/60min
50ºC/60min
NA*
6,72 (0,049)
Leche
55ºC/20min
6,69 (0,285)
Leche
55ºC/20min
6,47 (0,128)
Leche
60ºC/15min
6,73 (0,132)
Leche
60ºC/15min
6,48 (0,196)
Zumo
50ºC/60min
6,40 (0,195)
Zumo
50ºC/60min
7,20 (0,215)
Zumo
55ºC/20min
6,47 (0,217)
Zumo
55ºC/20min
7,01(0,181)
Zumo
60ºC/15min
6,49 (0,345)
Zumo
60ºC/15min
7,34 (0,305)
kmax (log
ufc/min)
-0,020
(0,003)
-0,047
(0,011)
-0,299
(0,028)
-0,260
(0,039)
-0,971
(0,206)
-0,282
(0,040)
NA*
-0,027
(0,003)
-0,300
(0,078)
-0,258
(0,034)
-1,392
(0,685)
-0,910
(0,140)
-0,039
(0,011)
-0,093
(0,016)
-0,264
(0,046)
-0,586
(0,088)
-0,819
(0,237)
-1,124
(0,238)
Valor D
(min)
-51,02
Nf (log
ufc/ml)
5,73 (1,39)
Nº Red
R2
1,38
0,91
-21,46
5,10 (0,10)
1,41
0,88
-3,34
4,67 (0,06)
2,58
0,98
-3,84
4,96 (0,09)
2,28
0,96
-1,03
4,85 (0,112)
2,45
0,91
-3,55
5,05 (0,109)
2,26
0,95
NA*
-37,59
NA*
5,81 (0,036)
NA*
0,91
NA*
0,97
-3,33
4,44 (0,143)
2,25
0,88
-3,88
4,42 (0,066)
2,04
0,97
-0,72
4,33 (0,054)
2,39
0,98
-1,10
3,94 (0,08)
2,54
0,95
-25,44
5,00 (0,149)
1,39
0,83
-10,76
4,61 (0,129)
2,59
0,94
-3,79
3,93 (0,128)
2,54
0,94
-1,71
4,45 (0,074)
2,56
0,96
-1,22
3,84(0,142)
2,65
0,88
-0,89
4,58 (0,125)
2,75
0,91
*En esta condición no se pudo ajustar ningún modelo a los datos observados.
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Máster en Agroalimentación. Eva María Padilla Navidad.
a)
b)
c)
Figura 1: Inactivación de Salmonella Enterica (Réplica 1 y 2: Rep 1 y 2) sometida a tratamientos térmicos
de 50ºC (a), 55ºC (b), 60ºC (c) en caldo TSB y modelo log-lineal + cola ajustado.
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Memoria de prácticas. Departamento de Bromatología y Tecnología de los Alimentos. Grupo HIBRO AGR170
Universidad de Córdoba.
a)
b)
c)
Figura 2: Inactivación de Salmonella Enterica (Réplica 1 y 2: Rep 1 y 2) sometida a tratamientos térmicos
de 50ºC (a), 55ºC (b), 60ºC (c) en Leche desnatada y modelo log-lineal + cola ajustado.
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Máster en Agroalimentación. Eva María Padilla Navidad.
a)
b)
c)
Figura 3: Inactivación de Salmonella Enterica (Réplica 1 y 2: Rep 1 y 2) sometida a tratamientos térmicos
de 50ºC (a), 55ºC (b), 60ºC (c) en concentrado de zumo de naranja y modelo log-lineal + cola ajustado.
18
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