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Artículos originales de investigación
111217 - Validación del método de cultivo microbiológico para su
utilización en el diagnóstico de micoplasmas en sueros, cultivos
celulares y productos biofarmacéuticos (Validation of
microbiological culture method for use in diagnosis of
mycoplasma in se
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Introducción.
La validación no es más que la confirmación mediante la
aportación de evidencia objetiva de datos que respaldan
la existencia o veracidad de algo, estos pueden
obtenerse por medio de la observación, medición, en
Para validar los métodos se hace referencia a los
parámetros a comprobar de acuerdo con las
características de los ensayos cuantitativos o cualitativos
de analitos mayoritarios o minoritarios en la muestra
evaluada según lo refiere la REGULACIÓN No. 41-2007
del CECMED (Centro para el Control Estatal de
Medicamentos, Equipos y Dispositivos Médicos), durante
este proceso es posible identificar si la metodología
nueva o modificada se acepta para su uso, en tanto
demuestre equivalencia con el método de referencia,
entendiéndose ésta como una diferencia no significativa
en los resultados emitidos por ambos métodos, o se
determine que el nuevo ensayo demuestra un
comportamiento superior. Si en el proceso de validación
el
nuevo
ensayo
demuestra
un
recuento
significativamente más bajo que el de referencia, se
debe rechazar (Barrell et al., 2002).
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Dentro de los sistemas de calidad la detección de contaminaciones biológicas juega un importante rol, de
modo que las agencias reguladoras han establecido normas relacionadas con la detección de estas
contaminaciones y entre ellas, específicamente, la detección de micoplasmas como prueba determinante
para la liberación o no de productos biotecnológicos (Farmacopea Británica, 2004; Regulación 16:2006
CECMED; Farmacopea Europea, 2007), debido a los efectos indeseables que producen estos
microorganismos en el individuo que recibe los productos contaminados, el error en la interpretación de un
diagnóstico y en las alteraciones que inducen los micoplasmas en la actividad y funciones de la célula,
relacionadas con la producción de severos eventos citopáticos, la inhibición de síntesis de carbohidratos,
proteínas, ácidos nucleicos (Lobo y Vega, 2004; Rivera-Tapia et al.,2010).
El Laboratorio de Diagnóstico de Micoplasmas, del CENSA (Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria),
cuenta entre los procedimientos utilizados para el diagnóstico de micoplasmas con el método de cultivo
microbiológico el cual es utilizado por centros de referencias internacionales además de ser reconocida
como la técnica de referencia en los documentos normativos relacionados con diagnóstico de
micoplasmas en animales, cultivos celulares y productos biofarmacéuticos. En tal sentido la validación de
este procedimiento en nuestro laboratorio nos pone al mismo nivel de los estos centros de referencias
internacionales, además, de ser el único laboratorio del país que brinda el servicio de detección de
micoplasmas a los diferentes productos o materias primas utilizadas tanto para investigaciones,
producciones como componentes de diagnosticadores desarrollados por los diferentes centros del polo
científico. Para el desarrollo del protocolo de validación se tuvo en cuenta lo referido en la
REGULACIÓN No. 41-2007 del CECMED bajo un sistema de calidad regido por la norma NC ISO
/IEC 17025:2006.
MATERIALES Y MÉTODOS.
Materialde Referencia Certificado (MRC), utilizado como controles positivos en elensayo Cultivo
Microbiológico.
Cepa de Mycoplasma arginini (M. arginini) NCTC 10129 1 : esta cepa se presenta como el contaminante
más frecuente de cultivos celulares, sueros y productos biofarmacéuticos. Es la cepa tipo a emplear en los
ensayos de cultivo microbiológico y PCR según lo recomendado por la Farmacopea Británica, 2004;
Farmacopea Europea, 2007.
Cepa de Mycoplasma orale(M. orale) NCTC 101121
Cepa de
101161
Acholeplasma laidlawii(A. laidlawii ) NCTC
Cepa de Mycoplasma hyorhinis (M. hyorhinis) NCTC 101301
Cepa de Mycoplasma fermentans,(M. fermentans)NCTC 101171
Cepa de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides small colony biotype (MmmSC). ATCC 279481
Cepa de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides large colony biotype (MmmLC). NCTC 101371
Cepa de Mycoplasma spp. Material de colección del laboratorio de Microbiología del Instituto
Zooprofiláctico de Teramo, Italia. (Laboratoriode referencia de la OIE para el diagnóstico de la
Pleuroneumonía contagiosa bovina).
Desarrollo de la validación del método de cultivo microbiológico para el género Mycoplasma.
Siembra de las cepas.
La siembra de las cepas se realizó según lo descrito por Hayflick, 1965. Las cepas liofilizadas se
resuspendieron en 1 mL de medio Micoplasma Hayflick líquido. Posteriormente se tomó 0.2 mL de cada
una de las cepas y se sembró en medio Micoplasma Hayflick Agar. Se incubó a 370C en incubadora
(Thermolyne) durante 48 horas en jarra con candil para favorecer las condiciones de microareofilia según
lo descrito por Poveda, 1998.
Estudio morfológico
Las colonias fueron observadas a las 48 horas de incubación usando un microscopio óptico (Opton) de
luz ordinaria bajo una magnificación de - 35 x. Se siguió como criterio de caracterización la formación de
colonias pequeñas, entre 50 a 500 mm de diámetro y en forma de “huevo frito”,según lo descrito por
Poveda, 1998.
Cultivos de las cepas.
El cultivo se realizó según lo descrito en el Manual de Obtención de Antígeno del Instituto de
Investigaciones de la Universidad de Georgia, 2002. Se cortó un bloque de 1 cm2 de las placas crecidas y
se sembraron en 5 mL de medio Hayflick líquido. Posteriormente se incubaron a 370C por 48 horas hasta
que alcanzaron la fase exponencial de crecimiento con un pH entre 7.4-7.5 y una densidad óptica (DO
540nm) entre 0.2-0.4, medida en espectrofotómetro (Pharmacia). Se sembraron estos 5 mL de cultivo en 20
mL de medio Hayflick líquido, para un volumen final de 25 mL y se incubaron a 370C por 48 horas, hasta
que alcanzó la DO y pH requeridos. Se realizó otro pase sembrando 10 mL de estos precultivos en 40 mL
de medio, para un volumen final de 50 mL manteniendo las mismas condiciones de crecimiento. Por
último, se tomaron 20 mL de los cultivos crecidos y se sembraron en 80 mL del medio en las mismas
condiciones de crecimiento, para un volumen final de 100 mL.
En cada pase, el cultivo de las cepas fue sembrado en Agar sangre para el control bacteriológico.
Metodología de Validación.
Teniendo en cuenta que este ensayo pertenece a la categoría de ensayo cualitativo, según la clasificación
realizada por la Organización Internacional de Sanidad Animal (OIE) 2008 y la REGULACIÓN No.
41-2007 del CECMED , se tuvo presente la demostración de los siguientes parámetros: estudio de
robustez, límite de detección, especificidad y precisión.
ESTUDIOS DE ROBUSTEZ, LÍMITE DE DETECCIÓN,
ESPECIFICIDAD Y
PRECISIÓN DEL CULTIVO
MICROBIOLÓGICO.
Robustez
En el estudio de robustez se evaluaron las siguientes variantes:
- Diferentes rangos de temperaturas (330C, 350C; 370C y 390C) manteniendo una atmosfera de 5% CO2,
- Diferentes
seisy
12 meses).
tiempos de conservación del suero equino para ser empleado como suplemento del medio de cultivo (tres meses,
- Diferentes medios de micoplasma base
Biopreparados, Cuba).
PPLO-OXOID y Micoplasma Base Caldo- BIOCEN (Centro Nacional de
Límite de detección.
Se partió de un cultivo inicial de Mycoplasma arginini (NCTC 10129), con una concentración de 2x10 8
UFC/mL. S e realizaron diluciones seriadas en base a diez,desde 10 -1 hasta 10 -10 UFC/mL, las
mismas fueron sembradas en placas con medio Hayflick e incubadas a 37 0 C por 48 horas en jarra con
candil para favorecer las condiciones de microareofilia según lo descrito por Poveda, 1998. Todas las
diluciones se trabajaron por triplicado.
Especificidad.
Para la determinación de este parámetro se utilizaron los siguientes cultivos de los MRC mencionadas anteriormente:
- M. arginini,con una concentración de 2x108 UFC/mL
- M. hyorhinis; con una concentración de 1.4 x108 UFC/mL
- M. fermentans;con una concentración de 3,2x108 UFC/mL
- M. orale con una concentración de 2.2x108UFC/mL
- A. laidlawii, con una concentración de 1.7x108 UFC/mL
-Staphylococcus aureus con una concentración de 2x108 UFC/mL,(ATCC 6538), donada gentilmente por Laboratorio de
Microbiología, Dirección de Aseguramiento de la Calidad, CENSA.
Los cultivos fueron sembrados en placas con medio Hayflick e incubadas a 370C por 48 horas en jarra
con candil para favorecer las condiciones de microareofilia según lo descrito por Poveda, 1998.Todos los
cultivos de las cepas se trabajaron por triplicado.
Precisión
La determinación de la precisión se realizó en dos niveles: intraensayo e interensayo relacionado con la
elaboración del medio de cultivo, comprobando para cada caso la esterilidad y promoción delcrecimiento.
- intraensayo(repetibilidad): elaboración del Medio de cultivo Hayflick por un mismo analista y bajo las
mismas condiciones de trabajo en diferentes días, hastallegar a un total de 20 lotes con 15 placas cada
uno. De ellas el 100% fueron sometidas a prueba de esterilidad y el 20% apromoción del crecimiento.
- interensayo (precisión intermedia): realizado por dos
(2) analistas, con las mismas condiciones, endías
diferentes. En este estudio se mantuvo las mismas
condiciones del análisis anterior para cada analista.
Para el análisis estadístico de los resultados se utilizó la
prueba t de student para comprobar la homogeneidad de
varianza.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
ENSAYOS RELACIONADOS CON EL CULTIVO PARA MICOPLASMAS.
A pesar de los avances tecnológicos en el diagnóstico de los micoplasmas, el método de cultivo continúa
siendo la técnica de referencia aprobada por las diferentes famacopeas (Farmacopeia Europea, acápite
2.6.7 y 2.6.16,2007 y 2010 y organismos reguladores como la OIE (Manual de la OIE, 2008),
Organización Mundial de la Salud (OMS, 2000 y 2010) y la Organización Panamericana de la Salud (OPS,
2000).
En la Figura 1 se observan los resultados obtenidos como parte del estudio morfológico utilizados en este
ensayo. En todos los casos se puedo apreciar la conocida forma de “huevo frito” reportada como
característica distintiva de los micoplasmas consistente en una región central granular oscura embebida
en el agar y una zona traslúcida periférica alrededor de esta, lo cual coincide con lo reportado por Poveda,
1998 y aparece descrito en el Manual Bergey, del 2010.
Los cultivos de estas cepaspresentaron el pH y DO
requeridos según se refiere en el Manual de Obtención
de Antígeno del Instituto de Investigaciones de la
Universidad de Georgia, 2002, donde se señala que
valores de pHentre 7.2 y 7.5 y una absorbancia entre 0.2
y 0.4 nm es lo recomendadoen un cultivo para ser
utilizado en los ensayos de validación. Valores similares
fueron obtenidos por Hernández, 2005 y Zamora, 2006
quienes señalan, además, que cuando un cultivo
mantienesus propiedades morfológicas y bioquímicas
estables y homogéneos, pueden ser utilizados en
estudios de caracterización y posibilita la extracción de
ADN de buena calidad.
El análisis bacteriológico de estos cultivos resultó negativo, lo que demuestra que no presentaba
contaminación bacteriana y que el crecimiento evidenciado se corresponde con las especies de
micoplasmas y no con las conocidas formas L bacterianas ya que en subcultivos realizados todas las
cepas de micoplasmas crecieron.
Lo anterior tiene su explicación ya que en condiciones de incubación favorables o en las fases tempranas
del cultivo (24 y 72 horas (hrs), las formas celulares esféricas de 0,3 µm de diámetro son las
predominantes. Cuando las condiciones de incubación no son las óptimas o el cultivo ha envejecido,
comienzan a aparecer formas cilíndricas (100 µm de largo yentre 0,3-0,4 µm de ancho), que contienen
varios nucleoides similares a las formas L bacterianas. Estas estructuras fibrilares se fragmentan y dan
origen a estructuras esféricas de 0,1 a 0,25 µm, denominadas “cuerpos elementales”, que carecen de
viabilidad, según lo descrito por Razin y Concenza, 1966. Cuando estas estructuras son re-inoculadas en
un medio fresco, no son capaces de crecer ni de multiplicarse criterios que sustentan los resultados
obtenidos por nosotros.
ESTUDIOS DE ROBUSTEZ, LIMITE DE DETECCIÓN, ESPECIFICIDAD Y PRECISIÓN DEL CULTIVO
MICROBIOLÓGICO.
Según lo establecido en la Farmacopeia Británica Veterinaria, 2004; Manual OIE, 2008 y Farmacopeia Europea, 2007 es
necesario emplear material de referencia certificado en los estudios devalidación de cualquierensayo,ya que los mismos
poseen todas sus propiedades bioquímicas y enzimáticas estables. El empleo de este material garantiza obtener resultados
confiables y permite demostrar que realmente el ensayo empleado es útil para detectar el microorganismo deseado.
De acuerdo a lo establecido en la Regulación 41/2007 del CECMED y la NC ISO/IEC 17025:2006, los métodos normalizados y
estandarizados no requieren validación sino una evaluación de su desempeño. No obstante, para la introducción de los mismos
cada laboratorio definirá sus criterios de evaluación caso a caso, tomando en consideración las características del método y la
experiencia que se tenga en la caracterización del producto en cuestión.
ROBUSTEZ
Los resultados obtenidos en relación a las condiciones de incubación empleando diferentes rangos de
temperaturas evidenciaron que en el caso de las variables de 330C, 350C y 390C no hubo crecimiento en
ninguno de los medios utilizados, por el contrario si se observó crecimiento a 37ºC ±0,5 de temperatura.
Esto se debe a que los micoplasmas son microorganismos mesófilos y necesitan este rango de
temperatura para propiciar su crecimiento Poveda, 1998. Este resultadotambién coincide con lo reportado
porBaseman et al., 2004,quienes obtuvieronde la región del cuello uterino y de la vagina 21 aislados de
M. genitalium durante una investigación a 31 mujeres que presentaban uretritis no gonocócica al sembrar
estos exudados en el medio SP-4 a 37ºC durante 21 días evidenciándose el cambio de pH.
Se conoce que los micoplasmas carecen de las vías
biosintéticas necesarias para la síntesis de ácidos
grasos y precursores de los ácidos nucleicos (
Manual Bergey, 2002) , además de ser incapaces de
sintetizar esteroles, es por ello que en su mayoría se
presentan como parásitos de organismos eucarióticos,
asociados a la membrana tanto de la célula como a la de
los orgánulos citoplasmáticos ( Willby et al., 2000
). Teniendo en cuenta estas características y para
favorecer el crecimiento de estos microorganismos en
medios artificiales se utiliza el suero equino como uno de
los requerimientos nutricionales más relevante.
En el estudio de los tiempos de conservación de tres, seis y doce meses del suero equino utilizado como
suplemento, no se observó diferencia significativa entre los tres tiempos evaluados (Tabla 1), esto puede
debersea que la conservación a-20ºCdel suero equino en estos intervalos de tiempo no afecta la calidad
del colesterol favoreciendo el crecimiento de los micoplasmas.
Estudios similares fueron llevados a cabo por Hernández et al., 2005 quienes confirman estadísticamente,
la factibilidad que tiene el empleo del suero equino con respecto al empleo del suero humano para realizar
la prueba de la coagulasa en tubo para la detección de Staphylococcus aureus por parte de los
laboratorios microbiológicos y de poderobtener grandes volúmenes para su distribución a diferentes
laboratorios, al mostrar ser muy estable a - 20 ºC por un período de 12 meses.
El tercer parámetro evaluado en la robustez fue el empleo de dos tipos de medios de Micoplasma base
procedente de dos casas comerciales, OXOID yBIOCEN. Además del suero equino utilizado como
suplemento en el medio de cultivo y las condiciones de incubación, es importante conocer que a veces los
componentes pueden ser tóxicos para los micoplasmas, según lo refiere Manual Bergey, 2002
recomienda el uso del Agar purificado o Agar Noble, que garantiza las condiciones óptimas de crecimiento
en el medio de cultivo.
Como resultado de este estudio se pudo evidenciar queno hubo diferencias en cuanto a los parámetros
de control de esterilidad y promoción del crecimiento entre los medios analizados, comportándose de
manera satisfactoria ambos medios de cultivo, estos resultados coinciden con los obtenidos por Pérez et
al., 2001quienes aplicaron un diseño compuesto central para estudiar el medio de cultivo Mycoplasma
base (Oxoid), enriquecido con extracto de levadura, suero equino y glucosa, para el crecimiento deM.
gallisepticum en el cual demostró que una disminución de un 40% del medio Micoplasma base no influye
negativamente en el rendimiento celular.
Resultados similares a los nuestros fueron obtenidos por Lobo, 2000 quien utilizando un medio de cultivo
que contenía PPLO y suero equino en condiciones de agitación favoreció el crecimiento de M. pullorum
obteniéndose un mejor comportamiento en cuanto a la velocidad de crecimiento y rendimientos de la
biomasa, aspectos que se deben tener en cuenta a la hora de trabajar en el laboratorio con estos
microorganismos.
LIMITE DE DETECCIÓN
Como resultado del límite de detección del ensayo, el mismo, fue
capaz de detectarhasta 1 UFC/mL, resultados similares se
describen por Poveda, 1998; Pérez, et al.,2009 y
Asarnow et al., 2010 quienes señalan que los
micoplasmas son microorganismos muy exigentes desde
el punto de vista nutricional y sus requerimientos
culturales son muy altos por tanto, en la medida que le
sean suplementados o garantizadas estas condiciones
en los medios de cultivos artificiales se podrán obtener
resultados favorables en cuanto a la promoción de
crecimiento de estos microorganismos ya que la célula
tendrá todos los cofactores enzimáticos necesarios para
el desarrollo de las funciones metabólicas básicas.
En nuestro caso el medio de cultivo utilizado contiene como suplemento dextrosala
cuales utilizada, según refiere
Poveda, 1998, como fuente de energía mediante la vía glicolítica Embden-Meyerhof-Parnas para la de
obtención de trifosfato de adenosina (ATP), que garantiza el crecimiento de micoplasmas, por otra parte
se mantuvieron lascondicionesde atmósfera propia para su desarrollo en condiciones de cultivo in vitro
relacionadacon5 - 10 % de CO2 y 90 - 95% de N2 en microaerofilia y pH entre 7,0 – 7,4 que favorecieron
el crecimiento, permitiendo obtener los resultados antes mencionados y de esta forma ofrecer una
seguridad en el diagnóstico de estos microorganismos.
ESPECIFICIDAD
Todas las cepas de micoplamas empleadas en este ensayo crecieron entre las 24 y 48 horas a 37 0C con
atmósfera de microaerofilia (Gráfico 1), lo que se describe como característico para estas especies según
Razin, 1999. Los resultados obtenidosratificaron la especificidad del medio Hayflick para
micoplasmascoincidiendo con lo reportado en la Farmacopea Europea, 2007 y el Manual Bergey
2002,quienes recomiendan este medio parael cultivo de los micoplasmas que afectan los cultivos
celulares, sueros y productos biofarmacéuticos puesto que propicia condicionesfisiológicas y pH
adecuado para el crecimiento de estas especie.
En relación al comportamiento de Staphylococcus aureus no se evidenció crecimiento en el medio. Este
resultado se explica si tenemos en cuenta que el medio Hayflick posee dentro de sus componentes la
penicilina, antibiótico que actúa sobre la síntesis de la pared celular lo que evita que crezcan bacterias
Gram positivas, esto propicia condiciones favorables para el crecimiento de los micoplasmas ya que al
carecer de pared celular no tiene efecto sobre el crecimiento de los mismos.
Por otra parte el medio de cultivo fue suplementado, además, con acetato de talium que inhibe el
crecimiento de bacterias Gram negativas (según lo refiere la Farmacopea Española, 2005), de esta
manera se garantiza el crecimiento de los micoplasmas y se evitan contaminaciones bacterianas.
Independiente de estos resultados debemos señalar que dentro del Sistema de Gestión de la Calidad
(SGC), de MYCOLAB esta implementado un procedimiento normativo operacional, relacionado con el
protocolo para el diagnóstico de micoplamas.En el mismo se hace referencia a que todas las muestra que
entre al laboratorio antes de proceder a las técnicas de cultivo y la PCR para la detección de micoplasmas
se le deberá realizar el procedimiento para el control bacteriológico, aquellas muestras que resulten
positivas saldrán del sistema de diagnóstico de micoplasmas, contribuyendo con esto aun mejor
desempeño del ensayo.
PRECISIÓN
La continua manipulación del medio durante la preparación, incrementa la probabilidad de contaminación y en algunos casos
puede interferir en el crecimiento de los microorganismos. Teniendo en cuenta este criterio basamos los estudios repetibilidad y
precisión intermedia en la evaluación del control de esterilidad y promoción del crecimiento.
En nuestro estudio ninguno de los medios preparados bajo estos criterios presentó contaminación alguna. Estos medios
funcionaron de manera óptima, y permitieron el crecimiento de la cepa control en un tiempo aproximado de 48 horas, lo cual
está dentro del rango descrito por Pérez et al., 2009. Los estudios para comprobar la homogeneidad de varianza
demostraron que no hubo diferencias significativas para una p?0.05 en el coeficiente de variación.
Esto sugiere que cuando se cuenta con un SGC, que de soporte al sistema de diagnóstico y se toman las medidas necesarias,
se puede reducir al mínimo la posibilidad de contaminación y lograr resultados reproducibles entre los analistas ya sea en el
mismo día o en condiciones diferentes(día y operario).
Conclusiones.
A partir de los resultados obtenidos se debe utilizar como proveedor, para nuestro laboratorio, el medio
Micoplasma base de la firma BIOCEN, el cualcuenta con una patente que avala sucomposición y calidad,
otro parámetro evaluado fue la robustez el cual demostró que el métodode cultivo microbiológico para micoplasmas es
robusto, pudiéndose aplicar cualquiera de las variantes del tiempo de conservación del suero equino, atemperatura de
incubación de 370C±0,5conel medio de cultivo recomendado.
Teniendo en cuenta estos resultados proponemos el empleo del medio Micoplasma Hayflick modificado
(penicilina/acetato de talium) para el diagnóstico de micoplasmas en cultivos celulares, sueros y productos
biotecnológico como parte del sistema de mejora de MYCOLAB.
El método de cultivo microbiológico evaluado en este estudio cumple con los indicadores requeridos de desempeño en cuanto
a robustez, límite de detección, especificidad y precisión por lo que posibilita brindar resultados confiables
para los fines previstos a partir de la técnica validada.
Por otra parte se recomienda ampliar estudios de validación de la PCR incorporando un control interno
para detectar inhibidores del ensayo en diferentes matrices e incorporar en el sistema diagnóstico del
laboratorio MYCOLAB el empleo de PCR múltiples para la identificación de especies de micoplasmas
contaminantes.
Agradecimientos.
A Evelyn Lobo por ser mi compañera y guía durante toda la investigación, gracias una y mil veces por su
apoyo infinito y ayuda incondicional, la admiro y le estaré eternamente agradecido, ya que no solo es una
gran amiga, también es como una madre llegando en muchas ocasiones a llamarme Roxano, el hijo
macho. A Arsenio y a Alejandrapor asesorarme todo el tiempo con tanta paciencia. A mis padres por ser
mi ejemplo y guía, enseñándome día a día los grandes valores de la vida,sepan quevivo orgulloso de
ustedes, por eso los QUIERO y los llevo siempre en mi CORAZÓN. A mi gran amor, Dailis por todo el
cariño, comprensión, dedicación y confianza que me brinda cada día, ayudándome en los momentos más
difíciles, estando siempre a mi lado, a mis padres que sin ellos este trabajo no fuese posible, a mi tía
Migdo y Noe que siempre me brindaron su apoyo y a mi abuela Juana, que siempre me está dando su
amor.
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Recibido 07.06.2012 /Ref. prov. JUN1236B_REDVET / Revisado 29.09.2012
Aceptado 28.10.2012 / Ref. def. 111217_REDVET / Publicado: 01.11.2012
Este artículo está disponible en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111112.html
concretamente en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111112/111217.pdf
REDVET® Revista Electrónica de Veterinaria está editada por VeterinariaOrganización®.
Se autoriza la difusión y reenvío siempre que enlace con Veterinaria.org®http://www.veterinaria.org y con REDVET®http://www.veterinaria.org/revistas/redvet
Autor
Lozada Yoesley 1: 1MYCOLAB, Laboratorio para el diagnóstico de micoplasmas, Dirección de
Microbiología, Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) | Coautor 1: Lobo Evelyn 1:1
MYCOLAB, Laboratorio para el diagnóstico de micoplasmas, Dirección de Microbiología, Centro Nacional
de Sanidad Agropecuaria (CENSA) | Coautor 2: Burgher Yaima 1:1MYCOLAB, Laboratorio para el
diagnóstico de micoplasmas, Dirección de Microbiología, Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria
(CENSA) | Coautor 3: Duque Arianna 1:1MYCOLAB, Laboratorio para el diagnóstico de micoplasmas,
Dirección de Microbiología, Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) | Coautor 4: Martínez
Siomara 2 : 2Grupo de Biología Molecular, Dirección de Microbiología, Centro Nacional de Sanidad
Agropecuaria CENSA.
Contactos: [email protected] y [email protected]
Resumen
diagnóstico
por
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Por
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biofarmecéuticos.
los
sistemas
estas
de
A
Sumario
Mycoplasmas frequently infected cell cultures, serums andbiofarmeceutical products. With the
development of biotechnology in Cuba, it is necessary to strictly control such pollution, specifically those
caused by mycoplasma, as part of quality systems for the production and release of these products. Thus
it is essential to have sensitive diagnostic techniques and reliable detection of these species, as in the
case of microbiological culture (CM), adopted by the European Pharmacopoeia, 2007 as a technique to
use for routine diagnosis of these organisms. MYCOLAB (Laboratory for diagnosis of mycoplasma) has
implemented a system for the detection of these agents included in this trial, but to demonstrate the
reliability of the results is essential to achieve the validation and accreditation of the technique under a
Management System (QMS) according to the NC ISO/IEC 17025:2006. Therefore, we intended to
establish a reliable diagnosis for the detection of mycoplasma in biopharmaceutical products MYCOLAB
biomedical application by microbiological culture assay validated and accredited by the NC ISO/ IEC
17025:2006. To this was validated (CM) taking into account various performance parameters as they were
robust, detection limit, specificity and accuracy. As a result of the validation of the CM was found that the
assay is robust, specific for mycoplasma, can detect up to 1 CFU/mL and with high accuracy, allowing a
diagnosis to provide faster, more reliable and less expensive.
Artículo
Introducción.
La validación no es más que la confirmación mediante la aportación de evidencia objetiva de datos que
respaldan la existencia o veracidad de algo, estos pueden obtenerse por medio de la observación,
medición, ensayo/prueba u otros medios que han cumplido los requisitos para una utilización o aplicación
específica prevista (NC ISO 9000:2005), similar concepto refiere la NC ISO/IEC 17025:2006 incluyendo la
comparación con otro método de ensayo siendo esta una parte de la validación que se emplea para fines
de comprobar la exactitud.
Para validar los métodos se hace referencia a los parámetros a comprobar de acuerdo con las
características de los ensayos cuantitativos o cualitativos de analitos mayoritarios o minoritarios en la
muestra evaluada según lo refiere la REGULACIÓN No. 41-2007 del CECMED (Centro para el Control
Estatal de Medicamentos, Equipos y Dispositivos Médicos), durante este proceso es posible identificar si
la metodología nueva o modificada se acepta para su uso, en tanto demuestre equivalencia con el método
de referencia, entendiéndose ésta como una diferencia no significativa en los resultados emitidos por
ambos métodos, o se determine que el nuevo ensayo demuestra un comportamiento superior. Si en el
proceso de validación el nuevo ensayo demuestra un recuento significativamente más bajo que el de
referencia, se debe rechazar (Barrell et al., 2002).
Teniendo
presentes
urogenital
los
et
aquellos
materias
al.,
productos
2010)
métodos
primas
en
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ycuenta
un
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tanto
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aplicación
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desarrollo
del
como
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biomédica
laelpapel
de
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como
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(Chaudhry
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animales,
pudiéndose
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entre
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sistemas
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losutilizan
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cultivos
respiratorios,
al.,
de2010;Arismendi
calidad
están
2007).
como
celulares
paray
Dentro de los sistemas de calidad la detección de contaminaciones biológicas juega un importante rol, de
modo que las agencias reguladoras han establecido normas relacionadas con la detección de estas
contaminaciones y entre ellas, específicamente, la detección de micoplasmas como prueba determinante
para la liberación o no de productos biotecnológicos (Farmacopea Británica, 2004; Regulación 16:2006
CECMED; Farmacopea Europea, 2007), debido a los efectos indeseables que producen estos
microorganismos en el individuo que recibe los productos contaminados, el error en la interpretación de un
diagnóstico y en las alteraciones que inducen los micoplasmas en la actividad y funciones de la célula,
relacionadas con la producción de severos eventos citopáticos, la inhibición de síntesis de carbohidratos,
proteínas, ácidos nucleicos (Lobo y Vega, 2004; Rivera-Tapia et al.,2010).
El Laboratorio de Diagnóstico de Micoplasmas, del CENSA (Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria),
cuenta entre los procedimientos utilizados para el diagnóstico de micoplasmas con el método de cultivo
microbiológico el cual es utilizado por centros de referencias internacionales además de ser reconocida
como la técnica de referencia en los documentos normativos relacionados con diagnóstico de
micoplasmas en animales, cultivos celulares y productos biofarmacéuticos. En tal sentido la validación de
este procedimiento en nuestro laboratorio nos pone al mismo nivel de los estos centros de referencias
internacionales, además, de ser el único laboratorio del país que brinda el servicio de detección de
micoplasmas a los diferentes productos o materias primas utilizadas tanto para investigaciones,
producciones como componentes de diagnosticadores desarrollados por los diferentes centros del polo
científico. Para el desarrollo del protocolo de validación se tuvo en cuenta lo referido en la
REGULACIÓN No. 41-2007 del CECMED bajo un sistema de calidad regido por la norma NC ISO
/IEC 17025:2006.
MATERIALES Y MÉTODOS.
Materialde Referencia Certificado (MRC), utilizado como controles positivos en elensayo Cultivo
Microbiológico.
Cepa de Mycoplasma arginini (M. arginini) NCTC 10129 1 : esta cepa se presenta como el contaminante
más frecuente de cultivos celulares, sueros y productos biofarmacéuticos. Es la cepa tipo a emplear en los
ensayos de cultivo microbiológico y PCR según lo recomendado por la Farmacopea Británica, 2004;
Farmacopea Europea, 2007.
Cepa de Mycoplasma orale(M. orale) NCTC 101121
Cepa de Acholeplasma laidlawii(A. laidlawii) NCTC 101161
Cepa de Mycoplasma hyorhinis (M. hyorhinis) NCTC 101301
Cepa de Mycoplasma fermentans,(M. fermentans)NCTC 101171
Cepa de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides small colony biotype (MmmSC). ATCC 279481
Cepa de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides large colony biotype (MmmLC). NCTC 101371
Cepa de Mycoplasma spp. Material de colección del laboratorio de Microbiología del Instituto
Zooprofiláctico de Teramo, Italia. (Laboratoriode referencia de la OIE para el diagnóstico de la
Pleuroneumonía contagiosa bovina).
Desarrollo de la validación del método de cultivo microbiológico para el género Mycoplasma.
Siembra de las cepas.
La siembra de las cepas se realizó según lo descrito por Hayflick, 1965. Las cepas liofilizadas se
resuspendieron en 1 mL de medio Micoplasma Hayflick líquido. Posteriormente se tomó 0.2 mL de cada
una de las cepas y se sembró en medio Micoplasma Hayflick Agar. Se incubó a 370C en incubadora
(Thermolyne) durante 48 horas en jarra con candil para favorecer las condiciones de microareofilia según
lo descrito por Poveda, 1998.
Estudio morfológico
Las colonias fueron observadas a las 48 horas de incubación usando un microscopio óptico (Opton) de
luz ordinaria bajo una magnificación de - 35 x. Se siguió como criterio de caracterización la formación de
colonias pequeñas, entre 50 a 500 mm de diámetro y en forma de “huevo frito”,según lo descrito por
Poveda, 1998.
Cultivos de las cepas.
El cultivo se realizó según lo descrito en el Manual de Obtención de Antígeno del Instituto de
Investigaciones de la Universidad de Georgia, 2002. Se cortó un bloque de 1 cm2 de las placas crecidas y
se sembraron en 5 mL de medio Hayflick líquido. Posteriormente se incubaron a 370C por 48 horas hasta
que alcanzaron la fase exponencial de crecimiento con un pH entre 7.4-7.5 y una densidad óptica (DO
540nm) entre 0.2-0.4, medida en espectrofotómetro (Pharmacia). Se sembraron estos 5 mL de cultivo en 20
mL de medio Hayflick líquido, para un volumen final de 25 mL y se incubaron a 370C por 48 horas, hasta
que alcanzó la DO y pH requeridos. Se realizó otro pase sembrando 10 mL de estos precultivos en 40 mL
de medio, para un volumen final de 50 mL manteniendo las mismas condiciones de crecimiento. Por
último, se tomaron 20 mL de los cultivos crecidos y se sembraron en 80 mL del medio en las mismas
condiciones de crecimiento, para un volumen final de 100 mL.
En cada pase, el cultivo de las cepas fue sembrado en Agar sangre para el control bacteriológico.
Metodología de Validación.
Teniendo en cuenta que este ensayo pertenece a la categoría de ensayo cualitativo, según la clasificación
realizada por la Organización Internacional de Sanidad Animal (OIE) 2008 y la REGULACIÓN No.
41-2007 del CECMED , se tuvo presente la demostración de los siguientes parámetros: estudio de
robustez, límite de detección, especificidad y precisión.
ESTUDIOS DE ROBUSTEZ, LÍMITE DE DETECCIÓN, ESPECIFICIDAD Y PRECISIÓN DEL CULTIVO
MICROBIOLÓGICO.
Robustez
En el estudio de robustez se evaluaron las siguientes variantes:
- Diferentes rangos de temperaturas (330C, 350C; 370C y 390C) manteniendo una atmosfera de 5% CO2,
- Diferentes
seisy
12 meses).
tiempos de conservación del suero equino para ser empleado como suplemento del medio de cultivo (tres meses,
- Diferentes medios de micoplasma base
Biopreparados, Cuba).
PPLO-OXOID y Micoplasma Base Caldo- BIOCEN (Centro Nacional de
Límite de detección.
Se partió de un cultivo inicial de Mycoplasma arginini (NCTC 10129), con una concentración de 2x10 8
UFC/mL. S e realizaron diluciones seriadas en base a diez,desde 10 -1 hasta 10 -10 UFC/mL, las
mismas fueron sembradas en placas con medio Hayflick e incubadas a 37 0 C por 48 horas en jarra con
candil para favorecer las condiciones de microareofilia según lo descrito por Poveda, 1998. Todas las
diluciones se trabajaron por triplicado.
Especificidad.
Para la determinación de este parámetro se utilizaron los siguientes cultivos de los MRC mencionadas anteriormente:
- M. arginini,con una concentración de 2x108 UFC/mL
- M. hyorhinis; con una concentración de 1.4 x108 UFC/mL
- M. fermentans;con una concentración de 3,2x108 UFC/mL
- M. orale con una concentración de 2.2x108UFC/mL
- A. laidlawii, con una concentración de 1.7x108 UFC/mL
-Staphylococcus aureus con una concentración de 2x108 UFC/mL,(ATCC 6538), donada gentilmente por Laboratorio de
Microbiología, Dirección de Aseguramiento de la Calidad, CENSA.
Los cultivos fueron sembrados en placas con medio Hayflick e incubadas a 370C por 48 horas en jarra
con candil para favorecer las condiciones de microareofilia según lo descrito por Poveda, 1998.Todos los
cultivos de las cepas se trabajaron por triplicado.
Precisión
La determinación de la precisión se realizó en dos niveles: intraensayo e interensayo relacionado con la
elaboración del medio de cultivo, comprobando para cada caso la esterilidad y promoción delcrecimiento.
- intraensayo(repetibilidad): elaboración del Medio de cultivo Hayflick por un mismo analista y bajo las
mismas condiciones de trabajo en diferentes días, hastallegar a un total de 20 lotes con 15 placas cada
uno. De ellas el 100% fueron sometidas a prueba de esterilidad y el 20% apromoción del crecimiento.
- interensayo (precisión intermedia): realizado por dos (2) analistas, con las mismas condiciones, endías
diferentes. En este estudio se mantuvo las mismas condiciones del análisis anterior para cada analista.
Para el análisis estadístico de los resultados se utilizó la prueba t de student para comprobar la
homogeneidad de varianza.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
ENSAYOS RELACIONADOS CON EL CULTIVO PARA MICOPLASMAS.
A pesar de los avances tecnológicos en el diagnóstico de los micoplasmas, el método de cultivo continúa
siendo la técnica de referencia aprobada por las diferentes famacopeas (Farmacopeia Europea, acápite
2.6.7 y 2.6.16,2007 y 2010 y organismos reguladores como la OIE (Manual de la OIE, 2008),
Organización Mundial de la Salud (OMS, 2000 y 2010) y la Organización Panamericana de la Salud (OPS,
2000).
En la Figura 1 se observan los resultados obtenidos como parte del estudio morfológico utilizados en este
ensayo. En todos los casos se puedo apreciar la conocida forma de “huevo frito” reportada como
característica distintiva de los micoplasmas consistente en una región central granular oscura embebida
en el agar y una zona traslúcida periférica alrededor de esta, lo cual coincide con lo reportado por Poveda,
1998 y aparece descrito en el Manual Bergey, del 2010.
Los cultivos de estas cepaspresentaron el pH y DO requeridos según se refiere en el Manual de
Obtención de Antígeno del Instituto de Investigaciones de la Universidad de Georgia, 2002, donde se
señala que valores de pHentre 7.2 y 7.5 y una absorbancia entre 0.2 y 0.4 nm es lo recomendadoen un
cultivo para ser utilizado en los ensayos de validación. Valores similares fueron obtenidos por Hernández,
2005 y Zamora, 2006 quienes señalan, además, que cuando un cultivo mantienesus propiedades
morfológicas y bioquímicas estables y homogéneos, pueden ser utilizados en estudios de caracterización
y posibilita la extracción de ADN de buena calidad.
El análisis bacteriológico de estos cultivos resultó negativo, lo que demuestra que no presentaba
contaminación bacteriana y que el crecimiento evidenciado se corresponde con las especies de
micoplasmas y no con las conocidas formas L bacterianas ya que en subcultivos realizados todas las
cepas de micoplasmas crecieron.
Lo anterior tiene su explicación ya que en condiciones de incubación favorables o en las fases tempranas
del cultivo (24 y 72 horas (hrs), las formas celulares esféricas de 0,3 µm de diámetro son las
predominantes. Cuando las condiciones de incubación no son las óptimas o el cultivo ha envejecido,
comienzan a aparecer formas cilíndricas (100 µm de largo yentre 0,3-0,4 µm de ancho), que contienen
varios nucleoides similares a las formas L bacterianas. Estas estructuras fibrilares se fragmentan y dan
origen a estructuras esféricas de 0,1 a 0,25 µm, denominadas “cuerpos elementales”, que carecen de
viabilidad, según lo descrito por Razin y Concenza, 1966. Cuando estas estructuras son re-inoculadas en
un medio fresco, no son capaces de crecer ni de multiplicarse criterios que sustentan los resultados
obtenidos por nosotros.
ESTUDIOS DE ROBUSTEZ, LIMITE DE DETECCIÓN, ESPECIFICIDAD Y PRECISIÓN DEL CULTIVO
MICROBIOLÓGICO.
Según lo establecido en la Farmacopeia Británica Veterinaria, 2004; Manual OIE, 2008 y Farmacopeia Europea, 2007 es
necesario emplear material de referencia certificado en los estudios devalidación de cualquierensayo,ya que los mismos
poseen todas sus propiedades bioquímicas y enzimáticas estables. El empleo de este material garantiza obtener resultados
confiables y permite demostrar que realmente el ensayo empleado es útil para detectar el microorganismo deseado.
De acuerdo a lo establecido en la Regulación 41/2007 del CECMED y la NC ISO/IEC 17025:2006, los métodos normalizados y
estandarizados no requieren validación sino una evaluación de su desempeño. No obstante, para la introducción de los mismos
cada laboratorio definirá sus criterios de evaluación caso a caso, tomando en consideración las características del método y la
experiencia que se tenga en la caracterización del producto en cuestión.
ROBUSTEZ
Los resultados obtenidos en relación a las condiciones de incubación empleando diferentes rangos de
temperaturas evidenciaron que en el caso de las variables de 330C, 350C y 390C no hubo crecimiento en
ninguno de los medios utilizados, por el contrario si se observó crecimiento a 37ºC ±0,5 de temperatura.
Esto se debe a que los micoplasmas son microorganismos mesófilos y necesitan este rango de
temperatura para propiciar su crecimiento Poveda, 1998. Este resultadotambién coincide con lo reportado
porBaseman et al., 2004,quienes obtuvieronde la región del cuello uterino y de la vagina 21 aislados de
M. genitalium durante una investigación a 31 mujeres que presentaban uretritis no gonocócica al sembrar
estos exudados en el medio SP-4 a 37ºC durante 21 días evidenciándose el cambio de pH.
Se conoce que los micoplasmas carecen de las vías biosintéticas necesarias para la síntesis de ácidos
grasos y precursores de los ácidos nucleicos ( Manual Bergey, 2002) , además de ser incapaces de
sintetizar esteroles, es por ello que en su mayoría se presentan como parásitos de organismos
eucarióticos, asociados a la membrana tanto de la célula como a la de los orgánulos citoplasmáticos (
Willby et al., 2000 ). Teniendo en cuenta estas características y para favorecer el crecimiento de estos
microorganismos en medios artificiales se utiliza el suero equino como uno de los requerimientos
nutricionales más relevante.
En el estudio de los tiempos de conservación de tres, seis y doce meses del suero equino utilizado como
suplemento, no se observó diferencia significativa entre los tres tiempos evaluados (Tabla 1), esto puede
debersea que la conservación a-20ºCdel suero equino en estos intervalos de tiempo no afecta la calidad
del colesterol favoreciendo el crecimiento de los micoplasmas.
Estudios similares fueron llevados a cabo por Hernández et al., 2005 quienes confirman estadísticamente,
la factibilidad que tiene el empleo del suero equino con respecto al empleo del suero humano para realizar
la prueba de la coagulasa en tubo para la detección de Staphylococcus aureus por parte de los
laboratorios microbiológicos y de poderobtener grandes volúmenes para su distribución a diferentes
laboratorios, al mostrar ser muy estable a - 20 ºC por un período de 12 meses.
El tercer parámetro evaluado en la robustez fue el empleo de dos tipos de medios de Micoplasma base
procedente de dos casas comerciales, OXOID yBIOCEN. Además del suero equino utilizado como
suplemento en el medio de cultivo y las condiciones de incubación, es importante conocer que a veces los
componentes pueden ser tóxicos para los micoplasmas, según lo refiere Manual Bergey, 2002
recomienda el uso del Agar purificado o Agar Noble, que garantiza las condiciones óptimas de crecimiento
en el medio de cultivo.
Como resultado de este estudio se pudo evidenciar queno hubo diferencias en cuanto a los parámetros
de control de esterilidad y promoción del crecimiento entre los medios analizados, comportándose de
manera satisfactoria ambos medios de cultivo, estos resultados coinciden con los obtenidos por Pérez et
al., 2001quienes aplicaron un diseño compuesto central para estudiar el medio de cultivo Mycoplasma
base (Oxoid), enriquecido con extracto de levadura, suero equino y glucosa, para el crecimiento deM.
gallisepticum en el cual demostró que una disminución de un 40% del medio Micoplasma base no influye
negativamente en el rendimiento celular.
Resultados similares a los nuestros fueron obtenidos por Lobo, 2000 quien utilizando un medio de cultivo
que contenía PPLO y suero equino en condiciones de agitación favoreció el crecimiento de M. pullorum
obteniéndose un mejor comportamiento en cuanto a la velocidad de crecimiento y rendimientos de la
biomasa, aspectos que se deben tener en cuenta a la hora de trabajar en el laboratorio con estos
microorganismos.
LIMITE DE DETECCIÓN
Como resultado del límite de detección del ensayo, el mismo, fue capaz de detectarhasta 1 UFC/mL, resultados
similares
se describen por Poveda, 1998; Pérez, et al.,2009 y Asarnow et al., 2010 quienes señalan que los
micoplasmas son microorganismos muy exigentes desde el punto de vista nutricional y sus requerimientos
culturales son muy altos por tanto, en la medida que le sean suplementados o garantizadas estas
condiciones en los medios de cultivos artificiales se podrán obtener resultados favorables en cuanto a la
promoción de crecimiento de estos microorganismos ya que la célula tendrá todos los cofactores
enzimáticos necesarios para el desarrollo de las funciones metabólicas básicas.
En nuestro caso el medio de cultivo utilizado contiene como suplemento dextrosala
cuales utilizada, según refiere
Poveda, 1998, como fuente de energía mediante la vía glicolítica Embden-Meyerhof-Parnas para la de
obtención de trifosfato de adenosina (ATP), que garantiza el crecimiento de micoplasmas, por otra parte
se mantuvieron lascondicionesde atmósfera propia para su desarrollo en condiciones de cultivo in vitro
relacionadacon5 - 10 % de CO2 y 90 - 95% de N2 en microaerofilia y pH entre 7,0 – 7,4 que favorecieron
el crecimiento, permitiendo obtener los resultados antes mencionados y de esta forma ofrecer una
seguridad en el diagnóstico de estos microorganismos.
ESPECIFICIDAD
Todas las cepas de micoplamas empleadas en este ensayo crecieron entre las 24 y 48 horas a 37 0C con
atmósfera de microaerofilia (Gráfico 1), lo que se describe como característico para estas especies según
Razin, 1999. Los resultados obtenidosratificaron la especificidad del medio Hayflick para
micoplasmascoincidiendo con lo reportado en la Farmacopea Europea, 2007 y el Manual Bergey
2002,quienes recomiendan este medio parael cultivo de los micoplasmas que afectan los cultivos
celulares, sueros y productos biofarmacéuticos puesto que propicia condicionesfisiológicas y pH
adecuado para el crecimiento de estas especie.
En relación al comportamiento de Staphylococcus aureus no se evidenció crecimiento en el medio. Este
resultado se explica si tenemos en cuenta que el medio Hayflick posee dentro de sus componentes la
penicilina, antibiótico que actúa sobre la síntesis de la pared celular lo que evita que crezcan bacterias
Gram positivas, esto propicia condiciones favorables para el crecimiento de los micoplasmas ya que al
carecer de pared celular no tiene efecto sobre el crecimiento de los mismos.
Por otra parte el medio de cultivo fue suplementado, además, con acetato de talium que inhibe el
crecimiento de bacterias Gram negativas (según lo refiere la Farmacopea Española, 2005), de esta
manera se garantiza el crecimiento de los micoplasmas y se evitan contaminaciones bacterianas.
Independiente de estos resultados debemos señalar que dentro del Sistema de Gestión de la Calidad
(SGC), de MYCOLAB esta implementado un procedimiento normativo operacional, relacionado con el
protocolo para el diagnóstico de micoplamas.En el mismo se hace referencia a que todas las muestra que
entre al laboratorio antes de proceder a las técnicas de cultivo y la PCR para la detección de micoplasmas
se le deberá realizar el procedimiento para el control bacteriológico, aquellas muestras que resulten
positivas saldrán del sistema de diagnóstico de micoplasmas, contribuyendo con esto aun mejor
desempeño del ensayo.
PRECISIÓN
La continua manipulación del medio durante la preparación, incrementa la probabilidad de contaminación y en algunos casos
puede interferir en el crecimiento de los microorganismos. Teniendo en cuenta este criterio basamos los estudios repetibilidad y
precisión intermedia en la evaluación del control de esterilidad y promoción del crecimiento.
En nuestro estudio ninguno de los medios preparados bajo estos criterios presentó contaminación alguna. Estos medios
funcionaron de manera óptima, y permitieron el crecimiento de la cepa control en un tiempo aproximado de 48 horas, lo cual
está dentro del rango descrito por Pérez et al., 2009. Los estudios para comprobar la homogeneidad de varianza
demostraron que no hubo diferencias significativas para una p?0.05 en el coeficiente de variación.
Esto sugiere que cuando se cuenta con un SGC, que de soporte al sistema de diagnóstico y se toman las medidas necesarias,
se puede reducir al mínimo la posibilidad de contaminación y lograr resultados reproducibles entre los analistas ya sea en el
mismo día o en condiciones diferentes(día y operario).
Conclusiones.
A partir de los resultados obtenidos se debe utilizar como proveedor, para nuestro laboratorio, el medio
Micoplasma base de la firma BIOCEN, el cualcuenta con una patente que avala sucomposición y calidad,
otro parámetro evaluado fue la robustez el cual demostró que el métodode cultivo microbiológico para micoplasmas es
robusto, pudiéndose aplicar cualquiera de las variantes del tiempo de conservación del suero equino, atemperatura de
incubación de 370C±0,5conel medio de cultivo recomendado.
Teniendo en cuenta estos resultados proponemos el empleo del medio Micoplasma Hayflick modificado
(penicilina/acetato de talium) para el diagnóstico de micoplasmas en cultivos celulares, sueros y productos
biotecnológico como parte del sistema de mejora de MYCOLAB.
El método de cultivo microbiológico evaluado en este estudio cumple con los indicadores requeridos de desempeño en cuanto
a robustez, límite de detección, especificidad y precisión por lo que posibilita brindar resultados confiables
para los fines previstos a partir de la técnica validada.
Por otra parte se recomienda ampliar estudios de validación de la PCR incorporando un control interno
para detectar inhibidores del ensayo en diferentes matrices e incorporar en el sistema diagnóstico del
laboratorio MYCOLAB el empleo de PCR múltiples para la identificación de especies de micoplasmas
contaminantes.
Agradecimientos.
A Evelyn Lobo por ser mi compañera y guía durante toda la investigación, gracias una y mil veces por su
apoyo infinito y ayuda incondicional, la admiro y le estaré eternamente agradecido, ya que no solo es una
gran amiga, también es como una madre llegando en muchas ocasiones a llamarme Roxano, el hijo
macho. A Arsenio y a Alejandrapor asesorarme todo el tiempo con tanta paciencia. A mis padres por ser
mi ejemplo y guía, enseñándome día a día los grandes valores de la vida,sepan quevivo orgulloso de
ustedes, por eso los QUIERO y los llevo siempre en mi CORAZÓN. A mi gran amor, Dailis por todo el
cariño, comprensión, dedicación y confianza que me brinda cada día, ayudándome en los momentos más
difíciles, estando siempre a mi lado, a mis padres que sin ellos este trabajo no fuese posible, a mi tía
Migdo y Noe que siempre me brindaron su apoyo y a mi abuela Juana, que siempre me está dando su
amor.
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REDVET: 2012, Vol. 13 Nº 11
Recibido 07.06.2012 /Ref. prov. JUN1236B_REDVET / Revisado 29.09.2012
Aceptado 28.10.2012 / Ref. def. 111217_REDVET / Publicado: 01.11.2012
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validación, prueba cualitativa, micoplasmas, cultivo.
validation
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