separaciondeproteinas

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LABORATORIO DE ANALISIS DE ALIMENTOS
SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS
INTRODUCCIÓN
Las proteínas son sustancias orgánicas muy complejas presentes en toda
la materia viva. Todas las proteínas contienen además de carbono, hidrógeno,
también nitrógeno y a menudo azufre y fósforo.
Todas las proteínas se componen básicamente de 20 unidades
estructurales
denominadas
aminoácidos
unidos
por
enlaces
peptídicos
provocando características específicas en cada una.
Las propiedades de las proteínas se ven afectadas por modificaciones en el
pH, la absorción de proteínas mediante intercambio iónico depende del pH, es
decir de valores de pH por abajo del punto isoeléctrico la carga neta de la proteína
es positiva y la molécula se ve absorbida con mayor fuerza en intercambiadores
catiónicos como la carboximetil celulosa sódica.
Esta propiedad permite la
separación y la purificación de proteínas mediante cromatografía de intercambio
iónico. La movilidad de las moléculas de proteínas en un campo electrostático
también depende del valor de pH. Esta propiedad permitió desarrollar la técnica
de la electroforésis que es una de las más utilizadas en la investigación de
proteínas.
OBJETIVOS
El estudiante identificará el pH isoeléctrico de la caseína.
El estudiante aprenderá a separar la clara del huevo en sus fracciones de
globulina y albúmina por el método de precipitación salina o salado.
El estudiante aprenderá a realizar una diálisis.
El estudiante conocerá la prueba de Buiret para la identificación de
proteínas.
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MATERIALES
9 tubos de ensayo.
2 tubos de centrífuga de 100 ml.
2 agitadores de vidrio.
Bolsas para diálisis.
Tela de manta de cielo o gasa (proporcionada por el alumno).
1 Matráz volumétrico de 500 ml.
1 Gradilla
1 Rollo de Hilaza (proporcionado por el alumno)
Tijeras (proporcionadas por el alumno)
1 molde para elaborar el queso (proporcionado por el alumno)
Manta de cielo (proporcionada por el alumno)
1 termómetro con escala de hasta 200ºC
EQUIPO
Potenciómetro.
Centrífuga.
REACTIVOS
Soluciones de ácido acético 0.01, 0.1 y 1M.
Caseína.
Sulfato de amonio.
Solución de NaOH 1M.
Solución saturada de sulfato de amonio.
Solución de NaCl 0.15M.
Solución de NaOH al 20%.
Solución de sulfato cúprico al 0.5%.
Alcohol amílico.
3 ó 4 huevos (proporcionados por el alumno).
Agua destilada.
Leche entera de vaca, cabra u oveja (proporcionada por el alumno)
Tabletas de renina o cuajo
Sal yodatada (de mesa, proporcionada por el alumno)
PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE CASEÍNA
1) En un matraz volumétrico de 500 ml. coloque 2.5 g de caseína.
2) Adicione 200 ml de agua destilada y un volumen de solución de NaOH
(1M) que proporcione exactamente 0.05 moles de NaOH.
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3) Agregue unas gotas de alcohol amílico para disminuir la formación de
espuma.
4) Agite, disuelva y adicione una solución de ácido acético 1M que
proporcione exactamente 0.05 moles de ácido acético
5) Afore a 500 ml. con agua destilada.
DETERMINACIÓN DEL pH ISOELÉCTRICO DE LA CASEÍNA
El pH isoeléctrico (baja solubilidad, carga neta igual a 0) debe
recordarse cuando se investiga sobre la separación y purificación de fracciones
protéicas.
Existen varios métodos para la determinación experimental del pH
isoeléctrico (pHI) de una proteína. En esta determinación el pH donde se presenta
la mínima solubilidad puede ser usado para estimar el pH isoeléctrico de la
caseína.
La caseína está presente en la leche en forma de partículas coloidales o
micelas y son fácilmente separadas por precipitación isoeléctrica. El cuajado y la
acidificación son una práctica de la tecnología de lácteos para la preparación de
productos de leche agria y algunos quesos suaves. La acidificación natural se
lleva a cabo por inoculación de la leche con iniciadores por ejemplo, cultivos de
bacterias ácido lácticas.
PROCEDIMIENTO
1) Prepare una serie de tubos como se indica:
REACTIVO
TUBO NÚMERO
1
2
3
4
5
6
7
8
9
H2O
8.4
7.8
8.8
8.5
8.0
7.0
5.0
1.0
7.4
HOAC 0.01M
0.6
1.2
-
-
-
-
-
-
-
HOAC 0.1 M
-
-
0.2
0.5
1.0
2.0
4.0
8.0
-
HOAC
-
-
-
-
-
-
-
-
1.6
(volumen en ml.)
1.0 M
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2) Agregue 1 ml. de solución de caseína a cada muestra y mezcle
inmediatamente cada 2 minutos.
3) Observe la presencia o ausencia de turbidez en la mezcla a los 10, 30 y
50 minutos.
4) Tabule los resultados e indique el grado de precipitación:
0 = ningún cambio.
1+ = opalecencia.
2+ = notable opalecencia.
3+ = precipitación.
4+ = marcada precipitación.
5+ = abundante precipitación.
5) Determine el pH de cada tubo en el medidor de pH.
II. PRECIPITACIÓN DIFERENCIAL DE PROTEÍNAS (PRECIPITACIÓN SALINA
O SALADO)
La precipitación salina o salado es uno de los métodos de separación de
proteínas de su estado natural (actividad biológica).
El sulfato de amonio es una de las sales más utilizadas para la
precipitación salina de proteínas.
Es muy soluble (760 g de sulfato de
amonio/1000 ml. de agua a una temperatura de 20°C, temperatura promedio del
laboratorio) y el ión sulfato divalente permite alcanzar altas fuerzas iónicas. En
esta determinación la proteína blanca del huevo (clara) será separada en
fracciones de globulina y albúmina.
PROCEDIMIENTO
Es recomendable trabajar en equipos de trabajo de 2 a 3 personas.
1) Separe las claras y las yemas de 3 ó 4 huevos.
2) Combine las claras y filtre a través de una manta de cielo o gasa.
3) Coloque 25 ml. de clara de huevo en un tubo de centrífuga y adicione 25
ml. de solución saturada de sulfato de amonio, mezcle suavemente.
4) Deje en reposo durante 30 minutos moviendo ocasionalmente.
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5) Permita que sedimente y decante el líquido sobrenadante. Guarde el
precipitado y la fracción sobrenadante.
6) Realice una prueba de confirmación de la presencia de proteína en la
muestra como se describe a continuación:
REACCIÓN DE BUIRET
Cuando una solución de proteína fuertemente alcalina es adicionada a una
solución de sulfato de cobre se obtiene un color púrpura.
La reacción es
característica de las sustancias que poseen dos grupos -NH-CO- unidos
directamente o separados por un átomo de carbono o de nitrógeno. Se trata de
una reacción inducida por la unión peptídica pero también puede ocurrir en
sustancias no protéicas que posean tal estructura (ejemplo, la biurea o buiret).
PROCEDIMIENTOS
1) Adicione 2 ml de solución de NaOH al 20% a 2 ml. de la solución de
prueba (la del paso 5 antes mencionada (fracción sobrenadante).
2) Mezcle y añada gota a gota solución de sulfato cúprico al 0.5%.
3) Agite constantemente hasta la formación del color púrpura. Un exceso
de sulfato cúprico provocará la formación de un precipitado de hidróxido
de sodio.
7) Demuestre que el sólido es globulina:
a) Pruebe la solubilidad en solución de NaCl 0.15M
b) Transfiera la solución de NaCl conteniendo la proteína disuelta a una
bolsa de diálisis y permita la dialización durante la noche frente a 500 ml
de agua destilada.
Observe y explique TODOS los resultados.
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FORMACIÓN DE UN GEL
Dos de los geles protéicos más conocidos y presentes en alimentos
son:
 gelatina
 caseína coagulada (queso)
Esta determinación estudiará los principios de la fabricación de
quesos en semejanza con la formación de geles.
PROCEDIMIENTO
1) Pulverizar ½ tableta de renina y adicionarla a 100 mL de leche
2) Calentar 900 mL de leche en un precipitador (u olla proporcionada por el
alumno) de 1000 mL hasta alcanzar 75ºC
(utilizar parrilla de
calentamiento o, puede ser mechero pero se debe tener mucho cuidado
al utilizarlo para que la leche no se derrame al hervir)
3) Adicionar los 100mL de leche que contienen la renina o cuajo a la
porción caliente.
4) Mover algunas veces
5) Dejar en reposo durante 15 minutos para formar la cuajada
6) Presionar la cuajada sobre manta de cielo para separarla del suero.
Adicionar sal al gusto
7) Dejar en reposo la cuajada en su molde durante 15 minutos para formar
el queso
Explicar qué sucede durante el proceso de elaboración del queso.
BIBLIOGRAFIA
Braverman, J.B.S. 1980. Introducción a la bioquímica de los alimentos.
2ª. Ed. Z. Berk. Editorial El Manual Moderno. México, 358pp.
Egan, H., Kirk, R.S., Sawyer, R. 1988. Análisis químico de alimentos de
Pearson. Ed. C.E.C.S.A. México, 586pp.
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Pearson, D. 1976. Técnicas de laboratorio para el análisis de alimentos.
Ed. Acribia. España 331pp.
Watty, B. M. 1982. Química analítica.
México, 671pp.
Ed. Alhambra Universidad.